一种生物提取物抑菌活性的测定方法
专利汇可以提供一种生物提取物抑菌活性的测定方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种 生物 提取物抑菌活性的测定方法，该方法包括以下步骤：生物提取物的提取；提取物的稀释；指示菌液的稀释；提取物与指示菌液的作用；吸光度的测定与抑菌率的计算。本发明的生物提取物抑菌活性的测定方法具有微量、准确、方便、快捷的特点，能准确定量测定生物提取物微量样品的抑菌活性，花费少，耗时短，便于处理大量不同的生物提取物样品，为定量评价生物提取物的抑菌活性，也为高通量筛选具抑菌活性的 生物材料 建立起一套快速而准确的测定方法，并为以活性为指导的快速分离获得具有抑菌活性的 单体 化合物提供有效途径。，下面是一种生物提取物抑菌活性的测定方法专利的具体信息内容。
1.一种生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征在于：包括以下步骤：
a.生物提取物干样品的获得；
b.样品的稀释：
将所述的提取物干样品用溶剂溶解后，用稀释液稀释，得样品稀释溶液；
c.菌液的稀释：
将细菌或真菌作为指示菌进行液体发酵获得指示菌液，再用稀释液稀释；
d.样品稀释溶液与稀释指示菌液的作用：
将所述的样品稀释溶液与稀释后的指示菌液发生作用，以稀释液代替样品溶液作对照， 加入染MTT溶液在染色3-5h；
e.OD值的测定：
将已发生反应的混合溶液离心，用96孔板置酶标仪570nm处测每个测试孔的OD值，通过以 下公式计算抑制率，
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％。
2.根据权利要求1所述的生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述生物提取物包括 植物、动物、或微生物及其加工的生物制品提取物。
3.根据权利要求1所述生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述稀释液为用于细菌 稀释的含0.1wt％～0.5wt％蛋白胨的生理盐水；或为用于稀释真菌的含1wt％～5wt％马铃薯汁 和0.1wt％～0.5wt％葡萄糖的水溶液。
4.根据权利要求3所述生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述稀释液为用于细菌 稀释的含0.2wt％蛋白胨的生理盐水；或为用于稀释真菌的含2wt％马铃薯汁和0.2wt％葡萄糖的 混合水溶液。
5.根据权利要求1-3任一项所述的生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述步骤b 为：将所述的提取物干样品用二甲基亚砜溶解，用稀释液将样品稀释至终浓度为1000～5000 μg/ml，静置60～180min，10000～13000r/min离心10～20min，小心吸取样品上清液，弃沉 淀，得样品稀释溶液；
6.根据权利要求1-3任一项所述的生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述步骤c 为：将指示菌进行液体发酵获得指示菌液，用稀释液稀释将指示菌液稀释至细菌浓度为105～ 107cfu/ml或真菌浓度为105～107个/ml。
7.根据权利要求6所述的生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述步骤d为：将所 述的样品稀释溶液与稀释后的指示菌液以体积比为1∶8-10的比例混合发生作用22～24h， 以稀释液代替样品溶液作对照，加入MTT溶液进行37℃染色3～5h，所述指示菌为细菌。
8.根据权利要求6所述的生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征是，所述步骤d为：将所 述的样品稀释溶液与稀释后的指示菌液以体积比为1∶8-10的比例混合发生作用72～96h， 以稀释液代替样品溶液作对照，加入MTT溶液进行26℃染色3～5h，所述指示菌为真菌。
9.根据权利要求1所述生物提取物抑菌活性的测定方法，其特征在于，所述指示菌为金黄葡 萄球菌或大肠杆菌或白色念珠菌或黑曲霉。
技术领域
本发明涉及提取物抑菌活性的测定方法，更具体地说，涉及生物材料提取物抑菌活性的 测定方法。
背景技术
开发和利用生物活性天然产物，首先要对生物材料的提取物进行活性评价，如抗肿瘤、 抗菌、抗氧化等方面的活性评价，然后以活性为指导，通过现代分离技术，分离获得具有生 物活性的单体化合物。目前在抑菌方面的活性评价一般是采用滤纸片法、平板计数法、比浊 法等。滤纸片法只能通过测定抑菌圈的大小，并不能做定量评价，且所需的样品量大；平板 计数法虽然能做定量评价，但其步骤繁琐，时间长，成本也相对较高；比浊法往往由于从生 物材料中获得的提取物具有颜色而不能正确读取其吸光度，从而影响评定结果。
发明内容
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种生物提取物抑菌活性的测定方法，包括以下步骤：
a.生物提取物的获得；新鲜或干的生物材料切碎或粉碎后加入溶剂，或在微生物发酵产物中 直接加入溶剂提取，得到的提取液经减压浓缩，挥干溶剂得提取物干样品；
b.样品的稀释：
将所述的提取物干样品用溶剂溶解，用稀释液稀释，得样品稀释溶液；
c.菌液的稀释：将指示菌进行液体发酵获得指示菌液，用稀释液稀释；
d.样品稀释溶液与稀释指示菌液的作用：
将所述的样品稀释溶液与稀释指示菌液发生作用，以稀释液代替样品溶液作对照，加入 染色剂MTT溶液进行染色反应；
e.吸光度(OD值)的测定：将已发生反应的混合溶液离心，用96孔板置酶标仪570nm处测每 个测试孔的OD值，计算抑制率，
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD值对照组)×100％。
优选地，所述稀释液为用于细菌稀释的含0.1wt％～0.5wt％蛋白胨的生理盐水；或为用于 稀释真菌的含1wt％～5wt％马铃薯汁和0.1wt％～0.5wt％葡萄糖的水溶液。
上述生物提取物抑菌活性的测定方法中，所述步骤b为：优选地，将生物提取物干样品 用二甲基亚砜溶解，配成10～50mg/ml浓度，用稀释液将样品稀释至1000～5000μg/ml浓 度，静置60～180min，10000～13000r/min离心10～20min，小心吸取样品上清液，弃沉淀。 更优选地，将生物提取干样品用二甲基亚砜溶解，配成20mg/ml浓度，然后用稀释液将样品 稀释至2000μg/ml浓度，静置120min，10000r/min离心10min，小心吸取样品上清液，弃沉 淀。
上述一种生物提取物抑菌活性的测定方法中，所述步骤c为：优选地，将液体发酵获得 的指示菌液稀释至105～107cfu/ml(细菌)或105～107个/ml(真菌)浓度；更优选地，将指 示菌液稀释稀释至106cuf/ml或106个/ml浓度。
上述一种生物提取物抑菌活性的测定方法中，所述步骤d为：优选地，将浓度为2000μg/ml 的样品溶液10μl～20μl和浓度为105～107cfu/ml或105～107个/ml的菌液50～250μl混合， 37℃或26℃恒温箱作用20～25h或72～96h后，加入MTT溶液5～25μl，37℃或26℃染色4～6h。 更优选地，将浓度为2000μg/ml的样品溶液10μl和浓度为106cfu/ml或106个/ml的菌液90μl 混合，37℃或26℃恒温箱作用24或96h后，加入MTT溶液10μl，37℃或26℃染色4h。
上述一种生物提取物抑菌活性的测定方法中，优选地，所述步骤e为：将已发生作用的混 合溶液离心，弃清液，沉淀用二甲基亚砜溶解，振荡待沉淀完全溶解后，用96孔板置酶标仪 570处nm测其吸光值，按以下式计算样品对菌液生长的抑制率：抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD值对 照组)×100％。
本发明通过在生物材料中加入溶剂提取获得提取液，提取液经浓缩获得生物提取物干样 品，用MTT法测定样品的抑菌水平，评估生物材料提取物的抑菌活性。从生物材料中获得的 提取物大多具有颜色，用传统的比浊法测定抑菌活性往往由于受提取物颜色的影响而不能正 确读取吸光度，从而影响提取物抑菌活性的评价结果，本发明是利用MTT进行染色反应产生 沉淀，经离心将去除上清液同时也将提取物中的颜色部分去除，避免了由于颜色的影响而不 能正确读取吸光度的问题。此方法样品与菌液的作用浓度20～500μg/ml，且每次用量只需20 μl，样品用量微量。另外，此方法避免了传统平板计数法中培养基配制、倒平板、涂平板、 菌落计数等繁琐步骤，可同时处理大量不同的生物提取物样品。
具体实施方式
本发明通过在生物材料中加入溶剂提取获得提取液，提取液经浓缩获得生物提取物干样 品，用MTT法测定样品的抑菌活性。
本发明通过以下具体实施例来加以说明，但并非限制本发明的。
实施例1：植物核桃(Juglans regia)叶提取物抑菌活性的测定
a.植物核桃叶提取物的获得：
将核桃叶粉碎后加入乙酸乙酯萃取3次，得提取液，提取液于真空旋转蒸发仪减压浓缩 至干，得提取物干品；
b.样品的稀释：
将核桃叶提取物干样品用DMSO(二甲基亚砜)溶解，配成浓度为20mg/ml的溶液，然后用 细菌稀释液(本实施例所用细菌稀释液为含0.1wt％蛋白胨的生理盐水)将样品溶液稀释至 2000μg/ml浓度，静置120min，10000r/min离心10min，小心吸取样品上清液，弃沉淀；
c.菌液的稀释：
将液体发酵获得大肠杆菌的指示菌液用细菌稀释液稀释至106cfu/ml浓度；
d.样品稀释溶液与稀释指示菌液的作用：
将浓度为2000μg/ml核桃叶提取物的溶液10μl和浓度为106cfu/ml的大肠杆菌菌液90μ l混合，37℃恒温箱作用24h后，加入MTT溶液10μl，37℃染色4h。
e.吸光度(OD值)的测定：
将作用后的混合溶液13000r/min离心，小心吸去上清液，沉淀用DMSO溶解，振荡，待沉 淀完全溶解后，将其吸取到96孔板中，置酶标仪570nm处测其OD值，按以下公式计算样品对指 示菌生长的抑制率：
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％。
实施例2：海洋动物红螺(Rapana bezona)提取物抑菌活性的测定
a.动物提取物的获得：
将红螺去壳后的软体部分加入无水乙醚提取得提取液，提取液减压浓缩至干，得提取物 干品。
b.样品的稀释：
将红螺提取物干样品用DMSO(二甲基亚砜)溶解，配成浓度为20mg/ml的溶液，然后用细 菌稀释液(本实施例所用细菌稀释液为0.5wt％蛋白胨的生理盐水)将样品溶液稀释至2000 μg/ml浓度，静置120min，10000r/min离心10min，小心吸取样品上清液，弃沉淀。
c.菌液的稀释：
将液体发酵获得金黄色葡萄球菌指示菌液，用细菌稀释液稀释至106cfu/ml浓度；
d.样品稀释溶液与稀释指示菌液的作用：
将浓度为2000μg/ml红螺提取物的溶液10μl和浓度为106cfu/ml金黄色葡萄球菌菌液90 μl混合，37℃恒温箱作用24h后，加入MTT溶液10μl，37℃染色4h。
e.吸光度(OD值)的测定：
将作用后的混合溶液13000r/min离心，小心吸去上清液，沉淀用DMSO溶解，振荡，待沉 淀完全溶解后，用96孔板置酶标仪570nm处测其OD值，按以下公式计算样品对指示菌生长的抑 制率：
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％。
实施例3：微生物提取物抑菌活性的测定
a.毛蜂窝菌(Hexagona apiaria)子实体提取物的获得：
毛蜂窝菌子实体粉碎加入乙醇提取，提取液减压浓缩至干，得提取物干品。
b.样品的稀释：
毛蜂窝菌子实体提取物干样品用DMSO(二甲基亚砜)溶解，配成浓度为20mg/ml的溶液， 然后用细菌稀释液(本实施例所用细菌稀释液为0.2wt％蛋白胨的生理盐水)将样品溶液稀释 至5000μg/ml浓度，静置120min，10000r/min离心10min，小心吸取样品上清液，弃沉淀。
c.菌液的稀释：
将通过液体发酵获得的金黄色葡萄球菌指示菌液，用细菌稀释液稀释至106cfu/ml浓度。
d.样品稀释溶液与稀释指示菌液的作用：
将浓度为5000μg/ml毛蜂窝菌子实体提取物的溶液10μl和浓度为106cfu/ml金黄色葡萄 球菌菌液100μl混合，37℃恒温箱作用24h后，加入MTT溶液10μl，37℃染色4h。
e.吸光度(OD值)的测定：
将作用后的混合溶液13000r/min离心，小心吸去上清液，沉淀用DMSO溶解，振荡，待沉 淀完全溶解后，用96孔板置酶标仪570nm处测其OD值，按以下公式计算样品对指示菌生长的抑 制率：
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％。
实施例4：螺旋木霉(Trichoderma spirale)发酵产物提取物的抑菌活性测定
a.螺旋木霉发酵产物提取物的提取：
螺旋木霉[从白木香(Aquilaria sinensis)中分离获得的内生真菌]发酵培养后菌体与发 酵液用乙酸乙酯浸泡30min，过滤去除菌体，滤液用乙酸乙酯提取3次，提取液减压浓缩至 干后得到螺旋木霉发酵产物提取物干样品。
b.样品的稀释：
螺旋木霉发酵产物提取物干样品用DMSO(二甲基亚砜)溶解，配成浓度为20mg/ml的溶 液，然后用真菌稀释液(本实施例中真菌稀释液为含2wt％马铃薯汁和0.2wt％葡萄糖的混合 水溶液)将样品溶液稀释至2000μg/ml浓度，静置120min，10000r/min离心10min，小心吸 取样品上清液，弃沉淀。
c.菌液的稀释：
将通过液体发酵获得的白色念珠菌的指示菌液，用真菌稀释液稀释至106个/ml浓度。
d.样品稀释溶液与稀释指示菌液的作用：
将浓度为2000μg/ml螺旋木霉发酵产物提取物的溶液10μl和浓度为106个/ml的白色念珠 菌菌液90μl混合，26℃恒温箱作用48h后，加入MTT溶液10μl，26℃染色4h。
e.吸光度(OD值)的测定：
将作用后的混合溶液13000r/min离心，小心吸去上清液，沉淀用DMSO溶解，振荡，待沉 淀完全溶解后，用96孔板置酶标仪570nm处测其OD值，按以下公式计算样品对指示菌生长的 抑制率：
抑制率(％)＝(1-OD样品组/OD对照组)×100％。
上述实施例1-4中，其得到的试验结果与传统平板计数法的样品对菌液生长抑制率(三次 重复试验的平均数)数据如下。
样品 指示菌液 本发明方法 平板计数法 核桃(Juglans regia)叶提取物 大肠杆菌 33.2％ 34.6％ 红螺(Rapana bezona)提取物 金黄色葡萄球菌 68.1％ 70.2％ 毛蜂窝菌(Hexagona apiaria) 子实体提取物 金黄色葡萄球菌 13.2％ 14.8％ 螺旋木霉(Trichoderma spirale) 发酵产物提取物 白色念珠菌 66.9％ 72.1％
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