一种用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法
阅读：1040发布：2020-05-21
专利汇可以提供一种用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种用于多重PCR小分子扩增 片段 的高效分离方法，首先用 磁珠 纯化法对多重PCR小分子扩增片段进行纯化，然后再采用毛细管 电泳 法进行分离。本发明采用多重PCR方法与毛细管电泳结合的方法可以对转基因 植物 进行快速的筛查。多重PCR具有节约模板、节省 试剂 和时间的高效性；磁珠法对多重PCR产物进行处理可以有效的除去PCR反应体系中的杂质，使其更适合于进行毛细管电泳；毛细管电泳具有 检测限 低、灵敏度高和检测时间短的特点。本发明应用安全，可以成功的对多重PCR小分子扩增片段进行分离鉴定，检测时间控制在10.6min，可广泛地应用于食品卫生检疫以及临床检验等领域中。，下面是一种用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法专利的具体信息内容。
1.一种用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法，其特征在于，其先用磁珠纯化法对多重PCR小分子扩增片段进行纯化，然后再采用毛细管电泳法进行分离。
2.根据权利要求1所述的分离方法，其特征在于，所述磁珠纯化法依次采用磁珠吸附、洗涤以及洗脱步骤。
3.根据权利要求1或2所述的分离方法，其特征在于，所述磁珠纯化法的纯化步骤为：
1)取多重PCR产物加入磁珠结合液和30uL 1mol/L的DTT溶液；
2)向其中加入保持均匀悬浮状态的磁珠，使磁珠保持悬浮状态5min；
3)将离心管置于磁架上进行磁性分离，吸去液体；
4)然后加入70％的乙醇进行洗涤，混匀；进行磁性分离，吸去液体；
5)重复步骤4)一次；
6)在磁性条件下，室温晾干，并吸去液体；
7)加入TE溶液，混匀；
8)磁性分离，吸取液体，所得液为纯化的PCR产物。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的分离方法，其特征在于，所述毛细管电泳法所用的筛分溶液体系由筛分介质HEC和基体缓冲液组成。
5.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述基体缓冲液由89mol/L三羟甲基氨基甲烷、332mol/L硼酸和2mol/L EDTA组成，pH为7.2～7.5。
6.根据权利要求4所述的分离方法，其特征在于，所述筛分介质HEC为水溶性高分子物质，质量浓度为1.0～1.5％。
7.根据权利要求1-6任意一项所述的分离方法，其特征在于，所述毛细管电泳法具体过程为：
1)配制电泳缓冲液：89mol/L三羟甲基氨基甲烷，332mol/L硼酸，2mol/L EDTA，pH为7.2～7.5，其余为去离子水；
2)将1)中的电泳缓冲液分装出部分来配制分离缓冲液，向其中加入质量浓度为1.0～1.5％的HEC，加热溶解，之后冷却至4℃密封保存；
3)将1)和2)的溶液过0.45μm滤膜，4℃保存；
4)毛细管的内径为75μm，在8.2～8.5cm处灼烧毛细管，作为检测窗口，毛细管长度为48.5cm，有效长度为40cm；
5)灼烧毛细管的头和尾处，使其穿过电极浸入电泳缓冲液中；
6)新毛细管的前处理的条件如下：0.10mol/L的氢氧化钠运行5min；去离子水运行10min；分离缓冲液运行10min；
7)毛细管电泳仪运行的参数如下：毛细管温度为20℃，-5kv下进样20～40s，-15～-20kv的电压下运行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm条件下检测。
8.根据权利要求7所述的分离方法，其特征在于，电泳缓冲液的pH值为7.4。
9.根据权利要求7或8所述的分离方法，其特征在于，HEC的质量浓度为1.2％。
10.根据权利要求7或8所述的分离方法，其特征在于，步骤7)中进样时间为20s，电压为-16.5kv。
技术领域
本发明涉及一种方法，具体地说，涉及一种方法。本发明可以成功的对多重PCR小分子扩增片段进行高效分离，多重PCR产物经过磁珠纯化后，可以更好的用毛细管电泳对其进行分离。
背景技术
转基因食品的安全性已成为全球关注的热点问题之一，为了标识转基因作物，通常不仅要筛选和检测出转基因作物的CaMV35S启动子及NOS终止子，还要鉴定转基因农作物的品系和定量转基因成分。
深加工产品PCR分子检测技术的研究一直是检测技术研究的难点和热点，因为其基因组DNA片段因为加工过程中高压高温以及机械力的破坏，已经降解成很小片段了(＜100bp)，并且含量非常微小，因此传统的PCR-琼脂糖凝胶电泳无法对这些小目的片段实现有效地检测，经常会出现假阴性的结果。
目前，已有采用多重PCR反应技术对这些小片段基因进行扩增，以提高检测特异性。但由于多重PCR反应体系较为复杂，对后续的分离方法要求更加严格，传统的琼脂糖凝胶电泳进行分离分析，其分辨率有限，无法达到对多重PCR小分子扩增片段检测的要求。
因此，需要研究一种能快捷高效地对多重PCR小分子扩增片段进行分离的方法。
深加工产品PCR分子检测技术的研究一直是检测技术研究的难点和热点，因为其基因组DNA片段因为加工过程中高压高温以及机械力的破坏，已经降解成很小片段了(＜100bp)，并且含量非常微小，因此传统的PCR-琼脂糖凝胶电泳无法对这些小目的片段实现有效地检测，经常会出现假阴性的结果。
目前，已有采用多重PCR反应技术对这些小片段基因进行扩增，以提高检测特异性。但由于多重PCR反应体系较为复杂，对后续的分离方法要求更加严格，传统的琼脂糖凝胶电泳进行分离分析，其分辨率有限，无法达到对多重PCR小分子扩增片段检测的要求。
因此，需要研究一种能快捷高效地对多重PCR小分子扩增片段进行分离的方法。
发明内容
本发明的目的在于克服现有的检测PCR小分子扩增片段的方法的缺陷，提供一种操作简便、快速高效的分离多重PCR小分子扩增片段的方法。
本发明提供的用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法，其先用磁珠纯化法对多重PCR小分子扩增片段进行纯化，然后再采用毛细管电泳法进行分离。
本发明所述样品为食品领域内任何含有玉米成分的原料产品以及深加工产品。
由于多重PCR反应体系较为复杂，具有一些可能会干扰到后续毛细管电泳的杂质，因此需要对其进行纯化处理。本发明采用磁珠纯化法。磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体，可分散于基液中形成磁性液体材料，它兼有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点，从而使固-液相的分离变得十分方便快捷。磁珠纯化法特异性地把DNA分离技术和富集技术有机的结合为一体，通过简单的洗脱即可以得到纯度很高的靶物质DNA。
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)也叫高效毛细管电泳(HPCE)，毛细管电泳法是近年来发展迅速的分离分析技术之一，毛细管电泳克服了传统的琼脂糖凝胶电泳分辨率较低、过程复杂、样品需要量大、重现性差，其最主要的特点是高效、快速和微量.本发明采用的是无胶筛分毛细管凝胶电泳(NGE)，它采用的是可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分介质，它能避免空泡的形成，比凝胶柱的制备要简单、方便.早在1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作为DNA分离介质的报道.但是其黏度大，操作又比较繁琐，且不是十分稳定.故在其后几年，PEO、PDMA、PVP在熔融石英毛细管壁单独具有动态涂层作用的线性高分子物质陆续被报道.经过试验研究，本发明选择分离介质为羟乙基纤维素(HEC).
所述磁珠纯化法采用BIO-V公司购买的磁珠进行纯化。依次采用磁珠吸附、洗涤以及洗脱步骤。
所述磁珠纯化法的步骤为：
1)取多重PCR产物加入磁珠结合液(向100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA溶液中加入2.0mol/L NaCl、1.0mol/L MgCl2、15％的PEG 6000和15％的PEG 8000，pH值为6.5)和30uL 1mol/L的DTT溶液(二硫苏糖醇溶液)；
2)向其中加入保持均匀悬浮状态的磁珠，使磁珠保持悬浮状态5min；
3)将离心管置于磁架上进行磁性分离，吸去液体；
4)然后加入70％的乙醇进行洗涤，混匀；进行磁性分离，吸去液体；
5)重复步骤4)一次；
6)在磁性条件下，室温晾干，并吸去液体；
7)加入TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)溶液，混匀；
8)磁性分离，吸取液体，所得液为纯化的PCR产物。
具体操作步骤如下：
1)取多重PCR产物于1.5ml Eppendorf离心管中。加入等体积的磁珠结合液(向100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA溶液中加入2.0mol/L NaCl、1.0mol/L MgCl2、15％的PEG 6000和15％的PEG 8000，pH值为6.5)和30uL 1mol/L的DTT溶液。
2)加入200uL磁珠。在吸取磁珠前，必须先涡旋振荡装磁珠的试剂瓶30s，以保证磁珠悬浮状态均匀。用取液器反复吹打或用漩涡混合仪充分混匀，使磁珠始终保持悬浮状态5min。
3)将离心管放置于磁架上静置30s，待磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时方可吸去液体，液体尽量吸取干净。
4)从磁架上取下离心管，往离心管中加入1mL 70％的乙醇进行洗涤，震荡混匀1min。将离心管放置于磁架上，磁性分离30s，尽量吸去液体。
5)重复步骤4)一次。
6)离心管始终放在磁架上，室温晾干10～15分钟，每隔5min，可能会从磁珠中渗出液体，聚集在离心管底部，用取液器将这些液体及时取出。
7)向离心管加入TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)溶液，震荡混匀5～10min，使磁珠始终保持悬浮状态。
8)磁分离，将离心管放置于磁架上静置约30s，使磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时小心吸取液体放入新的离心管中，所得液即为纯化的PCR产物。
羟乙基纤维素(HEC)是本发明的主要研究对象。本发明用HEC的线性高分子溶液作为毛细管中的填充介质。运用毛细管无胶筛分和毛细管动态涂渍区带电泳模式建立对多重PCR产物筛分的方案。
本发明毛细管电泳分离法所用筛分溶液体系由筛分介质和基体缓冲液组成。筛分介质为羟乙基纤维素(HEC)，基体缓冲液由89mol/L Tris base(三羟甲基氨基甲烷)、332mol/L硼酸和2mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)组成，pH在7.2～7.5之间，进一步优选为7.4。其中，Tris、硼酸和EDTA至少是分析纯级别。
所述的筛分介质HEC为水溶性高分子物质，优选的质量浓度范围在1.0～1.5％，进一步优选为1.2％。毛细管内径为75μm。经过优化后确定，每次使用长度为48.5cm，检测窗口至电极末端的距离为8.5cm，故毛细管有效长度为40cm。运行电压为负压，大小在15kv～20kv之间，进一步优化为-16.5kv。
具体地说，本发明所述毛细管电泳分离过程为：
1)配制电泳缓冲液：以30mL溶液为例，称取323.4mg的Tris，615.9mg的硼酸，22.5mg的EDTA，用去离子水定容至30mL，用1.0mol/L的硼酸调节PH值至7.2～7.5。
2)将1)中的电泳缓冲液分装出15mL来配制分离缓冲液。向其中加入质量浓度为1.0～1.5％的HEC，由于HEC的黏度较大，故不易溶解，可以采用漩涡震荡器震荡后，再放入水浴锅中温浴使之完全溶于电泳缓冲液中，冷却至4℃密封保存。
3)将1)和2)的溶液过45μm滤膜，4℃保存。
4)毛细管的内径为75μm，在8.2～8.5cm处灼烧毛细管，作为检测窗口，毛细管长度为48.5cm，有效长度为40cm。
5)灼烧毛细管的头和尾处，使其穿过电极浸入电泳缓冲液中。
6)新毛细管的前处理的条件如下：0.10mol/L的氢氧化钠运行5min；去离子水运行10min；分离缓冲液运行10min。
7)毛细管电泳仪运行的参数如下：毛细管温度为20℃，-5kv下进样20s，-16.5kv的电压下运行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm条件下检测。
本发明的用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法，可以先从样品中提取植物基因组；然后进行多重PCR扩增。
本发明从样品中提取植物基因组DNA采用CTAB(溴代十六烷基三甲胺)法。具体步骤如下：
1)将含有玉米成分的锅巴样品于液氮中研磨成粉末状。
2)称取200mg加入到1.5mL Eppendof离心管(安全微量离心管)中。
3)加入1000μL CTAB溶液，振荡均匀，65℃温育40min，其间至少混匀5次，在4℃下12000rpm离心10分钟。
4)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡均匀，4℃下12000rpm离心15min。
5)重复步骤4)一次。
6)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，振荡均匀，在4℃下12000rpm离心15min。
7)小心吸取上清到另一新管中，加入2/3体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠。-20℃条件下静置2h。在4℃下12000rpm离心15min。
8)弃去上清液，加入适量的70％乙醇溶液洗涤沉淀。
9)弃去上清液，吹干沉淀。用100uL无菌超纯水溶解沉淀。
10)加入3μl RNA酶溶液，37℃水浴环境中消化30min。
本发明所述的样品可以为锅巴，也可以是食品领域内任何含有玉米成分的深加工产品以及深加工转基因产品。
本发明的多重PCR小分子片段的扩增过程为：
PCR反应体系如下(30μL)：10×PCR缓冲液：3μL(10×PCR缓冲液：100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)；2.5mmol/L dNTP：2.4μL；引物浓度为10μM，共三对引物，每对引物的上、下游引物分别加入1μL；Taq DNA聚合酶：0.4μL，提取的DNA加入1μl作为模板，用ddH2O水补足至30μl。
PCR的扩增条件如下：预变性：94℃5min；变性：94℃30s；退火：60℃30s；延伸：72℃30s；最后延伸：72℃7min；共设35个循环。
本发明采用磁珠法纯化PCR产物，高效快速的去除了反应体系中的杂质，使其适合于进行毛细管电泳，将经过纯化后的PCR产物稀释后上样，出现了锐峰，可见磁珠纯化有助于毛细管电泳的操作，大大的提高了样品的纯度。
本发明中采用的磁珠纯化法区别于普通的DNA试剂盒纯化法，普通的纯化法利用高盐浓度下的硅类基质对DNA独特吸附的原理，清除凝胶与其它杂质，对小于100bp的DNA片段的回收率较低。而本发明中使用的磁珠纯化法以磁珠独特的分离作用为依据，提供了一个极其简便的操作程序：磁珠吸附、洗涤以及洗脱。在最适的试剂及操作条件下，可获得高质量的DNA。本发明所采用磁珠纯化方法具有简便、快捷和高效的特点，整个提取纯化过程中无须使用苯酚、氯仿等有机溶剂。
本发明提供了用于分离小片段PCR产物的毛细管电泳法，该方法在紫外检测条件下可以在10.6min内成功的分离出大小分别为51bp、74bp和88bp的多重PCR小分子扩增片段。
表1本发明与传统的琼脂糖凝胶电泳的实施效果比较
本发明弥补了现有技术对多重PCR小分子扩增片段检测的不足，成功的建立了一种用于深加工产品PCR分子检测的快速筛查方法。多重PCR技术具有节约模板、节省试剂和时间的高效性；磁珠法对多重PCR产物进行处理可以有效的除去PCR反应体系中的杂质，使其更适合于进行毛细管电泳；毛细管电泳具有检测限低、灵敏度高和检测时间短的特点。本发明应用安全，可以成功的对多重PCR小分子扩增片段进行分离鉴定，检测时间控制在10.6min，可广泛地应用于食品卫生检疫以及临床检验等领域中。
附图说明
图1为本发明琼脂糖凝胶电泳验证基因组DNA提取图；M：λDNA/EcoR I+Hind III Marker，1、2均为CTAB法提取的锅巴食品DNA电泳图谱
图2为本发明琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物；M：DL 2000DNA Marker，1、2均为多重PCR产物
图3为本发明毛细管电泳分离多重PCR产物；
图4为图3出峰部分的放大图。
本发明提供的用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法，其先用磁珠纯化法对多重PCR小分子扩增片段进行纯化，然后再采用毛细管电泳法进行分离。
本发明所述样品为食品领域内任何含有玉米成分的原料产品以及深加工产品。
由于多重PCR反应体系较为复杂，具有一些可能会干扰到后续毛细管电泳的杂质，因此需要对其进行纯化处理。本发明采用磁珠纯化法。磁珠是一种包被有生物活性基团的功能化载体，可分散于基液中形成磁性液体材料，它兼有液体的流动性和固体磁性颗粒材料的双重特点，从而使固-液相的分离变得十分方便快捷。磁珠纯化法特异性地把DNA分离技术和富集技术有机的结合为一体，通过简单的洗脱即可以得到纯度很高的靶物质DNA。
毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)也叫高效毛细管电泳(HPCE)，毛细管电泳法是近年来发展迅速的分离分析技术之一，毛细管电泳克服了传统的琼脂糖凝胶电泳分辨率较低、过程复杂、样品需要量大、重现性差，其最主要的特点是高效、快速和微量.本发明采用的是无胶筛分毛细管凝胶电泳(NGE)，它采用的是可形成无凝胶但有筛分作用的无胶筛分介质，它能避免空泡的形成，比凝胶柱的制备要简单、方便.早在1990年，已有聚丙烯酰胺(LPA)作为DNA分离介质的报道.但是其黏度大，操作又比较繁琐，且不是十分稳定.故在其后几年，PEO、PDMA、PVP在熔融石英毛细管壁单独具有动态涂层作用的线性高分子物质陆续被报道.经过试验研究，本发明选择分离介质为羟乙基纤维素(HEC).
所述磁珠纯化法采用BIO-V公司购买的磁珠进行纯化。依次采用磁珠吸附、洗涤以及洗脱步骤。
所述磁珠纯化法的步骤为：
1)取多重PCR产物加入磁珠结合液(向100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA溶液中加入2.0mol/L NaCl、1.0mol/L MgCl2、15％的PEG 6000和15％的PEG 8000，pH值为6.5)和30uL 1mol/L的DTT溶液(二硫苏糖醇溶液)；
2)向其中加入保持均匀悬浮状态的磁珠，使磁珠保持悬浮状态5min；
3)将离心管置于磁架上进行磁性分离，吸去液体；
4)然后加入70％的乙醇进行洗涤，混匀；进行磁性分离，吸去液体；
5)重复步骤4)一次；
6)在磁性条件下，室温晾干，并吸去液体；
7)加入TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH 8.0)溶液，混匀；
8)磁性分离，吸取液体，所得液为纯化的PCR产物。
具体操作步骤如下：
1)取多重PCR产物于1.5ml Eppendorf离心管中。加入等体积的磁珠结合液(向100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA溶液中加入2.0mol/L NaCl、1.0mol/L MgCl2、15％的PEG 6000和15％的PEG 8000，pH值为6.5)和30uL 1mol/L的DTT溶液。
2)加入200uL磁珠。在吸取磁珠前，必须先涡旋振荡装磁珠的试剂瓶30s，以保证磁珠悬浮状态均匀。用取液器反复吹打或用漩涡混合仪充分混匀，使磁珠始终保持悬浮状态5min。
3)将离心管放置于磁架上静置30s，待磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时方可吸去液体，液体尽量吸取干净。
4)从磁架上取下离心管，往离心管中加入1mL 70％的乙醇进行洗涤，震荡混匀1min。将离心管放置于磁架上，磁性分离30s，尽量吸去液体。
5)重复步骤4)一次。
6)离心管始终放在磁架上，室温晾干10～15分钟，每隔5min，可能会从磁珠中渗出液体，聚集在离心管底部，用取液器将这些液体及时取出。
7)向离心管加入TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)溶液，震荡混匀5～10min，使磁珠始终保持悬浮状态。
8)磁分离，将离心管放置于磁架上静置约30s，使磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时小心吸取液体放入新的离心管中，所得液即为纯化的PCR产物。
羟乙基纤维素(HEC)是本发明的主要研究对象。本发明用HEC的线性高分子溶液作为毛细管中的填充介质。运用毛细管无胶筛分和毛细管动态涂渍区带电泳模式建立对多重PCR产物筛分的方案。
本发明毛细管电泳分离法所用筛分溶液体系由筛分介质和基体缓冲液组成。筛分介质为羟乙基纤维素(HEC)，基体缓冲液由89mol/L Tris base(三羟甲基氨基甲烷)、332mol/L硼酸和2mol/L EDTA(乙二胺四乙酸)组成，pH在7.2～7.5之间，进一步优选为7.4。其中，Tris、硼酸和EDTA至少是分析纯级别。
所述的筛分介质HEC为水溶性高分子物质，优选的质量浓度范围在1.0～1.5％，进一步优选为1.2％。毛细管内径为75μm。经过优化后确定，每次使用长度为48.5cm，检测窗口至电极末端的距离为8.5cm，故毛细管有效长度为40cm。运行电压为负压，大小在15kv～20kv之间，进一步优化为-16.5kv。
具体地说，本发明所述毛细管电泳分离过程为：
1)配制电泳缓冲液：以30mL溶液为例，称取323.4mg的Tris，615.9mg的硼酸，22.5mg的EDTA，用去离子水定容至30mL，用1.0mol/L的硼酸调节PH值至7.2～7.5。
2)将1)中的电泳缓冲液分装出15mL来配制分离缓冲液。向其中加入质量浓度为1.0～1.5％的HEC，由于HEC的黏度较大，故不易溶解，可以采用漩涡震荡器震荡后，再放入水浴锅中温浴使之完全溶于电泳缓冲液中，冷却至4℃密封保存。
3)将1)和2)的溶液过45μm滤膜，4℃保存。
4)毛细管的内径为75μm，在8.2～8.5cm处灼烧毛细管，作为检测窗口，毛细管长度为48.5cm，有效长度为40cm。
5)灼烧毛细管的头和尾处，使其穿过电极浸入电泳缓冲液中。
6)新毛细管的前处理的条件如下：0.10mol/L的氢氧化钠运行5min；去离子水运行10min；分离缓冲液运行10min。
7)毛细管电泳仪运行的参数如下：毛细管温度为20℃，-5kv下进样20s，-16.5kv的电压下运行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm条件下检测。
本发明的用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法，可以先从样品中提取植物基因组；然后进行多重PCR扩增。
本发明从样品中提取植物基因组DNA采用CTAB(溴代十六烷基三甲胺)法。具体步骤如下：
1)将含有玉米成分的锅巴样品于液氮中研磨成粉末状。
2)称取200mg加入到1.5mL Eppendof离心管(安全微量离心管)中。
3)加入1000μL CTAB溶液，振荡均匀，65℃温育40min，其间至少混匀5次，在4℃下12000rpm离心10分钟。
4)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡均匀，4℃下12000rpm离心15min。
5)重复步骤4)一次。
6)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，振荡均匀，在4℃下12000rpm离心15min。
7)小心吸取上清到另一新管中，加入2/3体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠。-20℃条件下静置2h。在4℃下12000rpm离心15min。
8)弃去上清液，加入适量的70％乙醇溶液洗涤沉淀。
9)弃去上清液，吹干沉淀。用100uL无菌超纯水溶解沉淀。
10)加入3μl RNA酶溶液，37℃水浴环境中消化30min。
本发明所述的样品可以为锅巴，也可以是食品领域内任何含有玉米成分的深加工产品以及深加工转基因产品。
本发明的多重PCR小分子片段的扩增过程为：
PCR反应体系如下(30μL)：10×PCR缓冲液：3μL(10×PCR缓冲液：100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)；2.5mmol/L dNTP：2.4μL；引物浓度为10μM，共三对引物，每对引物的上、下游引物分别加入1μL；Taq DNA聚合酶：0.4μL，提取的DNA加入1μl作为模板，用ddH2O水补足至30μl。
PCR的扩增条件如下：预变性：94℃5min；变性：94℃30s；退火：60℃30s；延伸：72℃30s；最后延伸：72℃7min；共设35个循环。
本发明采用磁珠法纯化PCR产物，高效快速的去除了反应体系中的杂质，使其适合于进行毛细管电泳，将经过纯化后的PCR产物稀释后上样，出现了锐峰，可见磁珠纯化有助于毛细管电泳的操作，大大的提高了样品的纯度。
本发明中采用的磁珠纯化法区别于普通的DNA试剂盒纯化法，普通的纯化法利用高盐浓度下的硅类基质对DNA独特吸附的原理，清除凝胶与其它杂质，对小于100bp的DNA片段的回收率较低。而本发明中使用的磁珠纯化法以磁珠独特的分离作用为依据，提供了一个极其简便的操作程序：磁珠吸附、洗涤以及洗脱。在最适的试剂及操作条件下，可获得高质量的DNA。本发明所采用磁珠纯化方法具有简便、快捷和高效的特点，整个提取纯化过程中无须使用苯酚、氯仿等有机溶剂。
本发明提供了用于分离小片段PCR产物的毛细管电泳法，该方法在紫外检测条件下可以在10.6min内成功的分离出大小分别为51bp、74bp和88bp的多重PCR小分子扩增片段。
表1本发明与传统的琼脂糖凝胶电泳的实施效果比较
本发明弥补了现有技术对多重PCR小分子扩增片段检测的不足，成功的建立了一种用于深加工产品PCR分子检测的快速筛查方法。多重PCR技术具有节约模板、节省试剂和时间的高效性；磁珠法对多重PCR产物进行处理可以有效的除去PCR反应体系中的杂质，使其更适合于进行毛细管电泳；毛细管电泳具有检测限低、灵敏度高和检测时间短的特点。本发明应用安全，可以成功的对多重PCR小分子扩增片段进行分离鉴定，检测时间控制在10.6min，可广泛地应用于食品卫生检疫以及临床检验等领域中。
附图说明
图1为本发明琼脂糖凝胶电泳验证基因组DNA提取图；M：λDNA/EcoR I+Hind III Marker，1、2均为CTAB法提取的锅巴食品DNA电泳图谱
图2为本发明琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物；M：DL 2000DNA Marker，1、2均为多重PCR产物
图3为本发明毛细管电泳分离多重PCR产物；
图4为图3出峰部分的放大图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1用CTAB法从锅巴中提取基因组DNA
1)将含有玉米成分的锅巴样品于液氮中研磨成粉末状。
2)称取200mg加入到1.5mL Eppendof离心管中，同时需设立阴性对照。
3)加入1000μL CTAB溶液，振荡均匀，65℃温育40min，其间至少混匀5次，在4℃下12000rpm离心10分钟。
4)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡均匀，4℃下12000rpm离心15min。
5)重复步骤(4)一次。
6)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，振荡均匀，在4℃下12000rpm离心15min。
7)小心吸取上清到另一新管中，加入2/3体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠。-20℃条件下静置2h。在4℃下12000rpm离心15min。
8)弃去上清液，加入适量的70％乙醇溶液洗涤沉淀。
9)弃去上清液，吹干沉淀。用100uL无菌超纯水溶解沉淀。
10)加入3μl RNA酶溶液，37℃水浴环境中消化30min。
11)消化后，跑1％浓度的琼脂糖凝胶电泳对所提取的基因组进行验证。
如图1所示，结果表明，经过琼脂糖凝胶电泳时后发现，采用CTAB法可以提取出锅巴中的基因组DNA，上样量为5μL。其中基因组的大小在λDNA/EcoR I+Hind III Marker的21kb左右的位置。基因组的条带弥散，这是采用深加工技术对样品进行处理后的结果，样品点样孔中基本没有蛋白残留，以本发明的方法提取得到的基因组均可用于PCR扩增。
实施例2对实施例1提取的DNA做PCR检测
用实施例1提取的DNA为模板，以设计的引物(如表2)扩增锅巴的基因组。PCR反应体系如下(30μL)：10×PCR缓冲液：3μL(10×PCR缓冲液：100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)；2.5mmol/L dNTP：2.4μL；引物浓度为10μM，共三对引物，每对引物的上、下游引物分别加入1μL；Taq DNA聚合酶：0.4μL，提取的DNA加入1μl作为模板，用ddH2O水补足至30μl。PCR的扩增条件如下：预变性：94℃5min；变性：94℃30s；退火：60℃30s；延伸：72℃30s；最后延伸：72℃7min；共设35个循环。
表2引物设计
如图2所示，琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物，上样量为8μL。结果表明，用琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物，多重PCR扩增的目的DNA片段大小分别为51bp、74bp和88bp，产物以团状形式聚集在DL 2000DNAMarker的100bp以下的部分，可见传统的琼脂糖凝胶电泳无法对其进行有效的分离。其中DL 2000DNA Marker从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
实施例3采用磁珠纯化法对多重PCR小分子扩增片段进行纯化
1)取多重PCR产物于1.5ml Eppendorf离心管中。加入等体积的磁珠结合液(向100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA溶液中加入2.0mol/L NaCl、1.0mol/L MgCl2、15％的PEG 6000和15％的PEG 8000，pH值为6.5)和30uL 1mol/L的DTT溶液；
2)加入200uL磁珠。在吸取磁珠前，必须先涡旋振荡装磁珠的试剂瓶30s，以保证磁珠悬浮状态均匀。用取液器反复吹打或用漩涡混合仪充分混匀，使磁珠始终保持悬浮状态5min。
3)将离心管放置于磁架上静置30s，待磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时方可吸去液体，液体尽量吸取干净。
4)从磁架上取下离心管，往离心管中加入1mL 70％的乙醇进行洗涤，震荡混匀1min。将离心管放置于磁架上，磁性分离30s，尽量吸去液体。
5)重复步骤4)一次。
6)离心管始终放在磁架上，室温晾干10～15分钟，每隔5min，可能会从磁珠中渗出液体，聚集在离心管底部，用取液器将这些液体及时取出。
7)向离心管加入TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)溶液，震荡混匀5～10min，使磁珠始终保持悬浮状态。
8)磁分离，将离心管放置于磁架上静置约30s，使磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时小心吸取液体放入新的离心管中，所得液即为纯化的PCR产物。
实施例4用毛细管电泳分离多重PCR产物
1)配制电泳缓冲液：以30mL溶液为例，称取323.4mg的Tris，615.9mg的硼酸，22.5mg的EDTA，用去离子水定容至30mL，用1.0mol/L的硼酸调节PH值至7.4。
2)将1)中的电泳缓冲液分装出15mL来配制分离缓冲液。向其中加入180.0mg的HEC。由于HEC的黏度较大，故不易溶解，可以采用漩涡震荡器震荡后，再放入水浴锅中温浴使之完全溶于电泳缓冲液中，冷却至4℃密封保存。
3)将1)和2)的溶液过45μm滤膜，4℃保存。
4)毛细管的内径为75μm，管内壁无涂层，在8.2～8.5cm处灼烧毛细管，作为检测窗口，毛细管长度为48.5cm，有效长度为40cm.
5)灼烧毛细管的头和尾处，使其穿过电极浸入电泳缓冲液中。
6)新毛细管的前处理的条件如下：0.10mol/L的氢氧化钠运行5min；去离子水运行10min；分离缓冲液运行10min。
7)毛细管电泳仪运行的参数如下：毛细管温度为20℃，-5kv下进样20s，-16.5kv的电压下运行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm条件下检测。
如图3所示，结果表明，经过磁珠纯化后的PCR产物经过稀释后，在-5kv的条件下进样20s，毛细管电泳法可以成功分离出100bp以下的3个不同大小的PCR产物，目的DNA片段大小分别为51bp、74bp和88bp，毛细管电泳对其分离的分离度良好，样品经纯化后进样，峰形为锐峰，在10.6min内达到分离，可见样品的纯度非常的高，磁珠纯化法有助于进行毛细管的分离。
本发明用于转基因植物筛查的多重PCR反应体系，以转基因玉米Bt176为研究对象，采用多重PCR技术，一次PCR反应同时扩增玉米的CaMV 35S启动子、NOS终止子以及ZSSIIb基因，以提高检测效率和检测特异性。并采用了磁珠法对多重PCR产物进行纯化，该法快速、有效、操作简便。同时提供了一种用于毛细管电泳分离上述多重PCR产物的毛细管无胶筛分体系，该筛分体系的电泳缓冲液为89mol/L Tris，332mol/L硼酸，2mol/L EDTA，PH为7.4。筛分介质为羟乙基纤维素(HEC)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法
<130>KHP09113457.0
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
actgacgtaa gggatgacgc ac 22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggaagggtct tgcgaaggat agt 23
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgggttttt atgattagag tcccg 25
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agtttgcgcg ctatattttg tttt 24
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cggtggatgc taaggctgat g 21
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aaagggccag gttcattatc ctc 23
若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1用CTAB法从锅巴中提取基因组DNA
1)将含有玉米成分的锅巴样品于液氮中研磨成粉末状。
2)称取200mg加入到1.5mL Eppendof离心管中，同时需设立阴性对照。
3)加入1000μL CTAB溶液，振荡均匀，65℃温育40min，其间至少混匀5次，在4℃下12000rpm离心10分钟。
4)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的Tris饱和酚∶三氯甲烷∶异戊醇(25∶24∶1)，充分振荡均匀，4℃下12000rpm离心15min。
5)重复步骤(4)一次。
6)小心吸取上清到另一新管中，加入与上清等体积的三氯甲烷∶异戊醇(24∶1)，振荡均匀，在4℃下12000rpm离心15min。
7)小心吸取上清到另一新管中，加入2/3体积的异丙醇，1/10体积的乙酸钠。-20℃条件下静置2h。在4℃下12000rpm离心15min。
8)弃去上清液，加入适量的70％乙醇溶液洗涤沉淀。
9)弃去上清液，吹干沉淀。用100uL无菌超纯水溶解沉淀。
10)加入3μl RNA酶溶液，37℃水浴环境中消化30min。
11)消化后，跑1％浓度的琼脂糖凝胶电泳对所提取的基因组进行验证。
如图1所示，结果表明，经过琼脂糖凝胶电泳时后发现，采用CTAB法可以提取出锅巴中的基因组DNA，上样量为5μL。其中基因组的大小在λDNA/EcoR I+Hind III Marker的21kb左右的位置。基因组的条带弥散，这是采用深加工技术对样品进行处理后的结果，样品点样孔中基本没有蛋白残留，以本发明的方法提取得到的基因组均可用于PCR扩增。
实施例2对实施例1提取的DNA做PCR检测
用实施例1提取的DNA为模板，以设计的引物(如表2)扩增锅巴的基因组。PCR反应体系如下(30μL)：10×PCR缓冲液：3μL(10×PCR缓冲液：100mmol/L Tris-HCl，500mmol/L KCl，15mmol/L MgCl2)；2.5mmol/L dNTP：2.4μL；引物浓度为10μM，共三对引物，每对引物的上、下游引物分别加入1μL；Taq DNA聚合酶：0.4μL，提取的DNA加入1μl作为模板，用ddH2O水补足至30μl。PCR的扩增条件如下：预变性：94℃5min；变性：94℃30s；退火：60℃30s；延伸：72℃30s；最后延伸：72℃7min；共设35个循环。
表2引物设计
如图2所示，琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物，上样量为8μL。结果表明，用琼脂糖凝胶电泳检测多重PCR产物，多重PCR扩增的目的DNA片段大小分别为51bp、74bp和88bp，产物以团状形式聚集在DL 2000DNAMarker的100bp以下的部分，可见传统的琼脂糖凝胶电泳无法对其进行有效的分离。其中DL 2000DNA Marker从上到下依次为2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
实施例3采用磁珠纯化法对多重PCR小分子扩增片段进行纯化
1)取多重PCR产物于1.5ml Eppendorf离心管中。加入等体积的磁珠结合液(向100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA溶液中加入2.0mol/L NaCl、1.0mol/L MgCl2、15％的PEG 6000和15％的PEG 8000，pH值为6.5)和30uL 1mol/L的DTT溶液；
2)加入200uL磁珠。在吸取磁珠前，必须先涡旋振荡装磁珠的试剂瓶30s，以保证磁珠悬浮状态均匀。用取液器反复吹打或用漩涡混合仪充分混匀，使磁珠始终保持悬浮状态5min。
3)将离心管放置于磁架上静置30s，待磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时方可吸去液体，液体尽量吸取干净。
4)从磁架上取下离心管，往离心管中加入1mL 70％的乙醇进行洗涤，震荡混匀1min。将离心管放置于磁架上，磁性分离30s，尽量吸去液体。
5)重复步骤4)一次。
6)离心管始终放在磁架上，室温晾干10～15分钟，每隔5min，可能会从磁珠中渗出液体，聚集在离心管底部，用取液器将这些液体及时取出。
7)向离心管加入TE(100mmol/L Tris-Cl，10mmol/L EDTA，pH8.0)溶液，震荡混匀5～10min，使磁珠始终保持悬浮状态。
8)磁分离，将离心管放置于磁架上静置约30s，使磁珠完全吸附于离心管靠磁架一侧时小心吸取液体放入新的离心管中，所得液即为纯化的PCR产物。
实施例4用毛细管电泳分离多重PCR产物
1)配制电泳缓冲液：以30mL溶液为例，称取323.4mg的Tris，615.9mg的硼酸，22.5mg的EDTA，用去离子水定容至30mL，用1.0mol/L的硼酸调节PH值至7.4。
2)将1)中的电泳缓冲液分装出15mL来配制分离缓冲液。向其中加入180.0mg的HEC。由于HEC的黏度较大，故不易溶解，可以采用漩涡震荡器震荡后，再放入水浴锅中温浴使之完全溶于电泳缓冲液中，冷却至4℃密封保存。
3)将1)和2)的溶液过45μm滤膜，4℃保存。
4)毛细管的内径为75μm，管内壁无涂层，在8.2～8.5cm处灼烧毛细管，作为检测窗口，毛细管长度为48.5cm，有效长度为40cm.
5)灼烧毛细管的头和尾处，使其穿过电极浸入电泳缓冲液中。
6)新毛细管的前处理的条件如下：0.10mol/L的氢氧化钠运行5min；去离子水运行10min；分离缓冲液运行10min。
7)毛细管电泳仪运行的参数如下：毛细管温度为20℃，-5kv下进样20s，-16.5kv的电压下运行，在Sig.260/8nm和Ref.350/80nm条件下检测。
如图3所示，结果表明，经过磁珠纯化后的PCR产物经过稀释后，在-5kv的条件下进样20s，毛细管电泳法可以成功分离出100bp以下的3个不同大小的PCR产物，目的DNA片段大小分别为51bp、74bp和88bp，毛细管电泳对其分离的分离度良好，样品经纯化后进样，峰形为锐峰，在10.6min内达到分离，可见样品的纯度非常的高，磁珠纯化法有助于进行毛细管的分离。
本发明用于转基因植物筛查的多重PCR反应体系，以转基因玉米Bt176为研究对象，采用多重PCR技术，一次PCR反应同时扩增玉米的CaMV 35S启动子、NOS终止子以及ZSSIIb基因，以提高检测效率和检测特异性。并采用了磁珠法对多重PCR产物进行纯化，该法快速、有效、操作简便。同时提供了一种用于毛细管电泳分离上述多重PCR产物的毛细管无胶筛分体系，该筛分体系的电泳缓冲液为89mol/L Tris，332mol/L硼酸，2mol/L EDTA，PH为7.4。筛分介质为羟乙基纤维素(HEC)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110>中国农业大学
<120>一种用于多重PCR小分子扩增片段的高效分离方法
<130>KHP09113457.0
<160>6
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>1
actgacgtaa gggatgacgc ac 22
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
ggaagggtct tgcgaaggat agt 23
<210>3
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
atgggttttt atgattagag tcccg 25
<210>4
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
agtttgcgcg ctatattttg tttt 24
<210>5
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
cggtggatgc taaggctgat g 21
<210>6
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
aaagggccag gttcattatc ctc 23
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 扩增子测序文库及其构建方法 | 2020-05-11 | 135 |
| 用于扩增多个靶标的扩增子拯救多重聚合酶链式反应 | 2020-05-11 | 550 |
| 一种用于扩增子测序的建库方法 | 2020-05-12 | 873 |
| 具有碱基配对的寡聚体的扩增报告子 | 2020-05-13 | 360 |
| 一种用于牛性状扩增子测序的引物组 | 2020-05-13 | 894 |
| 防止扩增过程中高分子量产物的方法 | 2020-05-12 | 851 |
| 使用饱和染料的扩增子解链分析 | 2020-05-12 | 655 |
| 使用连接扩增的分子检测 | 2020-05-12 | 810 |
| 进行扩增子挽救多重PCR的装置 | 2020-05-13 | 23 |
| 单引物至双引物扩增子转换 | 2020-05-11 | 182 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈