马尾藻多糖在制备防治尿结石的药物中的应用
阅读：538发布：2021-06-09
专利汇可以提供马尾藻多糖在制备防治尿结石的药物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 马 尾藻多糖在制备 预防 和 治疗 尿结石的药物和保健食品中的应用。本发明优点在于：本发明的研究对利用马尾藻多糖开发天然抗 氧 化功效因子、保健食品和尿结石防治药品提供了科学依据，有一定的理论意义和临床应用价值。既为开发应用马尾藻多糖防治尿结石提供重要理论依据；又拓宽了马尾藻的用途，为其他海洋藻类或者海洋 生物 的研究提供一种思维模式，同时也为尿结石防治研究提供一种新型的天然 生物材料 。，下面是马尾藻多糖在制备防治尿结石的药物中的应用专利的具体信息内容。
马尾藻多糖在制备防治尿结石的药物中的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及药品和保健品领域，具体地说，是马尾藻多糖在制备防治尿结石的药物中的应用。
背景技术
[0002] 肾结石的发病率及复发率高，其中草酸钙结石占肾结石的80%以上。泌尿系结石是生物体内病理矿化的产物，是一种世界范围的常见病、多发病, 其发病率呈上升趋势。该病治疗后易复发，10年复发率50%。虽然外科治疗已取得了巨大进展，但其发病率和复发率居高不下，因此针对尿结石展开的各项研究越来越受到重视。
[0003] 鉴于肾结石的高发病率和复发率，临床尚无有效的药物防治；而当前中国存在的对儿童及中老年人的盲目补钙更让结石病的防治雪上加霜。目前用于草酸钙结石的药物包括：维生素E、绿茶、别嘌呤醇、维拉帕米、氧化镁、枸橼酸钾和血管紧张素Ⅱ受体阻断剂等。 [0004] 现阶段，对结石的预防尚无十分理想的方法，反复发作的病情严重地影响着人类的健康，也极大地困扰着泌尿科的医生。近年来微创的冲击波碎石和腹腔内镜技术的广泛使用使本病在手术治疗上取得了成功，但是术后肾脏受损伤，肾结石的复发率一直居高不下，因此，如何有效预防结石的形成，延缓结石的复发,减轻结石病人的痛苦, 具有极为重要的科学和现实意义。
[0005] 海藻硫酸多糖（SPS）是海藻所特有的一类多糖，具有广泛的生物活性，包括抗凝，抗氧化，抗病毒，抗肿瘤和免疫调节活性。但目前关于SPS防治肾结石研究较少，国内仅有 欧阳健明研究小组做了系列关于海藻硫酸多糖体外抑制草酸钙结晶的研究。例如王淼采用过氧化氢法降解产于印尼的海藻异枝麒麟菜硫酸多糖(ESPS)，采用体外模拟方法研究了降解前后ESPS对草酸钙晶体生长的抑制作用。马尾藻产于浙江省的舟山，象山，南麂列岛，福建，广东省台山和澳门等地,，资源十分丰富，目前马尾藻的加工利用范围比较窄，只有小部分被用作饲料、藻胶的原料，部分食用，大部分尚未得到全面的开发利用。目前国内外对马尾藻中的多糖研究多数集中于提取分离、结构分析及抗肿瘤研究。
[0006] 中国专利文献CN1313499C公开了一种海篙子多糖及其制备方法和用途，所述的海篙子多糖品，为海洋植物中的褐藻门Phaeophyta马尾藻科马尾藻属植物海篙子中所提取分离的有效部位多糖，其分子量在400-80000之间，呈固态深棕色，可用作安神、镇定、催眠的药品或作为具有这类药用功能的保健品或食品。中国专利文献CN101940588A公开了苯甲酰化褐藻多糖在制备治疗帕金森病药物中的应用，所述苯甲酰化褐藻多糖为天然褐藻多糖经苯甲酰化后获得，天然褐藻多糖来源于海带或马尾藻、裙带菜、羊栖菜、鼠尾藻、海黍子、昆布等其他褐藻，对神经毒素和高铁诱导的细胞损伤有保护作用。中国专利文献CN1213071C公开了一种古糖酯及其制备方法和应用，所述古糖酯为L-聚古罗糖醛酸-2,3-硫酸酯盐，是一种具有强聚阴离子性质的硫酸多糖类化合物，具有抑制晶体生成、生长、聚集，防止晶体与细胞相互作用等多重功能，可用于制备一种新型的预防和治疗尿路结石症的药物。但是关于马尾藻多糖在制备防治尿结石的药物中的应用目前还未见报道。 发明内容
[0007] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种马尾藻多糖在制备预防和治疗尿结石的药物中的应用。
[0008] 本发明的再一的目的是，提供一种马尾藻多糖在制备预防和治疗尿结石的保健食品中的应用。
[0009] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：马尾藻多糖在制备预防和治疗尿结石的药物中的应用。
[0010] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：马尾藻多糖在制备预防和治疗尿结石的保健食品中的应用。
[0011] 所述的马尾藻多糖的分子量在5000-20000之间。
[0012] 所述的尿结石是肾结石。
[0013] 所述的结石是草酸钙结石。
[0014] 本发明优点在于：本发明的研究对利用马尾藻多糖开发天然抗氧化功效因子、保健食品和尿结石防治药品提供了科学依据，有一定的理论意义和临床应用价值。既为开发应用马尾藻多糖防治尿结石提供重要理论依据；又拓宽了马尾藻的用途，为其他海洋藻类或者海洋生物的研究提供一种思维模式，同时也为尿结石防治研究提供一种新型的天然生物材料。
附图说明
附图说明
[0015] 附图1是马尾藻多糖的Molish反应图。
[0016] 附图2是A空白组大鼠肾组织切片。（HE染色×200）附图3是B单纯诱石组大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图4是C马尾藻多糖低剂量大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图5是D马尾藻多糖中剂量大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图6是E马尾藻多糖高剂量大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图7是F鼠尿液中的草酸钙结石。
附图4是C马尾藻多糖低剂量大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图5是D马尾藻多糖中剂量大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图6是E马尾藻多糖高剂量大鼠肾组织切片。（HE染色×200）
附图7是F鼠尿液中的草酸钙结石。
具体实施方式
[0017] 下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
[0018] 本发明以马尾藻为原料，利用热水浸提法从马尾藻中提取多糖并用三氯乙酸除蛋白和过氧化氢除色素后干燥得到马尾藻多糖。具体制备步骤：取100克马尾藻粉末，加水4500ml，提取温度为60℃、超声时间为45min后，滤过，将滤液进行浓缩至500ml，加入95%乙醇，使乙醇的总浓度达到80%，静置过夜，8000r/min离心10min，将所得到的沉淀用水溶解至100ml，再加入1倍的三氯乙酸除蛋白，除蛋白时间2小时，然后离心15min，离心转速为8000r/min，除去沉淀后收集上清液，调pH值4-5后，添加过氧化氢6%-7%进行脱色，脱色时间5-6h；脱色温度45℃，脱色后干燥得到马尾藻多糖。
[0019] 马尾藻多糖呈浅褐色粉末状，略带海藻腥味，溶于水，易溶于热水，不溶于高浓度乙醇、乙醚、丙酮等有机溶剂中。多糖在Molish反应中产生紫色环，茚三酮反应呈阴性，碘-碘化钾反应呈阴性（棕色 即颜色未变化）。如图1所示，a、b、c、d、A、B、C分别代表半乳糖、葡萄糖、果糖、木糖、甘露糖、岩藻糖和鼠李糖，e、f、D和E都代表样品；可以看出草叶马尾藻多糖中含有半乳糖、葡萄糖和岩藻糖等单糖。
[0020] 需要说明的是，本发明所述的马尾藻多糖为低分子量的马尾藻多糖，分子量在5000-20000之间。
[0021] SD雄性大鼠（购于上海复旦大学实验动物科学部）30只，体重200克左右，随机分成5组，每组6只，在同一环境下适应性喂养1周，然后按以下方法处理：A组（空白对照组）：饮用去离子水。B组（单纯诱石组）：以1%乙二醇+1%氯化铵为唯一饮用水源，同时每天腹腔注射1%乙二醇+1%氯化铵1ml。 C、D、E组（诱石+马尾藻多糖干预组）：以1%乙二醇+1%氯化铵为唯一饮用水源，同时每天腹腔注射1%乙二醇+1%氯化铵1ml，每天分别灌胃10%马尾藻多糖低剂量20mg/kg（C组）；马尾藻多糖中剂量100mg/kg（D组）；马尾藻多糖高剂量
200mg/kg（E组）；各组大鼠均予相同的标准颗粒饲料，自由进食，在相同的环境条件下(25℃空调恒温，12h白昼循环)饲养造模2周以后，形成高草酸尿症大鼠模型。运用组织切片制备及染色技术，观察肾组织中草酸钙结晶沉积的情况。运用生化技术和南京建成试剂盒检测大鼠尿液和血液相关的肾功能指标和肾组织中丙二醛（MDA）含量及相关抗氧化酶活性。 [0022] 一、尿液指标检测
尿量测定
测定前一天，所有的SD雄性老鼠都被单独的放进一个代谢笼里，分别同时收集每个大鼠的24小时尿液，尿量以量筒为标准测得并记录，之后将尿液在离心机中以3000 r/min的速度离心15min，后再用移液枪移取上清液作为待测液检测。
200mg/kg（E组）；各组大鼠均予相同的标准颗粒饲料，自由进食，在相同的环境条件下(25℃空调恒温，12h白昼循环)饲养造模2周以后，形成高草酸尿症大鼠模型。运用组织切片制备及染色技术，观察肾组织中草酸钙结晶沉积的情况。运用生化技术和南京建成试剂盒检测大鼠尿液和血液相关的肾功能指标和肾组织中丙二醛（MDA）含量及相关抗氧化酶活性。 [0022] 一、尿液指标检测
尿量测定
测定前一天，所有的SD雄性老鼠都被单独的放进一个代谢笼里，分别同时收集每个大鼠的24小时尿液，尿量以量筒为标准测得并记录，之后将尿液在离心机中以3000 r/min的速度离心15min，后再用移液枪移取上清液作为待测液检测。
[0023] 尿液草酸根离子的测定分别对每份SD雄性大鼠的尿液做以下操作:取三支20ml试管，分别作为标准管、样品管和空白管。标准管中须加入草酸标准工作液（0.01mmol/L）0.5ml，样品管中须加入用去离子水稀释10倍的上清尿液0.5ml，再各加入去离子水1.0ml，空白管中加去离子水1.5ml，各管加入1滴澳磨香草酚蓝指示剂（配制方法:0.1g磨香浪酚兰溶于20ml 100%乙醇，徐徐加入蒸馏水80ml，不断振荡），滴加0.1mmol/L盐酸或0.25mmol/L氢氧化钠使试管液变成蓝绿色，且总量不超过0.5ml。滴加2.0ml饱和硫酸钙及95%乙醇至20.0ml，混匀后加盖。在室温放置3小时后，以2500r/min 离心10min，倒去上清液，倒置于滤纸上吸去残液，滴加加
0.4mol/L盐酸2.0ml使沉淀溶解后，分别转移至三支10ml的比色管中，各加入甲基红（配制方法:秤取0.2g固体甲基红，溶于100ml乙醇中所得）2.0ml和1.mmol/l铬酸钾4ml，用去离子水稀释至刻度线，摇匀，计时。15min后加入1.0mmol/l氧氯化锆溶液1.0ml，摇匀后倒入1cm 比色杯中，以去离子水作参比，使用分光光度计在515nm处测吸光度。按下列公式计算尿草酸含量:C(mmol/L)=(测定管吸光度一空白管吸光度)/(标准管吸光度一空白管吸光度)×0.01。
0.4mol/L盐酸2.0ml使沉淀溶解后，分别转移至三支10ml的比色管中，各加入甲基红（配制方法:秤取0.2g固体甲基红，溶于100ml乙醇中所得）2.0ml和1.mmol/l铬酸钾4ml，用去离子水稀释至刻度线，摇匀，计时。15min后加入1.0mmol/l氧氯化锆溶液1.0ml，摇匀后倒入1cm 比色杯中，以去离子水作参比，使用分光光度计在515nm处测吸光度。按下列公式计算尿草酸含量:C(mmol/L)=(测定管吸光度一空白管吸光度)/(标准管吸光度一空白管吸光度)×0.01。
[0024] 尿液钙离子的测定根据南京建成生物工程研究所的钙测定试剂盒说明书：运用钙离子在碱性溶液中与甲基百里香酚蓝（MTB）结合，生成蓝色络合物，通过比色与同样处理的钙标准进行比较，可计算出钙含量的原理，做如下步骤：分别对每份SD雄性大鼠的尿液做以下操作:取三支试管，分别作为标准管、样品管和空白管。首先分别在三支试管中加入1.0ml甲基百里香酚蓝试剂和2.0ml碱性溶液.，之后在空白管中加入50μl去离子水，在标准管中加入2.5mmol/L钙标准液50μl，在测定管中加入50μl大鼠尿液。最后，混匀，静置5分钟后，用分光光度计在610nm和蒸馏水调零的条件下，测各管吸光度。按下列公式计算尿钙含量:C(mmol/L)=(测定管吸光度一空白管吸光度)/(标准管吸光度一空白管吸光度)×标准管浓度（2.5mmol/L）。
[0025] 结果与分析大鼠24小时的尿液尿量、草酸根离子和钙离子的含量测定结果如表1。
[0026] 表1 24小时大鼠尿液的尿量、草酸根离子和钙离子的含量测定结果注：数值来自于ml/24 h的大鼠尿液样品，其表示形式为平均值±标准差来表示；
a表示为与空白组（去离子水）作比较，b表示为与阴性组（1%乙二醇+1%氯化铵）作比较；
**表示为P<0.01，说明具有十分明显的差异，* 表示为p<0.05，说明具有明显的差异；动物数量（N）为6。
a表示为与空白组（去离子水）作比较，b表示为与阴性组（1%乙二醇+1%氯化铵）作比较；
**表示为P<0.01，说明具有十分明显的差异，* 表示为p<0.05，说明具有明显的差异；动物数量（N）为6。
[0027] 结果表明：马尾藻多糖有一定利尿作用，可以减弱草酸根与钙离子的浓度，从而发挥对草酸钙晶体的抑制作用，其剂量越大，抑制效果就越强。
[0028] 二、大鼠血液指标检测SD雄性老鼠血清中无机磷，BUN（氮），肌酐的含量测定。测定使用的是南京建成科技有限公司生产的试剂盒。
[0029] 表2 结石模型大鼠血液中各项指标注：数值来自于大鼠血清样品，其表示形式为平均值±标准差来表示；**表示为P<0.01，说明具有十分明显的差异，* 表示为p<0.05，说明具有明显的差异；动物数量（N）为6。
[0030] 结果表明：马尾藻多糖对尿结石大鼠的血液中指标中的BUN（氮），肌酐有显著影响，可以改善血液指标。
[0031] 三、丙二醛（MDA）含量及相关抗氧化酶活性测定实验大鼠饲养2周后全部处死，取出肾脏组织，分别置于9倍于组织重量的生理盐水，再倒入已编号的小烧瓶内，用眼科剪剪碎，再分别倒入各玻璃匀浆管中，匀浆3-4 min 制备成10%组织匀浆， 然后用低温离心机1500rpm×10min， 弃沉淀。取上清10000rpm×10min 后，弃上清，所得棕色沉淀即为线粒体，沉淀用分离介质悬浮制成线粒体悬液，各悬液分别取60ul装于编号试管中，每管再加入900ul的冰生理盐水和200ul的裂解液，备用。按照南京建成相关试剂盒测定丙二醛（MDA）水平、超氧化物歧化酶（SOD）活性、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）酶活力的检测。
[0032] 表3 丙二醛（MDA）含量及相关抗氧化酶活性测定数值来自于大鼠肾脏匀浆，其表示形式为平均值±标准差来表示；* 表示为B、 C、D or E与A组比较，p < 0.05，说明具有明显的差异；#表示为A、C、 D or E与B组比较，p<0.05，说明具有明显的差异；动物数量（N）为6。
[0033] 结果表明：马尾藻多糖通过抑制脂质过氧化反应，降低MDA水平，提高GSH-PX和SOD酶活性增强了肾结石模型大鼠肾脏细胞清除H2O2和脂质过氧化物能力，从而减少肾脏细胞受自由基攻击的损伤，有保护肾脏细胞的功能延缓了肾脏细胞的衰老和死亡。 [0034] 四、各组大鼠肾组织切片请参照附图2-7，附图2是A空白组大鼠肾组织切片，附图3是B单纯诱石组大鼠肾组织切片，附图4是C马尾藻多糖低剂量大鼠肾组织切片，附图5是D马尾藻多糖中剂量大鼠肾组织切片，附图6是E马尾藻多糖高剂量大鼠肾组织切片，附图7是F鼠尿液中的草酸钙结石。
[0035] (1)肉眼观察：除空白对照组外，各组肾脏均不同程度肿大，颜色变浅甚至发白，表面可见白色点状或团块状轻微突起，提示造模后大鼠肾脏有不同程度的炎性损害和草酸钙结晶形成。(2)显微镜观察：见A组（空白对照）细胞排列较整齐，结构清晰，肾小管结构正常，未见明显的草酸钙结晶聚集； B组（诱石组）肾小管明显扩张，上皮细胞脱落，多数管腔内存在无色透明的草酸钙结晶，大量结晶体沉积，从髓质到皮质均可发现，肾间质中也观察到有晶体存在。偏光显微镜下观察可见肾小管腔内晶体折光性显著。C组-E组（诱石+多糖干预组）可见皮质或及髓质或及肾乳头存在少量结晶，草酸钙结晶大小依次为C>D>E。但肾小管扩张情况及草酸钙结晶聚集情况明显轻于B组，和B组相比有显著性差异。从这些组织切片可以看出马尾藻多糖可以减少诱石剂诱导的大鼠肾草酸钙结石的形成，其作用机制主要是马尾藻多糖的抗氧化作用。减少了高尿草酸对肾小管上皮细胞的损伤，从而阻断了肾草酸钙结石形成链中的关键环节。
[0036] 五、讨论马尾藻产于浙江省的舟山，象山，南麂列岛，福建，广东省台山和澳门等地,，资源十分丰富，目前马尾藻的加工利用范围比较窄，只有小部分被用作饲料、藻胶的原料，部分食用，大部分尚未得到全面的开发利用。目前国内外对马尾藻中的多糖研究多数集中于提取分离、结构分析及抗肿瘤研究。
[0037] 本发明通过大鼠结石模型实验初步证实了马尾藻多糖具有良好的清除自由基和抗氧化损伤能力，同时可以利尿、减低尿液中草酸根和钙离子浓度，改善血液中的BUN（氮），肌酐，从而多方面改善草酸钙结石所造成的肾损伤。综上所述，鉴于肾结石的高发病率和复发率，临床尚无有效的药物防治，本发明的研究结果对利用马尾藻多糖开发天然抗氧化功效因子、保健食品和尿结石防治药品提供了科学依据，此研究有一定的理论意义和临床应用价值。既为开发应用马尾藻多糖防治尿结石提供重要理论依据；又以此拓宽马尾藻的用途，为其他海洋藻类或者海洋生物的研究提供一种思维模式，同时也为尿结石防治研究提供一种新型的天然生物材料。
[0038] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。
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