技术领域
[0001] 本
发明涉及一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒,特别涉及一种不依赖于高能
能量分子的恒温扩增技术。
背景技术
[0002] 阴道炎是妇产科患者最常见
疾病,每年约有500~1000万女性罹患此病,而75%的妇女在一生中至少患病1次。传统的阴道炎诊断方法主要依赖于患者主诉、阴道检查以及实验
室检查。阴道炎的症状缺乏特异性,因此在缺乏实验室确诊依据时,依据患者主诉和其他检
查难以确诊。多数阴道炎患者即使反复感染,依然无法确认发病原因,且阴道炎患者多为混
合感染,因此阴道炎的确诊十分困难。阴道炎最常见类型为细菌性阴道炎、
真菌性阴道炎和
滴虫性阴道炎,三者约占所有阴道炎的80%~90%。细菌性阴道炎(BV)是一种由阴道加特纳菌
和一些压
氧菌的混合感染,导致阴道内微生态平衡失调,引起的阴道分泌物增多,白带有鱼
腥臭味及外阴
瘙痒灼热的综合征。可分为嗜血杆菌性阴道炎、棒状杆菌阴道炎、压氧菌性阴
道病炎、加特纳菌性阴道炎等。本病也可通过性
接触传染,在性关系混乱的人群中发病率较
高。念珠菌性阴道炎也称霉菌性阴道炎,是由念珠菌感染引起。其发病率仅次于细菌性阴道
病。念珠菌性阴道炎多见于幼女、孕妇、糖尿病患者,以及绝经后曾用较大剂量雌
激素治疗的患者。滴虫性阴道炎是由毛滴虫引起,寄生人体的毛滴虫有阴道毛滴虫、人毛滴虫和
口腔毛滴虫,分别寄生于泌尿生殖系统、肠道和口腔,与
皮肤病有关的是阴道毛滴虫,引起滴虫
性阴道炎。
[0003] 长期阴道炎可能导致不孕;影响日常生活的
质量;会影响到
胎儿的发育,导致早产或者流产;诱发其他疾病,如生殖器感染,盆腔炎、子宫内膜炎、夫妻生活痛等;所以及时检
测及定期检测阴道炎致病病原体具有
预防和治疗的积极意义。基于病原体DNA直接进行检
测,相比涂片敏感性大大提高,可以极大提升阳性检出率。
[0004] 阴道炎致病病原体DNA的检测常用到传统PCR技术,检测程序需要设置多个循环,每个循环包括核酸的变性、
退火、延伸,这导致PCR 在技术应用上有几点限制:第一,PCR 技
术需要昂贵的实验室仪器,同时仪器要具备精细的
温度控制程序和加热模板,从而实现很
高的温度下的 DNA 模板链的变性,较低的温度下引物探针退火延伸模板,这样重复温度变
化几十个循环之后实现模板量的放大。由于每一个循环时间都较短,仪器必须能快速准确
升降温度,这就需要
银制或金制的加热模
块,增加了仪器研制的成本。第二,PCR 扩增体系
中的聚合酶必须具有耐受高温的能
力,否则必须在每一个循环中重新加入新酶,以实现下
一循环的扩增,这样极容易造成污染也加大了成本。第三,在 PCR 循环中,每一个循环引物
退火的时间都很短(几秒到十几秒)这就要求引物必须快速找到模板上同源匹配的区段,以
实现延伸。这就要求 PCR 体系必须有过量的 PCR 引物。过量的引物会与模板错配,错误引
发扩增,引物二聚体等等,进而抑制 PCR 扩增,特别是在模板量低的情况,会使这种情况加
剧。
[0005] 本发明恒温扩增技术主要利用重组酶的活性,不进行核酸解链和退火即可在恒温条件下(如37℃)进行核酸的扩增,与传统的PCR技术相比,因此不需要昂贵的仪器,也避免
了高温对酶的损耗。同时恒温扩增技术在体系中不需要加入过量的引物,降低了引物与模
板错配或生成引物二聚体的可能性。另外,恒温扩增体系有多重工具酶匹配进行有效扩增,
扩增效率远远高于传统PCR技术,所用时间更短,最短可以在5min内实现。最后,相对于目前
其他恒温扩增技术平台相比,本发明所用的重组酶依赖扩增技术平台是新一代核酸检测的
利器,在检测的时效性,便捷性和技术参数等多个方面都优于其它恒温扩增技术平台,通过
试剂的有效匹配,甚至可以在人体腋下进行扩增反应。在该技术平台上,除了可以开发基于
小型便携式设备用于医疗检测机构如医院急诊科、妇产科、
手术室;社区服务中心和
基层医
疗机构;检验检疫疾病防控机构的
分子诊断产品,还可以开发出适合家庭使用的分子诊断
产品,使我国不同区域即便存在经济条件参差不齐的情况下,也可以展开全国性病毒性疾
病、
肿瘤和遗传性疾病的定期和快速普查。这是一个非常巨大的潜在市场,其经济价值和社
会效益不可估量。当前我们已经开发适用于医疗机构和家庭使用的HIV检测产品和
宫颈癌
HPV检测产品。随着平台的不断成熟,可进一步拓展到
食品安全、检验检疫、防恐等多个领
域。
[0006] 本发明阴道炎病原体基因即时检测试剂盒将恒温扩增技术应用到阴道炎病原微
生物的检测上,缩短了反应时间,降低了体系对反应条件的要求,大大地提高了检测的效
率,也不需要人为主观判读结果,同时检测结果不受混合感染的干扰,因此能更准确的提示
混合感染的类型,非常有利于临床的快速诊断和对症治疗。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于提供一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒,包括反应液,启动液,反应酶系,阴道炎病原体特异性引物及探针。
[0008] 阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应液的具体组分如下:品名 浓度(摩尔浓度/质量分数/质量浓度)
Tris-HCl 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜
碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
作为上述反应液的进一步改进,Tris-HCl的pH为7.0~9.0,优选pH为8.3。
[0009]阴道炎病原体基因即时检测试剂盒启动液的具体组分如下:
品名 摩尔浓度
氯化镁 5mM~20mM
作为上述启动液的进一步改进,氯化镁的优选浓度为10mM。
[0010]阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应酶系的具体组分如下:
品名 浓度(摩尔浓度/酶浓度/质量浓度)
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 100ng/ul
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶(E.coli RecT) 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
作为上述反应酶系的进一步改进,重组酶选自E.coli RecT蛋白;λ
噬菌体β蛋白;
啤酒酵母SepΙ/STPβ;
啤酒酵母DPA蛋白;啤酒酵母STPα蛋白;粟酒裂殖酵母p140/Exoǁ蛋白以及
RrpΙ、HPP-Ι、v-SEP、ICP8蛋白。
[0011]阴道炎病原体基因即时检测试剂盒特异性引物及探针序列如下:
上游引物1 GTTCTGAATTTGAATGTGGTATGGGTAGGCTTG(SEQ ID NO:1)
下游引物1 AGACAAACAGGTTATATATGAGTTTGAGACCA(SEQ ID NO:2)
荧光探针1 TACAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAACAG(FAM-dt)TC (dSpacer) AT (BHQ-dT)TTTTATATTCCTTCCTAG(SEQ ID NO:3)上游引物2 CCGGCTCCATTTTGGTGGAGTCGCTTGATCGTTTTG(SEQ ID NO:4)
下游引物2 CCCGTCACGTCCTTCATCGGTCCTGTCTA(SEQ ID NO:5)
荧光探针2 TATTATGTCTAGAGAGTTAAGCGATAGGC(FAM-dt)TT(dSpacer)TT(BHQ-dT) ACTGGTGTATCACTGTAAGG(SEQ ID NO:6)上游引物3 TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC(SEQ ID NO:7)
下游引物3 ACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGC(SEQ ID NO:8)
荧光探针3 TCTCGATGAGAACGCAGCGAAA(FAM-dt)TG(dSpacer)GAT(BHQ-dT)ACG TAATRTAATTGCA(SEQ ID NO:9)作为本发明方法的进一步改进,恒温扩增的温度为35~42℃,优选扩增温度为37℃。
[0012]本发明的有益效果:
本发明的恒温扩增体系,不依赖于ATP、
磷酸肌酸等高能能量分子,相对现有的恒温扩
增体系,其组成更为简单,成本更为低廉,使用更为方便。
[0013] 本发明的恒温扩增体系适用于复杂模板的扩增,扩增速度快且稳定,可以在15 min以内完成扩增反应,扩增的灵敏度和准确性高,不易出现错配,扩增效果好。
[0014] 本发明的恒温扩增体系使用荧光实时定量技术,应用范围更广,适用于市面上大多数荧光定量扩增仪。
[0015] 本发明同时检测3种阴道炎常见的致病病原体,其中念珠菌属检测包括6种常见致病念珠菌种:白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠
菌。对比常规检测的培养方法,时间更短,灵敏度高受培养条件限制少,人为误操作几率低。
[0016]
附图说明:图1至图9依次分别为
实施例1至实施例9的荧光结果图,图中荧光曲线的标号对应实施
例中反应管的标号。
[0017]
具体实施方式
[0018] 一种阴道炎病原体基因即时检测试剂盒,采用了一种不依赖于高能能量分子的恒温扩增技术。试剂盒成分包括反应液,启动液,反应酶系,阴道炎病原体特异性引物及探针,
各成分的具体组分如下:
阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应液的具体组分如下:
品名 浓度(摩尔浓度/质量分数/质量浓度)
Tris-HCl(pH8.3) 50mM
KCl 60mM
二硫苏糖醇 2mM
甜菜碱 1M
海藻糖 5.5%
PEG 5.5%
BSA 0.1mg/mL
阴道炎病原体基因即时检测试剂盒启动液的具体组分如下:
品名 摩尔浓度
氯化镁 10mM
阴道炎病原体基因即时检测试剂盒反应酶系的具体组分如下:
品名 浓度(摩尔浓度/酶浓度/质量浓度)
dNTPs 200uM
聚合酶Bsu 100ng/ul
单链结合蛋白 262ng/ul
重组酶(E.coli RecT) 360ng/ul
上游引物 200nM
下游引物 200nM
阴道炎病原体基因即时检测试剂盒特异性引物及探针序列如下:
上游引物1 GTTCTGAATTTGAATGTGGTATGGGTAGGCTTG(SEQ ID NO:1)
下游引物1 AGACAAACAGGTTATATATGAGTTTGAGACCA(SEQ ID NO:2)
荧光探针1 TACAGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGCAACAG(FAM-dt)TC (dSpacer) AT (BHQ-dT)TTTTATATTCCTTCCTAG(SEQ ID NO:3)上游引物2 CCGGCTCCATTTTGGTGGAGTCGCTTGATCGTTTTG(SEQ ID NO:4)
下游引物2 CCCGTCACGTCCTTCATCGGTCCTGTCTA(SEQ ID NO:5)
荧光探针2 TATTATGTCTAGAGAGTTAAGCGATAGGC(FAM-dt)TT(dSpacer)TT(BHQ-dT) ACTGGTGTATCACTGTAAGG(SEQ ID NO:6)上游引物3 TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC(SEQ ID NO:7)
下游引物3 ACACGCAGCCCTGCTCACGCAGATGGCAACGGC(SEQ ID NO:8)
荧光探针3 TCTCGATGAGAACGCAGCGAAA(FAM-dt)TG(dSpacer)GAT(BHQ-dT)ACG TAATRTAATTGCA(SEQ ID NO:9)下面结合具体的实验,进一步说明阴道炎病原体基因即时检测试剂盒的优势,但并非
限制本发明。
[0019] 实验样本来源:以阴道炎患者阴道分泌物中分离的阴道滴虫、阴道加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠
菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌经提取得到的核
酸溶液作为样本;
以混合感染阴道滴虫-阴道加德纳菌、阴道滴虫-白色念珠菌、阴道加德纳菌-白色念珠
菌的患者阴道分泌物提取得到的核酸溶液作为混合感染样本;
以外购金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体菌株经提取得
到的核酸溶液作为特异性实验的样本;
以正常人阴道分泌物提取物为阴性对照样本。
[0020] 实施例1(8种阴道炎常见的致病病原体的检测):取11个200ul反应管,分别标记为反应管1~11。在反应管1~11中分别加入20ul反应液、
5ul反应酶系;在反应管1、2中加入上游引物1(200nM)、下游引物1(200nM)、荧光探针1
(150nM);在反应管3、4中加入上游引物2(200nM)、下游引物2(200nM)、荧光探针2(150nM);
在反应管5~11中加入上游引物3(200nM)、下游引物3(200nM)、荧光探针3(150nM)。在反应管
1中加入阴道滴虫样本2ul,反应管3中加入阴道加德纳菌样本2ul、反应管5~10分别加入白
色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌样本2ul,反应
管2,、4、11都分别加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌
水补足体系到45ul,振荡混匀
后各管再分别加入5ul启动液(各管的终体积为50ul)。
[0021] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光。
[0022]实施例2(非最优扩增温度条件的检测):
同实施例1,不同处在于上机条件改为:35℃,30s,30个循环,每个循环都收集荧光。结
果如图2。
[0023]实施例3(非最优扩增温度条件的检测):
同实施例1,不同处在于上机条件改为:42℃,30s,30个循环,每个循环都收集荧光。结
果如图3。
[0024]实施例4(特异性实验):
按照实施例1配制体系34管,分别标记1~31反应管。在1~13反应管的体系中加入上游引
物1(200nM)、下游引物1(200nM)、荧光探针1(150nM);在14~26反应管的体系中加入上游引
物2(200nM)、下游引物2(200nM)、荧光探针2(150nM;在27~34反应管的体系中加入上游引物
3(200nM)、下游引物3(200nM)、荧光探针3(150nM)。在1~13号反应管中按顺序分别加入阴道
滴虫、加德纳菌、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念
珠菌、金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体样本2ul;在14~26号
反应管中按顺序分别加入加德纳菌、阴道滴虫、白色念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热
带念珠菌、克柔念珠菌、乳酒念珠菌、金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆
菌、支原体的样本2ul;在27~34号反应管中按顺序分别加入白色念珠菌、阴道滴虫、加德纳
菌、金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体样本2ul。各反应管均用
灭菌水补足体系到45ul,振荡混匀后各管再分别加入5ul启动液(各管的终体积为50ul)。
[0025] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光,结果如图4。
[0026]实施例5(阴道滴虫重复性实验):
按实施例1配制体系6管,分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物1(200nM)、
下游引物1(200nM)、荧光探针1(150nM)。在反应管1~3中均加入阴道滴虫样本2ul,在反应管
4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul,振荡混匀后各管再分
别加入5ul启动液(各管的终体积为50ul)。
[0027] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光,结果如图5。
[0028]实施例6(阴道加德纳菌重复性实验):
按实施例1配制体系6管,分别标记反应管1~6。在反应管1~6中加入上游引物2(200nM)、
下游引物2(200nM)、荧光探针2(150nM)。在反应管1~3中均加入阴道加德纳菌样本2ul,在反
应管4~6中加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul,振荡混匀后各管
再分别加入5ul启动液(各管的终体积为50ul)。
[0029] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光,结果如图6。
[0030]实施例7(阴道滴虫和加德纳菌混合感染检测):
按实施例1配制体系6管,分别标记反应管1~6。在反应管1、2中加入上游引物1(200nM)、
下游引物1(200nM)、荧光探针1(150nM);在反应管3、4中加入上游引物2(200nM)、下游引物2(200nM)、荧光探针2(150nM);在反应管5、6中加入上游引物3(200nM)、下游引物3(200nM)、荧光探针3(150nM)。在反应管1、3、5中均加入阴道滴虫和加德纳菌混合感染样本2ul;在反
应管2、4、6中均加入阴性对照样本2ul。各反应管均用灭菌水补足体系到45ul,振荡混匀后
各管再分别加入5ul启动液(各管的终体积为50ul)。
[0031] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光,结果如图7。
[0032]实施例8(阴道滴虫和白色念珠菌混合感染检测):
同实施例7,不同处是往反应管1、3、5中均加入阴道滴虫和白色念珠菌混合感染样本
2ul。
[0033] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光,结果如图8。
[0034]实施例9(加德纳菌和白色念珠菌混合感染检测):
同实施例7,不同处是往反应管1、3、5中均加入加德纳菌和白色念珠菌混合感染样本
2ul。
[0035] 选择荧光定量PCR仪进行扩增及收集荧光,具体上机条件为:37℃,30s,30个循环,每个循环都搜集荧光,结果如图9。
[0036]结论:
1.从图1的结果可以看出,对应的病原体样本扩增结果都有“S”型扩增曲线,说明本发
明试剂盒的恒温扩增效果好。
[0037] 2.从图2、3的结果可以看出,即使不是在最适温度下进行扩增反应,仍然得到稳定的阳性结果,说明本发明试剂盒的容错率高、
稳定性强。
[0038] 3.从图4的结果可以看出,非本试剂盒检测范围内的其他阴道内
微生物(金黄色葡萄球菌、卷曲乳杆菌、詹式乳杆菌、惰性乳杆菌、支原体)不会产生
假阳性结果,且本试剂盒
可检测的阴道滴虫、阴道加德纳菌、6种念珠菌属的检测相互之间不产生干扰,说明本试剂
盒的特异性强。
[0039] 4.从图5、6的结果可以看出,对阴道滴虫和阴道加德纳菌进行了重复实验,均得到相应的“S”型扩增曲线,说明本试剂盒的灵敏度高。
[0040] 5.从图9的结果可以看出,混合感染型的样本中不同致病病原体相互之间不造成干扰,检测结果无误,说明本试剂盒的特异性好、稳定性强。
[0041] 综上,本发明试剂盒的扩增效果好,特异性强,容错率高,稳定性强,灵敏度高。