本发明涉及过饱和的钙和磷酸根离子溶液的制备方法和利用上述溶 液在固体表面上制备磷酸钙结晶薄膜的方法。具体地说，降低温度和/或利 用抑制水溶液中磷酸钙成核作用的适宜缓冲体系，因此，可以制备高度过 饱和的钙和磷酸根离子的溶液。利用上述的溶液，在固体表面上可以迅 速而在高反应性和低结晶度方面高质量的制备磷酸钙结晶的薄膜。

已知磷酸钙结晶具有生物适应性。磷灰石结晶仅是钙化组织中的一 种类型的磷酸钙结晶(H.-M.Kim等，J.Bone Miner.Res.10，1589-1601(1995)； USP 5565502；和USP5691397)，已用作骨的基材。通过在金属或用作固体 颗粒的生物材料表面生成磷灰石层，也广泛用于提高对组织的生物适应性 (R.G.T.Geesink，Clin.Orthop.Relat.Res.261，39-58(1990)；和M.G.Dunn和 S.H.Maxian，J.Long Term Effect.Med.Implants，1，193-203(1991))。

迄今，为了利用磷酸钙结晶提高生物适应性，对生成磷酸钙结晶，特别是 在钛等之类基材的表面上形成磷灰石层，已经开发出了各种各样的涂覆方 法。已经最广泛使用等离子体涂覆法。用等离子体涂覆，生成磷灰石层并 在高温下生长，因此由于高结晶度和大的结晶尺寸，它包括具有低生物适应 性的羟基磷灰石。已知除磷灰石结晶之外，还生成了磷酸钙的其它相或 氢氧化钙之类的副产物(H.-G.Pfaff等.，Properties of HA-Coatings in “Bioceramics”，vol.6，eds.，p.Ducheyne and D.Christiansen，pp.419-424， Buterworth-Heinemann Ltd.(1993))。已经清楚地证实，上述副产物对生物适 应性有负作用。因此，需要开发一种方法，该方法生成的磷灰石结晶层与骨 磷灰石结晶具有相似的性质，即由于结晶的小尺寸，由于低结晶度和广泛的 反应表面积，在基材表面上具有合适的生物适应性。

由钙、磷酸根和羟基离子组成的纯羟基磷灰石结晶是高结晶度的化 学计算量的棒状结晶，而把骨组织或钙化的软骨组织隔离开的生物结晶 是低结晶度的非化学计算量的磷灰石(Elliott J.C.磷灰石和其它正磷酸钙 的结构和化学研究，Studies in Inorganic Chemistry 18，Amsterdam： Elsevier，pp 111-190(1994))。生物结晶是极小的纳米晶体的薄片(骨是 27.3×15.8nm，钙化的软骨组织是103×68nm长×宽)纳米晶体的薄片有极 大表面积，具有高表面反应性的代谢活性(H.-M.Kim等，J.Bone Miner.Res. 10：1589-1601(1995)，Posner A.S等.骨骼研究：实验方法，Academic Press： New York，pp 167-192(1979))。

为了生成生物晶体的拟态的晶体学性质的结晶层，通过利用钙和磷酸 根离子的溶液，已经开发出了在低温下直接在固体表面上生成结晶层的方 法。但是，由于过饱和溶液中的自发成核作用，不能保持高的离子浓度，因 此，难以保持溶液产物[Ca2+]×[HPO2-4]的浓度在6mM2之上(H.B.Wen 等，J.Biomed.Mater.Res.41，227-236(1998))。此外，在这种低过饱和浓度时， 把溶液施加于固体表面形成结晶层对温度和固体表面的条件要求是非常 严格的。也就是说，温度必须保持在约37℃且涂布过程要求很长时间， 根据表面情况要一个月以上。温度控制了结晶层的晶体学特性。此外， 需要如此低的温度是与在表面上温度的敏感性和生物活性材料结晶有 关。因此，在温度必须控制或降低的情况下，不能采用上述的方法。在 许多情况下，仅能用于基材是带电的表面。

本发明的发明人已经开发出了过饱和的钙和磷酸根离子溶液的制备 方法和利用上述溶液在固体表面上制备磷酸钙结晶薄膜的方法。具体地 说，降低温度和/或利用抵制水溶液中磷酸钙成核作用的适宜的缓冲体 系，能够制备高度过饱和的磷酸钙溶液。和通过利用上述溶液，能够在 固体表面上迅速和在高反应性与低结晶度方面都优质的制备磷酸钙结晶 薄膜。按照本发明制备的磷酸钙结晶薄膜也具有生物适应性。

发明概述

本发明的目的是提供保持钙和磷酸根离子高浓度的磷酸钙过饱和溶 液的制备方法。

本发明的另一目的是提供利用上述溶液在固体表面上迅速和在高反 应性与低结晶度方面都优质的磷酸钙结晶薄膜制备方法。

附图简述

图1是磷灰石晶体的扫描式电子显微镜照片(×10000)。

图2是在纤维表面上生成的磷灰石结晶的薄膜上人工培养的纤维细 胞的扫描式电子显微镜照片(×1300)。

本发明的详细描述

本发明提供了保持钙和磷酸根离子高浓度的磷酸钙过饱和溶液的制 备方法，该方法包括步骤：

1)通过将磷酸钙结晶或钙盐和磷酸盐溶解在酸性溶液中，制备钙 和磷酸根离子的高浓溶液(步骤1)；

2)在低温下，将步骤1的高浓度的钙和磷酸根离子的酸性溶液与 碱性溶液混合(步骤2)；和

3)从步骤2制备的溶液中排除可以用作结晶成核作用和生长的核 的非晶形的磷酸钙颗粒或晶体，以进一步抑制溶液中的成核反应 和晶体的生长(步骤3)。

在步骤2中，低温抑制了溶液中磷酸钙均匀地成核作用，因此，节 省了后面用于磷酸钙薄膜制备的自由离子。通过利用合适的缓冲体系更 增强了对副作用的抑制。

在本发明中可使用任何钙盐和磷酸盐。在本发明中也可以使用任何 磷酸钙晶体。在本发明中可以使用的磷酸钙晶体是通过已知的合成方法 制备的。例如，如C。Rey等所公开的方法[Calcif.Tissue Int.45，157-164(1989)； 和Calcif.Tissue Int.46，157-164(1990)]，将四水硝酸钙溶在蒸馏水中生成 的溶液与溶在蒸水中的氨水溶液迅速地混合，过滤后冷冻干燥，得到磷 灰石。二水氯化钙和磷酸二氢钾也可以采用。在本发明中所使用的磷灰 石结晶也是通过将磷灰石与骨分离得到的(H.-M.Kim等，J.Bone Miner，Res.10，1589-1601(1995))。在使用合成磷酸钙结晶的情况下，其优 点是得到的溶液中包含的离子仅限于包括在结晶中的离子，如钙离子、 磷酸根离子、碳酸根离子等。通过用酸溶液使钙化的组织脱钙化制备的 溶液可以在步骤2中使用。

用于溶解上述磷酸钙结晶的酸溶液可以是任何的酸。例如，一般的 有机酸如N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]、N-三-[羟甲基]甲基-2-氨基 乙烷磺酸、1，4-哌嗪二乙烷磺酸、(3-N-吗啉代)丙烷磺酸和乙酸；无 机酸如盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、磷酸、硝酸和碳酸，或它们的混 合酸也可用于酸性溶液。优选使用盐酸和N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷 磺酸]。然后，将磷酸钙结晶溶解得到超浓的溶液，在此情况下，能够生 成结晶沉淀物，用碱性溶液制成混合物。

将碱性溶液加入磷酯钙在其中溶解的酸性溶液中，沉淀析出非晶形 的磷酸钙颗粒。此时，为了抑制溶液中磷酸钙的成核作用(节省自由离 子)，两溶液的温度和反应温度保持低温。温度优选保持在0-37℃。

作为碱性溶液，通常的无机碱类溶液如氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶 液、氢氧化锂溶液、氢氧化钙溶液、氢氧化镁溶液和氢氧化铵溶液；有 机碱选自三个[羟甲基]氨基甲烷、二[2-羟乙基]氨基三个[羟甲基]甲烷 和1，3-双[三个(羟甲基)甲基氨基]丙烷等，或它们的混合物可以采 用。根据优选的pH值，考虑每一种缓冲剂的缓冲范围，选择有机缓冲剂。 在关键温度下可以制备过饱和的磷酸钙离子溶液，在使用有机缓冲剂的 情况下比使用无机碱的情况可以制备更高的过饱和磷酸钙离子溶液。

混合物溶液的pH值，通过加入碱性溶液设定在6.0-8.0，优选在 7.0-7.6。磷酸钙结晶的晶体学特性取决于pH值。因此，通过控制pH值 可以得到所要求类型的结晶。为得到磷酸氢二钙二水合物结晶、磷酸八 钙结晶和广泛用作生物材料的磷灰石结晶膜的过饱和溶液的pH值分别为 6.0-6.5、6.5-6.8和6.8-8.0。

为了通过上述溶液得到的磷灰石膜有均匀的表面，优选除去在溶液中 产生的非晶形的磷酸钙颗粒。用碱溶液中和后通过常规过滤和离心分离 从溶液中除去非晶形的磷酸钙颗粒。在过滤的情况下，微生物可以同时 被排除，因此，不需要进一步的灭菌作用。

按本发明根据于反应条件制备的磷酸钙过饱和溶液的产物的离子浓 度为6.0-30.0mM2[Ca2+]×[HPO2-4]。在上述过程中，虽然离子浓度高到通 过均匀地成核作用足以生成沉淀物，但是，由于低温抑制了在这种溶液中 沉淀物或结晶的形成。然而，当溶液与固体表面接触时，由于超出了成 核作用的抑制效果的不均匀地成核作用，可能在固体表面生成结晶，并 附着在其上且在其上生长。

但是，由于在这种溶液中的自由离子的浓度很高，因此在低温下或 甚至需要高能量例如在有缺陷的带电表面上，由于不均匀地成核作用， 易于生成结晶。结果是，即使在通过以前开发的技术不可能生成结晶的 条件下，也能在各种材料的表面生成磷酸钙结晶薄膜。

此外，本发明提供的磷酸钙结晶薄膜的制备方法包括步骤：

1)通过将磷酸钙结晶或钙盐或磷酸盐溶于酸性溶液中制备高 浓的钙和磷酸根离子的溶液(步骤1)；

2)将步骤1制备的高浓度的钙和磷酸根离子的酸性溶液在低 温下与碱性溶液混合(步骤2)；

3)从步骤2制备的溶液中排出用作晶体成核作用或生长的核 的非晶形磷酸钙颗粒或结晶，抑制溶液中晶体的进一步成核 作用和生长(步骤3)；和

4)将步骤3制备的溶液涂布到固体表面，生成磷酸钙结晶的 薄膜(步骤4)。

通过钙和磷酸根离子的上述的过饱和溶液与固体表面接触可以制备 磷酸钙结晶的薄膜并可以使其成长。

在步骤4中，在固体表面上开始成晶的成膜温度为0-60℃，优选0- 37℃，而结晶在0-60℃生长并形成结晶。根据反应条件和表面类型可以 改变初始步骤和生长与形成结晶步骤的时间期间。

生成结晶膜的表面包含各种材料的表面，如金属、陶瓷、有机聚合 物、玻璃、动物或植物的生物组织等。例如，上述的溶液可以涂布到多 孔聚合物如聚乙醇酸、聚乳酸、聚(乳酸-乙醇酸)共聚物，制备磷酸钙 磷灰石薄膜，它们增加药物的利用和细胞的传递，以及用于不生长骨的 支架结构。

并且，材料的几何结构不限。所以，可为各种各样的结构，如平板、 圆筒体、立方体、圆锥体、方形柱体、它们的组合体等。固体表面可不 带电荷，也可以带电荷。

按本发明制备的钙和磷酸根离子的过饱和溶液通过降低温度可以浓 缩到很高的浓度。降低温度抑制了磷酸钙的均匀成核作用。通过使用适 合的缓冲体系，即通过选择适合的酸性溶液和适合的碱性溶液，高浓的 溶液可以进一步保持稳定。

具体地说，本发明的磷酸钙过饱和溶液的浓度与现有技术相比是极 度高的，在任何固体表面上可以迅速地生成磷酸钙结晶薄膜，所述的固 体表面是金属表面、陶瓷表面、有机聚合物表面、玻璃表面、动物或植 物的组织表面等。此外，通过使用上述溶液，甚至在很低的温度0-60℃ 下，在固体表面上也能生成磷酸钙结晶薄膜。而且，使用上述溶液制备 的磷酸钙结晶薄膜具有生物适应性，允许各种各样的细胞如成纤维细胞、 成骨细胞、破骨细胞、牙周韧带细胞等在表面附着或增殖和具有生物材 料的潜在应用性。

实施和提出的本发明的优选方案用下述的实施例加以说明。

但是，本领域内的技术人员应当理解，这是考虑公开本发明，在不 背离本发明的精神和范围的情况下，对本发明可以作出修改和改进。

实施例1过饱和磷酸钙溶液1的制备

将17.7毫克的四水硝酸钙溶于250毫升蒸馏水中的溶液、40毫克磷 酸氢二铵的溶液和溶于500毫升蒸馏水中的液氨1毫升迅速地混合，过滤 和冷冻干燥后得到磷灰石结晶。将400毫克磷灰石结晶溶于40毫升0.2M 的盐酸中，制备含磷酸钙离子的的酸性离子溶液。用0.2M的盐酸稀释酸 性溶液，使得磷酸钙的浓度达到15％。该溶液与0.2N的氢氧化钠溶液混 合，搅拌制备pH值为7.4的离子溶液。所有上述溶液的温度都保持在4℃。 此时，迅速地生成非晶形的磷酸钙。但是，由于低温，在生成的非晶形的磷 酸钙颗粒中没有自由离子参加，并且沉淀出结晶的量慢慢减少和达到平 衡。该溶液在4C保持10分钟，然后，产生的非晶形的磷酸钙通过用0.2 微米尺寸的过滤器过滤除去制得中性离子缓冲溶液。

制备溶液的离子产物浓度用原子吸收光谱(Perkin ElmerUSA)和比 色分析法测定为15-20mM2[Ca2+]×[HPO2-4]，即该溶液是过饱和的溶液。

上述制备的过饱和溶液在4C到使用。

实施例2过饱和磷酸钙溶液2的制备

用与实施例1相同的条件制备磷酸钙溶液，不同的是用0.2M的三[羟 甲基]氨基甲烷的溶液代替0.2N氢氧化钠制备pH值为7.4的三个[羟甲基] 氨基甲烷．盐酸缓冲溶液。

所制备溶液的离子产物的浓度用原子吸收光谱(Perkin ElmerUSA) 和比色分析法测定为15-20mM2[Ca2+]×[HPO2-4]，即该溶液是过饱和的溶 液。

上述制备的过饱和溶液在4℃到使用。

实施例3过饱和磷酸钙溶液3的制备

用与实施例l相同的条件制备磷酸钙溶液，不同的是改变酸性溶液。

使用N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]和盐酸代替0.1N的盐酸水溶 液加入0.2M N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[-乙烷磺酸]溶液，在此过程中，它们 的pH值在4℃保持。含钙和磷酸根离子的酸性溶液与0.2N氢氧化钠混 合后，搅拌制备pH值为7.4的Hepes缓冲溶液。

所制备的溶液的离子产物浓度用原子吸收光谱(Perkin ElmerUSA) 和比色分析法测定为15-20mM2[Ca2+]×[HPO2-4]，即该溶液是过饱和的溶 液。

上述制备的过饱和溶液在4℃到使用。

实施例4过饱和磷酸钙溶液4的制备

通过与实施例1相同的条件制备磷酸钙溶液，不同的是将93毫克二水 氯化钙和52毫克磷酸二氢钾直接溶于75毫升0.2M的盐酸中。

所制备溶液的离子产物的浓度用原子吸收光谱(Perkin ElmerUSA) 和比色分析法测定为15-20mM2[Ca2+]×[HPO2-4]，即该溶液是过饱和的溶 液。

上述制备的过饱和溶液在4℃到使用。

实施例5过饱和磷酸钙溶液5的制备

通过与实施例4相同的条件制备磷酸钙溶液，不同的是使用0.2M三[羟 甲基]氨基甲烷的碱性溶液代替0.2M氢氧化钠溶液，制备pH值为7.4的 三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸缓冲溶液。

所制备溶液的离子产物的浓度用原子吸收光谱(Perkin ElmerUSA) 和比色分析法测定为15-20mM2[Ca2+]×[HPO2-4]，即该溶液是过饱和的溶 液。

上述制备的过饱和溶液在4℃到使用。

实施例6过饱和磷酸钙溶液6的制备

通过与实施例4相同的条件制备磷酸钙溶液，不同的是改变酸性溶 液。

利用N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸和盐酸代替盐酸制备酸性溶 液。O.1N盐酸溶液加入0.2M N-[2-羟乙基]哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]溶液，在 该过程期间，它们的pH值在4℃保持。含钙和磷酸根离子的酸性溶液与 0.2N氢氧化钠溶液混合，搅拌制备pH值为7.4的Hepes缓冲溶液。

所制备溶液的离子产物的浓度用原子吸收光谱(Perkin ElmerUSA) 和比色分析法测定为15-20mM2[Ca2+]×[HPO2-4]，即该溶液是过饱和的溶 液。

上述制备的过饱和溶液在4℃到使用。

实施例7过饱和磷酸钙溶液7的制备

将实施例1制备的过饱和溶液倒入培养皿中(Corring，USA)，在8℃培 养2天。然后，温度升到20℃，被涂覆的培养皿在20℃温度下继续培养24 小时形成薄膜。

通过扫描式电子显微镜(SEM)(840A，JEOL，Japan)检验磷酸钙磷灰石 结晶的薄膜。图1示出了表面的SEM照片(×10000)。如图1所示，按本 发明制备的磷灰石薄膜有均匀的结晶尺寸和稳定的结构。在培养皿上结 晶的尺寸长度为16.7±3.7纳米和宽度为12.2±2.4纳米(n＝50)。

从培养皿表面削去的结晶的长度通过在100mA和50kv下粉末X-射线 衍射(XRD)(MXP 18，Mac Science，Japan)测定。

结果证实，在薄膜中没有磷酸钙结晶的其它相，只有磷灰石。磷灰 石结晶的X-射线衍射谱图已经证实，磷灰石是低结晶度，与骨组织结晶 的相似(参见表1)。结晶极度小的尺寸可以得到极大的比表面积，这就 能够使它们在细胞中强烈地相互作用或提供高表面反应性的有机环境。

表1

磷酸钙结晶的XRD数据     2θ   d     I(cps)     I/I     FWHM     22.70   3.9139     714     255     0.58     25.98   3.4267     832     745     0.44     27.84   3.2019     686     251     0.32     31.72   2.8185     828     807     0.38     32.16   2.7809     865     1000     0.44     33.14   2.7009     627     218     0.20

实施例8-12磷灰石薄膜2-6的制备

在与实施例7相同的条件下，通过使用实施例2-6制备的溶液，分别 制备磷灰石的薄膜。

所制备的磷灰石薄膜的SEM照片与实施例7制备薄膜相似。也就是 说，所制备的磷灰石薄膜有均匀的结晶尺寸和稳定的结构。

实施例13磷灰石薄膜1的制备和生物适应性试验

在与实施例7相同的条件下，制备磷灰石薄膜，不同的是利用 polyglactin910(vicryl)纤维代替培养皿。然后，将在纤维上生成磷灰石薄 膜置入L929成纤维细胞(ATCC NTCC克隆929)培养介质中并在37℃ 输送95％空气和5％二氧化碳的气氛下进行培养。在三天之后，用SEM (X1，300)检验纤维。

如图2所示，细胞附着在磷酸钙磷灰石薄膜上并均匀而稳定地增殖。 结果证实，按本发明制备的磷酸钙磷灰石薄膜具有生物适应性。

实施例14-18磷灰石薄膜2-6的制备和生物适应性试验

在与实施例13相同的条件下，利用实施例2-6制备的溶液分别制备 磷灰石薄膜。然后，在与实施例13相同的条件下，在上述磷灰石薄膜上 培养成纤维细胞。所制备的磷灰石薄膜的SEM照片与实施例13所制备 的薄膜相似。也就是说，细胞附着在磷酸钙磷灰石薄膜上并在其上均匀 而稳定地增殖。

本发明的技术背景