一种复合核酸靶分子扩增的方法
专利汇可以提供一种复合核酸靶分子扩增的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种复合核酸靶分子扩增的方法,包括使样品中核酸分子 片段 化,并对片段化所得的分子链进行末端延伸,然后在引物的作用下进行PCR扩增,其特征是PCR反应中使用的引物是对延伸所得的序列具有专一性的引物和对靶分子原序列具有专一性的引物,所述的末端延伸通过末端转移酶反应或连接酶反应或聚合酶反应或这些反应的组合而实现。本 发明 的优点是减少了专一性引物的使用,降低了反应成本,并可减少非特异性产物的形成。，下面是一种复合核酸靶分子扩增的方法专利的具体信息内容。
本发明涉及一种复合核酸靶分子扩增的方法。
核酸包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)，核酸为链状结构， 其基本单位是核苷酸，由少量(2-100个)核苷酸组成的核酸称为寡聚核苷 酸，由大量(100个以上)核苷酸组成的核酸为多聚核苷酸，核苷酸的特性 决定于其碱基。DNA中的四种碱基分别由A、C、G、T表示，RNA中的四 种碱基分别由A、C、G、U表示。核酸中的碱基A与T(或U)配对(互补)， G与C配对(互补)，有连续碱基配对的核酸链能结合(杂交)为双链结构。 从自然界提取的DNA一般为双链结构，双链核酸结构在高温(如90℃-100 ℃)下会裂变(变性)成单链核酸分子。当一短小的寡聚核苷酸分子与一较 长的单链多聚核苷酸分子杂交后，这一寡聚核苷酸分子可作为引物以多聚核 苷酸分子为模板，在聚合酶(Polymerase)的作用下，根据碱基配对原理复 制出一条互补的多聚核苷酸分子链。如一寡聚核苷酸与一核酸链有相同或相 互补的序列，则这一寡聚核苷酸对这一核酸链具有专一性或特异性。利用如 上原理可进行核酸(多聚核苷酸)的复制或扩增。常用的DNA扩增方法采用 聚合酶链反应(PCR)，一典型的PCR是由两个特异性(专一性)的寡聚核苷 酸(引物)分别与互补的两条靶分子链(分别称上链和下链)杂交。与上链 (左端为5’端，右端为3’端)有共同序列的引物为5’端引物，与上链有 互补序列的引物为3’端引物。据此5’端引物可以下链为模板在聚合酶的作 用下复制出上链，同理3’端引物会以上链为模板复制出下链。反复此一变 性→杂交→复制过程可得到大量的靶分子。进行高通量的核酸靶分子检测可 用基因芯片进行，一般基因芯片上置有大量的单链核酸探针，它们可识别相 应的核酸靶分子。从生物体中提取的DNA分子一般为双链的大分子结构，由 数千个以上的碱基单位组成。用物理方法(如超声波)或生物化学方法如脱 氧核糖核酸酶(DNase)，可使DNA降解为短小的分子片段，这一由大分子转 化为多个小分子的过程叫片段化。在适当的条件下连接酶(Ligase)可把其 它DNA片段与靶分子连接在一起达到末端延伸和修饰的目的。DNA靶分子片 段也可在末端转移酶(TdT)的作用下使核酸3’末端延伸。此外在适当的模 板存在下，DNA分子也可由聚合酶进行末端修饰和延伸。现已知人类基因组 的某些碱基位点在不同个体之间常有差异，这种高频率的单碱基置换称为单 碱基位点多态性(SNP)。对个体SNP位点进行碱基特征的检验是对这一个体 进行基因型的测定，这在医学临床诊断和科学研究中有重要价值。由于SNP 位点在人类基因组中的数量多而且是分散的，所以对一个体进行基因型测定 (如用基因芯片方法)，需对大量的与SNP位点相关的脱氧核糖核酸片段进行 扩增或富集。用PCR对多个与SNP相关的靶分子进行扩增(复合核酸靶分子 扩增)时，需要大量的引物，因而在实际应用中成本很高。此外在同一容器 中对多个核酸靶分子进行扩增时，引物之间会相互杂交和复制，产生大量的 非靶分子，因而会抑制靶分子的扩增。
本发明的目的是提供一种复合核酸靶分子扩增的方法，它能弥补现有技 术的上述不足。
一种复合核酸靶分子扩增的方法，包括使样品中核酸分子片段化，并对 片段化所得的分子链进行末端延伸，然后在引物的作用下进行PCR扩增，其 特征是PCR反应中使用的引物是对延伸所得的序列具有专一性的引物和对靶 分子原序列具有专一性的引物，所述的末端延伸通过末端转移酶反应或连接 酶反应或聚合酶反应或这些反应的组合而实现。
本发明的优点是在复合PCR反应中，对每一把分子的扩增都使用一个对 原序列有专一性的引物，因而减少了专一性引物的使用，降低了反应成本， 并可减少非特异性产物的形成。
下面通过实施例说明本发明。
对一病人DNA样品中的100个SNP靶序列进行扩增，扩增前把DNA 样品随机地切成平均200碱基长的片段，然后用末端转移酶(TdT)在DNA 链的3’末端延伸10-50个A碱基，再使这些修饰后的DNA链与一引物杂交， 这一引物的3’端部分具有含20个T碱基的序列，它与延伸所得的序列相互补， 5’端部分为T3启动子序列。杂交后用聚合酶将靶分子链作进一步修饰，复制 出T3启动子互补序列，同时用引物复制出上述DNA片段的互补链。把经修 饰后和复制所得的DNA分子链用于PCR反应使之扩增，扩增时所用的3’端 引物为T3引物，所用的5’端引物是分别对100个SNP专一的引物，它们的3’ 端部分(15-30碱基)具有对靶分子专一的序列，其5’端部分具有相同的序列 (T7启动子序列)。这5’端T7序列可以抑制非特异性产物的形成。PCR后， 对产物进行末端标记，然后使这些标记的PCR产物与相应的SNP基因芯片 进行分子杂交，再经信号分析后而确定这一病人的DNA在这100个SNP位 点的基因型。PCR扩增后的产物也可用转录的方法产生标记的RNA，然后使 标记的RNA与基因芯片上的核酸探针杂交。DNA的标记也可在PCR中实现， 如用标记的引物或标记的核苷酸，所得的标记的DNA与基因芯片上的核酸探 针杂交。
本实施例中对DNA片段进行末端延伸是用末端转移酶反应和聚合酶反 应，也可单独通过连接酶反应或末端转移酶反应或聚合酶反应或这些反应的 组合而实现。
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