控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法
阅读：737发布：2023-03-12
专利汇可以提供控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 申请 提供并公开了抗寄生、抗 害虫 或杀虫核酸分子和它们的 钙 调蛋白靶基因用于控制 节肢动物 寄 生物 和害虫。本申请还提供了控制和处理西方 蜜蜂 (蜜蜂) 蜂巢 中寄生物和害虫的方法和组合物。，下面是控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法专利的具体信息内容。
1.一种选择性杀虫剂组合物，其包含具有与钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上相同的序列的核酸分子。
2.根据权利要求1所述的选择性杀虫剂组合物，其还包含赋形剂。
3.根据权利要求1所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述核酸分子为dsRNA。
4.根据权利要求3所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述dsRNA为siRNA。
5.根据权利要求2所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述组合物为蜜蜂可摄取的。
6.根据权利要求2所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述组合物为蜜蜂可吸收的。
7.根据权利要求2所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述组合物为螨可摄取的。
8.根据权利要求2所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述组合物为螨可吸收的。
9.根据权利要求2所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述赋形剂选自蛋白、花粉、碳水化合物、聚合物、液体溶剂、糖浆、糖固体以及半固体饲料。
10.根据权利要求9所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述液体溶剂选自由蔗糖溶液和玉米糖浆溶液组成的组。
11.根据权利要求9所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述蛋白选自由花粉和大豆蛋白组成的组。
12.根据权利要求9所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述赋形剂为选自糖、糖替代物、或糖补充物的固体。
13.根据权利要求12所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述糖固体包括浸渍有所述dsRNA核酸序列的糖微粒。
14.根据权利要求1所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35以及69-89的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、
98％、99％、或100％的序列同一性。
15.根据权利要求1所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述钙调蛋白基因序列包含选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35以及69-89的序列的至少18个连续核苷酸。
16.根据权利要求3所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述dsRNA序列为对应于选自SEQ ID NO:3、4以及71-89的核酸序列的dsRNA。
17.根据权利要求3所述的选择性杀虫剂组合物，其还包含一种或多种核酸分子。
18.根据权利要求3所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述一种或多种核酸分子包含与钙调蛋白基因序列的第二区域互补的第二核酸序列。
19.根据权利要求18所述的选择性杀虫剂组合物，其中所述第二核酸分子包括一个或多个核酸片段。
20.一种蜜蜂可摄取组合物，其包含蜜蜂饲料和核酸分子，所述核酸分子具有与钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上相同的序列。
21.根据权利要求19所述的蜜蜂可摄取组合物，其中所述核酸序列为dsRNA。
22.根据权利要求20所述的蜜蜂可摄取组合物，所述蜜蜂饲料包括选自由玉米糖浆、花粉替代物、花粉、花粉饼、以及翻糖组成的组的蜜蜂食物。
23.根据权利要求21所述的蜜蜂可摄取组合物，其中所述dsRNA为siRNA。
24.根据权利要求20所述的蜜蜂可摄取组合物，其中所述钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35以及69-89的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％的序列同一性。
25.根据权利要求20所述的蜜蜂可摄取组合物，其中所述钙调蛋白基因序列包含选自SEQ ID NO:1-4、6、23、26-35以及69-89的序列的至少23个连续核苷酸。
26.根据权利要求21所述的蜜蜂可摄取组合物，其中所述dsRNA序列为对应于选自SEQ ID NO:3、4以及71-89的核酸序列的dsRNA。
27.一种包含核酸的核酸构建体，所述核酸与钙调蛋白基因序列的、或从其转录的RNA的区域基本上相同或互补，可操作地连接至在宿主细胞中有功能的启动子序列，并且在引入所述宿主细胞时能够产生dsRNA。
28.根据权利要求27所述的核酸构建体，其还包含至少一个选自由以下组成的组的调控元件：翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏子结合序列、终止序列、中止序列以及多腺苷酸识别序列。
29.根据权利要求27所述的核酸构建体，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞和酵母细胞组成的组。
30.一种向蜜蜂提供组合物的方法，其包括向所述蜜蜂提供有效量的包含与钙调蛋白基因序列的、或从其转录的RNA的区域基本上相同或基本上互补的核酸的组合物，从而所述核酸存在于蜜蜂组织中。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述钙调蛋白基因序列为狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列。
32.根据权利要求30所述的方法，其中所述蜜蜂为采集蜂。
33.根据权利要求31所述的方法，其中所述蜜蜂为蜂巢蜂。
34.根据权利要求30所述的方法，其中所述蜜蜂为属于一个群体的蜜蜂并且所述饲喂降低了所述蜜蜂群体对狄斯瓦螨的易感性。
35.一种降低狄斯瓦螨对蜜蜂的寄生作用的方法，其包括向所述蜜蜂提供有效量的核酸组合物，其中所述核酸与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的区域基本上相同或基本上互补，由此降低狄斯瓦螨对所述蜜蜂的寄生作用。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述蜜蜂为采集蜂。
37.根据权利要求35所述的方法，其中所述蜜蜂为蜂巢蜂。
38.根据权利要求35所述的方法，其中所述蜜蜂为属于一个群体的蜜蜂并且所述饲喂降低了狄斯瓦螨对所述蜜蜂群体的寄生作用。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述蜜蜂群体的寄生作用的所述降低包括所述狄斯瓦螨的存活少于25％、15％、10％或5％。
40.一种降低蜜蜂蜂巢寄生物载量的方法，其包括向所述蜂巢提供有效量的与寄生物钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的区域基本上相同或基本上互补的核酸，从而降低所述蜂巢的寄生物载量。
41.根据权利要求40所述的方法，其中所述寄生物为狄斯瓦螨。
42.根据权利要求40所述的方法，其中所述蜜蜂蜂巢具有每100只蜜蜂至少1个寄生物的初始寄生物载量。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述蜜蜂蜂巢具有每100只蜜蜂2、3、5、10或更多个寄生物的初始寄生物载量。
44.根据权利要求40所述的方法，其中所述寄生物载量降低至每100只蜜蜂少于2个、少于3个、少于5个或少于10个寄生物。
45.一种选择性处理寄生物的节肢动物物种的方法，其包括向节肢动物物种递送有效量的与寄生物钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的区域基本上相同或基本上互补的核酸。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述处理减少了所述节肢动物物种的寄生物载量、降低了所述节肢动物物种的死亡、或防止了所述节肢动物物种的寄生作用。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述节肢动物物种选自由西方蜜蜂、东方蜜蜂、极小无刺蜂、集蜂科、熊蜂某种、姬蜂总科(寄生蜂)、跳蚤、蝇、虱、蜱以及螨组成的组。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述节肢动物物种为群体物种。
49.根据权利要求48所述的方法，其中所述节肢动物物种为西方蜜蜂。
50.根据权利要求45所述的方法，其中所述寄生物选自由以下组成的组：蜱螨亚纲(蜱，螨)、虱蝇科(蝇)、姬蜂总科(寄生蜂)、狂蝇科(肤蝇)、虱目(虱)、蚤目(跳蚤)、微虾纲、豆蟹以及蟹奴属。
51.根据权利要求50所述的方法，其中所述寄生物为螨或蜱。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述螨或蜱为热厉螨螨、鹿蜱或二斑叶螨。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述寄生物为狄斯瓦螨。
54.根据权利要求45所述的方法，其中所述递送包括通过饲喂器递送。
55.根据权利要求45所述的方法，其中所述递送包括在蜂巢架上喷雾。
56.根据权利要求45所述的方法，其中所述递送包括使用以所述组合物浸渍的蜂巢内设备通过接触递送。
57.一种处理或防止蜜蜂群体中蜂群崩溃综合症的方法，其包括向蜜蜂提供有效量的包含具有与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列的区域基本上相同或基本上互补的序列的核酸的组合物，从而降低或防止狄斯瓦螨侵染的水平。
58.根据权利要求57所述的方法，其中所述核酸分子为dsRNA。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述dsRNA为siRNA。
60.根据权利要求57所述的方法，其中所述钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1-4、
6、23、26-35以及69-89的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性。
61.根据权利要求57所述的方法，其中所述钙调蛋白基因序列包含选自SEQ ID NO:1-
4、6、23、26-35以及69-89的序列的至少18个连续核苷酸。
62.根据权利要求58所述的方法，其中所述dsRNA序列为对应于选自SEQ ID NO:3、4以及71-89的核酸序列的dsRNA。
控制节肢动物寄生物和害虫侵染的组合物和方法
[0002] 计算机可读形式的序列表通过电子递交方式与本申请一起提交，并通过引用将其全文并入本申请中。该序列表包括在2014年10月27日创建的文件中，文件名为P34094US01_SEQ.txt，大小为64,002字节(如在 操作系统中测量的)。
[0003] 公开领域
[0005] 背景
[0006] 各个种类的节肢动物越来越多地在商业规模上培养。昆虫和它们的幼虫是有营养的，并在很多文化中生食和烹熟食用。诸如蟹、龙虾、小龙虾、虾和对虾的甲壳类动物以大型商业规模养殖，并为人类饮食的重要部分。除了培养节肢动物种类用于食品，节肢动物还作为害虫控制策略的一部分来培养，包括用于其它节肢动物的生物控制，例如培养寄生蜂用
于控制蟑螂和火蚁。节肢动物还可以用作原材料来源，例如染料、药品、药物以及抗生素。随着节肢动物培养重要性增加而成长的是各种害虫和寄生物，它们破坏节肢动物群体或大大
降低从节肢动物培养物获得的产物产量。因此，日渐需要控制节肢动物害虫和寄生物的方
法。
于控制蟑螂和火蚁。节肢动物还可以用作原材料来源，例如染料、药品、药物以及抗生素。随着节肢动物培养重要性增加而成长的是各种害虫和寄生物，它们破坏节肢动物群体或大大
降低从节肢动物培养物获得的产物产量。因此，日渐需要控制节肢动物害虫和寄生物的方
法。
[0007] 在培养的节肢动物中最重要的种类为蜜蜂。蜜蜂—西方蜜蜂(Apis mellifera)，为农作物有效传粉所需，并因此对世界农业是极重要的。蜜蜂还产生经济上重要的产物，包括蜂蜜和蜂蜡。蜜蜂易感于许多寄生物和病原体，包括外寄生螨—狄斯瓦螨(Varroa
destructor)。
destructor)。
[0008] 瓦螨(狄斯瓦螨)为控制的蜜蜂(西方蜜蜂)的头号寄生物，并且是商业养蜂的最大全球威胁(Rosenkranz等2010)。成体螨通常由蜜蜂幼蜂信息素所吸引，在封盖前进入工蜂
和雄蜂的抚幼室中。螨潜入蜜蜂放置在预期封盖的巢室内的幼蜂食物中，最可能是避免被
保育蜂认出并移除。在保育蜂对幼蜂巢室封盖后，螨附着至幼虫并开始吞食蜂幼虫的血淋
巴。这个过程是为螨中的卵子发生做准备，之后在几天后产下雄性卵和雌性卵。最终，成体瓦螨离开巢室并紧紧抓住在出现的蜜蜂上。瓦螨以多种方式直接损害蜜蜂，最值得注意的
是通过耗尽资源，不利地影响蜜蜂先天免疫系统，以及通过作为非常有效的病毒载体(Di
Prisco等2011)，它们中的一些已知在螨中复制，因此显著增加了病毒载量。
和雄蜂的抚幼室中。螨潜入蜜蜂放置在预期封盖的巢室内的幼蜂食物中，最可能是避免被
保育蜂认出并移除。在保育蜂对幼蜂巢室封盖后，螨附着至幼虫并开始吞食蜂幼虫的血淋
巴。这个过程是为螨中的卵子发生做准备，之后在几天后产下雄性卵和雌性卵。最终，成体瓦螨离开巢室并紧紧抓住在出现的蜜蜂上。瓦螨以多种方式直接损害蜜蜂，最值得注意的
是通过耗尽资源，不利地影响蜜蜂先天免疫系统，以及通过作为非常有效的病毒载体(Di
Prisco等2011)，它们中的一些已知在螨中复制，因此显著增加了病毒载量。
[0009] 安全、有效和持久的瓦螨问题解决方案是迄今仍没解决的持续挑战。当前，养蜂人采用过多的方法来控制瓦螨水平，包括各种化学杀螨剂，其中的大部分已失效并且是有毒的和/或在蜂蜡和蜂蜜中有残留。其它的方法包括施加草酸或甲酸、单萜类(百里酚)和各种其它的控制操作，效果高度差异，包括对所处理群体的毒性。培育对瓦螨有抗性的蜜蜂—例如选择卫生行为，这导致移除被侵染的幼蜂—提供了有限的实践成功。
[0010] 蜜蜂的蜂群崩溃综合症(CCD)威胁毁灭美国和世界农业。实际上，在最近美国爆发CCD的2006-2007年冬季，估计240万蜜蜂蜂巢有25％或更多因CCD而损失。在2006-2007整个冬季，估计美国有23％养蜂经营遭受CCD，影响了平均45％的养蜂人经营。在2007-2008冬
季，USDA-ARS的CCD行动组估计商业经营的全部蜂巢总共36％被CCD破坏。
季，USDA-ARS的CCD行动组估计商业经营的全部蜂巢总共36％被CCD破坏。
[0011] CCD以群体中其成体蜂群的快速损失为特征，死亡的成体蜜蜂通常在远离群体之处被发现。在崩溃的最后阶段，蜂王仅由少数新出现的成体蜜蜂照顾。崩溃蜂群常常具有大量封盖的幼蜂和食物储存。CCD现象在2006年首次报道；但是，养蜂人早在2004年就注意到与CCD一致的独特蜂群衰退。各种因素如螨和感染物、气候模式、电磁(蜂窝天线)辐射、农药、营养不良和应激被假定为原因。迄今为止，CCD控制集中在瓦螨控制、卫生和移除受影响的蜂巢、处理机会性感染(例如小孢子虫属(Nosema))和改善营养。至今还未开发出有效的
预防性措施。
预防性措施。
[0012] 瓦螨寄生蛹和成体蜜蜂，并在蛹抚幼室内繁殖。该螨用它们的嘴刺破外骨骼并以蜜蜂的血淋巴为食。外骨骼中的这些损伤位点具有细菌感染，例如引起欧洲幼虫腐臭病的
蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)。除了它们的寄生作用，怀疑瓦螨用作数种蜜蜂病
原体的媒介物，并可以削弱它们宿主的免疫系统，让它们易受感染，所述病原体包括畸翅病毒(DWV)、喀什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)。如果不处理，瓦螨侵染通常导致群体水平的死亡。
蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)。除了它们的寄生作用，怀疑瓦螨用作数种蜜蜂病
原体的媒介物，并可以削弱它们宿主的免疫系统，让它们易受感染，所述病原体包括畸翅病毒(DWV)、喀什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)。如果不处理，瓦螨侵染通常导致群体水平的死亡。
[0013] 当前的处理瓦螨侵染的方法证明是无效的，由于螨形成了对现有杀螨剂的抗性。另外，使用这些杀螨剂可以将有害化学品引入准备用于人消费的蜂蜜中。
[0014] 发明概述
[0015] 本公开提供并包括选择性杀虫剂组合物，其包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子具有与钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的区域基本上互补或基本上相同的序列。在一些方面，该组合物还包含赋形剂。
[0017] 在一个方面，所述钙调蛋白基因序列与选自SEQ ID NO:1至4、6、23、26至35、以及69至89的序列有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的序列同一性。在一些方面，所述钙调蛋白基因序列包含选自SEQ ID NO:1至4、6、23、26至35、以及69至
89的序列的至少18个连续核苷酸。
89的序列的至少18个连续核苷酸。
[0018] 在一个方面，该选择性杀虫剂组合物还包含一种或多种与钙调蛋白基因序列的第一区域基本上互补或基本上相同的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子。在一些方面，所述一种或多种核酸分子包含与钙调蛋白基因序列的第二区域互补的第二核酸序列。
[0019] 在一些方面，该选择性杀虫剂组合物为蜜蜂可摄取的、蜜蜂可吸收的、螨可摄取的或螨可吸收的。
[0020] 在一个方面，所述赋形剂选自蛋白、花粉、碳水化合物、聚合物、液体溶剂、糖浆、糖固体以及半固体饲料。在一个方面，所述液体溶剂选自蔗糖溶液和玉米糖浆溶液。在一些方面，所述蛋白选自花粉和大豆蛋白。在另一方面，所述赋形剂为选自糖、糖替代物、或糖补充物的固体。在一些方面，所述糖固体包括经dsRNA核酸序列浸渍的糖微粒。
[0021] 在一个方面，本申请公开了蜜蜂可摄取组合物，其包含蜜蜂饲料和核酸分子，该核酸分子具有与钙调蛋白基因序列的或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上相同或基本上互补的序列。在一些方面，所述蜜蜂饲料包括选自玉米糖浆、花粉替代物、花粉、花粉饼、以及翻糖的蜜蜂食物。在一些方面，所述蜜蜂饲料还包括一种或多种矿物盐、精油、啤酒酵母、酵母提取物、海藻糖、胰蛋白胨、奶粉、卵磷脂、以及维生素C。精油的实例包括但不限于冬青油、留兰香油、薄荷油、柠檬草油和茶树油。
[0022] 在另一方面，本申请公开了核酸构建体，其包含与钙调蛋白基因序列的、或从其转录的RNA的区域基本上相同或互补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸序列，可操作地连接至在宿主细胞中有功能的启动子序列，并且在引入所述宿主细胞时能够产生dsRNA。在一些方面，该核酸构建体还包含至少一个选自翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏子结合序列、终止序列、中止序列、以及多腺苷酸识别序列的调控元件。在一些方面，所述宿主细胞为细菌或酵母细胞。
[0023] 在另一方面，本申请公开了向蜜蜂提供组合物的方法，包括向蜜蜂提供有效量的包含与钙调蛋白基因序列的、或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上相同或基本上互
补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸的组合物，从而该核酸存在于蜜蜂组织中。
补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸的组合物，从而该核酸存在于蜜蜂组织中。
[0024] 在另一方面，本申请公开了处理或防止蜜蜂群体中疾病的方法，包括向蜜蜂提供有效量的包含与钙调蛋白基因序列的一个或多个区域基本上相同或基本上互补的抗寄生、
抗害虫或杀虫核酸的组合物，从而该核酸存在于蜜蜂组织中。在一些方面，该钙调蛋白基因序列为狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列。
抗害虫或杀虫核酸的组合物，从而该核酸存在于蜜蜂组织中。在一些方面，该钙调蛋白基因序列为狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列。
[0025] 在另一方面，本申请公开了降低狄斯瓦螨对蜜蜂的寄生作用的方法，包括向所述蜜蜂提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物，其中所述核酸与狄斯瓦螨钙调蛋白
基因序列的、或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上相同或基本上互补，由此降低狄斯瓦螨对蜜蜂的寄生作用。
基因序列的、或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上相同或基本上互补，由此降低狄斯瓦螨对蜜蜂的寄生作用。
[0026] 在另一方面，本申请公开了降低蜜蜂蜂巢寄生物载量的方法，包括向所述蜂巢提供有效量的与寄生物钙调蛋白基因序列的、或从其转录的RNA的一个或多个区域基本上相
同或基本上互补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸，从而降低所述蜂巢的寄生物载量。
同或基本上互补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸，从而降低所述蜂巢的寄生物载量。
[0027] 在另一方面，本申请公开了选择性处理节肢动物物种寄生物的方法，包括向节肢动物物种递送有效量的与寄生物钙调蛋白基因序列的、或从其转录的RNA的一个或多个区
域基本上相同或基本上互补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。
域基本上相同或基本上互补的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。
[0028] 在另一方面，本申请提供并公开了处理或防止蜜蜂群体中蜂群崩溃综合症的方法，包括向蜜蜂群体提供有效量的包含具有与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列的一个或多个区
域基本上相同或基本上互补的序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸的组合物，从而降低或防
止狄斯瓦螨侵染的水平。
附图说明
域基本上相同或基本上互补的序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸的组合物，从而降低或防
止狄斯瓦螨侵染的水平。
附图说明
[0029] 图1显示了来自不同物种的钙调蛋白(CAM)基因的系统发生树。紧挨物种名称前的数字对应序列标识号(SEQ ID NO)。
[0030] 图2显示了在处理后第3天时直接饲喂生物测定中暴露于核酸SEQ ID NO:3(CAM373)的螨相对于未处理对照(CNTR)或非特异序列(SCRAM,SEQ ID NO:5)的存活率。
[0031] 图3图A显示了在以核酸SEQ ID NO:3(CAM373)或SEQ ID NO:4(CAM186)处理后第5天时相对于对照的基因表达分析。图B显示了暴露于核酸SEQ ID NO:3(CAM373)和4
(CAM186)的螨相对于对照的存活率。
(CAM186)的螨相对于对照的存活率。
[0032] 图4显示了经处理的蜂巢相对于未处理对照在不同时间期间上的螨载量/100只蜜蜂。
[0033] 图5显示了经SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:88或SEQ ID NO:89处理的螨在处理后第5天(D％)或第6天(D6)相对于未处理(NTC)的％存活。
[0034] 图6显示了经SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:88和SEQ ID NO:89的混合物处理的螨在5天(5)、第6天(6)和第7天(7)相对于未处理(NTC)的％存活。
[0035] 图7显示了经处理的蜂巢相对于未处理对照在17周时间期间上的瓦螨载量/100只蜜蜂。最左侧条表示经非特异序列(SCRAM,SEQ ID NO:5)处理的蜂巢、中间条为未处理蜂
巢、最右侧条为经SEQ ID NO:3(CAM 373)处理的蜂巢。
巢、最右侧条为经SEQ ID NO:3(CAM 373)处理的蜂巢。
[0036] 详述
[0037] 除非另有说明，否则用在本文中的技术和科学术语具有与普通技术人员所通常理解的相同的含义。本领域技术人员会认识到，很多方法可用于本公开的实施。实际上，本公开绝不限于所描述的方法和材料。将本文引述的任何文献都通过引用以其全文并入。出于
本公开的目的，以下的术语随后进行定义。
本公开的目的，以下的术语随后进行定义。
[0038] 应该理解，本申请中公开的任何序列标识号(SEQ ID NO)可指DNA序列或RNA序列，这取决于提及SEQ ID NO之处的上下文，即使该SEQ ID NO仅以DNA序列形式或RNA序列形式
表示。例如，SEQ ID NO:1是以DNA序列形式表示的(例如，列出T表示胸腺嘧啶)，但是其可指对应成熟狄斯瓦螨调钙蛋白核酸序列的DNA序列，或成熟狄斯瓦螨调钙蛋白分子核酸序列
的RNA序列。类似地，尽管SEQ ID NO:3是以RNA序列形式表示的(例如，列出U表示胸尿嘧
啶)，但取决于所描述分子的实际类型，SEQ ID NO:3可指包括dsRNA的RNA分子的序列，或者对应显示的RNA序列的DNA分子。任何情况下，可预见到带有任何置换的具有所公开序列的
DNA和RNA分子。
表示。例如，SEQ ID NO:1是以DNA序列形式表示的(例如，列出T表示胸腺嘧啶)，但是其可指对应成熟狄斯瓦螨调钙蛋白核酸序列的DNA序列，或成熟狄斯瓦螨调钙蛋白分子核酸序列
的RNA序列。类似地，尽管SEQ ID NO:3是以RNA序列形式表示的(例如，列出U表示胸尿嘧
啶)，但取决于所描述分子的实际类型，SEQ ID NO:3可指包括dsRNA的RNA分子的序列，或者对应显示的RNA序列的DNA分子。任何情况下，可预见到带有任何置换的具有所公开序列的
DNA和RNA分子。
[0039] 用在本文时，术语“约”指±10％。
[0040] 用在本文时，单数形式的“一个”和“所述”包括复数指代物，除非上下文另有明确说明。例如，术语“一种化合物”或“至少一种化合物”可以包括多种化合物，包括其混合物。
[0041] 用在本文时，“基本上相同的”或“基本上互补的”指核酸(或双链核酸的至少一条链或其部分，或单链核酸的一部分)在生理条件下与内源基因、从其转录的RNA或其片段杂交，以实现对该内源基因的调节或抑制。例如，在一些方面，当与靶基因内的或从该靶基因转录的RNA内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60或更多连续核苷酸的区域对比时，核酸具有100％序列同一性或至少约83、
84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％的序列同一性。在一些方面，当与靶基因内的或从该靶基因转录的RNA内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多连续核苷酸的区域对比时，核酸具有
100％序列互补性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％的序列互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因(基因的编码或非编码序列)的一个等位基
因或一个家族成员有100％的序列同一性或互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因的多个等位基因或家族成员有至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或
99％的序列同一性或互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因的多个等位基因或家族成员
有100％的序列同一性或互补性。
31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、
56、57、58、59、60或更多连续核苷酸的区域对比时，核酸具有100％序列同一性或至少约83、
84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％的序列同一性。在一些方面，当与靶基因内的或从该靶基因转录的RNA内的10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、
48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60或更多连续核苷酸的区域对比时，核酸具有
100％序列互补性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或99％的序列互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因(基因的编码或非编码序列)的一个等位基
因或一个家族成员有100％的序列同一性或互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因的多个等位基因或家族成员有至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、或
99％的序列同一性或互补性。在一些方面，核酸与给定靶基因的多个等位基因或家族成员
有100％的序列同一性或互补性。
[0042] 在一些方面，核酸与靶害虫的内源钙调蛋白基因的或从其转录的RNA的至少约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70或更多连续核苷酸是基本上相同的或基本上互补的。该核酸可以是单链DNA、单链RNA、双链RNA、双链DNA或DNA/RNA杂合双链。在一些方面，该钙调蛋白基因序列为狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自
SEQ ID NO:1的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:2的
钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:3的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:4的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:69的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因
序列为选自SEQ ID NO:70的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:71-87的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:88的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:89的钙调蛋白基因
序列。
SEQ ID NO:1的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:2的
钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:3的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:4的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:69的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因
序列为选自SEQ ID NO:70的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:71-87的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:88的钙调蛋白基因序列。在一方面，该钙调蛋白基因序列为选自SEQ ID NO:89的钙调蛋白基因
序列。
[0043] 用在本文时，术语“处理”包括消除、大体上抑制、减慢或逆转状况的进展，基本上缓解状况的临床或美学症状，或者基本上防止状况的临床或美学症状的出现。在本公开的一方面，组合物可以用于处理生物体或生物体群体的寄生作用。在一方面，核酸组合物可用于处理宿主生物体或群体的寄生物。在一方面，该宿主生物体为蜜蜂，该寄生物为狄斯瓦
螨。
螨。
[0044] 当用在本文时，短语“RNA沉默”指由RNA分子介导的一组调控机制(例如，RNA干扰(RNAi)、转录基因沉默(TGS)、转录后基因沉默(PTGS)、压制、共抑制、以及翻译阻遏)，其引起对应的蛋白编码基因或蜂病原体RNA序列的表达的抑制或“沉默”。在很多类型生物体中观察到RNA沉默，包括植物、动物和真菌。在本公开的一些方面，核酸组合物提供RNA沉默。在某些方面，该核酸组合物在寄生物中提供RNA沉默和致死性。
[0045] 用在本文时，术语“RNA沉默试剂”指能够抑制或“沉默”靶基因表达的核酸。在某些方面，该RNA沉默试剂能够通过转录后沉默机制防止mRNA分子的完整加工(例如，完全翻译和/或表达)。RNA沉默试剂可为单或双链RNA或者单或双链DNA或者DNA/RNA杂合双链或者它
们经修饰的类似物。在一些方面，该RNA沉默试剂选自(a)单链RNA分子(ssRNA)、(b)自身杂交以形成双链RNA分子的ssRNA、(c)双链RNA分子(dsRNA)、(d)单链DNA分子(ssDNA)、(e)自身杂交以形成双链DNA分子的ssDNA、以及(f)包括转录为RNA分子的修饰Pol III基因的单
链DNA分子、(g)双链DNA分子(dsDNA)、(h)包括转录为RNA分子的修饰Pol III启动子的双链DNA分子，(i)双链杂交RNA/DNA分子，或者它们的组合。在一些方面，这些多核苷酸包括化学修饰的核苷酸或非典型核苷酸。在一些方面，该RNA沉默试剂为非编码RNA分子，例如包含配对链的RNA双链体，以及从其可生成这种小的非编码RNA的前体RNA。在一些方面，该RNA沉默试剂为dsRNA，如siRNA，miRNA和shRNA。在一个方面，该RNA沉默试剂能够诱导RNA干扰。在另一方面，该RNA沉默试剂能够介导翻译遏制。在一方面，该RNA沉默试剂能够抑制钙调蛋白基因的表达。在另一方面，该RNA沉默试剂能够用在抑制靶基因的表达并由此杀死靶生物体的方法中。在某些方面，该靶基因为钙调蛋白基因，该靶生物体为狄斯瓦螨。
们经修饰的类似物。在一些方面，该RNA沉默试剂选自(a)单链RNA分子(ssRNA)、(b)自身杂交以形成双链RNA分子的ssRNA、(c)双链RNA分子(dsRNA)、(d)单链DNA分子(ssDNA)、(e)自身杂交以形成双链DNA分子的ssDNA、以及(f)包括转录为RNA分子的修饰Pol III基因的单
链DNA分子、(g)双链DNA分子(dsDNA)、(h)包括转录为RNA分子的修饰Pol III启动子的双链DNA分子，(i)双链杂交RNA/DNA分子，或者它们的组合。在一些方面，这些多核苷酸包括化学修饰的核苷酸或非典型核苷酸。在一些方面，该RNA沉默试剂为非编码RNA分子，例如包含配对链的RNA双链体，以及从其可生成这种小的非编码RNA的前体RNA。在一些方面，该RNA沉默试剂为dsRNA，如siRNA，miRNA和shRNA。在一个方面，该RNA沉默试剂能够诱导RNA干扰。在另一方面，该RNA沉默试剂能够介导翻译遏制。在一方面，该RNA沉默试剂能够抑制钙调蛋白基因的表达。在另一方面，该RNA沉默试剂能够用在抑制靶基因的表达并由此杀死靶生物体的方法中。在某些方面，该靶基因为钙调蛋白基因，该靶生物体为狄斯瓦螨。
[0046] RNA干扰指动物中由小RNA介导的序列特异的转录后基因沉默过程。对应的过程在植物中一般称为转录后基因沉默或RNA沉默，在真菌中也称为压制。尽管并不局限于任何具体理论，转录后基因沉默过程还是可认为是用于防止外来基因表达的进化上保守的细胞防
御机制，并且为不同植物群和门所共有。这种防止外来基因表达可以在应答双链RNA
(dsRNA)的生成中进化，该双链RNA衍生自病毒感染或者衍生自经由特异破坏同源单链RNA
或病毒基因组RNA的细胞应答产生的转座子元件随机整合进宿主基因组。在本公开的一些
方面，核酸组合物在靶生物体中引起RNA干扰。在某些方面，该核酸组合物在狄斯瓦螨中引起RNA干扰，当其存在于宿主生物体-蜜蜂中时。根据本公开的一些方面，选择性杀虫剂可以在靶生物体中引起RNA干扰，而在非靶生物体中没有RNA干扰活性。
御机制，并且为不同植物群和门所共有。这种防止外来基因表达可以在应答双链RNA
(dsRNA)的生成中进化，该双链RNA衍生自病毒感染或者衍生自经由特异破坏同源单链RNA
或病毒基因组RNA的细胞应答产生的转座子元件随机整合进宿主基因组。在本公开的一些
方面，核酸组合物在靶生物体中引起RNA干扰。在某些方面，该核酸组合物在狄斯瓦螨中引起RNA干扰，当其存在于宿主生物体-蜜蜂中时。根据本公开的一些方面，选择性杀虫剂可以在靶生物体中引起RNA干扰，而在非靶生物体中没有RNA干扰活性。
[0047] 用在本文时，“小RNA”指至少15碱基对长度、通常15-30个核苷酸长、优选20-24个核苷酸长的任何RNA分子。在本公开的一些方面，“小RNA”长度大于50碱基对。在一方面，该小RNA长度大于50碱基对，但小于约500碱基对。在一方面，该小RNA长度大于100碱基对，但小于约500碱基对。在一方面，该小RNA长度大于200碱基对，但小于约500碱基对。小RNA可为双链或单链的。小RNA包括但不限于，miRNA(微RNA)、ta-siRNA(反式激活siRNA)、siRNA、激活RNA(RNAa)、nat-siRNA(天然反义siRNA)、hc-siRNA(异染色质siRNA)、顺式作用siRNA、lmiRNA(长miRNA)、lsiRNA(长siRNA)以及easiRNA(表观遗传激活的siRNA)以及它们各自的前体。在一些实施方案中，本公开的siRNA分子为miRNA分子、ta-siRNA分子和RNAa分子以及它们各自的前体。小RNA可以由生物体在体内加工成活性形式。根据本公开的一些方面，选择性杀虫剂可以为小RNA。
[0048] 在本公开的一些方面，在组合物中直接提供小RNA。在其它方面，小RNA从DNA或RNA前体通过生物体在体内生成。在一些方面，该小RNA作为转基因产物在生物体内生成，例如酵母或细菌细胞内。在某些方面，作为转基因产物生成的小RNA是作为前体生成的，该前体在生物体摄取或吸收后在体内被加工。在其它方面，作为转基因产物生成的小RNA是作为前体生成的，该前体在生物体摄取或吸收后在体内被加工。
[0049] 在一些方面，该RNA沉默试剂可以为人工微RNA。用在本文时，“人工微RNA”(amiRNA)为一种类型的miRNA，其是通过从天然miRNA前体置换原本miRNA双链体而衍生的。
通常，人工miRNA为从前miRNA分子骨架生成的非天然存在的miRNA分子，这通过以对应于人工miRNA序列的目的序列替换天然存在的前miRNA分子的miRNA序列来工程化。在本公开的
一些方面，核酸组合物可以为amiRNA组合物。
通常，人工miRNA为从前miRNA分子骨架生成的非天然存在的miRNA分子，这通过以对应于人工miRNA序列的目的序列替换天然存在的前miRNA分子的miRNA序列来工程化。在本公开的
一些方面，核酸组合物可以为amiRNA组合物。
[0050] 各种研究证明了长dsRNA可用于沉默基因表达，而不诱导应激反应或引起明显的脱靶效应-参见，例如(Strat等,Nucleic Acids Research,2006,Vol.34,No.13 3803-
3810；Bhargava A等Brain Res.Protoc.2004；13:115-125；Diallo M.等,
Oligonucleotides.2003；13:381-392；Paddison P.J.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA.2002；
99:1443-1448；Tran N.等,FEBS Lett.2004；573:127-134)。本公开提供并包括具有长
dsRNA的方法和组合物。
3810；Bhargava A等Brain Res.Protoc.2004；13:115-125；Diallo M.等,
Oligonucleotides.2003；13:381-392；Paddison P.J.等,Proc.Natl Acad.Sci.USA.2002；
99:1443-1448；Tran N.等,FEBS Lett.2004；573:127-134)。本公开提供并包括具有长
dsRNA的方法和组合物。
[0051] 用在本文时，关于核酸序列、核酸分子或基因，术语“天然”或“原本”指各自的序列或分子存在于野生型生物体中，其未经人工遗传修饰或处理。天然靶向靶基因的小RNA分子指存在于野生型生物体内的小RNA分子，细胞未经人工遗传修饰或处理，其靶向各生物体中天然出现的靶基因。
[0052] 用在本文时，当与核酸关联使用，术语“同源性”和“相同性”描述两或多个核苷酸序列之间的相似性程度。两序列之间的“序列同一性”百分比通过在比较窗口上比较两最佳对齐的序列来确定，为了最佳对齐两序列，比较窗口中该部分序列可以相对于参考序列(其不包含插入或缺失)包含插入或缺失(空位)。这样计算该百分比：确定两序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置数量，以得到匹配位置数量，用匹配位置数量除以比较窗口中总的位置数量，并以所得结果乘以100，得到序列同一性百分比。与参考序列比较，在每个位置上都相同的序列，称为与参考序列是相同的，反之亦然。可以采用任何适合的计算机程序进行两个或多个序列的比对。例如，进行序列比对所广泛使用并接受的计算机程序为
CLUSTALW v1.6(Thompson等，Nucl.Acids Res.,22:4673-4680,1994)。
CLUSTALW v1.6(Thompson等，Nucl.Acids Res.,22:4673-4680,1994)。
[0053] 用在本文时，对生物体而言的“外源多核苷酸”和“外源核酸分子”指不是在该生物体内天然表达的异源核酸序列。可以将外源核酸分子以稳定或瞬时方式引入生物体内。外源核酸分子可以包含与生物体或该生物体的害虫或病原体的内源核酸序列相同的或部分
同源的核酸序列。在某些方面，“外源多核苷酸”和“外源核酸分子”可以指在宿主中表达的或存在的寄生物核酸序列，无论是瞬时的还是稳定的。本公开提供并包括包含外源多核苷
酸和外源核酸分子的组合物以及将它们引入靶生物体的方法。在一些方面，本公开提供并
包括包含外源多核苷酸和外源核酸分子的组合物以及将它们引入作为靶生物体的宿主的
非靶生物体的方法。
同源的核酸序列。在某些方面，“外源多核苷酸”和“外源核酸分子”可以指在宿主中表达的或存在的寄生物核酸序列，无论是瞬时的还是稳定的。本公开提供并包括包含外源多核苷
酸和外源核酸分子的组合物以及将它们引入靶生物体的方法。在一些方面，本公开提供并
包括包含外源多核苷酸和外源核酸分子的组合物以及将它们引入作为靶生物体的宿主的
非靶生物体的方法。
[0054] 用在本文时，“对照生物体”指不含有用于控制害虫或寄生物的重组DNA、小RNA或其它核酸(例如，蛋白，miRNA，抗小RNA的靶mRNA，dsRNA，靶类似物)的生物体。对照生物体通常来自相同物种并处于相同发育阶段，在与经处理的生物体相同的生长条件下生长。类似地，“对照群体”指不含有用于控制害虫或寄生物的重组DNA、小RNA或其它核酸(例如，蛋白，miRNA，抗小RNA的靶mRNA，靶类似物)的生物体群体。对照生物体群体通常来自相同物种并处于相同发育阶段，在与经处理的生物体群体相同的生长条件下生长。作为非限定性实例，对照生物体可为提供了不含本公开的核酸的组合物的蜜蜂。在另一非限定性实例中，对照
生物体可为提供了含有核酸的组合物的蜜蜂，该核酸不在蜜蜂或寄生物内起RNA沉默剂的
作用，例如SEQ ID NO:5。
生物体可为提供了含有核酸的组合物的蜜蜂，该核酸不在蜜蜂或寄生物内起RNA沉默剂的
作用，例如SEQ ID NO:5。
[0055] 用在本文时，术语“改善”和“增加”指生物体或群体量、生物体或群体的增加的生产率(例如，增加的蜂蜜产量)、生物体或群体增加的生长率、或增加的繁殖率相对于对照生物体或群体有至少约2％、至少约3％、至少约4％、至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更多的增加。本公开提供了通过提供选择性杀虫组合物改善生物体或群体的健康的方法。
[0056] 用在本文时，诸如蛋白或mRNA的试剂的水平的“降低”指该水平相对于缺乏能够降低该试剂的核酸的生物体或群体而言降低了。用在本文时，当提及寄生作用或寄生物载量，“降低”指该水平相对于缺乏能够降低寄生物的存活力、产卵力或数量的核酸(如dsRNA分子)的生物体或群体降低了。本公开提供并包括降低蛋白或mRNA的水平以及降低寄生物的
水平或数量的方法和组合物。
水平或数量的方法和组合物。
[0057] 用在本文时，诸如蛋白或mRNA的试剂的水平的“至少部分降低”术语指该水平相对于缺乏能够降低该试剂的核酸(例如dsRNA分子)的生物体或群体而言降低至少25％。用在本文时，当提及寄生作用或寄生物载量，“至少部分降低”指该水平相对于缺乏能够降低寄生物的存活力、产卵力或数量的核酸(如dsRNA分子)的生物体或群体降低至少25％。本公开提供并包括至少部分降低蛋白或mRNA的水平以及至少部分降低寄生物的水平或数量的方
法和组合物。
法和组合物。
[0058] 用在本文时，诸如蛋白或mRNA的试剂的水平的“明显降低”指该水平相对于缺乏能够降低该试剂的核酸(例如dsRNA分子)的生物体或群体而言降低了，其中该试剂水平的降低为至少75％。用在本文时，当提及寄生作用或寄生物载量，“明显降低”指该水平相对于缺乏能够降低寄生物的存活力、产卵力或数量的核酸(如dsRNA分子)的生物体或群体降低至
少75％。本公开提供并包括明显降低蛋白或mRNA的水平以及明显降低寄生物的水平或数量
的方法和组合物。
少75％。本公开提供并包括明显降低蛋白或mRNA的水平以及明显降低寄生物的水平或数量
的方法和组合物。
[0059] 用在本文时，“有效消除”诸如蛋白或mRNA的试剂是相对于缺乏能够降低该试剂的dsRNA分子的生物体或群体，其中该试剂水平的降低大于95％。诸如dsRNA分子的试剂优选能够提供对诸如蛋白或mRNA的另一试剂或寄生物的至少部分降低、更有选明显降低、或最
优选有效消除，其中该试剂基本上不影响、明显地不影响或部分地不影响第二试剂的水平
或宿主生物体。用在本文时，当提及寄生作用或寄生物载量，“有效消除”还指该水平相对于缺乏能够降低寄生物的存活力、产卵力或数量的核酸(如dsRNA分子)的生物体或群体降低
至少95％。本公开提供并包括有效消除蛋白或mRNA以及有效消除寄生物的方法和组合物。
优选有效消除，其中该试剂基本上不影响、明显地不影响或部分地不影响第二试剂的水平
或宿主生物体。用在本文时，当提及寄生作用或寄生物载量，“有效消除”还指该水平相对于缺乏能够降低寄生物的存活力、产卵力或数量的核酸(如dsRNA分子)的生物体或群体降低
至少95％。本公开提供并包括有效消除蛋白或mRNA以及有效消除寄生物的方法和组合物。
[0060] 用在本文时，当提及核酸分子在生物体内的表达或活性，术语“抑制”、“遏制”和“下调”在本文中等同使用，指应用本公开的方法后，该核酸分子在生物体细胞内的表达或活性水平低于应用该方法前其在生物体细胞内的表达或活性，或者与缺乏本公开的核酸分子的对照生物体相比较降低了。本公开提供并包括抑制、遏制和下调蛋白或mRNA的水平以
及抑制、遏制和下调寄生物的水平或数量的方法和组合物。
及抑制、遏制和下调寄生物的水平或数量的方法和组合物。
[0061] 用在本文时，术语“被抑制的”、“被遏制的”和“被下调的”是同义的，在本文是指所靶向的核酸分子较低的、优选明显较低的表达或活性。用在本文时，当提及寄生作用或寄生物载量，“被抑制的”、“被遏制的”和“被下调的”还指寄生作用或寄生物载量的水平相对于缺乏能够降低寄生物的存活力、产卵力或数量的核酸(如dsRNA分子)的生物体或群体是较低的、优选是明显较低的。本公开提供并包括抑制、遏制和下调蛋白或mRNA的表达或活性以及抑制、遏制和下调寄生物的活性的方法和组合物。
[0062] 用在本文时，诸如蛋白、mRNA或RNA的试剂的水平或活性的“抑制”、“遏制”、或“下调”指该水平或活性相对于基本上相同的细胞、生物体或群体降低了，该细胞、生物体或群体在基本相同的条件下生长，缺乏本公开的核酸，例如缺乏与本公开的重组构建体或重组载体-dsRNA或siRNA的前体分子的至少一部分互补的区域。用在本文时，对诸如靶基因表达的preRNA、mRNA、rRNA、tRNA、snoRNA、snRNA和/或靶基因编码的蛋白产物的试剂的水平或活性的“抑制”、“遏制”、或“下调”，指，相对于缺乏本公开的重组核酸分子的细胞、生物体或群体，该量降低10％或更多，例如20％或更多，优选30％或更多，更优选50％或更多，甚至更优选70％或更多，最优选80％或更多，例如90％。本公开提供并包括用于相对于未处理生物体或群体抑制、遏制和下调诸如蛋白、mRNA、RNA的试剂或寄生物的方法和组合物。
[0063] 用在本文时，术语“节肢动物”指无脊椎动物的成体和蛹，具有外骨骼(外部骨骼)、分节的身体和有关节的附肢。节肢动物为节肢动物门的成员，包括昆虫、蜘蛛和甲壳类动物。本公开的节肢动物，包括但不限于西方蜜蜂、东方蜜蜂(Apis cerana)、极小无刺蜂
(Trigona minima)、集蜂科(Halictidae)、熊蜂某种(Bombus sp.)、跳蚤、蝇、虱、蜱、螨和有益昆虫。本公开提供并包括用于处理作为宿主或作为寄生物或害虫的节肢动物的方法和组
合物。
(Trigona minima)、集蜂科(Halictidae)、熊蜂某种(Bombus sp.)、跳蚤、蝇、虱、蜱、螨和有益昆虫。本公开提供并包括用于处理作为宿主或作为寄生物或害虫的节肢动物的方法和组
合物。
[0064] 在一方面，节肢动物可以为昆虫。在某些面，昆虫可以为蜜蜂。用在本文时，术语“蜜蜂”指成体蜜蜂及其蛹体。根据一个方面，该蜜蜂在蜂巢内。成体蜜蜂定义为膜翅目(Hymenoptera)蜜蜂总科(Apoidea)的几种有翅的、身体有毛的、通常有刺的昆虫的任一种，包括独居和群居种类，特征为以吸式口器和咀嚼式口器收集花蜜和花粉。蜜蜂物种的例子
包括但不限于蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、无刺蜂属(Trigona)、壁蜂属(Osmia)，等等。
在一个方面，蜜蜂包括但不限于大黄蜂(欧洲熊蜂(Bombus terrestris))、蜜蜂(西方蜜蜂)(包括采集蜂和蜂巢蜂)以及东方蜜蜂。本公开提供并包括用于处理作为寄生物宿主的蜂类
的方法和组合物。
包括但不限于蜜蜂属(Apis)、熊蜂属(Bombus)、无刺蜂属(Trigona)、壁蜂属(Osmia)，等等。
在一个方面，蜜蜂包括但不限于大黄蜂(欧洲熊蜂(Bombus terrestris))、蜜蜂(西方蜜蜂)(包括采集蜂和蜂巢蜂)以及东方蜜蜂。本公开提供并包括用于处理作为寄生物宿主的蜂类
的方法和组合物。
[0065] 根据一个方面，蜜蜂为群体的一部分。术语“群体”指一群蜜蜂，包括几十至通常几万个蜜蜂，它们在蜂巢搭建、食物收集和幼蜂抚养方面协作配合。群体一般具有单个蜂王，剩余的蜜蜂是“工蜂”(雌性)或“雄蜂”(雄性)。群体的社会结构由蜂王和工蜂维持，并依赖有效的交流系统。工蜂等级内的劳动分工主要取决于蜜蜂的年龄，但也随群体需要而变化。繁殖和群体力度取决于蜂王、食物储存量和工蜂势力的大小。蜜蜂也可细分为“蜂巢蜂”和“采集蜂”，“蜂巢蜂”通常为工蜂一生的前一部分时间，在此期间“蜂巢蜂”在蜂巢内执行任务；“采集蜂”为蜜蜂一生的后一部分时间，在此期间“觅食者”从蜂巢外部找到并收集花粉和花蜜，并将花蜜或花粉带进蜂巢用于消费和保存。本公开提供并包括用于处理昆虫群体
的方法和组合物。
的方法和组合物。
[0066] 用在本文时，术语“害虫”指这样的生物体成体和未成熟形式：其为侵入性的或多产的、有害的、令人烦恼的、有毒的、破坏性的，植物或动物或者生态系统的损害者。寄生物为一种类型的害虫。生物体有可能在一种情况下为害虫，但在另一种情况下为有益的、驯养的或可接受的。
[0067] 用在本文时，术语“寄生物”指这样的生物体成体和未成熟形式：它们直接从损害另一宿主生物体获益，例如通过以宿主的血液或液体为食、在宿主生物体细胞内生存、或在宿主生物体体内生存。寄生物包括作为动物、真菌、细菌或植物的生物体，提供它们与宿主的消极或有害相互作用来鉴定。在一些方面，用在本文时，寄生物又可作为第二寄生物的宿主。在一些方面，寄生物和宿主可以为相同类型的生物体(例如，节肢动物宿主和节肢动物寄生物)。寄生物包括但不限于，蜱螨亚纲(Acari)(蜱，螨)、虱蝇科(Hippoboscoidea)(蝇)、姬蜂总科(Ichneumonoidea)(寄生蜂)、狂蝇科(Oestridae)(肤蝇)、虱目(Phthiraptera)(虱)、蚤目(Siphonaptera)(跳蚤)、微虾纲(Tantulocarida)、豆蟹、以及蟹奴(Sacculina)。
用在本文时，害虫可以包括寄生和非寄生生命阶段。本公开提供并包括用于处理寄生物的
方法和组合物。在一方面，寄生物可以为狄斯瓦螨。
用在本文时，害虫可以包括寄生和非寄生生命阶段。本公开提供并包括用于处理寄生物的
方法和组合物。在一方面，寄生物可以为狄斯瓦螨。
[0068] 如本公开所提供的以及包括的，寄生物和/害虫包括狄斯瓦螨、肩突硬蜱(Ixodes scapularis)、红火蚁(Solenopsis invicta)、二斑叶螨(Tetranychus urticae)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)、致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)、豌豆蚜(Acyrthosiphon pisum)、以及人虱(Pediculus humanus)。在本公开的一些方面，选择性杀虫剂可以为狄斯瓦螨、肩突硬蜱、红火蚁、二斑叶螨、埃及伊蚊、致倦库蚊、豌豆蚜、以及人虱选择性的，并且对非靶生物体如宿主生物体是无活性的或明显减小活性的。
[0069] 用在本文时，术语“赋形剂”指制剂中的任何无活性物质，该制剂具有活性成分，例如抗寄生物、抗害虫或杀虫核酸，包括但不限于dsRNA、小RNA、miRNA和反义RNA。在一些实施方案中，赋形剂包括可以为组合物提供不同于抗寄生、抗害虫或杀虫核酸的额外功能性的物质。赋形剂包括但不限于“膨松剂”、“填充剂”、“稀释剂”、和“载体”。体积增大使得能方便和精确的分配本公开的组合物。赋形剂也可用来促进生物体摄取该组合物，包括各种碳水
化合物、蛋白、脂肪酸、花粉和花粉替代物。赋形剂也可用于促进生物体对组合物的吸收，包括例如活性成分的水性或非水性溶液。赋形剂的非限定性实例包括玉米糖浆、糖浆、糖固
体、半糖固体、花粉、大豆蛋白、以及花粉和蛋白的混合物。赋形剂还可以包括引诱剂、缓冲剂和营养补充物。本公开的组合物可以涂覆有赋形剂、包裹在赋形剂中、溶解在赋形剂中、与赋形剂混合，或者以其它方式与赋形剂结合。用在本文时，术语赋形剂可以指非活性物质的混合物。
化合物、蛋白、脂肪酸、花粉和花粉替代物。赋形剂也可用于促进生物体对组合物的吸收，包括例如活性成分的水性或非水性溶液。赋形剂的非限定性实例包括玉米糖浆、糖浆、糖固
体、半糖固体、花粉、大豆蛋白、以及花粉和蛋白的混合物。赋形剂还可以包括引诱剂、缓冲剂和营养补充物。本公开的组合物可以涂覆有赋形剂、包裹在赋形剂中、溶解在赋形剂中、与赋形剂混合，或者以其它方式与赋形剂结合。用在本文时，术语赋形剂可以指非活性物质的混合物。
[0070] 本申请提供并公开了抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，它们与钙调蛋白靶基因或从钙调蛋白靶基因表达的RNA或其片段基本上同源或互补，并起抑制钙调蛋白靶基因的作
用或者产生敲除表型。该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子能够抑制或“沉默”钙调蛋白靶基因的表达。通常在描述这些核酸分子时提及它们的“靶序列”。在一些实施方案中，该靶序列选自SEQ ID NO.1、2和6-77。该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以为单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、或双链DNA/RNA杂交体。这些核酸分子可以包含天然出现的核苷酸、修饰的核苷酸、核苷酸类似物或它们的任意组合。在一些实施方案中，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以被并入较大的多核苷酸中，例如在pri-miRNA分子中。在一些实施方案中，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以被加工成小干扰RNA
(siRNA)。在一些实施方案中，提供或公开了选择性地抗寄生或杀螨的核酸分子，以及调节它们的靶基因的表达或活性以从群体或群减少或消除寄生物的方法。
用或者产生敲除表型。该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子能够抑制或“沉默”钙调蛋白靶基因的表达。通常在描述这些核酸分子时提及它们的“靶序列”。在一些实施方案中，该靶序列选自SEQ ID NO.1、2和6-77。该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以为单链DNA(ssDNA)、单链RNA(ssRNA)、双链RNA(dsRNA)、双链DNA(dsDNA)、或双链DNA/RNA杂交体。这些核酸分子可以包含天然出现的核苷酸、修饰的核苷酸、核苷酸类似物或它们的任意组合。在一些实施方案中，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以被并入较大的多核苷酸中，例如在pri-miRNA分子中。在一些实施方案中，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以被加工成小干扰RNA
(siRNA)。在一些实施方案中，提供或公开了选择性地抗寄生或杀螨的核酸分子，以及调节它们的靶基因的表达或活性以从群体或群减少或消除寄生物的方法。
[0071] 在本发明的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子包含与选自SEQ ID NO:1至89的序列或序列的一部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或
99％序列同一性的核苷酸序列。在某些方面，该核酸分子选自ssDNA、ssRNA、dsRNA、dsDNA、或DNA/RNA杂交体。几个实施方案涉及dsRNA，该dsRNA包含与选自SEQ ID NO:1至89的序列
或序列的一部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核苷酸序列。在另一方面，提供了编码至少一个诸如ssRNA或dsRNA的核酸的DNA，该DNA包含选自SEQ ID NO:1至89的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分，或者与SEQ ID NO:1
至89或其部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。在另一方面，提供了编码至少一个诸如ssRNA或dsRNA的核酸的重组DNA，该DNA包含选自SEQ ID NO:1至89的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分、异源启动子以及转录终止子序列。
在另一方面，本公开提供了编码至少一个诸如ssRNA或dsRNA的核酸的重组DNA，该DNA包含
与选自SEQ ID NO:1至89的序列或序列的一部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、
96％、97％、98％、或99％序列同一性的核苷酸序列，还包含异源启动子和转录终止子。
99％序列同一性的核苷酸序列。在某些方面，该核酸分子选自ssDNA、ssRNA、dsRNA、dsDNA、或DNA/RNA杂交体。几个实施方案涉及dsRNA，该dsRNA包含与选自SEQ ID NO:1至89的序列
或序列的一部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的核苷酸序列。在另一方面，提供了编码至少一个诸如ssRNA或dsRNA的核酸的DNA，该DNA包含选自SEQ ID NO:1至89的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分，或者与SEQ ID NO:1
至89或其部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性。在另一方面，提供了编码至少一个诸如ssRNA或dsRNA的核酸的重组DNA，该DNA包含选自SEQ ID NO:1至89的核苷酸序列或核苷酸序列的一部分、异源启动子以及转录终止子序列。
在另一方面，本公开提供了编码至少一个诸如ssRNA或dsRNA的核酸的重组DNA，该DNA包含
与选自SEQ ID NO:1至89的序列或序列的一部分有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、
96％、97％、98％、或99％序列同一性的核苷酸序列，还包含异源启动子和转录终止子。
[0072] 在本公开的一些方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的10至17个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的18至25个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的20至30个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含
抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的25至35个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的30至40个或更多个连
续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的40至50个或更多个连续核苷酸的区
域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至50个连续核
苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至40个连续核苷酸的区域有100％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少25个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合
物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少35个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少40个连续核苷酸的
区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。
在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，靶基因可以为
包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方
面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选
自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的20至30个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含
抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的25至35个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的30至40个或更多个连
续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的40至50个或更多个连续核苷酸的区
域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至50个连续核
苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至40个连续核苷酸的区域有100％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少25个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合
物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少35个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少40个连续核苷酸的
区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。
在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，靶基因可以为
包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方
面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选
自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
[0073] 在本公开的一些方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的10至17个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的18至25个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的20至30个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的25至35个或更
多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的30至40个或更多个连续核苷酸
的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的40至50个或更多个连续核苷酸的区域有99％序
列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子的组合物包含与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性的核酸分子。在一
方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至50个连续核苷酸的区域有
99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少25个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少35个连续核
苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少40个连续核苷酸的区域有99％序列同
一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少
60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少
94％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少91％序列同一性。
在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与以上提供的靶基因的区域有至少约83、84、85、
86、87、88、89、90％相同性。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71
至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的30至40个或更多个连续核苷酸
的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的40至50个或更多个连续核苷酸的区域有99％序
列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子的组合物包含与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性的核酸分子。在一
方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至50个连续核苷酸的区域有
99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的多至40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少25个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少35个连续核
苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少40个连续核苷酸的区域有99％序列同
一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与靶基因内或从靶基因转录的RNA内的至少
60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少
94％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少91％序列同一性。
在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与以上提供的靶基因的区域有至少约83、84、85、
86、87、88、89、90％相同性。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71
至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
[0074] 在本公开的一些方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因(基因的编码或非编码序列)的一个等位基因或一个家族成员的10至17个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的18至25个或更多个
连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的20至30个或更多个连续
核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的25至35个或更多个连续核苷
酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的30至40个或更多个连续核苷酸的
区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的40至50个或更多个连续核苷酸的区域
有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有
100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％
序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。
在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个
家族成员的多至40个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄
生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的
至少25个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少35个连续
核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少40个连续核苷酸的区域
有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少50个连续核苷酸的区域有100％序列同
一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方
面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的20至30个或更多个连续
核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的25至35个或更多个连续核苷
酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的30至40个或更多个连续核苷酸的
区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的40至50个或更多个连续核苷酸的区域
有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有
100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％
序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。
在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个
家族成员的多至40个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄
生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的
至少25个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少35个连续
核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少40个连续核苷酸的区域
有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少50个连续核苷酸的区域有100％序列同
一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性。在一方
面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
[0075] 在本公开一些方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的10至17个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的18至25个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的20至30个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一
性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的25至35个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在
一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的30至40个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的40至50个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组
合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一
个家族成员的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物
包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家
族成员的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含
抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成
员的多至60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至50个连
续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分
子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至40个连续核苷酸的区
域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少25个连续核苷酸的区域有99％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少35个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含
抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成
员的至少50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少60个连
续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少93％序列同一
性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少92％序列同一性。
在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与以上提供的靶基因的区域有至少约83、84、85、86、87、
88、89、90％相同性。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序
列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的20至30个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一
性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的25至35个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在
一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的30至40个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的40至50个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组
合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一
个家族成员的50至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物
包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家
族成员的45至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含
抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成
员的多至60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至50个连
续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分
子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的多至40个连续核苷酸的区
域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少25个连续核苷酸的区域有99％序列
同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少35个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含
抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成
员的至少50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的至少60个连
续核苷酸的区域有99％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少98％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少93％序列同一
性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少92％序列同一性。
在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与以上提供的靶基因的区域有至少约83、84、85、86、87、
88、89、90％相同性。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序
列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
[0076] 在本公开一些方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与10至17个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与给定靶基因的一个等位基因或一个家族成员的18至25个或更多个连续核苷酸的
区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与20至30个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多
个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分
子，该核酸分子与25至35个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与30至40个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与40至50个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同
一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与50至60个或更多个连续核苷酸的区域有
100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与45至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或
互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同
或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至40个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相
同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少25个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员
相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少35个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成
员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少
40个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族
成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家
族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或
家族成员相同或互补。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87
的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
区域有100％序列同一性。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与20至30个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多
个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分
子，该核酸分子与25至35个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与30至40个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与40至50个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同
一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与50至60个或更多个连续核苷酸的区域有
100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方
面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与45至60个或更多个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或
互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同
或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至40个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相
同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少25个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员
相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少35个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成
员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少
40个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族
成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少50个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家
族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少60个连续核苷酸的区域有100％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或
家族成员相同或互补。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87
的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
[0077] 在本公开一些方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与10至17个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与18至25个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多
个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分
子，该核酸分子与20至30个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定
靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与25至35个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区
域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与30至40个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一
性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与40至50个或更多个连续核苷酸的区域有99％
序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与50至60个或更多个连续核苷酸的区
域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一
方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与45至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少25个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少35个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少98％序列同一性。
在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与以上提供的靶基因的区域有至少约83、84、85、86、87、88、89、90％相同性。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基
因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。
在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分
子，该核酸分子与20至30个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定
靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与25至35个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区
域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与30至40个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一
性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与40至50个或更多个连续核苷酸的区域有99％
序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与50至60个或更多个连续核苷酸的区
域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互补。在一
方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与45至60个或更多个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与多至40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少25个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少35个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少40个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少50个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一方面，组合物包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子，该核酸分子与至少60个连续核苷酸的区域有99％序列同一性，该区域与给定靶基因的多个等位基因或家族成员相同或互
补。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少98％序列同一性。
在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少97％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少96％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少95％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少94％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少93％序列同一性。在一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少92％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与靶基因的区域有至少91％序列同一性。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子与以上提供的靶基因的区域有至少约83、84、85、86、87、88、89、90％相同性。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1至89的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:1的基
因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:2的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:3的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:4的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:69的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:70的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:88的基因。在一方面，靶基因可以为包含SEQ ID NO:89的基因。
在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:71至87的序列的基因。在一方面，靶基因可以为包含选自SEQ ID NO:6至68的序列的基因。
[0078] 本申请提供并公开了包含抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子以及赋形剂物质的组合物。在一方面，该赋形剂可为一种或多种无活性组分的组合。在一些方面，该赋形剂包括糖。
示例性的糖包括己糖类、二糖类、三糖类和高级糖类。赋形剂糖包括，例如，果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖。在其它方面，该赋形剂包含糖和溶剂。在一些方面，该赋形剂包括蛋白。在一方面，该蛋白为大豆蛋白。在其它方面，该赋形剂可以为花粉。在本公开的一些方面，该赋形剂可以为蜂粮。在一些方面，该赋形剂包括胰蛋白胨。在一些方面，该赋形剂包括酵母提取物。在一些方面，该赋形剂包括精油。
示例性的糖包括己糖类、二糖类、三糖类和高级糖类。赋形剂糖包括，例如，果糖、葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、半乳糖、核糖。在其它方面，该赋形剂包含糖和溶剂。在一些方面，该赋形剂包括蛋白。在一方面，该蛋白为大豆蛋白。在其它方面，该赋形剂可以为花粉。在本公开的一些方面，该赋形剂可以为蜂粮。在一些方面，该赋形剂包括胰蛋白胨。在一些方面，该赋形剂包括酵母提取物。在一些方面，该赋形剂包括精油。
[0079] 蜜蜂饲养在养蜂者中是一般做法，用于提供营养的和其它的例如补充需求。蜜蜂通常以蜂蜜和花粉为食，但已知也吞食非天然饲料。可用各种食品饲喂蜜蜂，包括但不限
于，小麦(奶制品酵母生长在白干酪上)、大豆粉、酵母(例如啤酒酵母、圆酵母)和酵母产品-单独或组合饲喂，大豆粉作为干燥混合物或湿润块状物在蜂巢内饲喂，或者作为干燥混合
物在蜂巢外部的敞开饲喂器中饲喂。还可用的是糖或糖浆。向蜜蜂的补充饲喂添加10至
12％的花粉改善了可口性。添加25至百分比的花粉改善了必需营养素的质量和数量，为蜜
蜂生命活动所需要的。甘蔗或甜菜糖、异构化玉米糖浆、以及type-50糖浆为蜜蜂天然饮食中令人满意的蜂蜜替代品。后两个可仅作为液体提供给蜜蜂。液体饲料可在蜂巢内部提供
给蜜蜂，例如通过一些方法的任一个：摩擦顶桶(friction-top pail)、幼蜂巢箱内的脾、隔板饲喂器、博得曼(boardman)饲喂器，等等。干燥的糖可以通过放置一或两磅在倒置的内盖上来饲喂。必须让蜜蜂随时可获得提供的水。在一方面，可设想这样的盘或碟，其中存在木屑、软木或塑料海绵。关于蜜蜂补充饲料的详细描述可在例如Standifer等1977年撰写的标题为“Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies(蜜蜂蜂群的补充饲喂)”的USDA出
版物(USDA，农业信息快报No.413)中找到。
于，小麦(奶制品酵母生长在白干酪上)、大豆粉、酵母(例如啤酒酵母、圆酵母)和酵母产品-单独或组合饲喂，大豆粉作为干燥混合物或湿润块状物在蜂巢内饲喂，或者作为干燥混合
物在蜂巢外部的敞开饲喂器中饲喂。还可用的是糖或糖浆。向蜜蜂的补充饲喂添加10至
12％的花粉改善了可口性。添加25至百分比的花粉改善了必需营养素的质量和数量，为蜜
蜂生命活动所需要的。甘蔗或甜菜糖、异构化玉米糖浆、以及type-50糖浆为蜜蜂天然饮食中令人满意的蜂蜜替代品。后两个可仅作为液体提供给蜜蜂。液体饲料可在蜂巢内部提供
给蜜蜂，例如通过一些方法的任一个：摩擦顶桶(friction-top pail)、幼蜂巢箱内的脾、隔板饲喂器、博得曼(boardman)饲喂器，等等。干燥的糖可以通过放置一或两磅在倒置的内盖上来饲喂。必须让蜜蜂随时可获得提供的水。在一方面，可设想这样的盘或碟，其中存在木屑、软木或塑料海绵。关于蜜蜂补充饲料的详细描述可在例如Standifer等1977年撰写的标题为“Supplemental Feeding of Honey Bee Colonies(蜜蜂蜂群的补充饲喂)”的USDA出
版物(USDA，农业信息快报No.413)中找到。
[0080] 在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子如dsRNA是可吸收的。用在本文时，“可吸收的”指为并非通过吞食的核酸摄取提供的机制。在一方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以是经由生物体的皮肤或节肢动物的外骨骼可吸收的。在一方面，可吸
收的核酸分子溶解在赋形剂中。在其它方面，可吸收的核酸分子悬浮在赋形剂中。用于溶解或悬浮的赋形剂可以为水性或非水性的。在一些方面，该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子由宿主生物体吸收，并通过饲喂转移至寄生生物体。在其它方面，该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子由宿主生物体吸收，并通过吸收转移至寄生生物体。在一方面，本公开的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子由寄生物直接吸收。
收的核酸分子溶解在赋形剂中。在其它方面，可吸收的核酸分子悬浮在赋形剂中。用于溶解或悬浮的赋形剂可以为水性或非水性的。在一些方面，该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子由宿主生物体吸收，并通过饲喂转移至寄生生物体。在其它方面，该抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子由宿主生物体吸收，并通过吸收转移至寄生生物体。在一方面，本公开的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子由寄生物直接吸收。
[0081] 在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子如dsRNA是与赋形剂结合的。在一方面，该核酸可以作为核酸对赋形剂的一定比率提供。在一方面，该比率可以为一份核酸对4分赋形剂。在一方面，该核酸对赋形剂的比率可以为1:1、1:2、1:5、或1:10。在其它方面，该核酸对赋形剂的比率可以为1:20、1:25、1:30、1:40或更多。在一方面，核酸对赋形剂的比率可以为1:50。在本公开的一些方面，该比率可以确定为体积对体积比率(v/v)、重量：重量(w/w)比率。在某些方面，该比率可表示为重量：体积(w/v)比率。在某些方面，核酸与赋形剂可以为dsRNA与赋形剂。
[0082] 在本公开的一些方面，所述组合物可以包含与赋形剂结合的一定重量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子。在一方面，该核酸可以构成组合物总重量的一定百分比。在一方
面，该核酸可以构成组合物的约0.1％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的约0.2％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的约0.3％重量比。在另一方面，该核酸可以构成组合物的约0.4％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的多至0.5％重量比。在一方
面，该核酸可以构成组合物的多至0.6％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的多至
0.7％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的多至0.8％重量比。在另一方面，该核酸可以构成组合物的多至1.0％重量比。在其它方面，该核酸可以构成组合物的多至1.5％重
量比。在其它方面，该核酸可以构成组合物的多至2.0％重量比或2.5％重量比。在某些方
面，核酸与赋形剂可以为dsRNA与赋形剂。
面，该核酸可以构成组合物的约0.1％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的约0.2％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的约0.3％重量比。在另一方面，该核酸可以构成组合物的约0.4％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的多至0.5％重量比。在一方
面，该核酸可以构成组合物的多至0.6％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的多至
0.7％重量比。在一方面，该核酸可以构成组合物的多至0.8％重量比。在另一方面，该核酸可以构成组合物的多至1.0％重量比。在其它方面，该核酸可以构成组合物的多至1.5％重
量比。在其它方面，该核酸可以构成组合物的多至2.0％重量比或2.5％重量比。在某些方
面，核酸与赋形剂可以为dsRNA与赋形剂。
[0083] 本公开提供并包括具有0.1％至5％重量比的一种或多种抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子的组合物。在其它方面，组合物可以包含0.1至4％、0.1至3％、0.1至2％、0.1至1％、
0.1至2％、0.1至3％、或0.1至4％重量比的核酸。在一方面，组合物可以包含0.2％至5％重量比的核酸。在其它方面，组合物可以包含0.2至4％、0.2至3％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至
2％、0.2至3％、或0.2至4％重量比的核酸。在其它方面，组合物可以包含多至1％、多至2％、多至3％、多至4％、或多至5％的核酸。在其它方面，组合物可以包含多至7.5％、多至10％、或多至15％的核酸。在某些方面，核酸与赋形剂可以为dsRNA与赋形剂。
0.1至2％、0.1至3％、或0.1至4％重量比的核酸。在一方面，组合物可以包含0.2％至5％重量比的核酸。在其它方面，组合物可以包含0.2至4％、0.2至3％、0.2至2％、0.2至1％、0.2至
2％、0.2至3％、或0.2至4％重量比的核酸。在其它方面，组合物可以包含多至1％、多至2％、多至3％、多至4％、或多至5％的核酸。在其它方面，组合物可以包含多至7.5％、多至10％、或多至15％的核酸。在某些方面，核酸与赋形剂可以为dsRNA与赋形剂。
[0084] 本公开提供并包括具有0.1至10mg/ml的一种或多种抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子的组合物。在其它方面，组合物可以包含0.1至1.0mg/ml、0.1至2.0mg/ml、0.1至2.5mg/ml、0.1至5mg/ml、0.1至10mg/ml、0.1至15mg/ml、或0.1至20mg/ml的核酸。在某些方面，组合物包含至少0.1μg/ml的核酸。在某些其它方面，组合物包含至少1.0μg/ml的核酸。在另一些其它方面，组合物包含至少10μg/ml的核酸。在一方面，组合物可以包含0.5至10mg/ml的核酸。在其它方面，组合物可以包含0.5至1.0mg/ml、0.5至2.0mg/ml、0.5至2.5mg/ml、0.5至
5mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至15mg/ml、或0.5至20mg/ml的核酸。在一方面，组合物可以包含
1.0至10mg/ml的核酸。在其它方面，组合物可以包含1.0至2.0mg/ml、1.0至2.5mg/ml、1.0至
5mg/ml、1.0至10mg/ml、1.0至15mg/ml、或1.0至20mg/ml的核酸。在某些实施方案中，该组合物中的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子包括dsRNA。
5mg/ml、0.5至10mg/ml、0.5至15mg/ml、或0.5至20mg/ml的核酸。在一方面，组合物可以包含
1.0至10mg/ml的核酸。在其它方面，组合物可以包含1.0至2.0mg/ml、1.0至2.5mg/ml、1.0至
5mg/ml、1.0至10mg/ml、1.0至15mg/ml、或1.0至20mg/ml的核酸。在某些实施方案中，该组合物中的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子包括dsRNA。
[0085] 本公开提供并包括选择性杀虫剂组合物和使用选择性杀虫剂组合物的方法。
[0086] 用在本文时，“选择性杀虫剂组合物”为对一种或多种节肢动物物种更有效而对一种或多种不同的节肢动物物种较无效的组合物。选择性杀虫剂组合物包括杀灭成体或未成熟节肢动物的组合物，并包括作为杀幼虫剂和杀卵剂的组合物。选择性杀虫剂可以为通过
处理的食物掺入的系统杀虫剂，该食物包括从宿主生物体获得的血液或血淋巴。选择性杀
虫剂可以为接触性杀虫剂，它们对让直接接触的某些昆虫有毒，而对某些其它昆虫无毒或
低毒。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物为抗害虫的。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物为抗寄生物的。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物为杀螨剂。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物对靶寄生物或有害昆虫是有毒的，对非靶生物体是无毒或低
毒的。非靶生物体的例子包括，但不限于，有益昆虫、线虫类、鸟类、哺乳动物、以及植物。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物对寄生昆虫如瓦螨是有毒的，对宿主生物体如蜜蜂
是无毒或低毒的。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物对选自狄斯瓦螨、肩突硬蜱、红火蚁、二斑叶螨、埃及伊蚊、致倦库蚊、豌豆蚜、以及人虱的一种或多种害虫或寄生昆虫有毒。
处理的食物掺入的系统杀虫剂，该食物包括从宿主生物体获得的血液或血淋巴。选择性杀
虫剂可以为接触性杀虫剂，它们对让直接接触的某些昆虫有毒，而对某些其它昆虫无毒或
低毒。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物为抗害虫的。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物为抗寄生物的。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物为杀螨剂。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物对靶寄生物或有害昆虫是有毒的，对非靶生物体是无毒或低
毒的。非靶生物体的例子包括，但不限于，有益昆虫、线虫类、鸟类、哺乳动物、以及植物。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物对寄生昆虫如瓦螨是有毒的，对宿主生物体如蜜蜂
是无毒或低毒的。在一些实施方案中，选择性杀虫剂组合物对选自狄斯瓦螨、肩突硬蜱、红火蚁、二斑叶螨、埃及伊蚊、致倦库蚊、豌豆蚜、以及人虱的一种或多种害虫或寄生昆虫有毒。
[0087] 在本公开的某些方面，选择性杀虫剂可以通过遗传修饰掺入细菌或酵母(例如，经工程化以表达本公开的核酸的转基因细菌或酵母)中。通过遗传修饰引入细菌或酵母的选
择性杀虫剂可以直接作用于害虫生物体，或者通过害虫生物体的宿主吞食而间接地作用。
择性杀虫剂可以直接作用于害虫生物体，或者通过害虫生物体的宿主吞食而间接地作用。
[0088] 在本公开的一方面，相对于一种或多种第二昆虫，选择性杀虫剂可以是对一种或多种第一昆虫更有效的杀虫剂。在一方面，选择性杀虫剂可以对第一昆虫有毒，而对第二昆虫无作用。在一方面，选择性杀虫剂可以对第一昆虫有毒，而需要明显更高的浓度或量才能对第二昆虫有作用。在一方面，与第二昆虫相比，选择性杀虫剂可以是对第一昆虫有2倍或更高毒性。在一方面，与第二昆虫相比，选择性杀虫剂可以是对第一昆虫有4倍或更高毒性。
在一方面，与第二昆虫相比，选择性杀虫剂可以是对第一昆虫有5倍或更高毒性。在一方面，与第二昆虫相比，选择性杀虫剂可以是对第一昆虫有10倍或更高毒性。
在一方面，与第二昆虫相比，选择性杀虫剂可以是对第一昆虫有5倍或更高毒性。在一方面，与第二昆虫相比，选择性杀虫剂可以是对第一昆虫有10倍或更高毒性。
[0089] 在一方面，选择性杀虫剂可以抑制第一昆虫的生长、发育或产卵，而对第二昆虫无作用。在一方面，选择性杀虫剂可以抑制第一昆虫的生长、发育或产卵，而需要明显更高的浓度或量才能对第二昆虫有作用。在一方面，选择性杀虫剂可以需要2倍或更多的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或产卵。在一方面，选择性杀虫剂可以需要4倍或更多的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或产卵。在一方面，选择性杀虫剂可以需要5倍或更多的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或产卵。在一方面，选择性杀虫剂可以需要10倍或更多的活性成分来抑制第二昆虫的生长、发育或产卵。
[0090] 本公开还包括并提供了处理或防止蜜蜂群体中蜂群崩溃综合症的方法，包括向蜜蜂提供有效量的包含与狄斯瓦螨钙调蛋白基因序列的区域基本上相同或基本上互补的核
酸的组合物，由此降低狄斯瓦螨侵染的水平。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与
SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与SEQ ID NO:2的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上
互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与SEQ ID NO:69的至少19
个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效
量的包含与SEQ ID NO:70的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合
物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如SEQ ID NO:3的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如SEQ ID NO:4的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如SEQ ID NO:88的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如
SEQ ID NO:89的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含具有选自SEQ ID NO:3、4、88和89的序列的两种或多种核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核
酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的
至少23个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提
供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少30个连续核苷酸基本上相同或基
本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71
至87的序列的至少40个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，
该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少50个连续核苷酸基
本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自
SEQ ID NO:71至87的序列的至少60个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合
物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少70个
连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量
的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少80个连续核苷酸基本上相同或基本上互补
的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序
列的至少90个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包
括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少100个连续核苷酸基本上相同
或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID
NO:71至87的序列的至少110个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一
方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少120个连续核
苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含
与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少130个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸
的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至
少140个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。
在一方面，该方法包括提供有效量的包含如选自SEQ ID NO:71-87的序列的核酸的组合物。
酸的组合物，由此降低狄斯瓦螨侵染的水平。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与
SEQ ID NO:1的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与SEQ ID NO:2的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上
互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与SEQ ID NO:69的至少19
个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效
量的包含与SEQ ID NO:70的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合
物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如SEQ ID NO:3的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如SEQ ID NO:4的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如SEQ ID NO:88的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含如
SEQ ID NO:89的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含具有选自SEQ ID NO:3、4、88和89的序列的两种或多种核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少19个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核
酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的
至少23个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提
供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少30个连续核苷酸基本上相同或基
本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71
至87的序列的至少40个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，
该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少50个连续核苷酸基
本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自
SEQ ID NO:71至87的序列的至少60个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合
物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少70个
连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量
的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少80个连续核苷酸基本上相同或基本上互补
的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序
列的至少90个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包
括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少100个连续核苷酸基本上相同
或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID
NO:71至87的序列的至少110个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一
方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少120个连续核
苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含
与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至少130个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸
的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列的至
少140个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。在一方面，该方法包括提供有效量的包含与选自SEQ ID NO:71至87的序列基本上相同或基本上互补的核酸的组合物。
在一方面，该方法包括提供有效量的包含如选自SEQ ID NO:71-87的序列的核酸的组合物。
[0091] 本公开提供并包括降低宿主生物体的寄生物载量的方法。在一方面，该寄生物载量指每个单独宿主的寄生物数量。在一方面，该寄生物载量指每100宿主生物体的平均寄生物数量。在一方面，该寄生物载量指每个寄生物宿主群体的寄生物数量。在本公开的一些方面，该寄生物为狄斯瓦螨，该宿主为蜜蜂-西方蜜蜂。在某些方面，该寄生物载量指群体中每
100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物数量。在一些方面，本公开提供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于6个的方法和组合物。在一些方面，本公开提
供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于5个的方法
和组合物。在一些方面，本公开提供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于4个的方法和组合物。在一些方面，本公开提供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于2个的方法和组合物。
100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物数量。在一些方面，本公开提供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于6个的方法和组合物。在一些方面，本公开提
供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于5个的方法
和组合物。在一些方面，本公开提供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于4个的方法和组合物。在一些方面，本公开提供并包括用于将寄生物载量降低至群体中每100只蜜蜂的狄斯瓦螨寄生物少于2个的方法和组合物。
[0092] 在一方面，该降低寄生物载量的方法包括向宿主生物体提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子组合物。有效量的本公开的组合物导致寄生物载量在一段时间内降
低。在一方面，寄生物载量的降低可以在提供有效量的核酸组合物1天内测定。在一方面，该寄生物载量可以在2天后测定。在一方面，该寄生物载量可以在3天后测定。在其它方面，该寄生物载量可以在5天后或1周后测定。在另一方面，该寄生物载量可以测定不止一次，例如每3天、每5天、每周或每个月一次。在某些方面，根据本公开，可以测定寄生物数量的减少，并与未处理对照生物体或群体比较。在本公开的一些方面，该寄生物为狄斯瓦螨，该宿主为蜜蜂—西方蜜蜂。
低。在一方面，寄生物载量的降低可以在提供有效量的核酸组合物1天内测定。在一方面，该寄生物载量可以在2天后测定。在一方面，该寄生物载量可以在3天后测定。在其它方面，该寄生物载量可以在5天后或1周后测定。在另一方面，该寄生物载量可以测定不止一次，例如每3天、每5天、每周或每个月一次。在某些方面，根据本公开，可以测定寄生物数量的减少，并与未处理对照生物体或群体比较。在本公开的一些方面，该寄生物为狄斯瓦螨，该宿主为蜜蜂—西方蜜蜂。
[0093] 在本公开的一些方面，一段时间后寄生物载量的降低指寄生物数量的减少。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少10％、20％、30％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少40％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少50％或更
多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少60％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少70％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少80％或更多。
在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少90％或更多。
多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少60％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少70％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少80％或更多。
在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少90％或更多。
[0094] 在其它方面，该寄生物载量可以测定为每个宿主生物体的平均寄生物数量。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于20个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100
个宿主生物体少于5个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体
少于4个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生
物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生物。在一方面，减少的寄生物
载量可以包括每1000个宿主生物体少于20个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包
括每1000个宿主生物体少于15个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个
宿主生物体少于10个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体
少于5个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于4个寄生
物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于3个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于1个寄生物。
个宿主生物体少于5个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体
少于4个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生
物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生物。在一方面，减少的寄生物
载量可以包括每1000个宿主生物体少于20个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包
括每1000个宿主生物体少于15个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个
宿主生物体少于10个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体
少于5个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于4个寄生
物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于3个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，减少的寄生物载量可以包括每1000个宿主生物体少于1个寄生物。
[0095] 在本公开的一些方面，在提供有效量核酸的来源之前，宿主生物体的群体具有初始寄生物载量。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于20个寄生物。
在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于5个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生物。
在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于5个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，初始寄生物载量可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生物。
[0096] 在本公开的一些方面，有效量可以定期或持续提供。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每天提供一次、两次或三次。在其它方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每天提供一次。在另一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每隔一天提供一次或多次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每2天、每3天或每周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每2周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每3周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每月提供一次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每2月提供一次。在一方面，有效量的核酸组合物可以连续提供至有需要的生物体，例如通过提供连续的食物来源。在一个方面，有效量的核酸组合物可以作为蜜蜂可摄取的组合物连续提供。在本公开的一些方面，该寄生物为狄斯瓦螨，该宿主为蜜蜂意大利-蜜蜂。在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以是dsRNA。
[0097] 在本公开的一些方面，该寄生物载量可以在一段时间内减少。在一方面，寄生物载量减少所必需的时间段可以为15周。在另一方面，用于寄生物载量减少的时间段可以为12周。在一方面，该寄生物载量减少在10周时间出现。在一方面，寄生物载量减少所必需的时间段可以为5周。在另一方面，用于寄生物载量减少的时间段可以为2周。在一方面，该寄生物载量减少在1周时间出现。在一些方面，该寄生物载量可以在1天、2天或3天后减少。
[0098] 本公开提供了降低蜜蜂群体的寄生作用的方法，包括向蜜蜂群体提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子组合物。有效量的本公开的组合物导致寄生作用在一段时间
内降低。在一方面，寄生作用的降低可以在提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子组合物1天内测定。在一方面，该寄生作用的降低可以在2天后测定。在一方面，该寄生作用的降低可以在3天后测定。在其它方面，该寄生作用的降低可以在5天后或1周后测定。在另一方面，该寄生作用的降低可以测定不止一次，例如每3天、每5天、每周或每个月。在某些方面，根据本公开，可以测定寄生作用的降低，并与未处理对照生物体或群体比较。
内降低。在一方面，寄生作用的降低可以在提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子组合物1天内测定。在一方面，该寄生作用的降低可以在2天后测定。在一方面，该寄生作用的降低可以在3天后测定。在其它方面，该寄生作用的降低可以在5天后或1周后测定。在另一方面，该寄生作用的降低可以测定不止一次，例如每3天、每5天、每周或每个月。在某些方面，根据本公开，可以测定寄生作用的降低，并与未处理对照生物体或群体比较。
[0099] 在本公开的一些方面，一段时间后寄生作用的降低意味着寄生物总数量的减少。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少10％、20％、30％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少40％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少50％
或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少60％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少70％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少80％或
更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少90％或更多。
或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少60％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少70％或更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少80％或
更多。在一方面，寄生物的数量可以在测定之间减少90％或更多。
[0100] 在其它方面，寄生作用的降低可以测定为每个宿主生物体的平均寄生物数量。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于20个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于15个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于10个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主
生物体少于5个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，寄生作用的降低
可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生物。
生物体少于5个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于4个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于3个寄生物。在一方面，寄生作用的降低可以包括每100个宿主生物体少于2个寄生物。在一方面，寄生作用的降低
可以包括每100个宿主生物体少于1个寄生物。
[0101] 在本公开的一些方面，有效量的导致寄生作用降低的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸可以定期地或连续地提供。在一方面，有效量的核酸组合物可以每天提供一次、两次或三
次。在其它方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每天提供一次。在另一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每隔一天提供一次或多次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每2天、每3天或每周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以连续提供至有需要的生物体，例如通过提
供连续的食物来源。在一个方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以作为蜜蜂可摄取的组合物连续提供。在本公开的一些方面，该寄生物为狄斯瓦螨，该宿主为蜜蜂-西方蜜蜂。在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以是dsRNA。
次。在其它方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每天提供一次。在另一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每隔一天提供一次或多次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以每2天、每3天或每周提供一次。在一方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以连续提供至有需要的生物体，例如通过提
供连续的食物来源。在一个方面，有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物可以作为蜜蜂可摄取的组合物连续提供。在本公开的一些方面，该寄生物为狄斯瓦螨，该宿主为蜜蜂-西方蜜蜂。在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以是dsRNA。
[0102] 在本公开的一些方面，该寄生作用的降低可以在一段时间内减少。在一方面，寄生作用的降低所必需的时间段可以为15周。在另一方面，用于寄生作用降低的时间段可以为12周。在一方面，该寄生作用的降低在10周时间出现。在一方面，寄生作用的降低所必需的时间段可以为5周。在另一方面，用于寄生作用降低的时间段可以为2周。在一方面，该寄生作用的降低在1周时间出现。在一些方面，该寄生作用的降低可以在1天、2天或3天后出现。
[0103] 在本公开的一些方面，寄生作用的降低是通过与宿主生物体群体内寄生物数量的初始测定值进行比较时的存活寄生物数量来测定的。在一方面，该寄生物可以为狄斯瓦螨，宿主可以为蜜蜂—西方蜜蜂。在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的25％。
在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的15％。在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的10％。在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的
5％。在一方面，在向宿主群体提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物后，存活寄生物的数量可以少于5％或者甚至检测不到。
在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的15％。在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的10％。在一方面，存活寄生物的数量可以为初始寄生物数量的
5％。在一方面，在向宿主群体提供有效量的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸组合物后，存活寄生物的数量可以少于5％或者甚至检测不到。
[0104] 在一方面，本公开提供了用于降低蜜蜂对瓦螨侵染的易感性的方法和组合物。在其它方面，本公开提供了用于防止侵染蜜蜂群体的方法和组合物。在另一方面，本公开提供了用于降低蜜蜂被狄斯瓦螨寄生的方法和组合物。
[0105] 根据本公开，提供了抗寄生、抗害虫或杀虫核酸来源的宿主生物体可在宿主体内、通常是血淋巴内积累核酸。通过带有核酸，这种宿主生物体变得对寄生作用有抗性或者较不易感。在其它方面，提供了核酸来源的宿主生物体群体可在群体的众多数量的宿主体内
积累核酸，由此提供对寄生物的抗性或减弱的易感性。可采用本领域普通技术人员已知的
方法，检测在提供了核酸来源的宿主生物体内存在的核酸。在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以是dsRNA。
积累核酸，由此提供对寄生物的抗性或减弱的易感性。可采用本领域普通技术人员已知的
方法，检测在提供了核酸来源的宿主生物体内存在的核酸。在本公开的一些方面，抗寄生、抗害虫或杀虫核酸分子可以是dsRNA。
[0106] 在本公开的一方面，提供了通过下调钙调蛋白和钙调蛋白相关的瓦螨基因产物来处理瓦螨在蜜蜂中侵染的方法和组合物。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在一
些方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、
抗害虫或杀虫核酸。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄
斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一些方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序
列的dsRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的
dsRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一些方
面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。
在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，该组合物
包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一些方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在本公开的一些方面，所述组合物可以包含对应于SEQ ID NO:1或2的区域的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在本公开的其
它方面，该组合物可以包含对应于SEQ ID NO:69或70的区域的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。
在本公开的另一些其它方面，该组合物可以包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的序列的区域的核酸。
些方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、
抗害虫或杀虫核酸。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄
斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一些方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的小RNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序
列的dsRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的
dsRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在一些方
面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的dsRNA。
在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:1的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:2的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，该组合物
包含对应于SEQ ID NO:69的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一方面，该组合物包含对应于SEQ ID NO:70的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在一些方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:71至87的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在另一方面，该组合物包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的狄斯瓦螨钙调蛋白序列的siRNA。在本公开的一些方面，所述组合物可以包含对应于SEQ ID NO:1或2的区域的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。在本公开的其
它方面，该组合物可以包含对应于SEQ ID NO:69或70的区域的抗寄生、抗害虫或杀虫核酸。
在本公开的另一些其它方面，该组合物可以包含对应于选自SEQ ID NO:3、4、88和89的序列的区域的核酸。
[0107] 瓦螨寄生蛹和成体蜜蜂，并在蛹抚幼室内繁殖。该螨用它们的嘴刺破外骨骼并以蜜蜂的血淋巴为食。本发明人意外地发现，给药至蜜蜂以处理瓦螨侵染的多核苷酸试剂存
在于蜜蜂的血淋巴中，由此成为螨可获得的。
在于蜜蜂的血淋巴中，由此成为螨可获得的。
[0108] 本发明人显示，靶向钙调蛋白的dsRNA片段可成功地转移至瓦螨(参见，例如，图2)，dsRNA可在瓦螨中起下调钙调蛋白基因表达的作用(参见，例如，图3A)，以及还显示靶向钙调蛋白基因用于下调可导致瓦螨数量的降低(参见，例如，图3B)。
[0109] 因此，根据本公开的一个方面，提供了防止或处理狄斯瓦螨侵染蜜蜂的方法，该方法包括以有效量的核酸试剂对蜜蜂给药，该核酸试剂包含下调狄斯瓦螨钙调蛋白基因表达的核酸序列，由此防止或处理狄斯瓦螨侵染蜜蜂。
[0110] 根据本公开的这个方面，本公开的试剂用于防止狄斯瓦螨作为寄生物生活在蜜蜂或其幼虫上。短语“狄斯瓦螨”指侵袭东方蜜蜂和西方蜜蜂的外部寄生螨。该螨可以处于成年阶段，以蜜蜂为食，或者处于幼虫阶段，在蜜蜂抚幼室内部。
[0111] 如提到的，本公开的试剂能够选择性下调狄斯瓦螨的基因产物的表达。用在本文时，短语“基因产物”指RNA分子或蛋白。根据一个方面，该狄斯瓦螨基因产物为螨生存所必需的。这种基因产物的下调将典型地导致杀死瓦螨。根据另一个方面，该狄斯瓦螨基因产物为螨繁殖所必需的。这种基因产物的下调将典型地导致防止瓦螨繁殖以及最终清除螨群。
根据再另一个方面，该狄斯瓦螨基因产物为在蜜蜂中产生病原性症状所需的。在一些方面，该狄斯瓦螨基因产物为钙调蛋白基因。在某些方面，该钙调蛋白基因可以包含如SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在某些方面，该钙调蛋白基因可以包含如SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的核酸序列。
根据再另一个方面，该狄斯瓦螨基因产物为在蜜蜂中产生病原性症状所需的。在一些方面，该狄斯瓦螨基因产物为钙调蛋白基因。在某些方面，该钙调蛋白基因可以包含如SEQ ID
NO:1或SEQ ID NO:2的核酸序列。在某些方面，该钙调蛋白基因可以包含如SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:70的核酸序列。
[0112] 根据本公开的这个方面可以下调的基因产物的实例包括但不限于钙调蛋白基因。
[0113] 在本公开的一方面，能够下调狄斯瓦螨或其它寄生物基因产物的表达的试剂，可以将其它动物(例如蜜蜂或其它非靶生物体)内的基因产物下调至较小程度的表达。因此，
本公开的某些试剂能够区分螨基因和蜜蜂基因，将前者下调至比后者更大的程度。在一些
方面，本公开的某些试剂能够区分靶生物体内的靶基因和非靶生物体内的直系同源物，将
前者下调至比后者更大的程度。在其它方面，该寄生物的靶基因下调，而同源宿主基因并不下调。在又另一方面，该寄生物的靶基因在宿主内没有同源物。根据另一方面，本公开的试剂不下调任何蜜蜂基因。例如，可以通过靶向在螨中差异表达而不在蜜蜂中表达的基因来
实现，例如螨钙通道基因-FJ216963。或者，本公开的试剂可以靶向在螨和蜜蜂中都表达的基因的螨特异序列。
本公开的某些试剂能够区分螨基因和蜜蜂基因，将前者下调至比后者更大的程度。在一些
方面，本公开的某些试剂能够区分靶生物体内的靶基因和非靶生物体内的直系同源物，将
前者下调至比后者更大的程度。在其它方面，该寄生物的靶基因下调，而同源宿主基因并不下调。在又另一方面，该寄生物的靶基因在宿主内没有同源物。根据另一方面，本公开的试剂不下调任何蜜蜂基因。例如，可以通过靶向在螨中差异表达而不在蜜蜂中表达的基因来
实现，例如螨钙通道基因-FJ216963。或者，本公开的试剂可以靶向在螨和蜜蜂中都表达的基因的螨特异序列。
[0114] 根据一个方面，本公开的试剂靶向瓦螨基因的区段，这些区段至少100个碱基长，并且不带有任何长于19个碱基的与任何蜜蜂基因组序列或人基因组序列完全同源的序列。
尽管可以理解，为了最大化对瓦螨的细胞毒性效果，可以靶向不止一个基因，但是包含一种或少数几种小RNA的组合物将增加作为选择性杀虫剂组合物的可能性，因为可以减少与其
它昆虫的交叉反应性。
尽管可以理解，为了最大化对瓦螨的细胞毒性效果，可以靶向不止一个基因，但是包含一种或少数几种小RNA的组合物将增加作为选择性杀虫剂组合物的可能性，因为可以减少与其
它昆虫的交叉反应性。
[0115] 根据一个方面，可以制备对应于狄斯瓦螨钙调蛋白-1和钙调蛋白-2基因的dsRNA组合物(例如，采用具有如SEQ ID NO:1至4以及69至89中列出的序列、它们的互补物或针对其区域的核酸的核酸试剂)。
[0116] 应当理解，除了下调数个基因之外，本公开还提供并包括采用数种试剂来下调该相同基因(例如，数种核酸或dsRNA，每一种与相同基因的不同区段杂交)。例如，在一方面，一种或多种对应于选自SEQ ID NO:1至4、6、23、26至35、以及69至89的序列的核酸可以用于增强组合物的细胞毒性和抗寄生效果。能够鉴定物种特异序列的工具可用于这个目的，例
如BLASTN和其它的这类计算机程序。美国专利公开NO.20090118214和20120108497提供了
dsRNA防止和处理蜜蜂中病毒感染的用途。美国专利公开NO.20120258646提供了使用dsRNA
来控制蜜蜂中的狄斯瓦螨。在此将每一公开的全文并入本文。
如BLASTN和其它的这类计算机程序。美国专利公开NO.20090118214和20120108497提供了
dsRNA防止和处理蜜蜂中病毒感染的用途。美国专利公开NO.20120258646提供了使用dsRNA
来控制蜜蜂中的狄斯瓦螨。在此将每一公开的全文并入本文。
[0117] 本公开提供并包括下调靶生物体内基因表达的组合物和方法。在一方面，该靶生物体可以为寄生物。在某些方面，该寄生物为狄斯瓦螨。用在本文时，术语“下调表达”指直接或间接地引起所期望基因的转录的下降、基因转录产物(如RNA)的量、稳定性或可翻译性的下降、和/或由所期望基因编码的多肽翻译的下降。可通过多种方式来监测狄斯瓦螨的基因产物的下调表达，例如，直接检测基因转录物(例如，通过PCR)，检测基因或蜜蜂病原体RNA编码的多肽(例如，通过免疫印迹或免疫沉淀)，检测基因编码的多肽的生物学活性(例
如，催化活性、配体结合，等等)，或者监测狄斯瓦螨的变化(例如，降低的螨增殖、降低的毒力、降低的螨活动力等)以及测试蜜蜂感染性/致病性。
如，催化活性、配体结合，等等)，或者监测狄斯瓦螨的变化(例如，降低的螨增殖、降低的毒力、降低的螨活动力等)以及测试蜜蜂感染性/致病性。
[0118] 害虫或寄生物基因产物的下调可在基因组和/或转录水平上采用各种干扰转录和/或翻译的试剂(例如，RNA沉默试剂、核酶、脱氧核酶和反义核酸分子)实现。狄斯瓦螨基因产物的下调可在基因组和/或转录水平上采用各种干扰转录和/或翻译的试剂(例如，RNA
沉默试剂、核酶、脱氧核酶和反义核酸分子)实现。
沉默试剂、核酶、脱氧核酶和反义核酸分子)实现。
[0119] 在一个方面，该下调害虫或寄生物基因产物的表达的试剂为小RNA，例如RNA沉默试剂。在这方面，该小RNA长度大于15碱基对。在另一方面，该小RNA长度大于50碱基对。在一方面，该小RNA长度大于50碱基对，但小于约500碱基对。在一方面，该小RNA长度大于100碱基对，但小于约500碱基对。在一方面，该小RNA长度大于200碱基对，但小于约500碱基对。在一方面，该害虫或寄生物可以为狄斯瓦螨。
[0120] 下调害虫或寄生物基因产物的另一方法为通过引入小抑制性RNA(siRNA)。下调瓦螨基因产物的另一方法为通过引入小抑制性RNA(siRNA)。
[0121] 在本公开的一个方面，可按下文完成对适合于本公开使用的RNA沉默试剂的合成。首先，在AUG起始密码子下游扫描害虫或寄生物靶mRNA以发现AA二核苷酸序列。AA每次出现以及3’临近的19个核苷酸记录为可能的siRNA靶位点。优选地，siRNA靶位点选自开放阅读框，由于非翻译区(UTR)富含调节蛋白结合位点。UTR结合蛋白和/或翻译起始复合物可以干扰siRNA内切核酸酶复合物的结合(Tuschl ChemBiochem.2:239-245)。尽管如此，还应当理解，针对非翻译区的siRNA也可以是有效的，如在GAPDH所证实的，其中针对5’UTR的siRNA介导了细胞GAPDH mRNA的约90％减少并完全地消除了蛋白水平(可在因特网
www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html找到)。
www.ambion.com/techlib/tn/91/912.html找到)。
[0122] 其次，采用任何序列比对软件，例如可从NCBI服务器获得的BLAST软件(可在因特网www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/找到)，将可能的靶位点与适当的基因组数据库(例如，
人、蜜蜂、帝王蝶、小鼠、大鼠等)比较。过滤掉显示了与其它编码序列有明显同源性的假定靶位点。
人、蜜蜂、帝王蝶、小鼠、大鼠等)比较。过滤掉显示了与其它编码序列有明显同源性的假定靶位点。
[0123] 将合格的靶序列选作siRNA合成的模板。优选的序列为包括低G/C含量的序列，由于这些被证实，与具有高于55％G/C含量的那些相比，在介导基因沉默方面更有效。在用于评价的靶基因或序列的全长中，优选几个靶位点。为了更好地评价所选siRNA，优选结合使用阴性对照。阴性对照siRNA优选包括与该siRNA相同的核苷酸组成，但缺乏与基因组的明
显同源性。因此，优选使用siRNA的乱序核苷酸序列，只要其不显示与任何其它基因或害虫或寄生物靶序列的任何明显同源性。乱序核苷酸序列的实例提供在SEQ ID NO.5。
显同源性。因此，优选使用siRNA的乱序核苷酸序列，只要其不显示与任何其它基因或害虫或寄生物靶序列的任何明显同源性。乱序核苷酸序列的实例提供在SEQ ID NO.5。
[0124] 例如，可用在本公开这方面使用的siRNA为靶向螨特异的钙调蛋白基因的siRNA。siRNA的实例提供在SEQ ID NO:3、4、88和89中。
[0125] 应当理解，本公开的RNA沉默试剂并不限于仅含有RNA的那些分子，而是还涵盖化学修饰的核苷酸和非核苷酸。
[0126] 在一些方面，本文提供的RNA沉默试剂可在功能上与细胞穿透肽结合。用在本文时，“细胞穿透肽”为包含短(约12个残基)氨基酸序列或功能基序的肽，其赋予与运输可透膜复合物穿过细胞的质膜和/或核膜相关的非能量依赖(即，非内吞的)转移特性。用在本公开的可透膜复合物中的细胞穿透肽优选包含至少一个非功能性半胱氨酸残基，其或者是游
离的，或者经衍生与双链核糖核酸形成二硫键，该核糖核酸因这种键合而经修饰。赋予这些特性的代表性氨基酸基序列在美国专利No.6,348,185中，通过引用将其内容明确并入本
文。本公开的细胞穿透肽优选包括，但不限于，穿膜肽(penetratin)、转运素
(transportan)、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS、以及MAP。
离的，或者经衍生与双链核糖核酸形成二硫键，该核糖核酸因这种键合而经修饰。赋予这些特性的代表性氨基酸基序列在美国专利No.6,348,185中，通过引用将其内容明确并入本
文。本公开的细胞穿透肽优选包括，但不限于，穿膜肽(penetratin)、转运素
(transportan)、plsl、TAT(48-60)、pVEC、MTS、以及MAP。
[0127] 另一种能够下调害虫或寄生物基因产物的试剂为能够特异切割蜜蜂病原体多肽的mRNA转录物或DNA序列的脱氧核酶分子。脱氧核酶为单链多核苷酸，其能够切割单链和双链靶序列(Breaker,R.R.and Joyce,G.Chemistry and Biology 1995；2:655；Santoro,
S.W.&Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA1997；943:4262)。已提出脱氧核酶的通用模型
(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，两侧带有两底物识别结构域，每一个为7至9个脱氧核糖核苷酸。这种类型的脱氧核酶可在嘌呤：嘧啶连接处有效切割其底物RNA(Santoro,S.W.&Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA 199；关于脱
氧核酶的综述，参见Khachigian,LM,Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002))。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。害虫或寄生物基因产物的下调也可通过采用
能够与编码害虫或寄生物基因产物的mRNA转录物特异杂交的反义多核苷酸来实现。必须在
考虑对反义手段重要的两方面情况下，实现对可用于有效下调害虫或寄生物基因产物的反
义分子的设计。第一方面是寡核苷酸向适当细胞的细胞质内的递送，而另一方面是寡核苷
酸的设计，该核苷酸与以抑制翻译的方式与细胞内的指定mRNA或RNA靶序列特异结合。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。在另一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为钙调蛋白基因产物。
S.W.&Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA1997；943:4262)。已提出脱氧核酶的通用模型
(“10-23”模型)。“10-23”脱氧核酶具有15个脱氧核糖核苷酸的催化结构域，两侧带有两底物识别结构域，每一个为7至9个脱氧核糖核苷酸。这种类型的脱氧核酶可在嘌呤：嘧啶连接处有效切割其底物RNA(Santoro,S.W.&Joyce,G.F.Proc.Natl,Acad.Sci.USA 199；关于脱
氧核酶的综述，参见Khachigian,LM,Curr Opin Mol Ther 4:119-21(2002))。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。害虫或寄生物基因产物的下调也可通过采用
能够与编码害虫或寄生物基因产物的mRNA转录物特异杂交的反义多核苷酸来实现。必须在
考虑对反义手段重要的两方面情况下，实现对可用于有效下调害虫或寄生物基因产物的反
义分子的设计。第一方面是寡核苷酸向适当细胞的细胞质内的递送，而另一方面是寡核苷
酸的设计，该核苷酸与以抑制翻译的方式与细胞内的指定mRNA或RNA靶序列特异结合。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。在另一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为钙调蛋白基因产物。
[0128] 数种递送策略可用于将寡核苷酸有效递送进各种各样细胞类型(参见，例如，Luft J Mol Med 76:75-6(1998)；Kronenwett等.Blood 91:852-62(1998)；Rajur等Bioconjug Chem 8:935-40(1997)；Lavigne等Biochem Biophys Res Commun 237:566-71(1997)以及
Aoki等(1997)Biochem Biophys Res Commun 231:540-5(1997))。
Aoki等(1997)Biochem Biophys Res Commun 231:540-5(1997))。
[0129] 另外，也可获得用于基于热力学循环鉴定那些与它们的靶mRNA有最高的预测结合亲和力的序列的算法(参见，例如，Walton等Biotechnol Bioeng 65:1-9(1999))，该热力学循环解释了靶mRNA和该寡核苷酸内结构变化的能量学。这些算法已成功地用于在细胞内实
施反义手段。例如，由Walton等开发的算法使得科学家能够成功地设计针对兔β-球蛋白
(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNFα)转录物的反义寡核苷酸。该相同的研究小组新近报道，通过动态PCR技术评价，理性选择的针对细胞培养物中三种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B
以及大鼠gp1)的寡核苷酸的反义活性在基本上所有情况下都证实是有效的，包括以磷酸二
酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化学进行的针对两个细胞类型中的三种不同靶的试验。另外，还
出版了用于采用体外系统设计和预测特异寡核苷酸的有效性的几种手段(Matveeva等，
Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998)]。
施反义手段。例如，由Walton等开发的算法使得科学家能够成功地设计针对兔β-球蛋白
(RBG)和小鼠肿瘤坏死因子-α(TNFα)转录物的反义寡核苷酸。该相同的研究小组新近报道，通过动态PCR技术评价，理性选择的针对细胞培养物中三种模型靶mRNA(人乳酸脱氢酶A和B
以及大鼠gp1)的寡核苷酸的反义活性在基本上所有情况下都证实是有效的，包括以磷酸二
酯和硫代磷酸酯寡核苷酸化学进行的针对两个细胞类型中的三种不同靶的试验。另外，还
出版了用于采用体外系统设计和预测特异寡核苷酸的有效性的几种手段(Matveeva等，
Nature Biotechnology 16:1374-1375(1998)]。
[0130] 另一种能够下调害虫或寄生物基因产物的试剂为能够特异切割编码瓦螨基因产物的mRNA转录物的核酶分子。核酶越来越多地用于通过切割编码目的蛋白的mRNA来序列特
异性抑制基因表达(Welch等，Curr Opin Biotechnol.9:486-96(1998))。设计核酶来切割
任何特异的靶RNA(包括病毒RNA)的可能性使得它们在基础研究和治疗应用方面都是有价
值的工具。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。在另一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为钙调蛋白基因产物。
异性抑制基因表达(Welch等，Curr Opin Biotechnol.9:486-96(1998))。设计核酶来切割
任何特异的靶RNA(包括病毒RNA)的可能性使得它们在基础研究和治疗应用方面都是有价
值的工具。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。在另一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为钙调蛋白基因产物。
[0131] 另外的下调细胞内害虫或寄生物基因产物表达的方法是通过三链形成寡核苷酸(TFO)。最近的研究显示，可设计TFO，它们可以以序列特异方式识别并结合至双链螺旋DNA中的聚嘌呤/聚嘧啶区域。这些识别规则由Maher III,L.J.等,Science(1989)245:725-7；
Moser,H.E.等，Science,(1987)238:645-6；Beal,P.A.等Science(1992)251:1360-1363；
Cooney,M.等，Science(1988)241:456-459；以及Hogan,M.E.等欧洲专利公开375408概述。
寡核苷酸的修饰如引入嵌入剂和骨架置换，以及结合条件的优化(pH和阳离子浓度)，有助
于克服TFO活性的固有障碍，如电荷排斥和不稳定，并且最近显示，合成的寡核苷酸可靶向特异序列(关于最近的综述，参见Seidman和Glazer,J Clin Invest 2003；112:487-94)。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。在另一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为钙调蛋白基因产物。
Moser,H.E.等，Science,(1987)238:645-6；Beal,P.A.等Science(1992)251:1360-1363；
Cooney,M.等，Science(1988)241:456-459；以及Hogan,M.E.等欧洲专利公开375408概述。
寡核苷酸的修饰如引入嵌入剂和骨架置换，以及结合条件的优化(pH和阳离子浓度)，有助
于克服TFO活性的固有障碍，如电荷排斥和不稳定，并且最近显示，合成的寡核苷酸可靶向特异序列(关于最近的综述，参见Seidman和Glazer,J Clin Invest 2003；112:487-94)。在一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为瓦螨基因产物。在另一方面，该害虫或寄生物基因产物可以为钙调蛋白基因产物。
[0132] 通常，三链形成寡核苷酸具有序列对应：
[0133]
[0134] 但是，已显示，A-AT和G-GC三联体具有最高的三螺旋稳定性(Reither和Jeltsch,BMC Biochem,2002,Sept12,Epub)。该相同作者已经证实，根据A-AT和G-GC规则设计的TFO
不形成非特异三链，提示三链形成实际上是序列特异的。
不形成非特异三链，提示三链形成实际上是序列特异的。
[0135] 三链形成寡核苷酸优选长度至少15个、更优选25个、仍更优选或更多核苷酸，多至50或100bp。
[0136] 以TFO转染细胞(例如，通过阳离子脂质体)并与靶DNA形成三螺旋结构诱导了空间和功能变化，阻断了转录起始和延长、使得能在内源DNA中引入期望的序列变化并导致基因表达的特异下调。
[0137] 关于有效的TFO的设计、合成和给药，可在Froehler等的美国专利公开No.2003/017068和2003/0096980、Emanuele等的美国专利公开No.2002/0128218和2002/0123476以
及Lawn的美国专利No.5,721,138中找到。
及Lawn的美国专利No.5,721,138中找到。
[0138] 本公开的多核苷酸下调试剂可以根据本领域已知的任何多核苷酸合成方法生成，例如酶合成或固相合成。进行固相合成的设备和试剂是例如从Applied Biosystems可购得
的。也可以采用任何其它的用于这种合成的手段；多核苷酸的实际合成完全在本领域技术
人员的能力范围内，并且可通过建立的方法学完成，例如在“Molecular Cloning:A
laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)”Sambrook等,(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology(当代分子生物学规程)”卷I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；
Ausubel等,“Current Protocols in Molecular Biology(当代分子生物学规程)”,John
Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal“, A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实用指南)”,John Wiley&Sons,New York(1988)以及“Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)”Gait,M.J.,ed.(1984)中有详细描述，利用固相合成化学，例如氰乙基亚磷酰胺，接着去保护、脱盐、并通过例如自动的三苯甲基保护法(trityl-on
method)或HPLC纯化。
的。也可以采用任何其它的用于这种合成的手段；多核苷酸的实际合成完全在本领域技术
人员的能力范围内，并且可通过建立的方法学完成，例如在“Molecular Cloning:A
laboratory Manual(分子克隆：实验室手册)”Sambrook等,(1989)；“Current Protocols in Molecular Biology(当代分子生物学规程)”卷I-III Ausubel,R.M.,ed.(1994)；
Ausubel等,“Current Protocols in Molecular Biology(当代分子生物学规程)”,John
Wiley和Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal“, A Practical Guide to Molecular Cloning(分子克隆实用指南)”,John Wiley&Sons,New York(1988)以及“Oligonucleotide Synthesis(寡核苷酸合成)”Gait,M.J.,ed.(1984)中有详细描述，利用固相合成化学，例如氰乙基亚磷酰胺，接着去保护、脱盐、并通过例如自动的三苯甲基保护法(trityl-on
method)或HPLC纯化。
[0139] 本公开的多核苷酸试剂可以包含由以3’至5’5磷酸二酯键结合的嘌呤类和嘧啶类碱基组成的杂环核苷酸。优选使用的多核苷酸为在它们的骨架、核苷间键或碱基中经修饰
的那些，如在下文中广泛描述的。
的那些，如在下文中广泛描述的。
[0140] 根据本公开的这方面可用的多核苷酸的具体实例包括含有修饰骨架或非天然核苷间键的多核苷酸试剂。具有经修饰骨架的多核苷酸试剂包括在骨架中保留了磷原子的那
些，例如在美国专利4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、
5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,
233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,
571,799、5,587,361、以及5,625,050中公开的。
些，例如在美国专利4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、
5,276,019、5,278,302、5,286,717、5,321,131、5,399,676、5,405,939、5,453,496、5,455,
233、5,466,677、5,476,925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,
571,799、5,587,361、以及5,625,050中公开的。
[0141] 经修饰的多核苷酸骨架包括例如具有正常3’-5’键的硫代磷酸酯类、手性硫代磷酸酯类、二硫代磷酸酯类、磷酸三酯类、氨基烷基磷酸三酯类、甲基和其它烷基膦酸酯类包括3’-亚烷基膦酸酯类和手性膦酸酯类、次膦酸酯类、亚磷酰胺类包括3’-氨基亚磷酰胺类和氨基烷基亚磷酰胺类、硫羰基亚磷酰胺类、硫羰基烷基膦酸酯类、硫羰基烷基磷酸三酯类以及硼磷酸酯类，这些的2’-5’连接的类似物，或者具有反转极性的那些，其中相邻核苷单元对是3’-5’至5’-3’或2’-5’至5’-2’。也可使用各种盐、混合盐或自由酸形式。
[0142] 备选地，经修饰而在其中不包括磷原子的多核苷酸骨架具有通过短的链烷基或环烷基核苷间键、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间键、或一个或多个短链杂原子或杂环
核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉基键(部分地由核苷的糖部分形成)骨架；硅氧烷
骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲缩醒和硫代甲缩醒骨架；亚甲基甲缩醒和硫代甲缩醒骨架；
含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架以及其它具有混合的N、0、S和CH2构成部分的骨架的那些，例如在美国专利No.5,034,
506、5,166,315、5,185,444、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,
470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,602,240、5,608,
046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,214,134、5,466,677、5,610,289、5,
633,360、5,677,437、以及5,677,439中描述的。
核苷间键形成的骨架。这些包括具有吗啉基键(部分地由核苷的糖部分形成)骨架；硅氧烷
骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲缩醒和硫代甲缩醒骨架；亚甲基甲缩醒和硫代甲缩醒骨架；
含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚胺和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架以及其它具有混合的N、0、S和CH2构成部分的骨架的那些，例如在美国专利No.5,034,
506、5,166,315、5,185,444、5,216,141、5,235,033、5,264,562、5,264,564、5,405,938、5,
470,967、5,489,677、5,541,307、5,561,225、5,596,086、5,602,240、5,602,240、5,608,
046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,214,134、5,466,677、5,610,289、5,
633,360、5,677,437、以及5,677,439中描述的。
[0143] 可根据本公开使用的其它多核苷酸试剂为核苷酸单元的糖和核苷间键即骨架都经修饰的、被新的基团所取代的那些。保持碱基单元，用于与适当的多核苷酸靶标互补。这种多核苷酸模拟物的实例包括肽核酸(PNA)。PNA多核苷酸指其中糖骨架被含酰胺的骨架
(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)所替换的多核苷酸。保留碱基，并直接或间接地与酰胺部分
的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082、
5,714,331、以及5,719,262，通过引用将每一个都并入本文。可用在本公开中的其它骨架修饰在美国专利No:6,303,374中有公开。
(特别是氨基乙基甘氨酸骨架)所替换的多核苷酸。保留碱基，并直接或间接地与酰胺部分
的氮杂氮原子结合。教导制备PNA化合物的美国专利包括但不限于美国专利No.5,539,082、
5,714,331、以及5,719,262，通过引用将每一个都并入本文。可用在本公开中的其它骨架修饰在美国专利No:6,303,374中有公开。
[0144] 本公开的多核苷酸试剂也可以包括碱基修饰或取代。用在本文时，“未修饰的”或“天然的”碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的碱基包括但不限于其它的合成或天然碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其它烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其它烷基衍生物，2-硫尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-氮杂尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其它的8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴代、5-三氟甲基和其它5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-脱氮杂鸟嘌呤和7-脱氮杂腺嘌呤以及3-脱氮杂鸟嘌呤和3-脱氮杂腺嘌呤。其它的碱基包括
在美国专利No:3,687,808中公开的那些，在The Concise Encyclopedia Of Polymer
Science And Engineering(聚合物科学和工程简明百科全书),第858-859页,Kroschwitz,
J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些，Englisch等，Angewandte Chemie,
International Edition,1991,613中公开的那些，以及Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,
Antisense Research and Applications(反义研究和应用),第289-2页,Crooke,S.T.和
Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993中公开的那些。这些碱基对于增加本公开的寡聚化合物的
结合亲和力是尤其有用的。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi YS等(1993)Antisense Research and
Applications,CRC Press,Boca Raton 276-278)，为当前优选的碱基取代，甚至更尤其是
当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰结合时。
在美国专利No:3,687,808中公开的那些，在The Concise Encyclopedia Of Polymer
Science And Engineering(聚合物科学和工程简明百科全书),第858-859页,Kroschwitz,
J.I.,ed.John Wiley&Sons,1990中公开的那些，Englisch等，Angewandte Chemie,
International Edition,1991,613中公开的那些，以及Sanghvi,Y.S.,Chapter 15,
Antisense Research and Applications(反义研究和应用),第289-2页,Crooke,S.T.和
Lebleu,B.,ed.,CRC Press,1993中公开的那些。这些碱基对于增加本公开的寡聚化合物的
结合亲和力是尤其有用的。这些包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。5-甲基胞嘧啶取代已显示出增加核酸双链体稳定性0.6-1.2℃(Sanghvi YS等(1993)Antisense Research and
Applications,CRC Press,Boca Raton 276-278)，为当前优选的碱基取代，甚至更尤其是
当与2’-O-甲氧基乙基糖修饰结合时。
[0145] 在合成后，本公开的多核苷酸试剂可以任选地被纯化。例如，可通过以溶剂或树脂提取、沉淀、电泳、层析或其组合来从混合物纯化多核苷酸。或者，多核苷酸可以不经纯化或经最低限度纯化就使用，以避免样品处理带来的损失。该多核苷酸可以经干燥用于保存或者溶解在水性溶液中。该溶液可以含有缓冲剂或盐以促进退火和/或双链的稳定。
[0146] 应当理解，本公开的多核苷酸试剂可以以其本身提供，或者作为包含编码该多核苷酸试剂的核酸序列的核酸构建体提供。通常，该核酸构建体包含在宿主细胞中有功能的
启动子序列，如下文描述的。
启动子序列，如下文描述的。
[0147] 置于可操作连接的启动子序列控制下的本公开的多核苷酸序列，还可以在两侧带有其它的有利地影响其转录和/或生成的转录物稳定性的序列。这些序列一般位于启动子
上游和/或表达构建体3'端的下游。
上游和/或表达构建体3'端的下游。
[0148] 当提及调节序列和结构核苷酸序列使用时，术语“可操作连接的”指，该调控序列引起所连接的结构核苷酸序列的调控表达。“调控序列”或“控制元件”指位于结构核苷酸序列上游、内部或下游的核苷酸序列，它们影响转录的时序和转录水平或量、RNA加工或稳定性、或相关的结构核苷酸序列的翻译。调控序列可以包括启动子、翻译前导序列、内含子、增强子、茎环结构、阻遏子结合序列、终止序列、中止序列、多腺苷酸识别序列，等等。
[0149] 应当理解，核酸试剂可用多种不同方式递送至害虫或寄生物。根据一个方面，该核酸试剂直接递送至害虫或寄生物(例如，通过向螨侵染的蜂巢喷雾)。该核酸试剂或编码该核酸试剂的构建体可以通过扩散进入螨身体。在这方面，该核酸构建体的启动子通常在螨
细胞内是可起作用的。在一方面，该害虫或寄生物可以为狄斯瓦螨。
细胞内是可起作用的。在一方面，该害虫或寄生物可以为狄斯瓦螨。
[0150] 应当理解，因为很多寄生物利用它们的嘴刺破宿主节肢动物外骨骼并以节肢动物的血淋巴为食，本公开考虑将本公开的多核苷酸试剂递送至该节肢动物，结果它们变成存
在于节肢动物血淋巴中，由此成为害虫或寄生物可获得的。因此，根据另一方面，该核酸试剂间接递送至害虫或寄生物(例如，通过宿主蜜蜂到螨)。在这方面，该核酸构建体的启动子通常在宿主细胞内是可起作用的。在某些方面，该害虫或寄生物可以为狄斯瓦螨，宿主节肢动物可以为蜜蜂。
在于节肢动物血淋巴中，由此成为害虫或寄生物可获得的。因此，根据另一方面，该核酸试剂间接递送至害虫或寄生物(例如，通过宿主蜜蜂到螨)。在这方面，该核酸构建体的启动子通常在宿主细胞内是可起作用的。在某些方面，该害虫或寄生物可以为狄斯瓦螨，宿主节肢动物可以为蜜蜂。
[0152] 根据另一方面，该核酸试剂通过宿主食物递送至宿主。本发明人考虑到，在吞食本公开的核酸试剂后，该试剂可以存在于例如宿主节肢动物血淋巴中，结果成为寄生物如瓦螨可获得的。
[0153] 因此本公开的多核苷酸可以在体外或体内(例如在细菌或酵母细胞中)合成，并添加至食物中。例如，可以通过在基因区段的末端添加两个相对的启动子(例如T7启动子)来
合成双链RNA，其中启动子置于紧接基因5'端，且启动子置于相对方向紧接基因区段3’端。
然后，通过在体外用T7RNA聚合酶转录可制备dsRNA。
合成双链RNA，其中启动子置于紧接基因5'端，且启动子置于相对方向紧接基因区段3’端。
然后，通过在体外用T7RNA聚合酶转录可制备dsRNA。
[0154] 根据本公开的一些方面，用于合成包括dsRNA在内的核酸的序列的实例提供在SEQ ID NO:1至4、6、23、26至35、以及69至89中。
[0155] 应当理解，一些害虫或寄生物在宿主节肢动物的外骨骼中造成损伤位点。这种损伤位点接纳细菌感染。例如，宿主蜜蜂损伤位点可以接纳细菌，例如巢室蜜蜂球菌，其引起欧洲幼虫腐臭病。除了它们的寄生效应，寄生物还已知起数种其它病原体和寄生物的媒介
物的作用。例如，怀疑瓦螨起数种蜜蜂病原体的媒介物的作用，并可以削弱它们宿主的免疫系统，让它们易受感染，所述病原体包括畸翅病毒(DWV)、喀什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)。
物的作用。例如，怀疑瓦螨起数种蜜蜂病原体的媒介物的作用，并可以削弱它们宿主的免疫系统，让它们易受感染，所述病原体包括畸翅病毒(DWV)、喀什米尔蜜蜂病毒(KBV)、急性蜜蜂麻痹病毒(ABPV)和黑蜂王台病毒(BQCV)。
[0156] 因此，通过杀死害虫或寄生物(或防止它们繁殖)，本公开的抗寄生、抗害虫或杀虫试剂可以用于防止和/或处理宿主生物体的细菌感染。例如，上面指出的病毒在宿主蜜蜂中引起的巢室蜜蜂球菌和病毒感染。因为瓦螨侵染和病毒感染被认为是蜂群崩溃综合症(CCD)原因，所以本试剂也可以用于防止或降低蜜蜂群体对CCD的易感性。
[0157] 应当理解，除了饲喂抗寄生、抗害虫或杀虫核酸试剂用于降低蜜蜂病原体感染和侵染外，适当卫生设施的加强(例如，制止受侵染蜂巢的重新使用)可增强处理和防止感染
的效果。
的效果。
[0158] 本公开还包括并提供表达选择性杀虫剂的转基因细菌和酵母细胞。在一个方面，编码本文使用的小RNA、dsRNA、miRNA或抗小或miRNA靶核酸分子的核酸可操作地连接至启
动子以及可选地终止子。在一些实施方案中，通过使用热或者压力将转基因细菌和酵母细
胞杀死。在一些实施方案中，在向靶生物体提供选择性杀虫剂之前，将转基因细菌和酵母细胞裂解。在一些实施方案中，转基因细菌和酵母细胞不裂解。
动子以及可选地终止子。在一些实施方案中，通过使用热或者压力将转基因细菌和酵母细
胞杀死。在一些实施方案中，在向靶生物体提供选择性杀虫剂之前，将转基因细菌和酵母细胞裂解。在一些实施方案中，转基因细菌和酵母细胞不裂解。
[0159] 在一个方面，用在本文中的外源核酸分子为或编码小RNA，或在具体方面为或编码siRNA，其可调节靶生物体内的基因表达。在一方面，外源核酸编码小RNA，该小RNA与选自SEQ ID NO:1至4和6至89的序列有至少80％、85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、
98％、或99％序列同一性。在一另外方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码dsRNA分子。
在另一方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码人工miRNA分子。在一另外方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码siRNA。在一个方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码小RNA的前体。在另一方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码miRNA或siRNA的前体。在一个方面，本文中使用的外源核酸分子为天然出现的分子。在另一方面，本文中使用的外源核酸分子为合成的分子。
98％、或99％序列同一性。在一另外方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码dsRNA分子。
在另一方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码人工miRNA分子。在一另外方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码siRNA。在一个方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码小RNA的前体。在另一方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码miRNA或siRNA的前体。在一个方面，本文中使用的外源核酸分子为天然出现的分子。在另一方面，本文中使用的外源核酸分子为合成的分子。
[0160] 在一个方面，本文中使用的外源核酸分子为或编码小RNA的茎环前体、或在具体方面为或编码miRNA的茎环前体，包含与选自SEQ ID NO:1至4和6至89的序列有至少80％、
85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。本文中使用的茎环前体包含与选自SEQ ID NO:1至4和6至89的序列有至少60％、65％、70％、75％、80％、
85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。
85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。本文中使用的茎环前体包含与选自SEQ ID NO:1至4和6至89的序列有至少60％、65％、70％、75％、80％、
85％、88％、90％、92％、95％、96％、97％、98％、或99％序列同一性的序列。
[0161] 在一个方面，本文中使用的外源核酸分子为裸RNA或是从核酸表达构建体表达的，其中它可操作地连接至调控序列。
[0162] 在一个方面，本文公开的重组DNA构建体或转基因还包含转录终止子。
[0163] 可以预期，在从本申请成熟为专利期间，可开发出很多用于下调基因产物表达的相关方法，术语“下调狄斯瓦螨基因产物的表达”旨在预先包括所有的这类新技术。
[0164] 应当理解，本公开的某些特征出于清楚的原因描述在分开方面的上下文中，但它们也可以以组合方式在单一方面中提供。相反地，出于简洁的原因在单一方面上下文中描
述的本公开的各个特征也可以分开地、在任何适合的次组合中、或者适合于在本公开其它
描述的方面中提供。在各个方面上下文中描述的某些特征并非认为是这些方面的必需特
征，除非没有这些元素时该方面不可行。如上文阐述的以及所附权利要求书部分所要求的
各个方面和本公开的方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
述的本公开的各个特征也可以分开地、在任何适合的次组合中、或者适合于在本公开其它
描述的方面中提供。在各个方面上下文中描述的某些特征并非认为是这些方面的必需特
征，除非没有这些元素时该方面不可行。如上文阐述的以及所附权利要求书部分所要求的
各个方面和本公开的方面在以下实施例中得到实验支持。
实施例
[0165] 实施例1.瓦螨钙调蛋白基因序列
[0166] 将表1中提供的钙调蛋白(CAM)基因(SEQ ID NO:1和2)或它们对应的转录物用作多核苷酸组合物的靶标，该多核苷酸组合物包含与这些基因或转录物相同或互补的至少18
个连续核苷酸多核苷酸。将表1中提供的基因序列、由这些基因编码的蛋白序列、或那些基因内含有的序列可用于从其它节肢动物害虫和寄生物物种获得未列在表1中的直系同源钙
调蛋白(CAM)基因。然后此类直系同源基因和它们的转录物可用作本文提供的多核苷酸的
靶标，或者作为特异设计来靶向直系同源基因或转录物的抗寄生、抗害虫或杀虫多核苷酸
的来源。
个连续核苷酸多核苷酸。将表1中提供的基因序列、由这些基因编码的蛋白序列、或那些基因内含有的序列可用于从其它节肢动物害虫和寄生物物种获得未列在表1中的直系同源钙
调蛋白(CAM)基因。然后此类直系同源基因和它们的转录物可用作本文提供的多核苷酸的
靶标，或者作为特异设计来靶向直系同源基因或转录物的抗寄生、抗害虫或杀虫多核苷酸
的来源。
[0167] 表1.狄斯瓦螨的靶钙调蛋白(CAM)基因
[0168]
[0169] 对于提供在SEQ ID NO:1和2中的每种钙调蛋白DNA基因序列，有义或反义取向或双向单链或双链DNA或RNA片段在体外饲喂至生长在皮氏培养皿上的瓦螨，或者局部涂覆至
蜂巢以影响CAM基因的表达并获得狄斯瓦螨螨群的减少。
蜂巢以影响CAM基因的表达并获得狄斯瓦螨螨群的减少。
[0170] 实施例2.抑制狄斯瓦螨的钙调蛋白(CAM)基因。
[0171] 提供了对应于SEQ ID NO:3和4(表2)用于抑制狄斯瓦螨中钙调蛋白(CAM)基因表达的多核苷酸，并所述多核苷酸用来抑制狄斯瓦螨螨中钙调蛋白(CAM)基因的表达。SEQ ID NO:3和4分别描述了选自CAM-1(SEQ ID NO:1)的373bp dsRNA多核苷酸序列和186bp dsRNA
多核苷酸序列。对应于dsRNA多核苷酸CAM_L/CAM373的SEQ ID NO:3覆盖了钙调蛋白CAM-1
(SEQ ID NO:1)基因的大部分开放阅读框。对应于dsRNA多核苷酸CAM_S/CAM186的SEQ ID
NO 4为CAM_L/CAM373(SEQ ID NO:3)的部分片段，并且也源自CAM-1(SEQ ID NO:1)。表2中
的SEQ ID NO:5为对照dsRNA序列多核苷酸，没有超过19bp的序列与任何已知的狄斯瓦螨基
因相同。
多核苷酸序列。对应于dsRNA多核苷酸CAM_L/CAM373的SEQ ID NO:3覆盖了钙调蛋白CAM-1
(SEQ ID NO:1)基因的大部分开放阅读框。对应于dsRNA多核苷酸CAM_S/CAM186的SEQ ID
NO 4为CAM_L/CAM373(SEQ ID NO:3)的部分片段，并且也源自CAM-1(SEQ ID NO:1)。表2中
的SEQ ID NO:5为对照dsRNA序列多核苷酸，没有超过19bp的序列与任何已知的狄斯瓦螨基
因相同。
[0172] 表2.靶向狄斯瓦螨钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA
[0173]
[0174] 实施例3.以特异dsRNA处理后的第3天的狄斯瓦螨生物测定
[0175] 从蜜蜂群体收集成体雌性螨，并将它们放置在皮氏培养皿内的人工食物溶液上，该人工食物溶液含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合物。在本实施例中，向该食物补充每1mL食物溶液50μg卡那霉素。向该食物/琼脂溶液进一步补充
200-500μg/mL的dsRNA，并将所得的溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:5(SCRAM)组成。对每一平皿施加15个螨，并且一式三份进行实验。将有螨的食物平皿在29℃和50-60％相对湿度下孵育。以特定的时间间隔检测平皿，并对死亡的螨计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后的第3天对螨计数(图
2)。图2显示，与未处理的平皿或者其中螨以补充了非特异(SCRAM)dsRNA多核苷酸的食物为食的平皿相比，所有的螨在处理后的第3天都死亡。
200-500μg/mL的dsRNA，并将所得的溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:5(SCRAM)组成。对每一平皿施加15个螨，并且一式三份进行实验。将有螨的食物平皿在29℃和50-60％相对湿度下孵育。以特定的时间间隔检测平皿，并对死亡的螨计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后的第3天对螨计数(图
2)。图2显示，与未处理的平皿或者其中螨以补充了非特异(SCRAM)dsRNA多核苷酸的食物为食的平皿相比，所有的螨在处理后的第3天都死亡。
[0176] 实施例4.用靶向钙调蛋白的dsRNA处理后第5天的狄斯瓦螨生物测定
[0177] 从蜜蜂群体收集成体雌性螨，并将它们放置在皮氏培养皿内的人工食物溶液上。该人工食物含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合物。在本实施例中，向该食物进一步补充8x最终浓度的抗霉菌溶液(100x，Sigma Aldrich)，500μg/mL卡那霉素和220U/mL制霉菌素。向该食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的dsRNA，并将所得的溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或
SEQ ID NO:4(CAM_S/CAM186)或SEQ ID NO:5(SCRAM)组成。向每一平皿施加15个螨，并且一式三份进行实验。将有螨的食物平皿在29℃和50-60％相对湿度下孵育。以特定的时间间隔检测平皿并对死亡的螨计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后的第5天对螨计数(图3)。对于分子分析，将活螨从平皿取走，在液氮中速冻并进行TAQMANTM分析以评估钙调蛋白(CAM)RNA的水平。图3，图A。与非特异性(SCRAM)处理或未处理(CNTR)相比，暴露于SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:4(CAM_S/CAM186)的螨中对应钙调蛋白(CAM)基因的RNA
水平大大降低。图3，图B，处理后的第5天在暴露于针对钙调蛋白(CAM)的dsRNA的螨中观察到统计学上显著的死亡率。
SEQ ID NO:4(CAM_S/CAM186)或SEQ ID NO:5(SCRAM)组成。向每一平皿施加15个螨，并且一式三份进行实验。将有螨的食物平皿在29℃和50-60％相对湿度下孵育。以特定的时间间隔检测平皿并对死亡的螨计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后的第5天对螨计数(图3)。对于分子分析，将活螨从平皿取走，在液氮中速冻并进行TAQMANTM分析以评估钙调蛋白(CAM)RNA的水平。图3，图A。与非特异性(SCRAM)处理或未处理(CNTR)相比，暴露于SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)或SEQ ID NO:4(CAM_S/CAM186)的螨中对应钙调蛋白(CAM)基因的RNA
水平大大降低。图3，图B，处理后的第5天在暴露于针对钙调蛋白(CAM)的dsRNA的螨中观察到统计学上显著的死亡率。
[0179] 将用于抑制瓦螨靶钙调蛋白(CAM)基因表达的dsRNA如表3中所说明在制剂中制备，该制剂含有于磷酸盐缓冲液(1.15mM KH2PO4(一价)和8mM Na2HPO4(二价)的溶液，pH
8.0)中的1份dsRNA和～14份的海藻糖。采用Büchi B-290迷你喷雾干燥器，将液体制剂雾化成小滴，并用气体加热来生成流动性粉末。
8.0)中的1份dsRNA和～14份的海藻糖。采用Büchi B-290迷你喷雾干燥器，将液体制剂雾化成小滴，并用气体加热来生成流动性粉末。
[0180] 表3.制剂制备
[0181]
[0182]
[0183] 将所得的颗粒与粉末化的糖一起配制，并通过将粉末化的糖均匀撒布到框顶部上来均匀施加至蜂巢。在其它方面，将喷雾干燥物质的半固体制备物与水一起配制，并通过使蜜蜂以此为食将糖-水(“蜜蜂糖果”)制剂提供至蜜蜂蜂巢。
[0184] 实施例6.用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后蜂巢中瓦螨的体内减少
[0185] 收集侵染蜂巢中成体蜜蜂的瓦螨，并采用标准螨计数方法计数。根据实施例7包含SEQ ID NO:3(CAM-L)、SEQ ID NO:4(CAM-S)的喷雾干燥的dsRNA处理蜂巢，或不处理(对
照)。在开始实验时和处理后的第2周、第4周和第12周评估每一蜂巢的螨载量。图4显示了与未接受处理的蜂巢相比，经处理的蜂巢的螨载量。将计数的螨数量归一化至100只成体蜜
蜂，并作为瓦螨载量的代表。
照)。在开始实验时和处理后的第2周、第4周和第12周评估每一蜂巢的螨载量。图4显示了与未接受处理的蜂巢相比，经处理的蜂巢的螨载量。将计数的螨数量归一化至100只成体蜜
蜂，并作为瓦螨载量的代表。
[0186] 实施例7.在用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后瓦螨中过渡性小RNA的检测。
[0187] 从以SEQ ID NO:3dsRNA多核苷酸处理的蜂巢收集瓦螨并在处理后的第7天从蜂巢收集。提取瓦螨RNA并采用SOLiD平台进行小RNA测序分析。检测到大多数的小RNA分子在
dsRNA序列区域之外，并特异性朝向SEQ ID NO:3的dsRNA区域的3’部分。另外，大多数的过渡性读数相对于钙调蛋白(CAM)基因转录序列为反义取向。进一步地，在本实验中检测到对CAM-2(SEQ ID NO:2)有特异性的小RNA，尽管蜂巢经针对SEQ ID NO:3的dsRNA处理，这预测对CAM-1(SEQ ID NO:1)有特异性。这种观察结果支持了这样的假设：抑制RNA表达和过渡性小RNA生成在瓦螨内起作用，甚至当两基因之间仅有小片段在DNA水平上共有完全的同一性
(在这种情况下23个核苷酸)。
dsRNA序列区域之外，并特异性朝向SEQ ID NO:3的dsRNA区域的3’部分。另外，大多数的过渡性读数相对于钙调蛋白(CAM)基因转录序列为反义取向。进一步地，在本实验中检测到对CAM-2(SEQ ID NO:2)有特异性的小RNA，尽管蜂巢经针对SEQ ID NO:3的dsRNA处理，这预测对CAM-1(SEQ ID NO:1)有特异性。这种观察结果支持了这样的假设：抑制RNA表达和过渡性小RNA生成在瓦螨内起作用，甚至当两基因之间仅有小片段在DNA水平上共有完全的同一性
(在这种情况下23个核苷酸)。
[0188] 实施例8.来自节肢动物害虫和寄生物物种的钙调蛋白(CAM)基因同源物以及对应的dsRNA多核苷酸。
[0189] 采用标准生物信息学技术和用于狄斯瓦螨的序列SEQ ID NO:1和2，在侵染其它节肢动物或哺乳动物且将被靶向用于基因调节的节肢动物害虫物种中鉴定出一组31个保守
的钙调蛋白(CAM)基因序列。这些序列被鉴定并作为系统发生树显示在图1中。通过鉴定每
条序列内与SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)对应的保守373bp结构域，对图1的DNA序列进一步
分析。表4列出了新鉴定的钙调蛋白(CAM)基因序列的SEQ ID NO以及对应的373bp dsRNA多
核苷酸触发序列。373bp多核苷酸dsRNA序列将在直接饲喂测定中对它们各自的节肢动物物
种单独或联合测试。
的钙调蛋白(CAM)基因序列。这些序列被鉴定并作为系统发生树显示在图1中。通过鉴定每
条序列内与SEQ ID NO:3(CAM_L/CAM373)对应的保守373bp结构域，对图1的DNA序列进一步
分析。表4列出了新鉴定的钙调蛋白(CAM)基因序列的SEQ ID NO以及对应的373bp dsRNA多
核苷酸触发序列。373bp多核苷酸dsRNA序列将在直接饲喂测定中对它们各自的节肢动物物
种单独或联合测试。
[0190] 表4.从节肢动物害虫或寄生物鉴定的钙调蛋白(CAM)基因序列以及它们对应的373bp RNA多核苷酸。
[0191]
[0192]
[0193]
[0194] 实施例9.瓦螨钙调蛋白(CAM)基因转录物和dsRNA触发序列。
[0195] 将表5中提供的钙调蛋白(CAM)序列(SEQ ID NO:69和70)或它们对应的转录物用作多核苷酸组合物的靶标，该多核苷酸组合物包含与那些基因或转录物相同或互补的至少
18个连续核苷酸多核苷酸。通过RNA测序鉴定瓦螨钙调蛋白序列的5’和3’UTR序列。
18个连续核苷酸多核苷酸。通过RNA测序鉴定瓦螨钙调蛋白序列的5’和3’UTR序列。
[0196] 表5.狄斯瓦螨的钙调蛋白(CAM)基因的靶转录物
[0197]基因名称和物种 SEQ ID NO 类型
CAM-1；狄斯瓦螨 69 RNA
CAM-2；狄斯瓦螨 70 RNA
CAM-1；狄斯瓦螨 69 RNA
CAM-2；狄斯瓦螨 70 RNA
[0198] 将SEQ ID NO:69和70以150bp片段平铺。表6说明了跨SEQ ID NO:69和70平铺的150bp片段的上链(5’-3’)。
[0199] 表6.用于CAM-1和CAM-2基因的平铺多核苷酸序列
[0200]
[0201] 将包含选自SEQ ID NO:71-87的序列的一种或多种dsRNA体外提供至生长在皮氏培养皿上的瓦螨或局部施加至蜜蜂蜂巢，以影响CAM靶基因的表达并实现狄斯瓦螨螨群的
减少。
减少。
[0202] 实施例10.瓦螨中钙调蛋白(CAM)靶向触发剂的体外生物测定
[0203] 基于在CAM-1和CAM-2序列之间的保守序列重叠生成靶向钙调蛋白(CAM)-1和2的多核苷酸触发序列。这些表示为SEQ ID NO:88和89(分别靶向CAM-1和CAM-2)。
[0204] 在体外生物测定中测试选自SEQ ID NO:88和89的多核苷酸序列抑制成体瓦螨存活力的能力。从蜜蜂群体收集成体雌性螨，并将它们放置在皮氏培养皿内的人工食物溶液
顶部上。该人工食物含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合
物。在本实施例中，向该食物进一步补充8x最终浓度的抗霉菌溶液(100x，Sigma Aldrich)，
500μg/mL卡那霉素和220U/mL制霉菌素。向该食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的
dsRNA，并将所得的溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3
(CAM373)、SEQ ID NO:88(CAM-1)或SEQ ID NO:89(CAM-2)或未处理对照(NTC)组成。对每一平皿施加15个螨，并且一式三份进行实验。将有螨的食物平皿在29℃和50-60％相对湿度下孵育。以特定的时间间隔检测平皿，并对死亡的螨计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后的第5天和第6天对螨计数(图5)。另外，将针对SEQ ID NO:88(CAM-1)和SEQ ID
NO:89(CAM-2)的dsRNA以等摩尔量混合并如上描述饲喂给螨。图6显示了这种施加的结果。
顶部上。该人工食物含有1％胰蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl和15mg/mL琼脂的混合
物。在本实施例中，向该食物进一步补充8x最终浓度的抗霉菌溶液(100x，Sigma Aldrich)，
500μg/mL卡那霉素和220U/mL制霉菌素。向该食物/琼脂溶液进一步补充200-500μg/mL的
dsRNA，并将所得的溶液倾倒在皮氏培养皿上。本实施例中的dsRNA由SEQ ID NO:3
(CAM373)、SEQ ID NO:88(CAM-1)或SEQ ID NO:89(CAM-2)或未处理对照(NTC)组成。对每一平皿施加15个螨，并且一式三份进行实验。将有螨的食物平皿在29℃和50-60％相对湿度下孵育。以特定的时间间隔检测平皿，并对死亡的螨计数并移除。对于死亡率研究，在置于食物上之后的第5天和第6天对螨计数(图5)。另外，将针对SEQ ID NO:88(CAM-1)和SEQ ID
NO:89(CAM-2)的dsRNA以等摩尔量混合并如上描述饲喂给螨。图6显示了这种施加的结果。
[0205] 对于分子分析，将活螨从平皿取走，在液氮中速冻并进行TAQMANTM分析，以评估钙调蛋白(CAM)RNA的水平。
[0206] 实施例11.在用靶向钙调蛋白(CAM)基因的dsRNA处理后现场处理的蜜蜂蜂巢中瓦螨侵染的体内现场减少.
[0207] 通过将磷酸盐缓冲液中的dsRNA储备液与66％糖浆混合，来制备用于抑制瓦螨靶向的钙调蛋白(CAM)基因的表达的dsRNA。将液体制剂作为糖浆提供给蜜蜂，使得以其为食，直至完全消耗(约2至3天)。每一现场试验组由33个蜂巢组成。该组由未处理蜂巢、非特异性触发剂处理的(SEQ ID NO:5)和特异性触发剂处理的(SEQ ID NO:3)组成。蜜蜂处理两轮，
每一轮由间隔两周的两次饲喂组成：在递送开始时(0周)和两周后(第2周)，然后在第13周
和第15周重复。在第4、9、13、15和17周进行蜜蜂存活评估(图7)。在以特异触发(SEQ ID NO:
3)处理后的第9周观察到瓦螨群的显著抑制。
每一轮由间隔两周的两次饲喂组成：在递送开始时(0周)和两周后(第2周)，然后在第13周
和第15周重复。在第4、9、13、15和17周进行蜜蜂存活评估(图7)。在以特异触发(SEQ ID NO:
3)处理后的第9周观察到瓦螨群的显著抑制。
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