重叠扩增子的选择性扩增
阅读：781发布：2020-05-11
专利汇可以提供重叠扩增子的选择性扩增专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种可扩展的多重PCR方法，可以同时扩增重叠 扩增子 而没有常规多重PCR的缺点。该方法选择性地扩增具有重叠区域的靶核酸 片段 。该方法包括步骤：获得包括第一标签t2和第一正向引物F1的第一核酸序列，获得包括第二标签t1和第一反向引物R1的第二核酸序列，获得包括第二标签t1和第二正向引物F2的第三核酸序列，获得包括第三标签t3和第二反向引物R2的第四核酸序列，其中每一个引物都是基因特异性引物；执行PCR的初始循环；以及接下来在更高的 退火 温度 下执行PCR随后的循环，以获得扩增产物。，下面是重叠扩增子的选择性扩增专利的具体信息内容。
1.一种选择性扩增具有重叠区域的靶核酸片段的方法，包括步骤：
(a)获得第一核酸序列，所述第一核酸序列包括第一标签(t2)和第一正向引物(F1)，所述第一正向引物与第一靶核酸片段互补，
(b)获得第二核酸序列，所述第二核酸序列包括第二标签(t1)和第一反向引物(R1)，所述第一反向引物与所述第一靶核酸片段互补，
(c)获得第三核酸序列，所述第三核酸序列包括所述第二标签(t1)和第二正向引物(F2)，所述第二正向引物与第二靶核酸片段互补，
(d)获得第四核酸序列，所述第四核酸序列包括第三标签(t3)和第二反向引物(R2)，所述第二反向引物与所述第二靶核酸片段互补，其中所述第一靶核酸片段和所述第二靶核酸片段具有重叠核酸区域，F2与所述重叠核酸区域的一条链的5’端互补，R1与所述重叠核酸的另一条链的5’端互补，
(e)混合所述第一靶核酸片段、所述第二靶核酸片段、所述第一核酸序列、所述第二核酸序列、所述第三核酸序列、所述第四核酸序列以及有效量的用于执行聚合酶链式反应(PCR)所必需的试剂；
(f)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(e)的混合物循环至少两次，以及(g)在比步骤(f)中的退火温度高的退火温度下，通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f)的混合物循环以获得扩增产物，其中，步骤(g)中的退火温度高以防止最短的扩增子被主要扩增。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二核酸序列进一步包括在所述第二标签(t1)和所述第一反向引物(R1)之间的第二正向引物(F2)的全长序列。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第二核酸序列进一步包括在所述第二标签(t1)和所述第一反向引物(R1)之间的第二正向引物(F2)的5’端部分序列。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述第二正向引物的5’端部分序列包括F2序列的
10-90％。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(f)中的所述PCR循环重复2-10次。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述第三标签和所述第二标签相同。
7.根据权利要求5所述的方法，进一步包括步骤：
(h)将来自步骤(g)的扩增产物，与第一和第二通用PCR引物以及有效量的用于执行PCR所必需的试剂混合，其中所述来自步骤(g)的扩增产物是处理的或未处理的，所述第一和第二通用PCR引物分别与t1和t2结合但是不与所述第一靶核酸片段和所述第二靶核酸片段结合，以及
(i)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对步骤(h)的混合物循环以获得第二扩增产物，其中，所述第一标签和所述第三标签相同。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述来自步骤(g)的产物是通过稀释、单链核酸外切酶消化、纯化或适配体连接而预处理的。
9.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高
2-35℃。
10.根据权利要求9所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高
4-35℃。
11.根据权利要求10所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高5-25℃。
12.根据权利要求11所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高6-20℃。
13.根据权利要求12所述的方法，其中步骤(g)中的退火温度比步骤(f)中的退火温度高6-15℃。
重叠扩增子的选择性扩增
技术领域
[0003] 序列表在此随说明书同时提交，该序列表以ASCII格式的文本文件通过EFS-Web提交，文件名为“序列表.txt”(“Sequence Listing.txt”)，创建日期是2016年2月23日，文件大小为5.11千字节。该通过EFS-Web提交的序列表是说明书的一部分，在此其全部内容通过引用结合在说明书中。
背景技术
[0004] 多重PCR由单一PCR混合物中的多个引物集组成，从而生成对不同DNA序列特异的扩增子。通过一次性靶向多个基因，可由单个测试轮次获得额外信息，否则需要若干倍的试剂和更多的时间才能完成。必须优化每个引物集的退化温度以在单个反应中正确地工作。已有用于多重PCR通用试剂的市售试剂盒。多重PCR技术已经被用于下一代测序(NGS)中的靶标富集，下一代测序是指高通量平行DNA测序技术。数百万乃至数十亿的DNA链可以同时测序，产生非常高的通量。
[0005] 扩增子漏码的一个主要原因是扩增中两个重叠扩增子之间短重叠区域的优先扩增。目前，为了扩增两个重叠DNA扩增子，特异性靶向每个扩增子的引物对完全被分离到不同的反应孔、反应管或反应微滴中。例如，BRCA1基因和BRCA2基因包含大型外显子，要求重叠DNA扩增子的PCR扩增确保100％的碱基覆盖度。离子增序(Ion AmpliSeq)BRCA1和BRCA2板(Panel)、凯杰人类基因读长(Qiagen GeneRead Human)BRCA1和BRCA2板(Panel)、和麦提普利卡姆(Multiplicom)BRCA主Dx(MASTR Dx)分别将引物对分离到3、4、5个引物池，这主要是由于没有能力去有效率地扩增重叠扩增子。然而，多个引物池显著地使工作流程变复杂，增加了测试的成本。飞雨科技(RainDance Technologies)通过将PCR引物分离成数以千计的微滴克服了这个问题，但要依靠特殊且昂贵的仪器。
[0006] 将所有用于两段重叠DNA区域的PCR引物结合到一个多重反应中，由两种正向引物和两种不同的反向引物的四种不同结合方式，得到了四种产物。图1示出一种常规PCR方法。这四种PCR产物(图1)是：两个靶扩增子(扩增子1和扩增子2)，一个横跨这两个靶扩增子整个区域的长扩增子(扩增子4_长)，以及一个仅仅包含这两个靶扩增子之间重叠区域的短扩增子(扩增子3_重叠)。采用常规的引物设计和PCR条件，在循环中，最长的扩增子(扩增子4_长)作为所有四个扩增子扩增的DNA模板，两个靶扩增子(扩增子1&2)中的每一个作为该扩增子自身和最短的扩增子(扩增子3_重叠)扩增的DNA模板。假设所有的扩增以100％的效率发生，PCR的n次循环，四种产物——扩增子1、扩增子2、扩增子4_长和扩增子3_重叠——的数量将分别是nx2n、nx2n、2n及n2x2n。最短的扩增子(扩增子3_重叠)的数量n倍高于两种靶扩增子(扩增子1&2)中每一种的数量；反过来，两种靶扩增子中每一种的数量n倍高于最长的扩增子(扩增子4_长)的数量。
附图说明
附图说明
[0007] 图1示出了一种传统的用于重叠靶片段扩增的多重PCR(现有技术)。
[0008] 图2示出了本发明的PCR第一轮的一个实施例，其是通过靶特异性引物的扩增。F1和R1是靶片段1的正向引物和反向引物，同时F2和R2是靶片段2的正向引物和反向引物。F2^是F2引物5’端部分的一段部分序列。标签寡聚体t1、t2、t3不与靶标结合。标签t2和t3可以共有相同的序列，而t1是不同的。1、2、3、4表示四个引物结合的扩增产物。F2和R1的短产物扩增子3的扩增被茎环结构的形成所抑制。
[0010] 图4示出了第一轮PCR之后扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果(实例1和实例2)。
[0011] 图5为用于实例3-实例6的基因特异性扩增子的示意图。CDS：基因中的蛋白质编码序列(coding sequence)区；ROI：感兴趣区(region of interest)。在本实施例中，ROI包括BRCA2基因外显子27的CDS加上外显子27的20bp上游和20bp下游(CDS±20bp)。
[0012] 图6示出了PCR第一轮(实例3)和第二轮(实例4)之后扩增产物的琼脂糖凝胶电泳结果。
[0013] 图7为示出了来自扩增子NGS结果(实例6)的覆盖度数据的图表。
发明内容
[0014] 定义
[0015] “扩增子”指一段DNA或RNA，其是天然或人工的扩增或复制事件的来源和/或产物。在本报文义中，“扩增”指遗传片段或靶序列的一个或多个拷贝的生成，具体而言是扩增子的生成。作为扩增反应的产物，扩增子可与诸如PCR产物的常用实验室术语互换使用。
[0016] “锁核酸”(LNATM)是一类高亲和力的RNA类似物，在其中通过亚甲基桥连接2’-O原子和4’-C原子将核糖环“锁定”，从而形成沃森-克里克结合的理想构象。这种修饰显著地提高了寡核苷酸的解链温度，而且对核酸酶也很有抵抗力(www.exiqon.com/lna-technology)。
[0017] “肽核酸”(PNAs)是核酸的合成同系物，在该同系物中，糖磷酸的多核苷酸主链被连接有核苷碱基的伪肽多聚物取代。因为PNA链是不带电的，因此PNA-DNA双链比起相应的DNA-DNA双链，将会有更高的解链温度。
[0018] “通用(PCR)引物”是非靶特异性引物，其与任何位于DNA插入序列两端侧的通用标签(非靶特异性标签，例如图2中的t1、t2和/或t3)杂交。使用通用引物的PCR可以扩展任何有其互补标签序列在侧的DNA插入片段。
[0019] 本申请的发明人发现了一种可扩展的多重PCR技术，SLIMAMPTM(Stem-Loop Inhibition-Mediated Amplification，茎环抑制-介导扩增)，它可以在一个管中平行扩增几十万个扩增子。这种新颖的多重PCR方法可以同时扩增重叠扩增子而没有常规的多重PCR中主要扩增短重叠核酸序列的缺点。本方法是一种靶标富集方法，富集靶扩增子的拷贝超过扩增子重叠区域的拷贝。
[0020] 本发明涉及一种选择性扩增具有重叠区域的靶核酸片段的方法，而不会主要扩增短重叠核酸序列。本发明允许所有引物在一个单一引物池中，而不引入任何附加的昂贵设备。
[0021] 本方法包括步骤：(a)获得第一核酸序列，其包括第一标签t2和与第一靶核酸片段(扩增子1)互补的第一正向引物F1，(t2F1)，(b)获得第二核酸序列，其包括第二标签t1和与第一靶核酸片段(扩增子1)互补的第一反向引物R1，(t1R1)，(c)获得第三核酸序列，其包括第二标签t1和与第二靶核酸片段(扩增子2)互补的第二正向引物F2，(t1F2)，(d)获得第四核酸序列，其包括第三标签t3和与第二靶核酸片段(扩增子2)互补的第二反向引物R2，(t3R2)，其中第一靶核酸片段和第二靶核酸片段具有重叠区域，(e)混合第一靶核酸片段、第二靶核酸片段、第一核酸序列、第二核酸序列、第三核酸序列、第四核酸序列、以及有效量的执行聚合酶链式反应(PCR)所必需的试剂；(f)通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(e)中的混合物至少循环两次，和(g)在高于步骤(f)中退火温度的退火温度下，通过PCR的变性、退火和引物延伸步骤对(f)中的混合物循环，以获得扩增产物。以上方法步骤描述了PCR循环的第一轮。
[0022] F1、R1、F2、R2是基因特异性引物，其与基因组DNA的特定区域互补。这些引物的长度可由本领域技术人员选择。通常，这些基因特异性引物的长度是6-40、10-50、10-40、10-100、20-40或20-50个核苷酸。
[0023] 标签t1和t2是两个不同的通用标签序列。标签t3可以具有和t2相同或不同的序列。标签寡聚体t1、t2、t3不与靶序列结合。每个标签处于每个基因特异性引物的5’端。
[0024] 本发明在图2中示出。图2是用于说明目的，并不意味着将本发明仅仅限于附图。如步骤(a)-(d)中描述的标签、正向引物、反向引物、靶核酸、扩增子的排列示出在图2的上部。图2显示了本发明的一个实施例，其中F2^是F2引物5’端部分的一段部分序列。在本发明的其它实施例中，在图2中，F2^用0个核苷酸(不存在)替代或者用F2(F2引物全长序列)替代。
[0025] 在步骤(f)中，核酸和试剂的混合物至少经历两次PCR循环的变性、退火和引物延伸步骤，比如2-5次或2-10次，该PCR循环在本领域技术人员可知晓的标准PCR温度或条件下进行。在最初的第一次PCR循环中，形成了只在一端带标签的扩增子。在第二PCR循环中，该一端带标签的扩增子接着用作其它带标签的引物的模板以形成两端带标签的扩增子。步骤(f)示出在图2的中间部分，其中，在最初的循环之后，形成了扩增子1(F1+R1)、扩增子2(F2+R2)、扩增子4_长(F1+R2)和扩增子3_重叠(F2+R1)。在至少两次PCR的循环之后，在两端均带有标签序列的完整扩增子形成了，并且准备进入步骤(g)中退火温度升高的下一轮PCR循环。
[0026] 在步骤(g)中，(f)中的混合物经历更多次PCR循环的变性、退火和引物延伸；此次是在高于步骤(f)中退火温度的退火温度下，这是本发明的一个重要特征。退火温度升高是为了防止最短的扩增子(扩增子3_重叠)被主要扩增。
[0027] 如果退火温度不升高(像在常规PCR方法中一样)，所有扩增以常规方式进行，其中扩增子1、2和4_长都会用作短扩增子(扩增子3_重叠)扩增的模板；这是因为扩增子1、2和4_长都包含扩增子3_重叠的正向引物和反向引物的基因特异性部分。假设所有的扩增子具有相同的扩增效率，作为扩增(不升高退火温度)的结果，最短扩增子(扩增子3_重叠)的数量是n2x2n，n倍高于两种靶扩增子中每一种的数量(扩增子1&2，nx2n)。在实践中，观察到扩增效率受到扩增子长度的影响，其中更短的扩增子与更高的扩增效率相关(Mallona I，et al，BMC Bioinformatics 2011，12：404)，因此，更短的扩增子甚至更利于扩增。
[0028] 在本发明的步骤(g)中，退火温度升高，因此，一个成功的引物-模板杂交不仅需要引物的基因特异性部分，而且需要标签部分。当退火温度升高，扩增子1、2和4_长不能再用作短扩增子(扩增子3_重叠)扩增的模板，只有该短扩增子自身(扩增子3_重叠)可以用作其自身的模板。本发明以(i)最初至少两次PCR循环之后升高的退火温度，以及(ii)与每个扩增子相关联的标签(t1、t2、t3)的合理安排为特征，特别是，F2引物和R1引物带有相同的标签t1；如此特征的结果是理论上产生的所有扩增子的拷贝都是2n个，因为每个扩增子在它的扩增中都只能用它自己的扩增子作为模板。这已经是超过常规方法的改进，在常规方法中扩增子3(短重叠)会产生n倍高于靶扩增子的数量。在实践中，更短的扩增子通常比更长的扩增子更有效地扩增。
[0029] 在步骤(g)中，退火温度至少比步骤(f)中的退火温度高2℃。例如，该退火温度比步骤(f)中的基因特异性退火温度高大约2-35℃、4-35℃、5-25℃、6-20℃、6-15℃。在步骤(g)中，PCR循环重复至少2次，例如2-50次，优选2-5、5-10、10-30、10-40或10-50次。
[0030] 当引物序列与模板100％匹配时，任何附加的碱基都可以增加引物的解链温度。在本发明中，标签序列至少是2个或3个核苷酸长度，以及可以是5-100、3-40、10-30、10-40、10-50个核苷酸长度。优选地，标签被设计为将基因特异性不带标签的引物的解链温度增加至少5℃(例如5-10℃或5-15℃)。在PCR最初最小的两个循环后，标签序列为循环条件提供了更高的退火温度。标签序列可以是修饰的或未修饰的核酸。一些修饰的碱基(例如LNA或PNA)比它们相对应的天然碱基具有更高的退火温度。当因为各种原因而需要更短的标签序列时，那些修饰的碱基可以用来代替天然碱基。
[0031] 在本发明的一个实施例中，在扩增子3两端的标签t1序列的Tm(解链温度)足够高以形成牢固的t1-茎，其可以防止引物t1F2与扩增子3模板的杂交，并且抑制扩增子3进一步的指数扩增。为了抑制引物t1F2与扩增子3模板的结合，扩增子3端部t1-茎的Tm与单独t1F2寡核苷酸的Tm相比，应该是相同或更高。扩增子两端t1-茎的解链和杂交遵循分子内动力学，并且比那些常规分子间寡核苷酸双螺旋反应更有利。因此，相同两个短互补寡核苷酸序列(例如2到100个核苷酸)当他们在分子内通过非互补环连接形成茎时，具有比相同的两个互补寡核苷酸序列形成线性双螺旋的Tm高得多的Tm。另外，茎的Tm不仅受茎序列也受环长度(对应于重叠区域)的影响。相比小环尺寸(例如2-200、5-200或10-100个核苷酸)，大环尺寸(例如大于500个核苷酸，比如500-1000或500-1500个核苷酸)降低了茎杂交率，这可能是由于更大的环的端部接触的概率降低，并且类似于常规分子间DNA双螺旋形成的动力学。
[0032] 在一个实施例中，第二核酸序列可选地进一步包括在第二标签(t1)和第一反向引物(R1)之间的从第二正向引物(F2)的5’端连续的完全序列(F2)或部分序列(F2^)。在图2中示出了引物t1F2^R1这个可选实施例。依F2的长度，在一个实施例中，部分序列F＾比F2短1-50、1-20、1-10或1-5个核苷酸。例如，部分序列F2^可以是2-40、4-40、8-40、8-30或8-20个核苷酸。在另一实施例中，部分序列F2＾包括F2序列的10-50、10-90、20-80、30-70、40-90或50-
90％。
90％。
[0033] 如图2下部所示，在步骤(g)之后，扩增子1(F1+R1)、扩增子2(F2+R2)和扩增子4_长(F1+R2)通过PCR指数增长，同时扩增子3_重叠(F2+R1)的扩增被抑制。这是因为F2引物和R1引物带有同样的标签t1，因此在合适长度的F2^存在的情况下，包含t1和F2^序列的强茎环结构形成了并且防止了引物t1F2和扩增子3模板的杂交，抑制了扩增子3的进一步指数扩增。能够形成强茎环结构的F2^的合适长度可以依标签t1的Tm而不同。图2示出了t1和F2^形成的茎环结构，这是一个优选的实施例。如上文描述，在另一实施例中，在扩增子3两端的标签t1序列的Tm是足够高以形成牢固的t1-茎，并且不需要F2^的存在。
[0034] 在本发明的另一实施例中，如上文描述的第一轮PCR之后的上述扩增产物，用第一轮中与t1和t2结合的通用引物，进一步通过PCR扩增的第二轮被扩增。在这个实施例中，在PCR的第一轮中t3需要与t2相同。PCR第二轮包括步骤：(h)将来自(g)的处理或未处理的扩增产物，连同分别和t1、t2结合的第一通用PCR引物和第二通用PCR引物，以及有效量的执行PCR所必需的试剂相混合，其中两种通用PCR引物都不包含与第一和第二靶特异性核酸序列互补的序列；以及(i)在本领域技术人员知晓的标准PCR温度和条件下，通过PCR的变性、退火和引物扩增步骤对(h)中的混合物循环以获得第二扩增产物。
[0035] 载步骤(i)中，PCR循环重复至少2次，例如5-50次，优选2-5、5-10、10-30、10-40或10-50次。
[0036] 在PCR的第二轮中，短重叠扩增子3_重叠和长扩增子4_长进一步被抑制，因为它们的结合位点被扩增子3_短两端的t1和扩增子4两端的t2形成的强茎所限制。因此，第一和第二靶核酸扩增子(扩增子1和2)的扩增在PCR的第二轮中占优势。最终产物可以用于不同的目的，比如下一代测序(NGS)。
[0037] 在PCR的第二轮中，PCR第一轮(g)中的产物可选地在步骤(i)之前被预先处理，例如稀释、单链核酸外切酶消化、纯化或适配子连接。
[0038] 下述的实例进一步阐述了本发明。这些实例只是为了说明并且不被解释为限制本发明。实施例
[0039] 表1和图3示出了人类基因组hg19中扩增子1-4的尺寸和位置。扩增子3是扩增子1和2之间的重叠区。扩增子4是扩增子1和2的序列都覆盖的长扩增子。
[0040] 表1
[0041]
[0042] 表2示出了实例1、实例2和图4所用的寡核苷酸序列
[0043] SEQ ID NO：1-4是不带标签序列的BRCA2扩增子1和扩增子2的基因特异性引物。SEQ ID NO：5-6是来自亿明达公司(Illumina)的TSCA标签的标签序列。SEQ ID NO：7-16是用于实例试验的带有标签的引物。
[0044] SEQ ID NO：7只用于标准多重PCR(图4，泳道3)。SEQ ID NO：8-14用于本发明(泳道4-8)。SEQ ID NO：15-16用于标准多重PCR和本发明(泳道3-8)。
[0045] 通过寡核苷酸分析仪(OligoAnalyzer)3.1(IDTDNA)用1.5mM浓度的Mg+2评估Tm。
[0046] 表2
[0047]
[0048] *小写表示标签序列；下划线表示R1中插入的部分F2序列；未标记的大写序列是基因特异序列.N/A：不适用.FWD：正向.REV：反向
[0049] 表3示出了实例1和实例2中的引物混合信息。
[0050] 表3
[0051]
[0052] *包括以相同的体积比混合的单独扩增中的每一单重产物
[0053] 实例1：第一轮PCR扩增(基因特异性引物)
[0054] 一个代表性的25μL PCR混合物包括以下组份：
[0055] 12.5μL的2x多重主混合物(卡帕生物系统公司(KAPA Biosystems)，目录号KK5802)，2μL人基因组DNA(普洛麦格公司(Promega)，目录号G3041)使用低TE缓冲液(USB公司，目录号75793)稀释至5ng/μL，6.5μL无核酸酶水，以及4μL的基因特异性引物混合物(各1.25μM，参见表3中多重引物混合泳道3-8)。
[0056] 单重(图4，泳道2)PCR、标准多重(图4，泳道3)PCR以及茎-形成多重(图4，泳道4-8)PCR均如下所述在热循环仪上进行：
[0057]
[0058]
[0059] 实例2：琼脂糖凝胶电泳
[0060] 在E-Base设备(生命科学技术公司(Life Technologies))上分析来自实例1的产物。将2μL的产物用无核酸酶水稀释至20μL，并加载至2％尺寸选择(SizeSelect)E-凝胶(E-gel)上。对稀释的PCR产物(泳道2-8)和1Kb加的DNA梯状条带(英杰公司(Invitrogen)目录号10488-090，泳道1)进行DNA凝胶电泳，并且在运行的末端，通过E-凝胶成像仪(E-gel Imager)(生命科学技术公司)捕获凝胶的数字图像。结果示于图4。
[0061] 在图4的泳道2中，来自实例1中的单重反应的产物被等量混合并且可以在凝胶中被一起看到，标出为扩增子1和2。标准多重PCR主要产生扩增子3(泳道3)，是扩增自扩增子1和扩增子2重叠区的PCR产物。扩增子4，为扩增子1和扩增子2所覆盖的整个区域，可以在泳道3中模糊地看到。仅包括t1茎寡核苷酸的泳道4和包括t1加部分F2(自5’端，4个核苷酸)的泳道5示出了相似图案，分别具有三个可检测的带：扩增子1、2和3。在泳道6-8中，所有的扩增子1、2、3都可以看到，但是相对于泳道3-5扩增子3显著减少。
[0062] 表4和图5示出了实例3-6中所用的人类基因组hg19靶BRCA2外显子27(B2X27)的扩增子尺寸和位置。
[0063] 表4
[0064]
[0065] 表5示出了实例3、4、5和6中所用的用于BRCA2(B2)外显子27(X27)扩增的寡核苷酸序列。
[0066] 表5
[0067]
[0068] *小写表示标签序列；下划线表示来自下一扩增子的插入部分正向引物序列；未标记的大写序列是基因特异性序列。
[0069] 实例3：BRCA2外显子27(B2X27)的基因特异性PCR扩增的第一轮
[0070] 一个代表性的25μL PCR混合物包括以下组份：
[0071] 12.5μL的2x多重主混合物(卡帕生物系统公司，目录号KK5802)，6μL DNA(卡瑞尔公司(Coriell)，目录号NA19240或NA14622)使用低TE缓冲液(IDT公司，目录号11-05-01-09)稀释至5ng/μL，2.5μL无核酸酶水，以及4μL的基因特异性引物混合物(各1.25μM)。
[0072] 常规的引物混合物包括来自表5的下述六种寡核苷酸：SEQ ID NO：17和18(B2X27扩增子1)、19和20(B2X27扩增子2)、以及21和22(B2X27扩增子3)。SLIMAMPTM引物混合物(本发明)包括下述六种寡核苷酸：17和23(B2X27扩增子1)、24和25(B2X27扩增子2)、以及21和22(B2X27扩增子3)。
[0073] 标准多重PCR和茎-形成多重PCR如下所述在热循环仪上进行：
[0074]
[0075] 实例4：第二轮PCR扩增(通用引物)和纯化
[0076] 实例3中的基因特异性产物被稀释了1000倍。一个代表性的25μL PCR混合物包括以下组份：2.5μL 10x反应缓冲液、0.5μL dNTPs、0.25μL酶(罗氏公司(Roche)，目录号12140314001)、2μL来自实例3的稀释产物、2μL亿明达公司的索引正向引物、2μL亿明达公司的索引反向引物(25μM引物原种，来自真序自定义扩增子索引试剂盒(TruSeq Custom Amplicon Index Kit)，目录号FC-130-1003)和15.75μL无核酸酶水。
[0077] PCR扩增如下进行：
[0078]
[0079] 通过加入18μL亚仁考特AM纯XP磁珠(Agencourt AMPure XP beads)(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，目录号A63881)、将磁珠与上清液分离、丢弃上清液来纯化产物。用70％的乙醇洗涤两次来洗涤磁珠，并且用32μL无核酸酶水从磁珠中洗脱产物。接下来用2μL的产物稀释于198μL量子位高灵敏度(Qubit High Sensitivity)缓冲液(英杰公司(Invitrogen)，产品目录Q32854)来定容产物的浓度。
[0080] 实例5：琼脂糖凝胶电泳
[0081] 在E-Base设备(生命科学技术公司)上分析来自实例3和实例4的产物。将2μL的产物用无核酸酶水稀释至20μL，并加载至2％尺寸选择(SizeSelect)E-凝胶(E-gel)上。对稀释的PCR产物和50bp的DNA梯状条带(英杰公司(Invitrogen)目录号10488-043)进行DNA凝胶电泳。在运行的末端，通过E-凝胶成像仪(E-gel Imager)(生命科学技术公司)捕获凝胶的数字图像。结果示于图6。
[0082] 图6中的泳道1-4示出来自实例3的产物(第一轮PCR产物)。泳道1和2显示了常规多重PCR的产物。扩增子1和扩增子2以及扩增子2和扩增子3重叠区的小扩增子，随同扩增子1-3产生。另一方面，加载于泳道3和泳道4的SLIMAMPTM反应主要产生扩增子1-3，而几乎不产生重叠扩增子。
[0083] 图6中的泳道5-8示出来自实例4的产物(第二轮PCR产物)，是通用PCR和磁珠清洁之后的产物。在实例4中(泳道5-8)，扩增子是带有标签的并且进一步扩增，当与泳道1-4相比时显示了核苷酸尺寸的增加。最初经历常规多重PCR的样本主要产生不想要的短重叠扩增子(泳道5-6)，而SLIMAMPTM样本(本发明)只包括靶扩增子1-3(泳道7-8)。
[0084] 实例6：NGS文库标准化和测序
[0085] 实例4中的每一产品都用含0.1％吐温20的10mMTris-HCl(特诺瓦公司(Teknova)，目录号T7724)标准化为4mM。来自实例4的所有标准化产品等体积(各3μL)混合以产生文库混合物。5μL的文库混合物加入到5μL 0.2N的NaOH中以使文库变性。20pM的文库用采用HTl缓冲液制备，加载，并且以250bp的双末端读长的长度进行测序(亿明达公司，产品目录MS-102-2003)。接下来通过BWA-MEM每个样本产生的Fastq格式的测序读长与参考基因组hg19比对。合并双末端读长并且分析每个扩增子区域的覆盖。图7示出了覆盖信息。
[0086] 图7描述了在每个样本中归因于每个扩增子的NGS读长的百分比。在常规多重PCR中，由于它们小得多的尺寸(60及82bp)，重叠扩增子比靶扩增子更有效扩增，并且占总NGS读长的78％。在SLIMAMPTM样本中，所有不想要的重叠扩增子被抑制到在NGS中检测出的比例接近0％的程度。关于在常规样本和SLIMAMPTM样本中的靶扩增子，如期望的，扩增子1(267bp)具有比扩增子2(324bp)和扩增子3(348bp)都要高的百分比，因为更小的尺寸(扩增子1)显著地更有效扩增。
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