技术领域
[0001] 本
发明设计一种用于生物活性物质包埋的海藻酸盐微胶囊产品，具体的说是一种多巴胺接枝改性的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊的制备及其在生物活性物质包埋中的应用。
背景技术
[0002] 微囊化技术相关材料和制备方法是目前的一个研究热点,在细胞移植、药物释放和
基因治疗等生物医学领域的临床前研究中得到广泛应用(Wang et al.,2006)。在众多的生物微胶囊中，特别是用于生物活性物质包埋的微胶囊领域，海藻酸盐-聚阳离子微胶囊的使用较多。海藻酸盐-聚阳离子微胶囊包括海藻酸钠-α-聚赖
氨酸(alginate/α-polylysine)微胶囊(简称α-APA微胶囊)，海藻酸钠-ε-聚赖氨酸(alginate/ε-polylysine)微胶囊(简称ε-APA微胶囊)和海藻酸钠-壳聚糖(alginate/chitosan)微胶囊(简称ACA微胶囊)等。
[0003] 但是这些微胶囊在应用中仍存在强度差，膨胀严重而导致的细胞泄露问题。特别是在生理环境和
血浆环境中，微胶囊的机械强度差已经成为限制其进一步发展和应用的主要因素(Chen et al.,2014)。为了提高微胶囊的
稳定性，已经有报道将共价化学键引入到微胶囊体系，用于提高微胶囊的强度(Chen,Ouyang,Lawuyi&Prakash,2006；Gattas-Asfura,Valdes,Celik&Stabler,2014)。但是涉及到的微囊制备方法复杂，耗时长，用到的化学分子和
溶剂小分子具有潜在的细胞毒性，不适于活性物质的包埋。
发明内容
[0004] 针对上述问题，本发明提出将多巴胺接枝在海藻酸钠分子上并用于生物微胶囊的制备，发明了一种新型的多巴胺修饰的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊产品。一方面多巴胺分子之间发生
氧化聚合，另一方面多巴胺氧化后具有的
醛基能够和聚阳离子材料的氨基形成希夫
碱反应。在这两方面因素的共同影响下，微胶囊的机械强度得到提高。整个过程反应条件温和可控，为生物活性物质的包埋提供了可能。
[0005] 技术方案
[0006] 多巴胺接枝改性的海藻酸盐-壳聚糖微胶囊，其特征在于微胶囊结构分为微胶囊膜与
内核两部分，其中微胶囊膜是由聚阳离子材料和海藻酸盐形成的聚
电解质复合
水凝胶膜。聚多巴胺被接枝在海藻酸钠分子上，在微胶囊的膜上和内核中存在。其中，微胶囊产品为粒径100-1000微米的球形微胶囊；组成微胶囊的海藻酸盐海藻酸
2 9
盐分子量10kDa-2000kDa；内核中海藻酸盐浓度在1-50g/L，内核中细胞含量10-10个细胞/ml内核体积，且活性保持90％以上。
微胶囊产品中的多巴胺是通过共价键直接原位接枝到微胶囊中的海藻酸钠分子上，反应过程的结构式为：
[0007] 其中，多巴胺分子在海藻酸钠分子生的接枝率(每100个海藻酸钠糖环接枝的多巴胺百分数)为1-100％或1-199％。
[0008] 微胶囊产品中壳聚糖及其衍
生物材料的脱乙酰度50-100％，分子量为1kDa-500kDa。聚氨基酸分子量为10kDa-500kDa。聚氨基
酸溶液的配制方法是：聚赖氨酸溶于生理盐水，聚赖氨酸浓度为0.01-15g/L。所述的聚氨基酸包括α-聚赖氨酸，ε-聚赖氨酸，聚精氨酸，聚
鸟氨酸和聚组氨酸。
[0009] 产品的具体制备步骤为：
[0010] 1)制备多巴胺共价接枝的海藻酸盐，称之为多巴胺修饰的海藻酸盐；
[0011] 2)将步骤1)制备的多巴胺修饰的海藻酸盐通过内部凝胶化或外部凝胶化方法，制备成多巴胺修饰的海藻酸盐凝胶微球，称之为A微球，其中，海藻酸盐凝胶为二价金属
钙、钡或锌的海藻酸盐水凝胶。
[0012] 3)将步骤2)中制备的凝胶微球浸入聚阳离子溶液中，微球与聚阳离子溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应
温度在0-50℃，此时得到多巴胺修饰的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，称之为B微球，取出用生理盐水洗涤；
[0013] 其中，聚阳离子包括下述任意一种或两种以上：聚氨基酸类中的聚赖氨酸、聚鸟氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸，聚胺类中的聚乙烯亚胺、聚亚甲基胍、聚N乙烯基己内酰胺、羧基-丙基-丙烯酰胺共聚物、DEAE-dextran、氨基聚乙二醇， 壳聚糖。
[0014] B微球也可浸入到海藻酸盐溶液中，用于中和暴露在B微球表面的聚阳离子电荷，微球与海藻酸盐溶液体积比为1:1-1:40，反应时间为1-60分钟，反应温度在0-50℃，此时得到表面中和的多巴胺修饰的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，称之为B’微球，取出用生理盐水洗涤。其中，海藻酸盐溶液为海藻酸的钠盐或
钾盐，或者多巴胺修饰的海藻酸的钠盐或
钾盐。
[0015] 4)将步骤3)制备的多巴胺修饰的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊“B微球”或“B’微球”浸入有机金属螯合剂溶液中，
液化微胶囊内部的海藻酸盐凝胶，微囊与有机金属螯合剂溶液体积比范围为1：1～1：40，反应1-60分钟，取出用生理盐水洗涤，此时得到内部液态核心的多巴胺修饰的海藻酸盐-聚阳离子微胶囊，称为C微球(B微球液化后)或C’微球(B’微球液化后)；其中，有机金属螯合剂为
乙二胺四乙酸(EDTA)，氨基三乙酸(又称次氮基三乙酸NTA)，二亚乙基三胺五乙酸及其盐，
柠檬酸(CA)、
酒石酸(TA)和
葡萄糖酸(GA)，羟乙基乙二胺三乙酸(HEDTA)和二羟乙基甘氨酸(DEG)中的一种或两种以上。
[0016] 5)将步骤2)或3)或4)得到的A微球、B微球或B’微球、C微球或C’微球转移至pH＝7.4的缓冲溶液中，自然氧化0-500h。缓冲溶液中使用的缓冲对包括
碳酸氢根、
磷酸氢根和Hepes体系。
[0017] 其中，A微球氧化后得到的聚多巴胺海藻酸盐凝胶微球，可通过步骤3)制备成聚多巴胺海藻酸盐-聚阳离子微胶囊。
[0018] 该微胶囊产品用于活细胞的包埋。所述活细胞为人或动物(老鼠、
牛、猪等)来源的离体的胰岛细胞、
肝细胞、甲状腺细胞、甲状旁腺细胞、肾上腺髓质细胞具有分泌生物活性物质功能的细胞，细胞系细胞，基因工程细胞，干细胞或干细胞分化的各种细胞。
[0019] 该微胶囊产品用于蛋白多肽类的包埋。所述蛋白为
纤维蛋白、球蛋白
角蛋白、
胶原蛋白、伴娘蛋白、肌红蛋白中的一种或两种以上，包括牛磺酸、谷胱甘肽、金属硫蛋白、免疫球蛋白、生长
激素、胰岛素、肝素、干扰素、白细胞介素等。
[0020] 该微胶囊产品用于核酸类物质的包埋。所述核酸为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)中的一种或两种以上。
[0021] 该微胶囊产品用于酶的包埋。所述酶为氧化还原酶、转移酶类、
水解酶、 裂合酶、异构酶和连接酶中的一种或两种以上，包括超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、木瓜蛋白酶、过氧化氢酶、苯丙氨酸羟化酶、天
门冬酰胺酶、葡萄糖
淀粉酶等。
[0022] 本发明的有益效果：
[0023] 1.与传统的海藻酸钠-聚赖氨酸微胶囊(APA微胶囊)和海藻酸钠-壳聚糖微胶囊(ACA微胶囊)相比，本发明的这种新型多巴胺接枝改性海藻酸盐-聚阳离子微胶囊产品，在体液环境中具有高稳定性，不发生膨胀和
破碎。
[0024] 2.多巴胺分子接枝在海藻酸钠分子上的结构稳定，此外，由于多巴胺分子特有的粘附性质，有利于细胞的贴附，还在一定程度上具有促进贴壁细胞生长和代谢的作用。
[0025] 3.与其他利用共价化学方法提高微胶囊的机械强度的策略相比，本
专利涉及到的材料合成和微囊制备方法简单易行，反应条件温和可控，适用于活性物质的包埋。
附图说明
[0026] 图1为
实施例1制备的海藻酸钙凝胶、微囊以及模拟血浆处理过的微囊形态。(A)多巴胺修饰的海藻酸钙胶珠(B)多巴胺修饰的海藻酸钙-壳聚糖微胶囊(C)多巴胺修饰的海藻酸钠-壳聚糖微胶囊经过模拟血
浆液处理。
[0027] Chen,H.,Ouyang,W.,Lawuyi,B.,&Prakash,S.(2006).Genipin cross-linked alginate-chitosan microcapsules:Membrane characterization and optimization of cross-linking reaction.Biomacromolecules,7(7),2091-2098.
[0028] Chen,L.,Zhang,Y.,Li,S.,Wang,X.,Li,N.,Wang,Y.,Guo,X.,Zhao,S.,Yu,W.,Sun,G.,Liu,Y.,&Ma,X.(2014).Effect of plasma components on the stability and permeability of microcapsule.Journal of Biomedical Materials Research Part A,102(7),2408-2416.
[0029] Gattas-Asfura,K.,Valdes,M.,Celik,E.,&Stabler,C.(2014).Covalent layer-by-layer assembly of hyperbranched polymers on alginate microcapsulesto impart stability and permselectivity.J Mater Chem B Mater Biol Med,2(46),8208-8219.
[0030] Wang,W.,Liu,X.,Xie,Y.,Zhang,H.a.,Yu,W.,Xiong,Y.,Xie,W.,&Ma,X.(2006).Microencapsulation using natural polysaccharides for drug delivery and cell implantation.Journal of Materials Chemistry,16(32),3252-3267.
具体实施方式
[0031] 为更好的理解本发明，下面结合附图和实施例对本发明作进一步的说明，但本发明的实施方案不限于此。
[0032] 实施例1
[0033] 1)制备海藻酸钠溶液：2g海藻酸钠溶于200ml去离子水，加MES 2.132g，调节pH值至5.5左右。海藻酸钠分子量320kDa，G/M比55/45。
[0034] 2)过滤1)溶液除杂质。
[0035] 3)将可溶于水的碳二亚胺(EDC·HCl)1.936g，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)1.116g固体用加入步骤2)的海藻酸钠溶液中，活化40分钟。
[0036] 4)将多巴胺
盐酸盐1.92g固体用加入步骤3)的海藻酸钠溶液中，在氮气保护下室温反应12小时。
[0037] 5)将400ml
乙醇滴加入步骤4)的海藻酸钠溶液中，得到沉淀出的海藻酸钠固体。乙醇洗涤三次，收集产物。
[0038] 6)将步骤5)得到的产物
真空干燥，得到多巴胺接枝的海藻酸钠，接枝度26％。
[0039] 7)将6)制得的多巴胺接枝海藻酸钠溶于生理盐水中制备成15g/L的多巴胺接枝的海藻酸钠溶液。
[0040] 8)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
[0041] 9)配制凝胶浴溶液：无水
氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
[0042] 10)制备多巴胺接枝的海藻酸钙水凝胶微球：将步骤7)制备的多巴胺接枝的海藻酸钠溶液在高压静
电场下形成射流，液滴落入步骤10)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，
固化30分钟，即获得多巴胺接枝海藻酸钙水凝胶微球。
[0043] 11)将步骤10)制得的水凝胶微球置于pH 7.4的Hepes缓冲体系中，每24小时更换新的Hepes缓冲液，共反应72小时。
[0044] 12)制备多巴胺接枝海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将该半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球浸入步骤8)配制的α-聚赖氨酸溶液中，水凝胶微球与聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成多巴胺接枝海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，
显微镜下观察，微囊粒径450μm，球形度好，膜厚度10 微米。
[0045] 13)将步骤12)制得的多巴胺接枝海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊0.1ml混入20ml生理盐水，加入20颗粒径为5mm的玛瑙球，共同放置于三角瓶内，在37度，170r/min条件下震荡球磨24小时，微胶囊的完整率保持在95％以上，表明微胶囊具有良好的机械强度。
[0046] 14)将步骤12)制得的多巴胺接枝海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，按微胶囊：IgG＝1：20体积比放入FITC标记的IgG(γ-免疫球蛋白)溶液中，振荡孵育24小时，激光共聚焦显微镜下观察，微囊内没有
荧光信号，表明微胶囊保持良好的免疫隔离性能。
[0047] 比较例1
[0048] 1)将海藻酸钠溶于生理盐水中制备成15g/L的溶液。
[0049] 2)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
[0050] 3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
[0051] 4)制备海藻酸钙水凝胶微球：将步骤1)制备的海藻酸钠溶液在高压静电场下形成射流，液滴落入步骤3)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，固化30分钟，即获得海藻酸钙水凝胶微球。
[0052] 5)制备多海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将该海藻酸钙水凝胶微球浸入步骤2)配制的α-聚赖氨酸溶液中，水凝胶微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，显微镜下观察，微囊粒径450微米，球形度好，膜厚度10微米。
[0053] 6)将步骤5)制得的海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊0.1ml与0.1ml混入20ml生理盐水，加入20颗粒径为5mm的玛瑙球，共同放置于三角瓶内，在37度，170r/min条件下震荡球磨24小时，微胶囊的完整率保持在95％以上，表明微胶囊具有良好的机械强度。
[0054] 7)将步骤5)制得的海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊，按微胶囊：IgG＝1：20体积比放入FITC标记的IgG(γ-免疫球蛋白)溶液中，振荡孵育24小时，激光共聚焦显微镜下观察，微囊内有明显荧
光信号，表明微胶囊的免疫隔离性能丧失。
[0055] 实施例2
[0056] 1)制备海藻酸钠溶液：2g海藻酸钠溶于200ml去离子水，加MES 2.132g，调节pH值至5.5左右。海藻酸钠分子量320kDa，G/M比55/45。
[0057] 2)过滤1)溶液除杂质。
[0058] 3)将EDC·HCl 1.936g，NHS 1.116g固体用加入步骤2)的海藻酸钠溶液中，活化40分钟。
[0059] 4)将多巴胺盐酸盐1.92g固体用加入步骤3)的海藻酸钠溶液中，在氮气保护下室温反应12小时。
[0060] 5)将400ml乙醇滴加入步骤4)的海藻酸钠溶液中，得到沉淀出的海藻酸钠固体。乙醇洗涤三次，收集产物。
[0061] 6)将步骤5)得到的产物真空干燥，得到多巴胺接枝的海藻酸钠，接枝度26％。
[0062] 7)将6)制得的多巴胺接枝海藻酸钠溶于生理盐水中制备成15g/L的多巴胺接枝的海藻酸钠溶液。
[0063] 8)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶于pH为6.5的
醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为5g/L。其中，壳聚糖分子量45kDa。
[0064] 9)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
[0065] 10)制备多巴胺接枝的海藻酸钙水凝胶微球：将步骤7)制备的多巴胺接枝的海藻酸钠溶液在高压静电场下形成射流，液滴落入步骤10)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，固化30分钟，即获得多巴胺接枝海藻酸钙水凝胶微球。
[0066] 11)将步骤10)制得的水凝胶微球置于pH 7.4的Hepes缓冲体系中，每24小时更换新的Hepes缓冲液，共反应72小时。
[0067] 12)制备多巴胺接枝海藻酸钙/壳聚糖微胶囊：将该半乳糖基海藻酸钙水凝胶微球浸入步骤8)配制的壳聚糖溶液中，水凝胶微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成多巴胺接枝海藻酸钙/壳聚糖微胶囊，显微镜下观察，微囊粒径450μm，球形度好，膜厚度10微米。
[0068] 13)将步骤12)制得的多巴胺接枝海藻酸钙/壳聚糖微胶囊0.1ml与1ml模拟血浆液混合，震荡24小时，微胶囊的球形度良好，未发生明显的膨胀和破碎，表明微胶囊具有良好的血浆稳定性。
[0069] 比较例2
[0070] 1)将海藻酸钠溶于生理盐水中制备成15g/L的溶液。
[0071] 2)制备壳聚糖溶液：将壳聚糖溶于pH为6.5的醋酸-醋酸钠缓冲液，壳聚糖浓度为5g/L。其中，壳聚糖分子量45kDa。
[0072] 3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液。
[0073] 4)制备海藻酸钙水凝胶微球：将步骤1)制备的海藻酸钠溶液在高压静电场下形成射流，液滴落入步骤3)配制的氯化钙凝胶浴溶液中，固化30分钟，即获得海藻酸钙水凝胶微球。
[0074] 5)制备多海藻酸钙/壳聚糖微胶囊：将该海藻酸钙水凝胶微球浸入步骤2)配制的壳聚糖溶液中，水凝胶微球与壳聚糖溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成海藻酸钙/壳聚糖微胶囊，显微镜下观察，微囊粒径450微米，球形度好，膜厚度10微米。
[0075] 6)将步骤5)制得的海藻酸钙/壳聚糖微胶囊0.1ml与1ml模拟血浆液混合，震荡24小时，微胶囊的粒径膨胀至550微米，破碎率达到90％以上。
[0076] 实施例3
[0077] 1)制备半多巴胺修饰海藻酸钠溶液：多巴胺海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的半乳糖基海藻酸钠溶液，无菌过滤。其中，多巴胺修饰海藻酸分子量为350kDa。
[0078] 2)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液，无菌过滤。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
[0079] 3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液，过滤除菌。
[0080] 4)制备包裹猪肝细胞的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸包埋型水凝胶微球载体：取3mL多巴胺修饰海藻酸钠溶液，加入6*10^6个大鼠原代肝细胞，混合均匀后，使用静电液滴法制备包埋有猪肝细胞的水凝胶微球。
[0081] 5)制备包裹肝细胞的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将包埋有猪肝细胞的多巴胺修饰海藻酸钙包埋型水凝胶微球浸入步骤2)制备的α-聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊。
[0082] 6)将包埋有猪肝细胞的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊制备成体外人工肝系统，用于肝衰狗的动物模型，狗的肝衰症状得以纠正，血氨指标恢复正常，该微胶囊在人工肝系统保持形态完整。
[0083] 实施例4
[0084] 1)制备半多巴胺修饰海藻酸钠溶液：多巴胺海藻酸溶于生理盐水中制备成15g/L的半乳糖基海藻酸钠溶液，无菌过滤。其中，多巴胺修饰海藻酸分子量为350kDa。
[0085] 2)制备α-聚赖氨酸溶液：将α-聚赖氨酸溶于生理盐水中制备成5g/L的α-聚赖氨酸溶液，无菌过滤。其中，α-聚赖氨酸分子量30kDa。
[0086] 3)配制凝胶浴溶液：无水氯化钙溶于去离子水中制备成11g/L的氯化钙溶液，过滤除菌。
[0087] 4)制备包裹L-天门冬酰胺酶的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸包埋型水凝胶微球载体：取3mL多巴胺修饰海藻酸钠溶液，加入3mg L-天门冬酰胺酶，混合均匀后，使用静电液滴法制备包埋有L-天门冬酰胺酶的水凝胶微球。
[0088] 5)制备包埋有L-天门冬酰胺酶的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊：将包埋有L-天门冬酰胺酶的多巴胺修饰海藻酸钙包埋型水凝胶微球浸入步骤2)制备的α-聚赖氨酸溶液中，包埋型水凝胶微球与α-聚赖氨酸溶液体积比为1:10，反应10分钟，生理盐水洗涤，制备成多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊。
[0089] 6)将包埋有L-天门冬酰胺酶的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊注射入患有淋巴肉瘤的小白鼠体内，第69天后发现淋巴肉瘤增殖，而只注射生理盐水的小白鼠，第20天后即发现淋巴肉瘤增殖，说明包埋有L-天门冬酰胺酶的多巴胺修饰海藻酸钙/α-聚赖氨酸微胶囊能在很长时间内阻止淋巴肉瘤的生长。
