技术领域
[0001] 本
发明属于生物医用材料领域，具体涉及一种生物诱导型人工硬脑膜及其制备方法。
背景技术
[0002] 硬脑膜是一层紧贴在颅骨内侧和脑组织之间的坚硬膜性组织，由胶原
纤维网和缠绕其中的
成纤维细胞所组成，紧贴颅骨内侧，主要作用是保护大脑。当人患颅内
肿瘤，硬脑膜组织容易受到侵蚀破坏；此外，因手术、外伤等原因也可能造成硬膜缺损。硬脑膜缺损可引起脑医源性损伤、
脑脊液渗漏、颅内感染、继发性
癫痫等一系列并发症。为
预防脑、脊髓与周围组织发生粘连，防治脑脊液漏和感染，并为神经组织提供容纳和保护作用，必须进行及时有效的硬膜修补术。据资料统计，有10％—30％的脑外科手术都需要实施硬脑膜修补。
[0003] 目前临床上应用的脑膜替代材料有三类:自体组织修补材料、异种
生物材料和人工合成材料。自体组织修补材料虽然免疫反应低，但属于“以伤治伤”，造成患者的二次痛苦。异种生物材料具有良好的
生物相容性，国内临床上常使用
牛心包、羊心包、牛腹膜、猪腹膜、肠系膜以及牛跟
腱胶原等，人工合成材料包括膨体聚四氟乙烯(ePTFE)和聚已内酯
纳米纤维等，大量调查资料表明这些已有的硬脑膜材料存在排斥反应，脑膜粘连，脑脊液渗漏，不可降解或降解速度过慢，降解产物有一定毒性，原材料来源有限，以及手术过程中不便于操作等其它
缺陷。
[0004] 大量研究资料表明，理想的硬脑膜修补材料需具备以下特点：(1)原料来源丰富，价廉易得，工艺简单；(2)化学性质稳定，无急性炎性反应，不发生脑膜-脑粘连；(3)组织相容性好，无毒
副作用，无免疫反应；(4)安全，无致癌致畸作用，不传播病毒；(5)合适的物理机械性能；(6)致密无渗漏；(7)合适的
生物降解性(8)贮运方便；(9)术前准备及操作方便；(10)经济适用，价格适中等。
[0005] 人体真皮组织的主要成分包括成纤维细胞、血管内皮细胞等细胞成分和细胞外基质蛋白、胶原等非细胞成分等。
皮肤移植中，主要是细胞免疫引起的排斥，当除去了具有较强免疫原性的细胞成分之后，脱细胞真皮(ADM)只留有很低的
抗原性,而同种脱细胞真皮基质则几乎不会引起宿主的排异反应,在宿主体内可以长期存留，最终材料被正常组织吸收、改建。脱细胞真皮(ADM)的细胞成分及Ⅰ、Ⅱ型细胞相容性抗原已经被完全清除掉,因而免疫活性很低,故而它不会诱发针对异体组织移植所产生的特异性细胞免疫反应,也不会诱发非特异性异物反应。这样，既消除了应用其它同种异体材料时可见的免疫反应，又因为分子超微结构的存在成为一个模板，诱导组织内皮细胞和血管内皮细胞再生形成新的脑膜，并且有较长的保存期。Warren等用无细胞(人)真皮修补硬脑膜缺损200例，伤口感染率为2％，与未应用或自体移
植物的病人之间没有明显差异。无细胞人体真皮已经在
牙周病和整形重建外科中使用超过5.5万例，到目前为止尚无传递
疾病的报道。但这种材料是皮肤的衍生物，天然皮肤存在毛孔、汗腺、血管以及胶原纤维间隙等，存在天然的孔隙结构，某些制品孔隙较大，可能导致脑脊液渗漏。
[0006] 总而言之，目前的硬脑膜修补材料中，丝素蛋白膜在制作工艺上仍有待进一步改进；羊膜在取材方法与交联剂的选择方面值得进一步探究；高分子聚合材料的生物学毒性及理化性能也有待长期试验的确证；细菌
纤维素膜在硬脑膜领域的研究尚未见文献报道；现有的胶原膜、胶原海绵等还存在降解速度不容易控制等问题，以致材料降解后新脑膜还未形成、材料较硬、容易
破碎，缝合时容易撕裂，引起脑脊液渗漏。因此，新材料与新技术的各种优点相互融合，制备具有诱导组织再生功能的新型硬脑膜替代材料将成为开发和应用的必然趋势。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于针对现有各类硬脑膜修复材料存在的问题，从目标材料的原料选择、结构设计入手，综合运用系统工程、、再生医学、
仿生学和生物设计(Bio-Design)的原理和方法，提供一种具有诱导组织再生功能的胶原基复合硬脑膜；该方法制备的胶原基人工硬脑膜兼具胶原的优异的生物相容性和脱细胞猪真皮良好的
力学性能。且具备合适的孔隙结构，能有效防止脑黏粘，能够承受较高的颅内高压，促进硬膜化
进程，可在脑部组织愈合的过程中可控降解，并可任意裁剪成所需形状，存储方便，临床应用操作简便易行。产品具有良好的抗张强度和力学性能，可使用圆形针进行无明显损伤的缝合；在干态下可裁剪成任意所需形状，在使用之前易
水化。比起其他硬脑膜材料，它有更好的撕裂强度和操纵特性，因此在手术操作过程中，能很好的适应湿法处理和钳操纵过程。
[0008] 本发明的另一目的是提供一种制备上述硬脑膜的方法。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现上述目的：
[0010] 一种基于表面封闭处理技术的工艺稳定的胶原基复合结构的人工硬脑膜。设计目标材料由双层结构组成：以脱细胞猪真皮
支架为基底，将生物相容性优良的复合胶均匀涂敷其上，形成有效防止脑脊液渗漏的
薄膜。胶原纤维支架既保留了天然基质的三维结构，又最大程度的保留了其发挥生物诱导作用的结构
基础——三股螺旋结构，保证了生物活性。该方法制备的胶原基人工硬脑膜兼具胶原的优异的生物相容性和脱细胞猪真皮良好的力学性能。
[0011] (1)脱细胞猪真皮基质的制备：将生态猪皮剖层，采用消毒、表面清洗等技术去除原材料热源；使用平平加、
乙醇等
试剂进行
脱脂处理；采用复合酶脱细胞工艺和曲拉通100清洗工艺相结合的方法，去除细胞成分；使用酸
碱结合法进一步对所得脱细胞猪真皮基质进行去除热源处理；冻干备用；
[0012] (2)聚乙二醇和丙三醇进行共聚交联反应得到一种复合胶。采用水平流涎和水平
喷涂等方法将其涂敷在脱细胞真皮基质上，控制压力、喷涂距离、喷涂速率等工艺参数，使涂层均匀分布，通过室温晾干，恒温干燥
固化，即可在脱细胞猪真皮表面形成一层均匀的封闭膜，得到可有效防止脑脊液渗漏的胶原基复合硬脑膜
[0013] (3)配制洗脱液，将上述所得胶原基复合膜层，通过去离子水，去离子水与乙醇的互配物浸泡洗涤，以去除残留物质，再经
冷冻干燥成型，即得可有效防止脑脊液渗漏的双层复合结构之胶原基硬脑膜；
[0014] (4)通过上述方法制备的胶原基硬脑膜经过灭菌、
包装后储存；
[0015] 所述步骤(1)中的胶原基硬脑膜的制备方法，其特征在于所述的采用过
氧化氢灭活病毒，该步骤在恒温
超声波清洗器或其他可震荡的设备中进行，其中过氧化氢的
质量浓度为0.05-3.0％，灭活时间为1h-3h，
温度范围为10-40℃。
[0016] 所述步骤(1)中的胶原基硬脑膜的制备方法，其特征在于所述的采用过氧化氢灭活病毒，该步骤在恒温
超声波清洗器或其他可震荡的设备中进行，其中过氧化氢的质量浓度为0.05-3.0％，灭活时间为1h-3h，温度范围为10-40℃。
[0017] 所述步骤(1)中采用生物酶脱细胞工艺和Triton-100清洗工艺相结合的方法，去除细胞成分。其中生物酶的质量浓度为0.01％-5％，Triton-100的质量浓度为0.25-5％。
[0018] 所述步骤(1)中使用酸碱结合法对所得脱细胞猪真皮基质进行去除热源处理。其中使用的酸为
盐酸，碱为氢氧化钠。
[0019] 所述步骤(4)中的灭菌方式为低温环氧乙烷灭菌，或采用钴-60进行辐照灭菌，灭菌剂量为25～50kGy；
[0020] 采用上述方法制备得到的具有复合结构的胶原基硬脑膜，其关键性能符合以下要求：
[0021] 1.外观：胶原基硬脑膜应为白色薄片状，干态具有一定硬度，湿态柔顺、不易破裂。
[0022] 2.尺寸：胶原基硬脑膜长度和宽度分别为25mm-100mm，厚度0.3～0.7mm。
[0023] 3.吸收力：每克试样的液体吸收量应不小于3g。
[0024] 4.抗牵拉强度：持续15S施加10N拉力时不断裂。
[0025] 5.缝合强度：耐缝性不小于0.3N/mm。
[0026] 6.灰分：灰分应小于2％。
[0027] 7.重金属：重金属含量≤10μg/g(m/m)
[0028] 8.水分：水分含量≤10％。
[0029] 9.酸碱度：胶原基硬脑膜检验液与空白对照液的PH值之差应不超过1.0。
[0030] 10.无菌：产品应无菌。
[0031] 11.细菌内毒素含量：细菌内毒素含量应小于20EU/套。
[0032] 12.细胞毒性：细胞毒性应不大于1级。
[0033] 13.迟发型超敏反应：产品应无迟发型超敏反应。
[0034] 14.AMES试验：结果应为阴性。
[0035] 15.小鼠淋巴瘤试验：结果应为阴性。
[0036] 16.
染色体畸变试验：结果应为阴性。
[0037] 17.植入：皮下植入60天，
显微镜下植入部位可见少量巨噬细胞和淋巴细胞浸润，可见胶原纤维和纤维细胞，未见异常反应。皮下植入120天，组织相容性良好，样品全部被吸收。
[0038] 18.降解：皮下植入120天，样品应完全被降
解吸收。
[0039] 与
现有技术相比，本发明具有以下显著优点和效果：
[0040] 1.综合运用系统工程、再生医学、仿生学和生物设计(Bio-Design)的原理和方法；
[0041] 2.产品具有良好的抗张强度和力学性能，可使用圆形针进行无明显损伤的缝合；在干态下可裁剪成任意所需形状，在使用之前易水化。比起其他硬脑膜材料，它有更好的撕裂强度和操纵特性，因此在手术操作过程中，能很好的适应湿法处理和钳操纵过程；
[0042] 3.在制备技术上，利用固定化酶纯化技术与Triton-100清洗工艺和酸碱法相结合的技术体系，制备清除抗原物质和去
除热原的硬脑膜基质材料—脱细胞猪皮胶原纤维；
[0043] 4.在结构设计上，本项目所制备的胶原基硬脑膜，面向大脑皮层一面为具有优良生物相容性的聚乙二醇-丙三醇交联共聚复合胶原液形成的胶原复合胶封闭膜，能有效防止黏粘效应，同时背向大脑皮层一面为脱细胞猪真皮或高孔隙度的胶原膜，具有发达的多孔网状结构，使该产品迅速的血管化，与自身组织一体化，有效防止脑脊液的渗漏。
附图说明
图1所示的是胶原基硬脑膜的样图；
图2所示的是本发明
实施例2中的
光学显微镜图。
具体实施方式
[0044] 以下结合实施例对本发明作进一步具体描述，但不局限于此。
[0045] 实施例1：
[0046] (1)脱细胞猪真皮的制备：将生态猪皮剖层，采用消毒、表面清洗等技术去除原材料热源；使用平平加、乙醇等试剂进行脱脂处理；采用复合酶脱细胞工艺和Triton-100清洗工艺相结合的方法，去除细胞成分；使用酸碱结合法进一步对所得脱细胞猪真皮基质进行去除热源处理；冻干备用；
[0047] (2)聚乙二醇和丙三醇进行共聚交联反应得到一种复合胶。采用水平流涎和水平喷涂等方法将其涂敷在脱细胞真皮基质上，控制压力、喷涂距离、喷涂速率等工艺参数，使涂层均匀分布，通过室温晾干，恒温干燥固化，即可在脱细胞猪真皮表面形成一层均匀的封闭膜，得到可有效防止脑脊液渗漏的胶原基复合硬脑膜；
[0048] (3)配制洗脱液，将上述所得胶原基复合膜层，通过去离子水，去离子水与乙醇的互配物浸泡洗涤，以去除残留物质，再经冷冻干燥成型，即得可有效防止脑脊液渗漏的双层复合结构之胶原基硬脑膜；
[0049] (4)将冷冻干燥后的胶原基硬脑膜无菌封装在医用包装袋内，低温环氧乙烷灭菌。
[0050] 实施例2：1.对制备的材料进行物理性能检测
[0051] (1)外观：目力观察和实际操作，胶原基硬脑膜为白色薄片状，干态具有一定硬度，湿态柔顺、不易破裂。。
[0052] (2)尺寸：以通用量具测量，胶原基硬脑膜长度和宽度分别为25mm-100mm，厚度0.3～0.7mm。。
[0053] (3)吸收力：按YY/T0471.1-2004中3.2的方法进行试验时，每克试样的液体吸收量大于3g。
[0054] 4)缝合强度检测：方法：用4-0的外科缝线缝合在脑膜
补片一端边缘内3毫米处，将缝线与硬脑膜补片的另一端固定在拉力仪上，用AI-7000S
电子拉力机进行拉伸，直到缝合点被撕裂，记录下缝合点被撕裂时的拉力。缝合强度大于或等于50.34N。
[0055] 5)抗张强度检测方法：方法：使用拉伸(压缩)试验机，将修补片裁剪成试样，将试样两端固定在拉伸试验机的夹头上,向外拉伸直到试样断裂。抗张强度大于7Mpa。
[0056] 2.化学性能检测
[0057] 1)灰分：方法：按照《中华人民共和国药典》2010版灰分的检测方法进行检测，灰分含量小于2％。
[0058] 2)重金属：方法：按照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录VIII H第二法测定，重金属含量小于10μg/g。
[0059] 3)酸碱度检测：按照《中华人民共和国药典》(2010年版)二部附录VI H规定的方法进行测定，胶原基硬脑膜检验液与空白对照液的PH值之差不超过1.0。
[0060] 3.生物学性能检测
[0061] 1)内毒素：按GB/T 14233.2规定方法进行检测，内毒素含量小于10EU/g。
[0062] 2)细胞毒性：按3g样品加15ml浸提介质比例，37±1℃，24±2hr制备试验液，浸提介质：MEM培养基。取实验液按照GB/T 16886.5规定的试验法进行，细胞毒性不大于1级。
[0064] 1)光学显微镜观察：方法：
石蜡包埋后的材料用苏木精—伊红染色，倒置相差显微镜观察。结果：无细胞和细胞碎片残留，胶原纤维连续无断裂，如图2所示。
[0065] 本发明的上述实施例是对本发明的说明而不能用于限制本发明，与本发明的
权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
