技术领域

本发明涉及生物材料领域。具体地说是一种将克隆的人血管内皮生长 因子hVEGF165cDNA克隆至pET28a(+)，在体外表达了hVEGF165c，经 分离纯化后免疫动物，制备多克隆兔抗人血管内皮生长因子抗体的方法。

                         技术领域

近年来，血管内皮生长因子VEGF在生理、病理方面作用机制的研究 逐步阐明，VEGF对机体正常功能的维持及在疾病发生发展中的意义日益 受到重视，尤其是人类疾病血管化治疗和抗VEGF治疗肿瘤等临床研究的 需要，hVEGF和其抗体的社会需求明显增加，但机体中对VEGF这样的 稀有抗原获得困难，传统抗体制备方法在制备抗VEGF抗体上存在难以克 服的缺陷。例如：传统制备抗VEGF的多克隆抗体，均采用生化分离的方 法从人血清中分离，纯化少量的抗原与弗氏佐剂等一些免疫增强剂合并使 用来制备相应的多克隆抗体，这种方法的弊端是：第一，纯化难度大。由 于VEGF在人体血清中占的比例相当小，要纯化出足够量的VEGF来制备 抗体，需要纯化大量的血液。第二，纯化的精度有限。由于血清中有大量 与VEGF的理化性质相似的细胞因子，要将它们完全区分开来，并使用 VEGF达到很高的纯度，需要很多道程序。第三，费用昂贵。要想得到足 够多的纯人血管内皮生长因子，需要先进的仪器、大量的原材料和人力。 这样，最后的得到的抗体就相当昂贵。

                         发明内容

本发明的目的是将人血管内皮生长因子基因克隆至原核表达质粒中， 并在大肠杆菌中大量表达并纯化，经免疫家兔，以得到特异性好，浓度高 的抗体，从而能大量制备出廉价的、高质量的抗人血管内皮生长因子抗体。

实现本发明的具体技术方法是：在于生产抗人血管内皮生长因子的多 克隆抗体，包括在兔、羊、鼠动物体内制备相应动物来源的抗人血管内皮 生长因子多克隆抗体，它至少包括，脐静脉内皮细胞培养、扩增、酶切、 人血管内皮生长因子基因序列的测定、感受态细胞的制备与重组质粒的转 化、重组克隆的筛选及酶切的鉴定、进行质粒的大量扩增7个步骤。

本发明抗体的制备具体步骤：

步骤1)、脐静脉内皮细胞培养：按常规方法用0.25％胰蛋白酶消化人 脐静脉，获得血管内皮细胞，用含10％胎牛清、5μg内皮来源的生长因子 及100μg肝素M199培养基培养，5天后收获细胞，用Trizol试剂提取RNA。

步骤2)、RT-PCR(扩增)：用Promega公司的试剂盒及5μg总RNA， 进行RT-PCR。

步骤3)、酶切：将PCR产物经BamHI及EcoRI酶切后连接到pBluescript SK+(简称PBS)。

步骤4)、VEGF165cDNA序列的测定：将已克隆载体(pBluescript SK+)中的VEGF165cDNA进行测序，测序结果显示其序列与基因库完全 一致。

1   atgaactttctgctgtcttgggtgcattggagccttgccttgctgctctacctccaccat

61  gccaagtggtcccaggctgcacccatggcagaaggaggagggcagaatcatcacgaagtg

121 gtgaagttcatggatgtctatcagcgcagctactgccatccaatcgagaccctggtggac

181 atcttccaggagtaccctgatgagatcgagtacatcttcaagccatcctgtgtgccctg

241 atgcgatgcgggggctgctgcaatgacgagggcctggagtgtgtgcccactgaggagtcc

301 aacatcaccatgcagcttatgcggatcaaacctcaccaaggccagcacataggagagatg

361 agcttcctacagcacaacaaatgtgaatgcagaccaaagaaagatagagcaagacaagaa

421 aatccctgtgggccttgctcagagcggaagaaagcatttgtttgtacaatatccgcagacg

481 tgtaaatgttcctgcaaaaacacagactcgcgttgcaaaggcgaggcagcttgagttaaac

541 gaacgtacttgcagatgtgacaagccgaggcggtga

步骤5)、感受态细胞的制备及重组质粒的转化：用无菌接种棒从-75 ℃保存的DH5α菌株蘸少许菌液划LB琼脂盘(无氨苄青霉素)，37℃培 养过夜后挑取单个克隆接种于5ml LB培养基中，细菌培养于摇床中37℃、 200转/分震荡培养20小时。取0.5ml该菌液接种于5ml LB培养基中(含 氨苄青霉素)300转/分培养至OD6000.4之后在4℃离心机中4000转/分离 心10分钟。弃上清，以5ml预冷的0.1M氯化钙(无菌)重悬沉淀，冰浴 30分钟后再次离心，沉淀以2ml氯化钙重悬，4℃放置16小时，分装备用， 剩余的加25％甘油储存于-80℃。取5ul DNA连接产物加入200ul感受态细 胞中，轻轻旋转数次使DNA分散均匀，冰浴中30分钟，42℃水浴中热休 克90秒，再次冰浴2-3分钟后加不含氨苄青霉素的LB培养基600ul于37 ℃200转/分复苏45分钟后，以200ul菌液铺盘(LB琼脂培养盘，含氨苄 青霉素70ug/ml)，37℃培养过夜。

步骤6)、重组克隆的筛选及酶切鉴定：从上述培养盘中挑取5个克隆 接种于5ml含氨苄青霉素70ug/ml的LB培养基中，剧烈震荡300转/分培 养16小时，以miniprep方法小量提取质粒DNA，限制性内切酶和消化， 电泳鉴定DNA目的片断是否正确构建于表达载体的阅读框中。(见图4)

步骤7)、选鉴定正确克隆的菌液接种于大量LB培养基中(含氨苄青 霉素70ug/ml)进行质粒的大量扩增，去内毒素质粒大量提取试剂盒提取 纯化。

本发明所述制备的抗体，包括在兔、羊、鼠等动物体内制备相应的动 物来源的抗人血管内皮生长因子多克隆抗体，这些多克隆抗体在体内外均 可特异性的与人血管内皮生长因子结合。阻断人血管内皮生长因子的生物 活性。

本发明采用分子克隆将人血管内皮因子反向克隆于更高效的质粒表 达载体pcDND3.1中可形成一种用于疾病抗血管生成的基因制剂，此制剂能 够在骨骼肌、心肌、血管内皮细胞等多种组织器官中能高效表达目的基因， 从而促进这些组织器官中新生血管的形成。

本发明现已保藏于武汉市珞珈山武汉大学内中国典型培养物保护中 心，保藏日期：2002年3月26日，保藏编号：M202012，分类命名： PCDNA3.1-VEGF165大肠杆菌DH5a。

本发明的优越性在于：以pET28a(+)为基础所构建的体外VEGF165 表达系统在BL21中能高效地表达目的蛋白，进一步以成熟的方法进行纯 化、剪切，可方便地获得大量的hVEGF165，满足相关实验的需要。另外， 经此蛋白免疫家兔所制备的兔抗人VEGF血清滴度高、特异性好，完全可 以替代Santa Cruz等的商品抗体。

                         附图说明

图1、目的基因hVEGF165的测序结果示图。

图2、真核表达质粒pcDND3.1-VEGF165构建示图。

图3、重组克隆筛选及酶切鉴定示图。

图4、细菌裂解产物电泳后考马斯亮蓝染色结果示图。

图5、商品抗VEGF抗体与目的蛋白的WesternBlot分析示图。

图6、以抗血清为抗体对细菌产物的WesternBlot分析示图。

图7、注射真核表达质粒后动物组织局部及血管内皮的VEGF表达示 图。

图8、人类胃癌组织中血管内皮生长因子的表达示图。

图9、实验组与对照的VEGF免疫荧光示图。

                         具体实施方式

本发明实施例：

实施例1目的蛋白的表达

1、BL21(DE3)感受态细胞的制备方法(方法同上述DH5α感受态 细胞的制备)。

2、用鉴定正确的pET28a-VEGF165重组质粒转化BL21(DE3)感受 态细胞复苏后取200uL菌液涂于含卡那霉素30ug/ml的LB琼脂培养盘， 37℃培养过夜。挑取生长良好的单个克隆接种于5ml含卡那霉素30ug/ml 的LB培养基中，培养至OD600达0.6-0.8，取出1ml菌液，然后在剩余菌 液中加入IPTG至终浓度1mmol/L，继续诱导培养4小时。同时以 BL21(DE3)-pET28a做阴性对照。

3、采用两种方法检测蛋白的表达情况。首先，将诱导、未经诱导的及 BL21(DE3)-pET28a菌液各1ml室温12000g离心1分钟，弃去上清，沉淀 分别以100ul的1×SDS凝胶加样缓冲液重悬，100℃煮沸3分钟，然后以 12000g离心1分钟，在15％SDS聚丙烯酰胺凝胶中各加入20ul悬液，电 泳后凝胶经考马斯亮蓝染色脱色液I、II脱色后检测融合蛋白表达情况。 其次，用同样的方法进行蛋白的诱导表达，以商品抗VEGF多克隆抗体进 行Western Blot检测。(见图5、图6)

实施例2  多克隆抗体的制备

1、证实有目的蛋白表达后，用实例2-3中同样的方法大量诱导扩增 BL21(DE3)-pET28a/VEGF165菌株，菌液离心、超声破碎后，经15％SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后回收所表达的目的蛋白条带。收集足够量的蛋白质 后，免疫家兔并在初次免疫一月后用半量抗原进行加强免疫。

2、抗体的检测：加强免疫后一周从兔的耳缘静脉采血制备血清。以抗 血清为抗体对细菌目的蛋白条带和动物组织中的VEGF进行检测，确定抗 体滴度和特异性。

结果1、目的蛋白获得了高效的表达。2、在稀释度为1∶200的条件 下，VEGF抗血清与商品化的抗体(1∶700)在检测目的蛋白方面无明显 的差异。3、经动物实验以免疫组化的方法证明抗血清能有效的识别动物组 织中的VEGF。(见图7、图8、图9)

实施例3  人血管内皮生长因子基因对大鼠股动脉缺血模型的干预

1、从同济医科大学实验动物中心购买成年Westar大鼠(体重250-300 克)13只，丝线结扎大鼠双侧股动脉，造成下肢缺血模型。术后10天， 以pcDNA3.1/VEGF165 200ug注射于缺血的股肌(注射组7只14条后肢， 对照组6只12条后肢)。

2、质粒注射后2周，用3％戊巴比妥钠麻醉，切开腹壁、分离腹主动 脉，经腹主动脉插管行下肢动脉造影、摄片，造影完毕，取出大鼠结扎线 以下部位的肌肉，部分冰冻切片机中的切片，以抗VEGF抗体(兔抗人血 清，购自美国Santa Cruz公司)为第一抗体行免疫荧光分析，观察肌肉细 胞及新生血管内皮的VGEF表达情况。

实验组与对照组的免疫荧光结果如下：

结果：1、按Genbank序列成功地克隆了人VEGF165cDNA并构建了 重组真核表达质粒pcDNA3.1/VEGF165。2、实验组比对照组有明显的下 肢肌肉萎缩，且无明显的侧肢循环形成。3、免疫荧光显示与对照组相比实 验组肌肉组织有VEGF的高表达。(见图10)

实施例4  VEGF基因促进猪心肌血运重建的实验研究

1、克隆并经测序的人类VEGF165cDNA(560bp)BamHI/EcoRI片段 克隆至质粒载体pcDNA3.1(购自Stratagene公司)，构成pcDNA3.1hVEGF， 并在大肠杆菌DH5α中扩增，用Qiagen去内毒素试剂盒(德国Qiagen公 司)提取和纯化，溶解于去离子水中并测定浓度后备用。

2、从中国农业大学购得中国实验小型猪11只，体重29.3±4.3kg。将 实验用小型猪静脉复合麻醉，气管内插管，呼吸机(SH-500B型)机械通 气。经左前外侧第2肋间开胸，切开心包，显露左冠状动脉回旋支(LCX)， 游离其近心端，放置内径2.5mm的Ameroid收缩环(Research Instrument SW，USA)，关闭心包，放置胸腔引流管后关胸。术后心电监测待自主呼吸 完全恢复后拔除气管插管及胸腔引流管。术后6周行冠脉造影时，确定LCX 狭窄>95％为选用模型。

3、将选用模型随机分为治疗组(n＝6)和对照组(n＝5)。同上麻醉和 辅助呼吸下，经左前外侧第4肋间二次开胸，剥离心包，显露心脏。治疗 组将pcDNA3.1hVEGF 500μg用生理盐水稀释至2ml，在左室前侧壁用 6-0prolene线标记10个注射位点，每点间距为1cm，用携25#针头的1ml 注射器，分别向每个标记处心肌中层注射0.2ml(50μg)pcDNA3.1hVEGF。 对照组用相同方法注射等量空质粒。关胸及术后处理同前述。治疗后第6 周，在全麻下正中开胸，游离心脏，注入过量氯化钾溶液使心脏停跳，在 注射区域随机选取5～8处全壁心肌组织(以注射点为中心，直径为0.6～1cm) 分别进行心肌血管密度和免疫组织化学方法研究VEGF蛋白表达(所用抗 体来自美国JacksonImmunResearchLab公司和同济医院心血管研究室)。

结果1、与对照组对比，治疗组局部心肌血管面积、血管周长及血管 数目均增多；2、免疫荧光显示治疗组心肌VEGF基因mRNA高表达。

结论 所构建的真核表达质粒pcDNA3.1-VEGF165在猪缺血心肌模 型中可高效表达hVEGF165，促进猪缺血心肌中侧枝循环的建立及改善缺 血区域心肌功能。

<110>华中科技大学同济医学院附属同济医院

<120>人血管内皮生长因子及其多克隆抗体的制备与真核表达载体的构建方法

<140>02115773.1

<141>2002-04-28

<160>2

<210>1

<211>576

<212>DNA

<213>人(Homo sapiens)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(576)

<400>I

atg aac ttt ctg ctg tct tgg gtg cat tgg agc ctt gcc ttg ctg    45

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu

1               5               10               15

ctc tac ctc cac cat gcc aag tgg tcc cag gct gca ccc atg gca    90

Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala

20              25               30

gaa gga gga ggg cag aat cat cac gaa gtg gtg aag ttc atg gat    135

Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp

35              40              45

gtc tat cag cgc agc tac tgc cat cca atc gag acc ctg gtg gac    180

Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp

             50               55               60

atc ttc cag gag tac cct gat gag atc gag tac atc ttc aag cca    225

Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro

             65              70               75

tcc tgt gtg ccc ctg atg cga tgc ggg ggc tgc tgc aat gac gag    270

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

            80              85              90

ggc ctg gag tgt gtg ccc act gag gag tcc aac atc acc atg cag    305

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile The Met Gln

            95              100              105

att atg cgg atc aaa cet cac caa ggc cag cac ata gga gag atg    360

Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met

               110               115               120

agc ttc cta cag cac aac aaa tgt gaa tgc aga cca aag aaa gat    405

Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp

              125               130               135

aga gca aga caa gaa aat ccc tgt ggg cct tgc tca gag cgg aga    450

Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg

               140               145               150

aag cat ttg ttt gta caa gat ccg cag acg tgt aaa tgt tcc tgc    495

Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys

             155               160             165

aaa aac aca gac tcg cgt tgc aag gcg agg cag ctt gag tta aac    540

Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Lcu Asn

              170                175               180

gaa cgt act tgc aga tgt gac aag ccg agg egg tga

Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

           185             190

<210>2

<211>192

<212>PRT

<213>人(Homo sapiens)

<400>2

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu

1               5               10              15

Leu Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala

20              25               30

Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp

35              40              45

Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp

             50               55               60

Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu lle Glu Tyr Ile Phe Lys Pro

             65              70               75

Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

            80              85              90

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile The Met Gln

            95              100              105

Ile Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met

               110               115               120

Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp

              125               130               135

Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg

               140               145               150

Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys

             155               160             165

Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn

              170                175               180

Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

           185             190