本发明涉及一种生物相容性交联凝胶的制备方法，所述凝胶及所 述凝胶的用途，用于构成包含至少一种分散的活性组分的基质，或者 用于分离、替代或填充生物组织，或者用于增加所述组织的体积，或 者用于补充或替代生物流体。

在治疗应用的情况下和用于美容目的用时，需要增加组织体积。 可通过将一种基于永久的或生物可降解产品的粘弹性溶液引入到生物 组织中来实现。

基于永久的或生物可降解的产品的粘弹性溶液的注射也被视为对 生物流体的替代。

例如，其用于替代天然滑液，由于组成糖胺聚糖的量和分子量的 降低，该天然滑液在关节炎患者中不再能够满足软骨保护润滑功能的 润滑和吸收冲击的功能。但当这种粘弹性溶液由生物可降解产品构成 时，其可从滑液囊中迅速除去。

在其它治疗应用的情况下，这种粘弹性溶液被用于某些需要扩增 以保证其功能的组织；其实例为声带、食道、括约肌或尿道。

在美容应用的情况下，这种粘弹性溶液被用作例如填充皱纹，掩 饰疤痕，或增加嘴唇体积。这些粘弹性溶液的注射是一种简单的非侵 入性方法，具有比美容手术相比更低的风险和难度。

使用基于永久产品的粘弹性溶液具有在注入该粘弹性溶液的组织 中可长期保持的优点。

硅酮注射已经使用了很长时间。然而，由于该方法不希望的长期 效果，其特征在于皮肤上出现瘤状体和溃疡，人们逐渐放弃了这种手 术。

悬浮液中的微颗粒固体的注射也可使组织体积产生永久的增加。 美国专利5,344,452公开了一种粉末状固体的用途，其由直径在10μm～ 200μm间的小颗粒组成，且具有非常光滑的表面。商品和 是由聚甲基丙烯酸酯微球体在胶原溶液中的悬浮液组成的。 EP 1 091 775提出了一种甲基丙烯酸酯水凝胶的碎片在透明质酸酯溶 液中的悬浮液。也已经使用了硅酮、陶瓷、碳或金属的颗粒(美国专 利5,451,406、5,792,478和美国申请2002-151466)，和聚四氟乙烯、 玻璃或合成聚合物的碎片(US申请2002-025340)，但结果都不令人 满意。因此，会出现导致溶液生物降解的副反应，因为生物可降解悬 浮液和残留碎片的移动会引起炎症反应。此外，如果颗粒的直径太大 或形状不规则会提高颗粒之间的结块，那么通过细针孔注射颗粒会很 困难。此外，脆性颗粒的注射会破坏其结构，这样导致注射颗粒太小， 不能粘合至临近的细胞，而会向其它组织移动，或者被小噬细胞和淋 巴系统的其它组成快速消化。

一般而言，这些产品的永久特性导致了大量缺点(US 6,436,424)， 其显著具有刺激小噬细胞的危险，构成产品的合成碎片的移动能够引 起发炎行为，这甚至会导致肉芽瘤的出现。因此这些肉芽瘤的治疗需 要通过注射类固醇的治疗处理，或者通过切除的手术处理，这些处理 会严重影响患者的健康或其生活质量。因此，永久产品的副作用是非 常棘手的，以至于它们阻碍了这些产品单纯用于美容目的的使用。此 外，基于永久产品的粘弹性溶液的注射不允许需要时的修饰。

在生物可降解的材料中，有胶原质或交联透明质酸的悬浮液。

美国专利4,582,640中公开了Collagen Corporation开发了一种基 于与戊二醛交联的胶原质的制备。然而，这种产品在其注入的组织内 通过小噬细胞或者通过酶作用或化学作用迅速降解，然后由淋巴系统 从组织中排出。美国专利5,137,875提出了含透明质酸的胶原的水性悬 浮液或溶液的用途，但该产品不能形成持久的治疗，因为其也会迅速 消化，然后由淋巴系统排出。因此需要重复治疗，这会带来相当高的 费用，且降低患者的生活质量。

专利EP 0 466 300提出了一种双相粘弹性凝胶的注射，所述凝胶 由分散在液相中的基质组成，所述两相由透明素、动物来源的高分子 量透明质酸酯组成，交联并萃取。使用高分子量的聚合物允许生物可 降解的粘弹性凝胶长期保持在组织中。这种技术产生了市场中的许多 产品，例如用于填充连接组织细胞间基质的萎缩；或者 用于治疗关节炎的粘性补充物产品。

在该双相生物可降解产品中，也可以引用 或以及由液相(非交联的透明质酸酯)和包含高度 交联的透明质酸相构成的其它双相组合物。为适用于组织体积(面部、 胸部)的增加或关节炎的治疗，这些产品是基于Q-Med所属的NASHA 技术。也观察到在某些情况下，使用双相产品会引起炎症反应或甚至 会出现肉芽瘤(Laeschke K.Biocompatibility of microparticles into soft tissues fillers.Comgress of Aesthetic Medicine and Dermatologic Surgery， Paris，2003)，即使这些反应比基于合成聚合物的凝胶存在时观察到的 更少。此外，流体相会非常迅速地排出，这会引起对应于该流体相体 积的材料损失。结果，当需要组织的体积增加时，在第一次注射后还 需要多次修饰，这会降低患者的生活质量。

最后，提出了许多单相粘弹性凝胶，用于均化凝胶中的交联质量 (美国专利申请2003-148995)，或者用于控制凝胶的生物可降解性(US 4,963,666)，或者用于控制凝胶的粘弹性(US 5,827,937)。该聚合物 的高交联度使得生物可降解的粘弹性凝胶在组织内具有更高的保持 性。然而，注射这种包含如此高交联度聚合物的凝胶比较困难。此外， 这种凝胶的注射会导致机械性破碎聚合物的非交联位点，这会变得更 易受到生化和酶的攻击，从而会促进该凝胶的迅速降解。

本发明的目的在于提出一种可避免上述缺点的生物相容性交联凝 胶，其同时具有如下优点：易于在临床应用中使用，其寿命使得生物 相容性交联凝胶在其功能不再需要时会消失，但足以限制由药物或手 术介入引起的治疗次数。

为此，本发明的目的是提供一种生物相容性交联凝胶的制备方法， 包括以下步骤：

通过添加一定量的交联剂，将预定量的至少一种生物相容性聚合 物在溶液中开始交联，

使所述量的聚合物交联反应，

在具有反应混合物的稀释物的溶液中添加补充量的分子量大于 500000Da的聚合物，使溶液中聚合物的整体浓度降低，并交联，和

通过除去交联剂，停止该交联反应。

添加补充量的聚合物的步骤能够提供新的反应位点。

本方法能够得到一种生物相容性的交联凝胶，其同时具有单相性、 高致密性(polydensified)、凝结性、可注射性和长期保持性。

关于凝结性，是指凝胶重新聚合而不扩展和分裂的倾向。因此凝 结性有助于获得凝胶在活体内的高相容性和长期保持性。

关于高致密性，是指甚至在凝胶本体内交联度的变化。凝胶的高 致密性可使该组合物获得通过小直径针孔的可注射性的优点，和凝胶 在活体内的总体保持性。

单相性可使炎症反应和出现肉芽瘤的危险降低。

凝胶长期保持性的作用可以间隔开医疗介入操作，从而提高患者 的生活质量。

依照本发明获得的凝结性高致密单相凝胶的特征在于促进了可注 射性，比相同组成的单相凝胶在体内具有更长的保持性，其交联量在 凝胶内是均匀的。

依照本发明的一种实施方式，开始交联的步骤是在碱性介质中进 行的。

依照本发明的另一种实施方式，开始交联的步骤是在酸性介质中 进行的。

依照本发明的改进，在添加补充量聚合物的过程中添加补充量的 交联剂。

优选地，停止交联的步骤是通过渗析进行的。渗析可保证反应的 最终停止。这样可除去交联剂和未反应的小聚合物链。

适宜地，该聚合物为天然来源。天然来源聚合物的使用可获得更 高的生物相容性，即这种应用可引起较低的炎症反应危险。

优选地，该天然来源的聚合物选自如下化合物：透明质酸、硫酸 软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、纤维素及其衍生物、 藻酸盐、苍耳烷、角叉菜胶、蛋白质或核酸。

甚至更适宜地，至少一种天然来源的聚合物是非天然存在于人体 内的聚合物，选自：纤维素及其衍生物、藻酸盐、苍耳烷、角叉菜胶， 与至少一种天然存在于人体内的聚合物交联的聚合物，其选自：透明 质酸、硫酸软骨素、角质素、硫酸角质素、肝素、硫酸肝素、蛋白质 或核酸。

适宜地，交联剂是双官能分子，选自环氧化物、表卤代醇和二乙 烯基砜。

本发明目的还提供一种由上述方法制备的凝胶。

优选地，该凝胶构成了包含至少一种分散的活性组分的基质。该 凝胶然后用作可使所述活性组分从液体和其注入的生物组织中逐渐释 放的介质。

最后，本发明目的还提供该凝胶的用途，用于分离、替代或填充 生物组织，或增加所述组织的体积，或者用于补充或替代生物流体。

通过下面的详细解释，以及仅为示例性但非限制性的实施例给出 的本发明实施方式，可更好地理解本发明，其它目的、细节、特征和 优点将从下面的描述中将变得更加清楚明显。

生物可降解交联凝胶的制备方法特征在于以下的连续步骤：将预 定量的至少一种生物相容性聚合物在溶液中开始交联，交联所述量的 聚合物，在具有反应混合物的稀释物的溶液中添加补充量的分子量大 于500000Da的聚合物，使溶液中聚合物的整体浓度降低，并交联，和 通过除去交联剂停止该交联反应。

通过添加一定量的交联剂进行开始交联的步骤，所述交联剂是双 官能和多官能分子，选自环氧化物、表卤代醇和二乙烯基砜。优选的 环氧化物是选自如下的化合物：1，4-丁二醇二缩水甘油醚(也称为1，4- 二(2，3-环氧丙氧基)丁烷)、1-(2，3-环氧丙基)-2，3-环氧环己烷和1，2-乙 二醇二缩水甘油醚。

依照本发明的一种实施方式，开始交联的步骤是在碱性介质中进 行的。在碱性介质中进行的交联反应的特征在于形成非常稳固的醚键。 醚化产生的交联能够形成在活体内更长的保持性。

依照本发明的另一种实施方式，开始交联的步骤是在酸性介质中 进行的。在酸性介质中进行的交联反应的特征在于形成比上述醚键更 不稳定的酯键。然而，更不稳定的键会有某些优点。特别地，这种用 作包含分散活性组分的基质的凝胶能够使所述活性组分另一种动力学 释放更适用于某些应用。

交联反应是可保证每个聚合物链彼此间交联的反应。其可通过交 联量的确定进行量化。

交联量的定义为保证每个聚合物链桥联的交联剂的摩尔数与聚合 单元的摩尔数之间的比值。

交联反应优选的反应温度范围为25℃～60℃。

可与单一聚合物和聚合物的混合物发生交联反应。

参加交联反应的聚合物可以是合成来源，但优选为天然来源。使 用天然来源的聚合物能够具有更好的生物相容性，即该使用会带来更 低的炎症反应的危险。

优选地，使用上述天然来源的聚合物。

然而，本发明显然不局限于上述聚合物，也可使用不同类型和尺 寸的聚合物。

添加补充量聚合物的步骤伴随着反应介质的稀释，从而降低了聚 合物在溶液中的整体浓度。

在这些条件下，聚合物链具有新的交联位点，通过固定到最初交 联的凝胶上，其将会与剩余的交联剂和/或少量添加的交联剂发生反应， 和在它们之间具有更少量的交联，因为交联剂的量已经降低。第一步 交联反应中产生的凝胶链上的桥联数比后面与添加的链之间的桥联数 以及添加的链之间的桥联数都要大。因此在最终的凝胶中交联量发生 变化，该最终凝胶是由稳固交联的中心(hubs)(例如交联键为25％) 构成，这些中心通过交联量越来越低的凝胶(其交联量逐渐降低，可 达到1％)相互连接。这样特别为其提供了优良的粘弹性，其可使凝胶 在具有大量交联键，因此在活体内具有长期保持性的同时，可为凝结 性的(单一且相同的凝胶)，并可通过任何类型特别是细针孔的医疗 设备注射。

补充聚合物的添加可在初始交联反应进行到任何程度时发生，优 选在初始交联反应进行75％时。该步骤可以通过以连续或不连续的方 式添加聚合物来完成。

补充的聚合物必须具有高于500000Da的分子量。它们也可以是 合成或天然的。它们可以聚合物混合物的形式添加。它们可以与最初 交联步骤中使用的那些具有相同或不同的种类或尺寸。适宜地，加入 的补充聚合物由比最初存在的聚合物更长的链组成。这使得凝胶的外 部机械结构得到改进，长链比短链更难降解。

因此该方法可得到一种生物相容性的交联凝胶，其同时具有单相 性、高致密性、聚结性、可注射性和长期保持性。

依照本发明的一种实施方式，在添加补充聚合物的步骤过程中添 加了补充量的交联剂。该交联剂可以与反应开始步骤过程中使用的那 些具有相同或不同的性质或尺寸。优选地，其选自如上所述的组分。 添加的量基本上低于最初交联的添加量。

停止交联反应的步骤确保反应的最终停止。例如可通过透析进行， 其能除去交联剂和未反应的聚合物短链。因此包括这种试剂的凝胶的 注射会导致炎症反应，因为这些试剂都是难吸收的化合物，且活性很 强。

优选地，该凝胶构成了包含至少一种分散的活性组分的基质。因 此该凝胶用作可使所述活性组分逐步释放到液体或其注入的生物组织 中的介质。该活性组分是一种例如可以为抗氧化剂的药理学活化剂。 该活性组分也可为不同性质。不同性质的活性组分的混合物也可分散 在凝胶中。

该凝胶优选被注射。

最后，该凝胶可适宜地用于分离、替代或填充生物组织，或增加 所述组织的体积，例如在治疗应用的情况下(提高声带、食道、括约 肌、尿道或其它器官的体积)，或用于填充皱纹、掩饰疤痕、或增加 嘴唇体积的美容目的。

其也可以用于补充或替代生物流体，例如天然滑液。

下面提出实施例用于解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1(对比例)

将10g透明质酸(MW＝2×106Da)稀释在100ml的1％ NaOH 溶液中。通过该步骤，在交联反应之前透明质酸发生水合反应。

混合物中整体均质化，直到得到透明溶液。

然后通过向溶液中添加470μl的1，4-丁二醇二缩水甘油醚 (BDDE)，引发交联反应，在25℃下的无氧环境中混合15h。

用1M的HCl重新调节pH到生理pH，用pH＝7的缓冲溶液将体 积调节到400ml。

然后对得到的凝胶在pH＝7的缓冲溶液中透析24h(再生纤维素， 分离极限：MW＝60kDa)(凝胶I)。

该凝胶中透明质酸的总含量为2.5wt.％。

实施例2(对比例)

该凝胶的制备方法同实施例1，只是加入了更多量的交联剂。

将10g透明质酸(MW＝2×106Da)稀释在100ml的1％NaOH 溶液中。

混合物中整体均质化，直到得到透明溶液。

然后通过向溶液中添加760μl的1，4-丁二醇二缩水甘油醚 (BDDE)，在25℃下的无氧环境中混合15h。

用1M的HCl重新调节pH到生理pH。

用pH＝7的缓冲溶液将体积调节到400ml。

然后对得到的凝胶在pH＝7的缓冲溶液中透析24h(再生纤维素， 分离极限：MW＝60kDa)(凝胶II)。

该凝胶中透明质酸的总含量为2.5wt.％。

实施例3(对比例)

该凝胶的制备方法同实施例1或2，只是加入了更多量的交联剂。

将10g透明质酸(MW＝2×106Da)稀释在100ml的1％NaOH 溶液中。

混合物中整体均质化，直到得到透明溶液。

向溶液中添加950μl的1，4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)，在25 ℃下的无氧环境中混合15h。

用1M的HCl重新调节pH到生理pH。

用pH＝7的缓冲溶液将体积调节到400ml，整体均质化。

然后将得到的凝胶在pH＝7的缓冲溶液中透析24h(再生纤维素， 分离极限：MW＝60kDa)(凝胶III)。

该凝胶中透明质酸的总含量为2.5wt.％。

实施例4(依照本发明的)

将10g透明质酸(MW＝2×106Da)稀释在100ml的1％ NaOH 溶液中。

混合物中整体均质化，直到得到透明溶液。

然后通过在溶液中添加950μl的1，4-丁二醇二缩水甘油醚 (BDDE)，引发交联反应，在25℃下的无氧环境中混合9h。

然后添加补充量的聚合物，同时用0.5％的透明质酸溶液、pH＝11 (MW＝2×106Da)调节其体积至300ml。

反应继续再进行6h。用1M HCl重新调节pH到生理pH，调节体 积到400ml。

整体均质化。

为使交联反应最终停止，然后将得到的凝胶在pH＝7的缓冲溶液 中透析24h(再生纤维素，分离极限：MW＝60kDa)(凝胶IV)。

只有该最后一种凝胶依照本发明制备，其它三种凝胶都是依照现 有技术制备，即具有均匀的交联度。

该凝胶中透明质酸的总含量为2.75wt.％。

对实施例1～4中的凝胶进行流变学研究。

该研究是针对凝胶的极限挤出力(F)，即凝胶可被挤出的力。

为此，将凝胶置于直径为2.5cm的不锈钢圆筒中，通过直径为0.2 mm的小孔进行挤出。

得到的结果如下表所示：

  凝胶类型   F(N/mm2)σ＝0.15N/mm2   I   3.56   II   5.85   III   7.40   IV   6.12

σ：标准变化

凝胶I、II、III是凝胶内交联量为常数的凝胶。只有凝胶IV是交 联量变化的凝胶。

该方法首先表明交联剂增加添加量(I至III的凝胶)导致极限挤 出力(即挤出交联量增加的凝胶所应用的力)也较大，对于具有交联 量均匀的凝胶极限挤出力也增加。

含2.75wt.％透明质酸的凝胶IV(依照本发明的凝胶)的注射与 含2.5wt.％透明质酸且具有更低交联量的同质凝胶(凝胶II)的注射 同样容易，比含2.5wt.％透明质酸且具有相同交联量但为同质的凝胶 (凝胶III)的注射更为容易(力F比其小15％)。

因此，该实施例证明了依照本发明的凝胶，其交联量是非均匀的， 能够具有高程度的交联，因此在体内具有高保持性，易于用细针孔型 的设备挤出。