稳定的非多腺苷酸化RNA的产生
阅读：573发布：2023-03-14
专利汇可以提供稳定的非多腺苷酸化RNA的产生专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且在一些方面，本 发明 涉及缺乏polyA尾的杂合体RNA和用于表达所述RNA的核酸载体。在一些情况下，所述杂合体RNA具有3’末端稳定化三螺旋结构。还公开了用于体内和体外表达所述RNA的相关方法。，下面是稳定的非多腺苷酸化RNA的产生专利的具体信息内容。
1.杂合体核酸，其包含：
与异源RNA稳定化末端序列连接的缺乏polyA尾的RNA分子。
2.根据权利要求1所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列具有三螺旋构象。
3.根据权利要求1至2中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是细胞质RNA或核RNA。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是mRNA。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是非编码RNA。
6.根据权利要求1至3中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是真核生物RNA。
7.根据权利要求1至3中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是哺乳动物RNA。
8.根据权利要求1至3中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是植物RNA。
9.根据权利要求1至3中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子是人RNA。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是MALAT1末端序列。
11.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是MENβ末端序列。
12.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是富含U的序列。
13.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是富含A的序列。
14.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是富含U且富含A的序列。
15.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是富含C且富含G的序列。
16.根据权利要求1至8中任一项所述的杂合体核酸，其中所述异源RNA稳定化末端序列是具有三螺旋结构的RNA。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的杂合体核酸，其中所述RNA分子对应于报道分子。
18.载体，其包含：
对应于RNA分子的核酸、在所述对应于RNA分子的核酸上游的启动子、以及在所述对应于RNA分子的核酸下游之对应于末端序列的核酸。
19.根据权利要求18所述的载体，其中所述载体是质粒。
20.根据权利要求18至19中任一项所述的载体，其中所述对应于RNA分子的核酸是编码报道蛋白的核酸。
21.根据权利要求20所述的载体，其中所述报道蛋白是绿色荧光蛋白。
22.根据权利要求18至21中任一项所述的载体，其中所述RNA分子是mRNA。
23.根据权利要求18至22中任一项所述的载体，其中所述载体包含产生根据权利要求
1至17中任一项所述之杂合体核酸的核酸序列。
24.根据权利要求18至23中任一项所述的载体，其中所述启动子是异源启动子。
25.根据权利要求18至24中任一项所述的载体，其中所述启动子是CMV启动子。
26.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述RNA分子是真核生物RNA、哺乳动物RNA、植物RNA或人RNA。
27.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是MALAT1末端序列。
28.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是MENβ末端序列。
29.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是富含U的序列。
30.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是富含A的序列。
31.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是富含U且富含A的序列。
32.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是富含C且富含G的序列。
33.根据权利要求18至25中任一项所述的载体，其中所述末端序列是具有三螺旋结构的RNA。
34.根据权利要求18至33中任一项所述的载体，其中所述末端序列具有配体结合结构域。
35.根据权利要求34所述的载体，其中所述配体结合结构域具有组织特异性元件。
36.根据权利要求35所述的载体，其中所述组织是癌组织并且所述组织特异性元件参与所述癌组织中的翻译调控。
37.根据权利要求1至17中任一项所述的杂合体核酸或根据权利要求18至36中任一项所述的载体，其中核酸包含至少一种化学修饰或天然修饰。
38.用于增强RNA翻译的方法，其包括：
在细胞中表达分离的缺乏poly A尾的细胞质RNA，其中所述细胞质RNA具有有效增强所述RNA在所述细胞中之翻译的3’末端序列。
39.根据权利要求38所述的方法，其中具有3’末端序列的所述分离的缺乏poly A尾的细胞质RNA是根据权利要求1至17中任一项所述的杂合体核酸。
40.根据权利要求38所述的方法，其中向所述细胞施用根据权利要求18至36中任一项所述的载体，以表达所述分离的缺乏poly A尾的细胞质RNA。
41.用于表达缺少polyA尾之RNA的方法，其包括：
在细胞中表达分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏polyA尾的RNA。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述分离的核酸是根据权利要求1至17中任一项所述的杂合体核酸。
43.根据权利要求41所述的方法，其中向所述细胞施用根据权利要求18至36中任一项所述的载体以表达所述分离的核酸。
44.组合物，其包含：
配制在纳米颗粒中的缺乏poly A尾的RNA分子，所述RNA分子与异源RNA稳定化末端序列连接。
45.根据权利要求44所述的组合物，其中RNA包含至少一种化学修饰或天然修饰。
46.组合物，其包含：
含有根据权利要求18至36中任一项所述之核酸载体的纳米颗粒或微米颗粒。
47.根据权利要求46所述的组合物，其中核酸包含至少一种化学修饰或天然修饰。
48.向体内细胞递送RNA的方法，其包括向对象施用根据权利要求46所述的组合物。
49.用于纯化RNA的方法，其包括：
使分离的核酸的混合物进行亲和纯化步骤或尺寸排阻纯化步骤，以获得经纯化之缺乏poly A尾的RNA，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述分离的核酸是根据权利要求1至17中任一项所述的杂合体核酸。
51.根据权利要求49所述的方法，其中经纯化的RNA用于体外、离体或体内方法中。
52.用于在对象中治疗疾病的方法，其包括：
向所述对象施用有效量的分离的核酸以在所述对象中表达蛋白质，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述蛋白质可用于在所述对象中治疗疾病。
53.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病是与功能丧失有关的疾病。
54.根据权利要求53所述的方法，其中所述疾病是肌营养不良或囊性纤维化。
55.根据权利要求52所述的方法，其中所述疾病为选自以下的疾病：癌症、心血管疾病、自身免疫病、神经变性疾病和皮肤病。
56.根据权利要求52所述的方法，其中所述分离的核酸是根据权利要求1至17中任一项所述的杂合体核酸。
57.根据权利要求52所述的方法，其中向细胞施用根据权利要求18至36中任一项所述的载体以表达所述分离的核酸。
58.用于组织产生的方法，其包括：
在细胞中表达分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，于生长条件下在骨架上培养所述细胞以形成组织。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述组织被植入体内。
60.组织，其根据权利要求58所述的方法产生。
61.用于产生干细胞的方法，其包括：
在分化细胞的群体中表达分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码重编程蛋白，在促进重编程的条件下培养所述分化的细胞以形成多潜能干细胞。
62.多潜能干细胞，其根据权利要求61所述的方法产生。
63.用于产生分化的细胞的方法，其包括：
在干细胞群中表达分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码分化蛋白，在促进分化的条件下培养所述干细胞以形成分化的细胞。
64.用于在有此需要的对象中校正遗传缺陷的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的分离的细胞，所述分离的细胞包含分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码用于校正所述遗传缺陷的蛋白质。
65.根据权利要求64所述的方法，其中所述遗传缺陷选自：引起免疫系统病症的遗传缺陷、引起神经病症的遗传缺陷、引起心脏病症的遗传缺陷、引起循环病症的遗传缺陷和引起呼吸病症的遗传缺陷。
66.用于在有此需要的对象中治疗遗传病症的方法，其包括向所述对象施用治疗有效量的分离的细胞，所述分离的细胞包含分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码替代蛋白质，其中所述替代蛋白质的缺乏与所述遗传病症有关。
67.杂合体核酸，其包含：
与异源RNA稳定化末端序列连接的缺乏poly A尾的RNA分子，其中所述RNA分子编码免疫原性蛋白质。
68.用于给对象接种疫苗的方法，其包括：
向对象施用有效量的根据权利要求67所述的杂合体核酸以引发针对所述免疫原性蛋白质的适应性免疫应答。
69.非人动物，其包含：在所述动物的一个或更多个细胞中之与异源RNA和稳定化末端序列连接的缺乏poly A尾的外源RNA分子。
70.根据权利要求69所述的动物，其中所述RNA分子编码治疗性蛋白质。
71.根据权利要求69所述的动物，其中所述RNA分子编码免疫原性蛋白质。
稳定的非多腺苷酸化RNA的产生
[0001] 相关申请
[0002] 根据35 U.S.C.§119(e)，本申请要求于2012年10月16日提交的标题为“PRODUCTION OF STABLE NON-POLYADENYLATED RNAS”的美国临时申请序列号61/714,697、于2012年10月22日提交的标题为“PRODUCTION OF STABLE NON-POLYADENYLATED RNAS”的美国临时申请序列号61/716,764和于2012年12月19日提交的标题为“PRODUCTION OF STABLE NON-POLYADENYLATED RNAS”的美国临时申请序列号61/739,153的优先权，其均通过引用以其整体并入本文。
[0003] 联邦政府资助的研究
[0004] 本发明是在由国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的基金号GM34277和CA133404的政府支持下进行的。政府在本发明中拥有一定的权利。
[0005] 发明背景
[0006] 加工新生转录物的3’端对终止RNA聚合酶并确保成熟RNA正确的功能是关键的。在正常发育期间和在疾病(例如癌症)发展中，3’端切割位点的使用频繁改变，从而导致在成熟RNA的3’端包括(或不包括)额外的序列基序，这可影响转录物的稳定性、亚细胞定位或功能(综述于Lutz和Moreira 2011中)。实际上，所有的长RNA聚合酶II(Pol II)转录物以poly A尾终止，poly A尾通过核酸内部切割(endonucleolytic cleavage)之后以非模板方式添加腺苷(A)残基而产生(Moore和Sharp1985；综述于Colgan和Manley 1997中；Zhao等1999；Proudfoot 2004)。然而，最近对人转录物组的大规模研究表明转录遍布整个基因组(综述于Wilusz等2009中)，并且指出细胞中存在的对应部分(可能＞25％)的长Pol II转录物可能缺乏规范的poly A尾(Cheng等2005；Wu等2008；Yang等2011a)。
尽管这些转录物中的一些可能是降解中间产物，但是存在已经充分表征的缺乏poly A尾的稳定Pol II转录物，例如复制依赖性组蛋白mRNA。在其3’端发生U7snRNA指导的核酸内部切割之后，组蛋白mRNA在其3’非翻译区(UTR)中具有高度保守的茎-环结构，其在功能上与poly A尾类似，因为其确保了RNA的稳定性并增强翻译效率(综述于Marzluff等
2008)中。
尽管这些转录物中的一些可能是降解中间产物，但是存在已经充分表征的缺乏poly A尾的稳定Pol II转录物，例如复制依赖性组蛋白mRNA。在其3’端发生U7snRNA指导的核酸内部切割之后，组蛋白mRNA在其3’非翻译区(UTR)中具有高度保守的茎-环结构，其在功能上与poly A尾类似，因为其确保了RNA的稳定性并增强翻译效率(综述于Marzluff等
2008)中。
[0007] 最近的工作已鉴定出进行非规范3’端加工机制的另外Pol II转录物(综述于Wilusz和Spector 2010中)。特别地，已显示，在其他RNA加工事件(例如前体mRNA剪接(Box等2008)和tRNA生物发生)中具有公知作用的酶切割某些新生转录物以产生成熟的3’端。在其经充分表征的作用中，RNA酶P(RNase P)核酸内部切割tRNA前体以产生功能tRNA的成熟5’末端(综述于Kirsebom 2007中)。已表明，RNase P还产生长非编码RNA MALAT1(肺腺癌转移相关转录物1，也称为NEAT2)的成熟3’端，尽管附近多腺苷酸化信号存在(Wilusz等2008)。RNase P的切割同时产生约6.7-kb MALAT1非编码RNA的成熟3’端和小tRNA样转录物的5’端。参与tRNA生物发生的另一些酶(包括RNase Z和CCA加成酶)对小RNA进行进一步加工以产生成熟的称为mascRNA(MALAT1相关小细胞质RNA，(MALAT1-associated small cytoplasmic RNA))的61个核苷酸(nt)转录物(Wilusz等
2008)。
2008)。
[0008] 长MALAT1转录物滞留在细胞核的核斑中(Hutchinson等2007)，在其中已提出其顺式调控附近基因的选择性剪切(Tripathi等2010)、转录激活(Yang等2011b)和表达(Nakagawa等2012；Zhang等2012)。尽管MALAT1基因座对小鼠发育来说似乎是不必要的(Eissmann等2012；Nakagawa等2012；Zhang等2012)，但是MALAT1在很多人癌症中过表达(Ji等2003；Lin等2007；Lai等2011)，表明其可能在癌症进展中具有重要功能。此外，已在MALAT1内鉴定出与癌症有关的染色体易位断裂点(Davis等2003；Kuiper等2003；Rajaram等2007)以及点突变和短缺失(Ellis等2012)。
[0009] 尽管缺乏规范的poly A尾，但MALAT1仍是小鼠和人细胞中最丰富的长非编码RNA之一。实际上，MALAT1的表达水平与很多蛋白质编码基因(包括β-肌动蛋白或GAPDH)相当或者比其高，(Zhang等2012)。
[0010] 发明概述
[0011] 在一些方面，本发明涉及杂合体RNA、用于表达所述RNA的表达载体及其使用方法。所述杂合体RNA包含替代内源RNA之poly A尾的稳定化3’端。因此，在一些方面，本发明是杂合体核酸，其包含与末端序列连接的缺乏poly A尾的RNA分子。
[0012] 在另一些方面，本发明提供了用于产生不是mRNA的功能RNA的方法。在一些实施方案中，所述不是mRNA的功能RNA是可与靶mRNA进行碱基配对并调控靶mRNA表达的反义RNA。所述调控可以是上调或下调。
[0013] 在一些实施方案中，末端序列是具有三螺旋构象的异源RNA稳定化末端序列(stabilizing terminal sequence)。在另一些实施方案中，所述末端序列是为MALAT1末端序列或MENβ末端序列的异源RNA稳定化末端序列。在又一些实施方案中，所述末端序列是以下异源RNA稳定化末端序列：富含U的序列、富含A的序列、富含U且富含A的序列或富含C且富含G的序列。
[0014] 在另一些实施方案中，所述末端序列具有配体结合结构域。例如，所述配体结合结构域可以是组织特异性元件。在一些实施方案中，所述组织是癌组织并且所述组织特异性元件参与癌组织中的翻译调控。
[0015] 所述RNA分子可以是任何类型的RNA分子。例如，所述RNA分子可以是细胞质RNA、核RNA、mRNA或非编码RNA。在一些实施方案中，所述RNA分子是真核生物RNA、哺乳动物RNA、植物RNA或更特别地为人RNA。在一些实例中，所述RNA分子对应于报道分子。
[0016] 根据本发明的另一些方面，提供了载体，所述载体具有对应于RNA分子的核酸、在对应于RNA分子之核酸上游的启动子和在对应于RNA分子之核酸下游的对应于末端序列的核酸。在一些实施方案中，所述载体是质粒。
[0017] 在一些实施方案中，所述对应于RNA分子的核酸是编码报道蛋白(例如，绿色荧光蛋白)的核酸。
[0018] 在另一些实施方案中，所述载体包含产生本文所述之任意杂合体核酸的核酸序列。
[0019] 在一些实施方案中，所述启动子是异源启动子。在另一些实施方案中，所述启动子是CMV启动子。
[0020] 在本发明的另一些方面，提供了用于增强RNA翻译的方法。所述方法包括在细胞中表达分离的缺乏poly A尾的细胞质RNA，其中所述细胞质RNA具有有效增强细胞中RNA翻译的3’末端序列。
[0021] 在一些实施方案中，具有3’末端序列的分离的缺乏poly A尾的细胞质RNA是本文所述的杂合体核酸。在另一些实施方案中，向细胞施用本文所述的任意载体以表达所述分离的缺乏poly A尾的细胞质RNA。
[0022] 根据本发明的另一些方面，提供了用于通过在细胞中表达分离的核酸来表达缺乏poly A尾之RNA的方法，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA。在一些实施方案中，所述分离的核酸是本文所述的任意杂合体核酸。在另一些实施方案中，向细胞施用本文所述的任意载体以表达所述分离的核酸。
[0023] 在一些实施方案中，所述核酸包含至少一种化学或天然修饰。
[0024] 在另一些方面，本发明是用于纯化RNA的方法。所述方法包括以下步骤：对分离的核酸的混合物进行亲和纯化步骤或尺寸排阻纯化步骤以获得经纯化之缺乏poly A尾的RNA，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA。
[0026] 根据本发明的另一些方面，提供了用于如下治疗对象中疾病的方法：向所述对象施用有效量的分离的核酸以在所述对象中表达蛋白质，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述蛋白质可用于在所述对象中治疗疾病。在一些实施方案中，所述疾病是与功能丧失有关的疾病，例如肌营养不良或囊性纤维化。在另一些实施方案中，所述疾病是选自以下的疾病：癌症、自身免疫病、心血管疾病、神经变性疾病和皮肤病。
[0027] 根据另一些方面，本发明是用于组织产生的方法，所述方法包括在细胞中表达分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，于生长条件下在骨架上培养所述细胞以形成组织。在一些实施方案中，所述组织被植入体内。
[0028] 本发明还涵盖根据本文所述的方法产生的组织。
[0029] 在本发明的另一些方面，提供了用于产生干细胞的方法。所述方法包括在分化细胞的群体中表达分离的的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码重编程蛋白，在促进重编程的条件下培养所述分化的细胞以形成多潜能干细胞。
[0030] 根据本发明的另一些方面，提供了根据本文所述的方法产生的多潜能干细胞。
[0031] 根据本发明的一些方面，提供了用于产生分化的细胞的方法。所述方法包括在干细胞群中表达分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码分化的蛋白，在促进分化的条件下培养所述干细胞以形成分化的细胞。
[0032] 在另一些方面，本发明是用于如下在有此需要的对象中校正遗传缺陷的方法：向所述对象施用治疗有效量的分离的细胞，其包含分离的核酸，所述分离的核酸包含具有3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码用于校正遗传缺陷的蛋白质。在一些实施方案中，所述遗传缺陷选自：引起免疫系统病症的遗传缺陷、引起神经病症的遗传缺陷、引起心脏病症的遗传缺陷、引起循环病症的遗传缺陷和引起呼吸病症的遗传缺陷。
[0033] 在本发明的另一些方面，提供了如下在有此需要的对象中治疗遗传病症的方法：向所述对象施用治疗有效量的分离的细胞，其包含分离的核酸，所述分离的核酸包含具有
3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码替代蛋白质(replacement protein)，其中所述替代蛋白质的缺乏与遗传病症有关。
3’异源末端序列并且缺乏poly A尾的RNA，其中所述RNA编码替代蛋白质(replacement protein)，其中所述替代蛋白质的缺乏与遗传病症有关。
[0034] 在另一些方面，本发明是缺乏poly A尾之RNA分子的杂合体核酸，其与异源RNA稳定化末端序列连接，其中所述RNA分子编码免疫原性蛋白质。在另一些实施方案中，提供了用于如下给对象接种疫苗的方法：向所述对象施用有效量的杂合体核酸以引发对所述免疫原性蛋白质的适应性免疫应答。
[0035] 在另一些方面，本发明是非人动物，其包含：在所述动物的一个或更多个细胞中之与异源RNA和稳定化末端序列连接的缺乏poly A尾的外源RNA分子。在一些实施方案中，所述RNA分子编码治疗性蛋白质或免疫原性蛋白质。
[0036] 本发明在其应用方面并不局限于下文描述中所提出或附图中所示的组成的结构和布置的细节。本发明还能够具有其他实施方案，并且可以以多种方式进行实践或实施。上述实施方案和方面中的每一个均可与任何其他实施方案或方面相关。此外，本文使用的措辞和术语是出于描述目的，而不应认为是限制性的。本文中使用的“包括”、“包含”或“具有”、“含有”、“涉及”及其变化形式旨在涵盖其后所列出的项及其等同物以及另外的项。
[0037] 附图简述
[0038] 附图并非意在按比例绘制。在附图中，多个图中所示的每个相同或接近相同的组件通过相似的数字表示。出于清楚的目的，并非每个组件在每个附图中都可进行标记。在附图中：
[0039] 图1示出了MALAT1的3’端是高度保守的并且被RNase P切割。(A)尽管MALAT1基因座的3’端具有多腺苷酸化信号，但是MALAT1主要通过由tRNA生物发生机制介导的上游切割机制进行加工。RNase P切割同时产生MALAT1的成熟3端和mascRNA的5’端。随后，将tRNA样小RNA通过RNA酶Z(RNase Z)切割并进行CCA加成。所示序列为SEQ ID NO.70。(B)MALAT1RNase P切割位点(箭头所示)的紧接上游是进化上高度保守的富含A的段(A-rich tract)。较远上游是被预计的茎环结构隔开的两个接近完全保守的富含U基序。所示序列从上到下为SEQ ID NO.71至SEQ ID NO.78。(C)MENβRNase P切割位点的上游存在类似的基序。所示序列从上到下为SEQ ID NO.79至SEQ ID NO.84。(D)通过将小鼠MALAT1的nt 6581-6754置于cGFP开放阅读框的下游产生CMV-cGFP-mMALAT1_3’有义表达质粒。在3’端不存在多腺苷酸化信号。所示序列为SEQ ID NO.70。(E)在将质粒转染到HeLa细胞中后，进行Northern印迹以检测mascRNA和cGFPMALAT1_3’RNA的表达。
为了验证cGFP MALAT1_3’RNA的3’端被准确产生并且在转录后没有添加另外的核苷酸，在Northern印迹分析之前进行RNA酶H(RNase H)消化。
为了验证cGFP MALAT1_3’RNA的3’端被准确产生并且在转录后没有添加另外的核苷酸，在Northern印迹分析之前进行RNA酶H(RNase H)消化。
[0040] 图2示出了富含U基序抑制MALAT1 3’端的尿苷化和降解。(A)本研究中使用的cGFP表达质粒的示意图。所示序列为SEQ ID NO.70。将mMALAT1_3’区用牛生长激素(bGH)或SV40多腺苷酸化信号替换以产生以规范poly A尾结尾的cGFP转录物(中间)。将mMALAT1的nt 1676-3598置于cGFP的上游以产生核滞留(retain)的cGFP转录物(底部)。(B)将转染的HeLa细胞分级并分离核和细胞质总RNA，然后用针对cGFP ORF的探针对其进行Northern印迹分析。使用针对内源MALAT1的探针作为用于分级效率的对照。(C)核斑F2-MALAT1_3’转录物被有效滞留在细胞核中。(D)将突变或缺失(红色所示)引入到CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒的mMALAT1_3’区中。所示序列从上到下为SEQ ID NO.85至SEQ ID NO.89。(E)将野生型(WT)或突变质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。在进行Northern印迹检测cGFP-MALAT1_3′RNA之前进行RNase H处理。(F)使用连接介导的3’RACE方法来检测正经历降解之cGFP-MALAT1_3′RNA转录物的3’端。转录后添加的核苷酸以红色表示。所示序列从上到下为SEQ ID NO.90至SEQ ID NO.100。(G)使用在Northern印迹之后的RNase H处理来表明cGFP-MALAT1_3’(图2D中所示的comp 14)转录物是稳定的。由于缺失了51个nt以产生Comp.14转录物，因此预期条带仅为139-nt。
[0041] 图3示出了富含U的基序2和富含A的段之间的碱基配对是必需的但对MALAT1的稳定性并不足够。(A)成熟Comp.14转录物(SEQ ID NO.101)3’端的预计二级结构。紫色所示为富含U的基序2和富含A的段之间在图C、D和E中突变的碱基对。(B)将突变(红色所示)引入到CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒中。所示序列从上到下为SEQ ID NO.102至SEQ ID NO.111。尽管螺旋的原子结构可能在所示预计结构的细节方面有所不同，但是强烈支持二级结构的形成。这些质粒中存在全174-nt mMALAT1_3’区，但是仅示出了富含U的基序2和富含A的段之间的区域。(C至E)将野生型(WT)或突变质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。在进行Northern印迹检测cGFP-MALAT1_3′RNA之前进行RNase H处理。
[0042] 图4示出了在MALAT1的3’端处形成三螺旋。(A)在成熟Comp.14转录物的3’端处形成碱基三联体(虚线所示)。所示序列为SEQ ID NO.101。该结构与图3A中所示的结构类似，除保守茎环的方向被旋转了90度之外。尽管该预计结构在获得时可能在原子结构的细节方面有所不同，但强烈支持三螺旋的形成。图E中突变的U-A·U碱基三联体以紫色表示。(B)U-A·U和C-G·C碱基三联体通过与Watson-Crick碱基配对螺旋的大沟键合的Hoogsteen氢键形成。(C)MALAT1Comp.14 3’端之Rosetta模型的动画表示。不包括1-5位碱基以获得建模的收敛性。如图A中，富含U的基序1是绿色的，富含U的基序2是红色的而富含A的段是蓝色的。剩余碱基是灰色的。(D)围绕非键合碱基C-11的三螺旋的近视图(编号如图A中)。碱基以棒表示，而Watson-Crick氢键以黑色表示、Hoogsteen氢键以红色表示。(E)将CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒中的四个U-A·U碱基三联体逐步转变成C-G·C碱基三联体。在每个构建体的名称中，＊表示Hoogsteen氢键。然后，将野生型(WT)或突变质粒转染到HeLa细胞中，并进行Western印迹以检测cGFP蛋白表达。使用黏着斑蛋白作为上样对照。(F)将突变(红色所示)引入CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒中。这些质粒中存在全174-nt mMALAT1_3’区，但是仅示出了富含U的基序1周围的区域。注意到，每个转录物的5’端均位于右侧以允许与图A中的结构进行直接比较。所示序列从上到下为SEQ ID NO.112至SEQ ID NO.117。然后，将WT或突变质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。
[0043] 图5示出了MALAT1三螺旋起翻译增强子元件的作用。(A)将表达以指定3’端序列结尾之cGFP转录物的质粒转染到HeLa细胞中。将mMALAT1_3’区和多腺苷酸化信号以所示的有义或反义方向插入。进行Western印迹以检测cGFP蛋白表达。使用黏着斑蛋白作为上样对照。(B)两色荧光报道子表达系统的示意图。(C)将两色表达质粒瞬时转染到HeLa细胞中并使用流式细胞术测量单个细胞中的mCherry和eYFP蛋白表达。所示为在来自一个代表性实验(n＝3)的单独转染细胞中测量的mCherry与eYFP蛋白表达比的盒状图(水平线，中值；盒，第25百分位至第75百分位；误差条，1.5x四分位距(interquartile range))。(D)使用QPCR来测量转染有两色表达质粒的细胞群中mCherry mRNA与eYFP mRNA的比。将数据归一化至多腺苷酸化构建体，并表示为三个独立实验的平均值和标准偏差值。(E)将突变或缺失(红色所示)引入CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒的mMALAT1_3’区中。
所示序列从上到下为SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.118至SEQ ID NO.122。(F)然后，将野生型(WT)或突变质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。在进行Northern印迹检测cGFP-MALAT1_3’RNA之前进行RNase H处理。(G)使用Western印迹检测经转染HeLa细胞中的cGFP表达。(H)将经转染的HeLa细胞分级以分离核和细胞质总RNA，然后对其进行Northern印迹分析。(I)在促进翻译中起作用的核苷酸(紫色所示)位于MALAT1 3’端三螺旋区的侧翼。所示序列为SEQ ID NO.101。
所示序列从上到下为SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.118至SEQ ID NO.122。(F)然后，将野生型(WT)或突变质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。在进行Northern印迹检测cGFP-MALAT1_3’RNA之前进行RNase H处理。(G)使用Western印迹检测经转染HeLa细胞中的cGFP表达。(H)将经转染的HeLa细胞分级以分离核和细胞质总RNA，然后对其进行Northern印迹分析。(I)在促进翻译中起作用的核苷酸(紫色所示)位于MALAT1 3’端三螺旋区的侧翼。所示序列为SEQ ID NO.101。
[0044] 图6示出了在小鼠胚胎干细胞中MALAT1的5’端附近观察到核糖体足迹(ribosome footprint)。示出了通过Ingolia等2011确定的小鼠胚状体和小鼠胚胎干细胞(在存在或不存在白血病抑制因子LIF的情况下生长)中MALAT1的mRNA序列和核糖体足迹谱。该图右侧的箭头表示MALAT1转录起始位点。
[0045] 图7示出了以MALAT1三螺旋结尾的转录物被微RNA体内有效抑制。(A)向mCherry的3’UTR中插入与let-7完全互补的序列或两个凸起的let-7结合位点。let-7微RNA序列以蓝色表示。所示序列从上到下为SEQ ID NO.123至SEQ ID NO.125，重复两次的SEQ ID NO.124。(B)用以SV40多腺苷酸化信号或mMALAT1_3’区结尾、含或不含(0x所示)微RNA结合位点的两色荧光报道质粒转染HeLa细胞。此外，按照所述将40nM对照siRNA或外源let-7微RNA共转染。然后，使用流式细胞术来测量mCherry和eYFP的蛋白质水平。将相对抑制倍数计算为归一化至非靶向(0x)报道子之当量比的靶向构建体的平均mCherry与平均eYFP信号的比。将数据表示为三个独立实验的平均值和标准偏差值。(C)使用QPCR测量整个细胞群的mCherry和eYFP转录水平，并通过与上文类似的方法计算mCherry RNA表达的相对抑制倍数。将数据表示为三个独立实验的平均值和标准偏差值。
[0046] 图8示出了将结构上不稳定的mascRNA突变体在其3’端标记以用于体内降解。(A)示出靶向在其5’端具有GG并包含不稳定接纳茎的tRNA(和tRNA样转录物)以通过经CCA加成酶添加的CCACCA快速降解(Wilusz等2011)。所示序列均为SEQ ID NO.126。使用纯化的CCA加成酶允许mascRNA体外通过在接纳茎中引入四个突变(红色所示)来从CCA转变成CCACCA靶标(产生Mut 10转录物)。相比之下，具有不稳定接纳茎但在其5’端具有GA的mascRNA突变体(Mut 7)在体外保留CCA靶标。为了确认这些序列在体内对添加CCACCA的需求，产生表达这两种突变mascRNA转录物的CMV-cGFP-mMALAT1_3’质粒。(B)将野生型(WT)或突变表达质粒转染到HeLa细胞中并使用Northern印迹检测mascRNA和cGFP-MALATl_3’RNA的表达。mascRNA突变均不影响RNase P切割，因为cGFP-MALATl_3’RNA可从两个突变质粒有效地产生(底部)。相比之下，通过Northern印迹分析未检测到任何突变mascRNA转录物(顶部)，表明两者在RNase P切割后均被有效降解。(C)通过进行基于连接的3’RACE PCR方法，发现CCACC(A)体内添加至mascRNA Mut 10转录物。在转录后添加的核苷酸以红色表示。所示序列从上到下为SEQ ID NO.127至SEQ ID NO.131。(D)相比之下，与此前的体外结果一致(Wilusz等2011)，未检测到以CCACCA结尾的mascRNA Mut
7转录物。作为替代，经常观察到Mut 7转录物的3’端添加有短的富含U的尾，表明降解过程中发生了尿苷化。所示序列从上到下为SEQ ID NO.132至SEQ ID NO.138。对于一些RACE克隆，富含U的尾在接纳茎中开始，表明3’-5’外切核酸酶可能在该双链区域中停止，并且添加富含U的尾以提供用于外切核酸酶识别并重新开始衰变过程的新单链尾。这表明短单链尾通过体内多重机制被添加到结构上不稳定的tRNA和tRNA样转录物的3’端，从而导致转录物降解。
7转录物。作为替代，经常观察到Mut 7转录物的3’端添加有短的富含U的尾，表明降解过程中发生了尿苷化。所示序列从上到下为SEQ ID NO.132至SEQ ID NO.138。对于一些RACE克隆，富含U的尾在接纳茎中开始，表明3’-5’外切核酸酶可能在该双链区域中停止，并且添加富含U的尾以提供用于外切核酸酶识别并重新开始衰变过程的新单链尾。这表明短单链尾通过体内多重机制被添加到结构上不稳定的tRNA和tRNA样转录物的3’端，从而导致转录物降解。
[0047] 图9示出了MALAT1 tRNA样结构体内足以用于RNase P募集和mascRNA生物发生。(A)为了鉴定由CMV驱动的转录物进行mascRNA生物发生所需的最少序列元件，将渐进缺失引入CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒中(顶部)。首先，将cGFP开放阅读框去除以产生CMV-mMALAT1_3’表达质粒(中间)。该质粒仍然包含完整的174-nt mMALAT1_3’片段(nt 6581-6754)，因此其包括在RNase P切割位点上游之富含U的基序和富含A的基序。将MALAT1RNase P切割位点上游的区域用不相关的12-nt序列替换并产生CMV-前导-mmascRNA表达质粒(底部)以随后确定mascRNA tRNA样结构本身是否足以用于mascRNA生物发生。所述12-nt序列为来自酿酒酵母(S.cerevisiae)前tRNA(Tyr)的5’前导。用于每种质粒的反义对照(未示出)通过以反义方向放置MALAT1/mascRNA区来产生。所示序列从上到下为SEQ ID NO.139、139和140。(B)将表达质粒转染到HeLa细胞中并在24小时后分离总RNA。然后，进行Northern印迹以检测mascRNA表达。使用U6snRNA作为上样对照。由于mascRNA从所有三个有义质粒中有效产生，因此这表明体内mascRNA产生所需的唯一MALAT1区是tRNA样结构自身。
[0048] 图10示出了MENβ的3’端被RNase P切割并支持有效翻译。(A)所使用之表达质粒的示意图。cGFP开放阅读框下游插入的是mMALAT1_3’区(顶部)、SV40或bGH多腺苷酸化信号(中间)或来自小鼠MENβ基因座3’端的174-nt区，其包含MENβtRNA样结构以及保守的上游富含U的基序和富含A的基序(底部)。所示序列两者均为SEQ ID NO.139。(B)在将质粒转染到HeLa细胞中后，进行Northern印迹以检测mascRNA和cGFP mRNA的表达。为了验证用不同构建体进行cGFP mRNA 3’端加工的准确性，在Northern印迹分析之前进行RNase H消化。对于以SV40或bGH poly A位点结尾的cGFP转录物观察到拖尾(smear)，表明添加的poly A尾的长度有所不同。相比之下，对于以MALAT1或MENβ的3’端结尾的cGFP转录物观察到预期大小(190-nt)的清晰条带，表明在RNase P切割后没有添加另外的核苷酸。(C)进行Western印迹以检测转染质粒的cGFP蛋白表达。使用黏着斑蛋白作为上样对照。结果表明MALAT1和MENβ的3’端支持类似的翻译水平。
[0049] 图11示出了富含U的基序和富含A的基序对稳定细胞核中MALAT1的3’端是关键的。(A)将富含U的基序1、富含U的基序2或富含A的段中之突变(红色所示)引入CMV-核斑F2-mMALAT1_3’表达质粒中，从而产生如图2C中所示的核滞留长转录物。所示序列从上到下为SEQ ID NO.85、86、141和142。(B)将野生型(WT)或突变CMV-核斑F2-mMALAT1_3’表达质粒转染到HeLa细胞中。还使用CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒作为对照(泳道2)。然后，进行Northern印迹以检测mascRNA和核斑F2-MALAT1_3’转录物(或泳道2中的cGFP-MALATl_3’转录物)的表达。在Northern印迹分析之前进行RNase H消化以验证长核斑F2-MALAT1_3’转录物的3’端准确产生并且在转录后没有添加另外的核苷酸。由于通过Northern分析检测不到核斑F2-MALAT1_3’突变转录物，因此我们推断富含U的基序和富含A的基序均是稳定细胞核中MALAT1所需要的。(C)使用连接介导的
3’RACE方法检测正经历降解之核斑F2-MALAT1_3’转录物的3’端。检测到三个代表尿苷化衰变中间体的克隆(在所测序的15个中)，表明尿苷化还发生在细胞核中。所示序列从上到下为SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.143至SEQ ID NO.145。有趣的是，在添加短U尾之前，这三个尿苷化转录物已被从3’端显著降解。
3’RACE方法检测正经历降解之核斑F2-MALAT1_3’转录物的3’端。检测到三个代表尿苷化衰变中间体的克隆(在所测序的15个中)，表明尿苷化还发生在细胞核中。所示序列从上到下为SEQ ID NO.85和SEQ ID NO.143至SEQ ID NO.145。有趣的是，在添加短U尾之前，这三个尿苷化转录物已被从3’端显著降解。
[0050] 图12示出了表明MALAT1 3’端的基序协作确保转录物稳定性的突变分析。(A)产生在MALAT1的3’端区中包含多个缺失的CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒。＊表示各个构建体中缺失的核苷酸。所示序列从上到下为SEQ ID NO.146至SEQ ID NO.160。(B)将包含复合突变的多种CMV-cGFP-mMALAT1_3’质粒转染到HeLa细胞中并在24小时后分离总RNA。然后，进行Northern印迹以检测mascRNA或cGFP-MALAT1的表达。在对cGFP-MALAT1 RNA进行Northern印迹分析之前，进行RNase H消化以确认各个构建体之RNase P加工的准确性。有趣的是，cGFP-MALATl_3’转录物是稳定的，表明保守茎环中仅10nt是RNA稳定性所需要的。然而，当试图从Comp.1转录物缺失另外的核苷酸(以产生Comp.2、Comp.3、Comp.4或Comp.5)时，cGFP-MALATl_3’转录物变得不稳定。然而，如果保守茎环中存在18个或更多个核苷酸的话(Comp.12)，则可将另外的核苷酸从MALAT13’端的其他部分缺失。发现，保守茎环中以及富含U的基序2与富含A的段之间区域中的核苷酸冗余协作(redundantly cooperate)以确保MALAT1 RNA的稳定性，可能通过确保达到结构稳定性的阈值来实现。然而，重要的是指出三螺旋构造在确保MALAT1 3’端的稳定性中发挥关键得多的作用。
[0051] 图13示出了富含U的基序2与富含A的段之间的碱基配对是稳定MALAT1的3’端所必需的。(A)将富含U的基序2中的突变引入CMV-cGFP-mMALAT1_3’质粒中以破坏富含U的基序2与富含A的段之间所选的碱基对。这些质粒中均存在全174-nt mMALAT1_3’区，但仅示出了富含U的基序2。在mMALAT1_3’Comp.14的二级结构预测中，将图B每个泳道中突变的核苷酸以紫色表示。所示序列从上到下为SEQ ID NO.161至SEQ ID NO.168和SEQ ID NO.101。(B)将野生型(WT)或突变质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。在进行Northern印迹检测cGFP-MALAT1_3’RNA之前，进行RNase H处理。除离MALAT1 3’端最远的U-A碱基对之外(Mut U2.5，泳道9)，富含U的基序2与富含A的段之间的所有碱基对在体内稳定MALAT1 3’端中均发挥显著作用。
[0052] 图14示出了MALAT1 3’端的结构模型。(A)全长(nt 1-59)MALAT1Comp.14 3’端的5个单独模型的轮廓图(overlay)。模型以动画表示示出并以蓝色、红色、绿色、橙色和品红色着色。(B)以蓝色着色模型的5’端的近视图(来自图A)。将三螺旋的第一个碱基三联体通过其Watson-Crick和Hoogsteen碱基对标出。将G-5与A-45之间的可能氢键以橙色表示，突出了该区域5’端通过富含U的基序2与富含A的段之间的环稳定的可能性。(C)通过Rosetta从头RNA折叠(Rosetta de novo RNA folding)产生的2,000个MALAT1 Comp.14 3’端模型(缺乏nt 1-5)的散点图。该图示出了所有模型与参考模型的距离(X轴上)(以 计)和单个结构的评分(Y轴上)。
[0053] 图15示出了MALAT1三螺旋支持蛋白质的有效翻译。(A)在用指定的双色荧光报道载体转染HeLa细胞后(每幅图均指出mCherry的下游序列)，使用流式细胞术确定每个细胞的原始eYFP和mCherry强度。模拟转染样品显示出所观察到的eYFP和mCherry的背景(自体荧光)水平。在随后的所有分析中，将表达背景水平荧光的细胞移除，如材料和方法(Materials and Methods)中所述。(B至D)比较转染有双色载体之每个细胞的eYFP和mCherry强度的散点图，其中mCherry以SV40多腺苷酸化信号或指定的WT/突变mMALAT1_3’区结尾。将只表达背景水平荧光的细胞移除。(E)在Northern印迹分析之前进行RNase H消化以验证用多个构建体进行mCherry mRNA 3’端加工的准确性。对于以SV40poly A位点结尾的mCherry转录物观察到拖尾，表明添加的poly A尾的长度有所不同。相比之下，对于以mMALAT1_3’区结尾的mCherry观察到预期大小(180-nt)的清晰条带，表明在RNase P加工之后没有添加另外的核苷酸。
[0054] 图16示出了以MALAT1三螺旋结尾的转录物被微RNA有效地抑制。在用指定的双色荧光报道载体转染HeLa细胞后(每幅图均指出mCherry的下游序列)，使用流式细胞术确定每个细胞的原始eYFP和mCherry强度。mCherry转录物以SV40多腺苷酸化信号(A)或mMALAT1_3’区(B)结尾。将只表达背景水平荧光的细胞从所有分析中移除并不示出。
[0055] 图17示出了其他高度结构化之RNA尾可稳定长转录物的3’端。(A)为了测试其他高度结构化的RNA尾是否可以足够稳定长cGFP转录物的3’端，将RNase P切割位点上游的MALAT1区(包含形成三螺旋的富含U和富含A的基序)用经充分表征的核糖开关(riboswitch)序列替换(Serganov等2004；Klein和Ferre-D’Amare 2006；Montange和Batey2006；Sudarsan等2008)。所示序列为SEQ ID NO.139。由于紧邻核糖开关3’端下游存在mascRNA tRNA样结构，因此RNase P切割产生以体内核糖开关序列结尾的成熟cGFP转录物。(B)将以mMALAT1_3’区或核糖开关+mascRNA结尾的CMV-cGFP质粒转染到HeLa细胞中并进行Northern印迹。在进行Northern印迹检测cGFP mRNA之前进行RNase H处理。在5个所测试的核糖开关中，发现只有传感葡糖胺-6-磷酸的腾冲嗜热菌(T.tengcongensis)glmS催化性核糖开关能够稳定cGFP信使的3’端，但是比MALAT1三螺旋弱很多。(C)Western印迹显示腾冲嗜热菌glmS核糖开关还较弱地支持翻译。所测试的结构基序表明这种体内表达系统为筛选足以稳定RNA转录物3’端的RNA序列提供了一种理想的方法。
[0056] 图18示出了本发明RNA的半衰期测量。上图是Northern印迹的照片，下图是表示HeLa细胞中以三螺旋结尾之cGFP转录物的半衰期的数据的图，为5小时左右。
[0057] 图19是显示在间充质细胞中含有三螺旋的mRNA翻译的示意图和图。(19A)两色荧光报道子表达系统的示意图。(19B)将两色表达质粒瞬时转染到小鼠的间充质干细胞中并使用流式细胞术测量单个细胞中的mCherry和eYFP蛋白表达。所示为在来自一个代表性实验(n＝3)的单独转染细胞中测量的mCherry与eYFP蛋白表达之比的盒状图(水平线，中值；盒，第25百分位至第75百分位；误差条，1.5x四分位距)。(19C)比较转染有双色载体之每个细胞的eYFP和mCherry强度的散点图，其中mCherry以SV40多腺苷酸化信号或指定的mMALAT1_3’区结尾。将只表达背景水平荧光的细胞移除。
[0058] 图20是证明三螺旋可位于多个不同mRNA的3’端并支持翻译的示意图和图组。(20A)L1 mRNA的示意图(由Beck等2011改良而来)。尽管L1mRNA通常以poly(A)尾结尾(顶部，如SEQ ID NO.174所示)，但产生了另外的构建体，其中L1多腺苷酸化信号被mMALAT1_3’区替换以允许成熟L1转录物以三螺旋结尾(底部)。(20B)用表达GFP的对照载体或表达以poly(A)尾或三螺旋结尾之L1mRNA的基于附加体的载体转染HeLa细胞。进行Northern印迹以检测L1mRNA的表达，每个泳道使用15μg总RNA。(20C)在Northern印迹分析之前进行RNase H消化以验证L1 mRNA的3’端得以准确产生。对以三螺旋结尾的L1mRNA观察到单一条带，而以poly(A)尾结尾的L1 mRNA则产生从约300nt延伸到约400nt的拖尾。(20D)进行Western印迹以检测来自经转染表达载体的ORF1和ORF2蛋白的表达。
使用p110作为上样对照。(20E)使用免疫荧光来检测经转染HeLa细胞中ORF1和ORF2蛋白的表达。
使用p110作为上样对照。(20E)使用免疫荧光来检测经转染HeLa细胞中ORF1和ORF2蛋白的表达。
[0059] 图21是显示以三螺旋结尾的体外转录GFP mRNA可在体外进行翻译的图。将等量7
的体外转录的加帽(5’-mGpppG)荧光素酶mRNA在野生型酵母提取物中孵育。所示为在其
3’端以poly(A)尾终止的荧光素酶mRNA、野生型MALAT1三螺旋或Comp.27突变MALAT1三螺旋。示出了来自加帽mRNA翻译的平均荧光素酶活性。误差条表示标准偏差。
的体外转录的加帽(5’-mGpppG)荧光素酶mRNA在野生型酵母提取物中孵育。所示为在其
3’端以poly(A)尾终止的荧光素酶mRNA、野生型MALAT1三螺旋或Comp.27突变MALAT1三螺旋。示出了来自加帽mRNA翻译的平均荧光素酶活性。误差条表示标准偏差。
[0060] 发明详述
[0061] 通常，长RNA聚合酶II转录物以在转录后添加的多腺苷酸(poly-A)尾结尾，其是RNA稳定性和蛋白质有效翻译所需要的。当不存在poly A尾时，转录物一般在细胞中被迅速降解。本文描述了用于产生缺乏poly A尾但仍稳定并被有效翻译之转录物的方法。本发明至少部分地以以下发现为基础：RNA的poly A尾可被在不存在poly A尾的情况下增强RNA稳定性的功能末端结构域或序列替代，并且在一些实例中，所述功能末端结构域或序列甚至增强该RNA内编码的蛋白质的翻译。
[0062] 例如，本文提供的实施例中证明了衍生自MALAT1长非编码RNA和MENβ长非编码RNA的序列以及其突变和修饰的用途，当其转录成RNA时折叠成三螺旋结构，接着是tRNA样结构。MALAT1基因座在很多人类癌症中被错误调控并产生大量核滞留的长非编码RNA。尽管通过RNA聚合酶II进行转录，但是通过规范的切割/多腺苷酸化不产生MALAT1的3’端，而替代地通过RNase P识别并切割tRNA样结构产生MALAT1的3’端。因此，成熟的MALAT1缺乏poly A尾，但其表达水平却比很多体内蛋白质编码基因高。通过内切核酸酶RNase P在其5’端识别并有效切割tRNA样结构，从而在体内产生不是poly A，但替代地在其3’端具有三螺旋的成熟转录物。
[0063] RNase P切割同时产生约6.7-kb MALAT1非编码RNA的成熟3’端和小tRNA样转录物的5’端(图1A)。成熟的MALAT1转录物在其3’端具有短富含A的段(Wilusz等2008；Wilusz和Spector 2010)。不同于在转录后添加，如发生在多腺苷酸化期间，MALAT1poly A尾样部分被编码在基因组中，并且因而是新生转录物的一部分(图1A)。从人到鱼，该富含A的基序以及两个富含U的上游基序和茎环结构在进化上是高度保守的(图1B)。MENβ核滞留的长非编码RNA(也称为NEAT1_2)的3’端存在类似的高度保守的富含A和富含U的基序，其也通过RNase P在其3’端进行加工(Sunwoo等2009)(图1C)。然而，这些基序的功能以及通过其保护MALAT1和MENβ的3’端以允许转录物积累至高水平的分子机制在本发明之前是未知的。
[0064] 在一些方面，本发明涉及杂合体RNA、用于表达所述RNA的表达载体及其使用方法。所述杂合体RNA有效地重演(recapitulate)体内MALAT1 3’端加工，其中，例如，高度保守的富含A和富含U的基序在其3’端形成三螺旋结构。所述三螺旋的形成不影响RNase P加工或mascRNA生物发生，反而对于保护MALAT1的3’端免受3’-5’外切核酸酶是重要的。出人意料的是，当MALAT1或MENβ的3’端位于开放阅读框下游时(如实施例中所示)，尽管不存在poly A尾，但转录物在体内被有效翻译。因此，三螺旋结构强烈地促进RNA的稳定性和翻译两者，表明这些长非编码RNA可与蛋白质合成机器相互作用或者甚至在某些条件下被翻译。此外，使用突变分析来显示RNA稳定性和翻译控制功能可以分开。由于该表达系统提供了用来体内产生缺乏poly A尾之稳定转录物的独特方式，因此我们探究了poly A尾在微RNA介导的抑制中的作用。本发明涵盖这些及另一些研究方法。这些结果在以下方面提供了重要的新认识：如何稳定、调控缺乏poly A尾的MALAT1、MENβ及其他可能转录物，并因而使其能够执行重要的细胞功能。
[0065] 三螺旋结构足以有效稳定体内成熟非poly A RNA的3’端。此外，以三螺旋结尾的转录物在体内被有效翻译以产生蛋白质。末端序列或结构域可用于构建多种缺乏poly A尾的稳定RNA分子。这些稳定RNA分子可在体内由表达载体产生。如下文实施例中所证明的，转录的RNA随后被递送到细胞质并有效地产生蛋白质。根据本发明，在一些情况下，使用核RNA。在这些情况中，RNA留在细胞核中，在细胞核中其具有功能。
[0066] 由于tRNA样结构/RNase P切割位点上游的序列可被任何其他序列替换，因此本发明的方法可用于产生在其3’端具有任何期望序列的成熟RNA。这些序列可例如响应于某些刺激而调控RNA稳定性和/或翻译，从而产生调控的基因表达。本文所述的方法和构建体能够研究poly A尾的作用以及替代表达机制和在一些情况下的体内调控表达机制的设计。
[0067] 因此，在一些实施方案中，本发明是由与异源RNA稳定化末端序列连接的RNA分子构成的杂合体核酸。所述RNA分子可以是任何天然存在的形式或合成RNA，但其缺乏poly A尾。本文使用的poly A尾指8、9、10、11、12或更多个连续A的核酸。通常，从细胞核输出到细胞质的RNA(细胞质RNA)包含poly A尾。在没有poly A尾的情况下，RNA高度不稳定。通过用本发明的末端序列替代poly A尾，RNA得以稳定并使翻译增强，从而导致RNA产生特异性蛋白质。所述RNA分子包括例如mRNA或非编码RNA以及细胞质RNA和核RNA。mRNA通常对应于蛋白质。根据本发明方法的目的，RNA对应的蛋白质可以是治疗性蛋白质或诊断性蛋白质或报道蛋白或其他研究蛋白质，例如绿色荧光蛋白。
[0068] 所述RNA分子可以是对应于来自任何类型物种或生物体的RNA分子并包括其任何化学或天然修饰的RNA分子。例如，所述RNA可以是真核生物RNA、哺乳动物RNA、植物RNA或更特别地为人RNA。RNA的具体类型将取决于所述RNA的用途。例如，如果RNA将用于研究哺乳动物细胞中特定蛋白质的表达效果，那么所述RNA可对应于该类型的哺乳动物。在另一些情况下，可在人中体内表达RNA以用于治疗目的。在此情况下，理想的是表达人RNA。
[0069] 化学和天然修饰在本领域中是公知的。这样的修饰包括，例如，设计来增加与靶链结合(即，升高其解链温度)的修饰、设计来帮助鉴定寡核苷酸或寡核苷酸-靶标复合物的修饰、设计来增加细胞渗透的修饰、设计来针对核酸酶和降解或干扰寡核苷酸结构或活性的其他酶进行稳定化的修饰、设计来一旦与靶标序列特异性结合就提供破坏模式(终止事件)的修饰以及设计来改善寡核苷酸药代动力学性质的修饰。
[0070] 修饰包括，但不限于，例如(a)末端修饰，例如5’端修饰(磷酸化、去磷酸化、缀合、反向键合(inverted linkage)等)、3’端修饰(缀合、DNA核苷酸、反向键合等)；(b)碱基修饰，例如，用经修饰的碱基、稳定化碱基、去稳定化碱基或与配偶体延伸的所有组成成分碱基配对的碱基或共轭碱基替换；(c)糖修饰(例如在2’位或4’位)或糖替换；以及(d)核苷间键修饰，包括修饰或替换磷酸二酯键。在这些修饰干扰翻译的程度上(即，导致相对于缺乏修饰的翻译减少50％、60％、70％、80％或90％或更多-例如，在兔网织红细胞体外翻译测定中)，这些修饰可能不适用于本文所述的方法和组合物。
[0071] 经修饰的核苷间键的非限制性实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基膦酸酯(包括3’-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3’-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯)、硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidate)、硫羰烷基膦酸酯、硫羰烷基磷酸三酯，和具有正常3’-5’键的硼烷磷酸酯、这些的2’-5’连接类似物以及具有反向极性的那些，其中核苷单元的邻近对是连接的3’-5’到5’-3’或2’-5’到5’-2’。还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。
[0072] 其中不包含磷原子的经修饰的核苷间键具有这样的核苷间键，其由以下形成：短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或者一个或更多个短链杂原子或杂环核苷间键。这些包括具有吗啉代键(由核苷的糖部分部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰乙酰基(formacetyl)和硫代甲酰乙酰基骨架；亚甲基甲酰乙酰基和硫代甲酰乙酰基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架的那些；和具有混合的N、O、S和CH2组成部分的其他。
[0073] 取代的糖部分包括，但不限于在2’位的下列之一：H(脱氧核糖)；OH(核糖)；F；O-、S-或N-烷基；O-、S-或N-烯基；O-、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中烷基、烯基和炔基可以是取代或未取代的CI至CIO烷基或C2至CIO烯基和炔基。
[0074] 经化学或天然修饰的RNA可包括，例如至少一个在糖之2’位修饰的核苷酸，最优选2’-O-烷基、2’-O-烷基-O-烷基或2’-氟-修饰的核苷酸或末端帽。在另一些实施方案中，RNA修饰包括在RNA 3’端的嘧啶、脱碱基残基或反向碱基的核糖上的2’-氟、2’-氨基和2’O-甲基修饰。
[0075] 根据本发明可用的RNA可包括单个经修饰的核苷。在另一些实施方案中，所述RNA可包括至少两个经修饰的核苷，至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少15、至少20、或更多个核苷，最多为寡核苷酸的整个长度。
[0076] 核苷或核碱基包括天然的嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。经修饰的核苷包括其他合成和天然的核碱基，例如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、异鸟苷(isoguanisine)、tubercidine、2-(卤代)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、7(去氮)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、
8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(巯基)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6(甲基)腺嘌呤、N6，N6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6(甲基)鸟嘌呤、7(烷基)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7(去氮)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8(卤代)鸟嘌呤，8-(羟基)鸟嘌呤、8(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(巯基)鸟嘌呤、N(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3(去氮)5(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(卤代)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍基烷基(guanidiniumalkyl))尿嘧啶、5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5羟乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，
4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的
2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮
杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩 嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻
嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟
基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫
代)-3-(氮杂)-吩 嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻
嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩 嗪-1-基、7-(胍基烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩
噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1，3，
5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、tubercidine、异鸟苷(isoguanisine)、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-去氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)isocarbostyrilyl、
5-(甲基)isocarbostyrilyl、3-(甲基)-7-(丙炔基)isocarbostyrilyl、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、isocarbostyrilyl、7-(丙炔基)isocarbostyrilyl、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2，
4，5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、均二苯乙烯基、并四苯基、并五苯基、diiluorotolyl、4-(iluoro)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2，6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、取代的1，2，4-三唑、吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、对-取代的-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、邻-取代的-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-取代的-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基
烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧
啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并
嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化的衍生物。
8-(卤代)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(巯基)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6(甲基)腺嘌呤、N6，N6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6(甲基)鸟嘌呤、7(烷基)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7(去氮)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8(卤代)鸟嘌呤，8-(羟基)鸟嘌呤、8(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(巯基)鸟嘌呤、N(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3(去氮)5(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(卤代)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2，4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2，4(二硫代)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍基烷基(guanidiniumalkyl))尿嘧啶、5(1，3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤代)尿嘧啶、5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5羟乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2，4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2，
4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2，4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的
2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2，4-(二硫代)假尿嘧啶、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩嗪-1-基、1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮
杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩 嗪-1-基、7-取代的1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻
嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟
基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫
代)-3-(氮杂)-吩 嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻
嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩 嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩 嗪-1-基、7-(胍基烷基-羟基)-1，3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩
噻嗪-1-基、7-(胍基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1，3，
5-(三氮杂)-2，6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、nubularine、tubercidine、异鸟苷(isoguanisine)、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-去氮-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)isocarbostyrilyl、
5-(甲基)isocarbostyrilyl、3-(甲基)-7-(丙炔基)isocarbostyrilyl、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、isocarbostyrilyl、7-(丙炔基)isocarbostyrilyl、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2，
4，5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4，6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、均二苯乙烯基、并四苯基、并五苯基、diiluorotolyl、4-(iluoro)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2，6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、取代的1，2，4-三唑、吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、对-取代的-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、邻-取代的-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻-取代的-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、对-(氨基
烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧
啶-2-酮-3-基、双-邻-(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并
嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化的衍生物。
[0077] 杂合体RNA的末端序列或用于表达所述RNA的载体通常是具有三螺旋结构的异源RNA稳定化末端序列。在用于RNA的3’端或“RNA稳定化末端序列”的情况时，本文使用的术语“异源”指不是在天然存在RNA的3’端发现的天然存在序列的任何核苷酸序列。长RNA聚合酶II转录物3’端的poly A尾用于确保成熟RNA是稳定的、被输出到细胞质并被有效翻译(综述于Zhao等1999)。根据本发明，已证明MALAT1和MENβ长非编码RNA 3’端的三螺旋结构可在功能上替代poly A尾。还已证明，类似的三螺旋结构也可替代poly A尾。除支持转录物的稳定性之外，这些三螺旋结构还支持报道转录物的有效输出(图2B)和翻译(图5)。然而，当转录物中其他位置的核滞留信号(图2C)以某种方式覆盖3’端存在的任何输出信号时，实例中的内源非编码RNA不被输出。基于产生不被有效翻译之稳定和输出转录物的突变的鉴定，已将归因于三螺旋区的多种功能彼此分开。
[0078] PAN(多腺苷酸化核)RNA是一种由Kaposi肉瘤相关孢疹病毒产生的丰富的长非编码RNA，此前，已显示在其3’端也具有三螺旋(Mitton-Fry等2010)。不同于MALAT1和MENβ，PAN RNA进行规范的切割/多腺苷酸化并结合PABP(Borah等2011)。尽管如此，在PAN RNA poly A尾部分与在poly A尾上游约120nt的富含U的区域之间形成5个连续的U-A·U碱基三联体(Mitton-Fry等2010)。该三螺旋的形成抑制RNA衰变并已提出其是PAN RNA的核滞留所需要的。相比之下，我们发现MALAT1/MENβ三螺旋对核滞留而言并不是关键的(图2B)。使用PAN RNA三螺旋结构作为指导，最近的计算工作已鉴定出6个可能形成三螺旋的另外的转录物，但是它们中的两个单纯地是相关γ孢疹病毒中的PAN RNA同源物(Tycowski等2012)。该研究中没有鉴定出MALAT1和MENβ三螺旋，可能是由于与PAN RNA三螺旋相比，这些结构具有细微差别。考虑到碱基三联体可通过转录物初级序列中彼此远离的核苷酸形成(或者甚至在分开的独立转录物上被编码)，根据本发明还预期另外的功能性RNA三螺旋，并且所述另外的功能性RNA三螺旋包括在本发明内。
[0079] 因此，除组蛋白茎环结构和MALAT1/MENβ三螺旋之外，其他的RNA结构基序也可能能够在功能上替代poly A尾。例如，已知tRNA样结构稳定许多单链RNA病毒的3’端，例如芜菁黄花叶病毒(Turnip Yellow Mosaic Virus)和噬菌体Qβ(综述于Fechter等2001)。实施例中所示的工作涉及筛选其他的稳定化RNA结构。使用那些筛选，已通过将RNase P切割位点上游的MALAT1区用多种核糖开关的序列替换产生了经修饰的CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达质粒，核糖开关是结合细胞代谢物并通常折叠成精细结构的RNA元件(综述于Serganov和Patel 2012中)(数据示于实施例中)。由于紧邻核糖开关3’端的下游存在mascRNA tRNA样结构，因此RNase P切割体内产生以核糖开关序列结尾的成熟cGFP转录物。有趣的是，传感葡糖胺-6-磷酸的腾冲嗜热菌glmS催化核糖开关(Klein和Ferre-D’Amare 2006)能够稳定cGFP信使的3’端并支持翻译，但是与用MALAT1三螺旋所获得的效果相比，其效果较弱。尽管如此，这些结果证明确实存在多种足以稳定非多腺苷酸化转录物3’端的RNA序列。本发明还包括用于体内筛选以鉴定另外的序列的方法。
[0080] 因此，异源RNA稳定化末端序列可以是MALAT1末端序列或MENβ末端序列或其功能变体。变体可来自本文中提供基因的选择性剪接或等位基因变化。一般情况下，同源物和等位基因通常将分别与已知的三螺旋形成核酸和多肽的序列具有至少90％核苷酸同一性和/或至少95％氨基酸同一性；在一些情况下，将具有至少95％核苷酸同一性和/或至少97％氨基酸同一性；在另一些情况下，将具有至少97％核苷酸同一性和/或至少98％氨基酸同一性；在另一些情况下，将具有至少99％核苷酸同一性和/或至少99％氨基酸同一性；
并且在另一些情况下，将具有至少99.5％核苷酸同一性和/或至少99.5％氨基酸同一性。
可使用多种本领域中已知的可公开获得的软件工具计算同源性，例如由NCBI(Bethesda，Maryland)开发的那些工具，这些工具均可通过互联网获得。示例性工具包括由国立卫生研究院(National Institutes of Health)的国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站可得的BLAST系统(例如，使用默认的核酸(Blastn)或蛋白质(Blastp)检索参数)。
并且在另一些情况下，将具有至少99.5％核苷酸同一性和/或至少99.5％氨基酸同一性。
可使用多种本领域中已知的可公开获得的软件工具计算同源性，例如由NCBI(Bethesda，Maryland)开发的那些工具，这些工具均可通过互联网获得。示例性工具包括由国立卫生研究院(National Institutes of Health)的国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的网站可得的BLAST系统(例如，使用默认的核酸(Blastn)或蛋白质(Blastp)检索参数)。
[0081] 或者，异源RNA稳定化末端序列可以是富含U或富含A的序列或其组合。本文使用的富含U的序列指包含至少5个紧邻的U，并且在一些实施方案中包含5个连续U的核苷酸序列组。本文使用的富含A的序列指包含至少5个紧邻的A，并且在一些实施方案中包含5个连续A的核苷酸序列组。所述末端序列可包含多个富含U和/或富含A的序列或基序。例如，末端序列可包含2、3或4个富含U的序列和/或2、3或4个富含A的序列或其任意组合。优选地，所述富含U和/或富含A的序列以将产生三螺旋结构的方式排列。
[0082] 所述末端序列可类似地由富含C和/或富含G的序列构成。本文使用的富含C的序列指包含至少5个紧邻的C，并且在一些实施方案中包含5个连续C的核苷酸序列组。本文使用的富含G的序列指包含至少5个紧邻的G，并且在一些实施方案中包含5个连续G的核苷酸序列组。所述末端序列可包含多个富含C和/或富含G的序列或基序。例如，末端序列可包含2、3或4个富含C的序列和/或2、3或4个富含G的序列或其任意组合。优选地，所述富含C和/或富含G的序列以将产生三螺旋结构的方式排列。
[0083] 所述末端序列还可具有配体结合结构域。配体结合结构域是对配体的存在或不存在敏感的结构域。当存在配体时，RNA可被激活或抑制。或者，当不存在配体时，RNA可被激活或抑制，这取决于所述RNA中的特定配体和元件。在一些情况下，所述配体结合结构域具有组织特异性元件。例如，所述配体可对特定类型的癌症具有特异性，并且可在该特定类型癌症的存在下被激活或抑制。
[0084] 可使用载体表达本发明的RNA。可将核酸在载体中递送和/或有效地与异源启动子和转录终止子连接以使基因有效表达。表达载体是可将期望序列插入到其中的载体，例如通过限制和连接使得其有效地与调控序列连接并可作为RNA转录物表达。载体还可包含适用于鉴定是否已转化或转染有所述载体的细胞或用于研究末端序列和杂合体RNA的表达和作用的一个或更多个标志物序列。标志物包括，例如编码增加或降低对抗生素或其他化合物的抗性或敏感性之蛋白质的基因、编码其活性可通过本领域中已知的标准测定检测的酶的基因(例如，β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶)和明显影响经转化或转染细胞、宿主、菌落或噬斑之表型的基因(例如，绿色荧光蛋白)。
[0085] 用于鉴定和获得用在本文公开的方法中之核酸序列的方法在本领域中是常规的。例如，技术人员可使用靶标的GeneID或GeneAlias检索Entrez基因数据库(Entrez Gene database)以鉴定用于产生本文所述之杂合体RNA或载体的RNA序列。在大多数情况下，Entrez Gene网页界面中提供了含有cDNA的转录物的供应商(例如，Open Biosystems)的连接，可利用其获得拷贝cDNA克隆。在另一些情况下，可直接联系商业来源(例如Sigma Aldrich)。
[0086] 克隆载体是这样的载体，其能够在宿主细胞中复制并且其特征还在于一个或更多个限制性内切核酸酶位点，在这些限制性内切核酸酶位点处可将载体以确定方式切割并且可将期望的DNA序列连接到其中使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。表达载体是可将期望DNA序列通过限制和连接插入到其中，使得其有效地与调控序列连接并可作为RNA转录物表达的载体。
[0087] 如本文所使用的，当编码序列和调控序列以使所述编码序列的表达或转录置于所述调控序列的影响或控制之下的方式共价连接的话，将它们称作“有效地连接”。如本文所使用的，“有效地相连”(operably joincd)和“有效地连接”(operably linked)可交替使用并且应解释为具有相同的含义。如果编码序列被理想地翻译成功能蛋白质，那么如果5’调控序列中启动子的诱导导致编码序列转录并且如果两个DNA序列之间的连接性质(1)不导致引入移码突变、(2)不干扰启动子区指导编码序列转录的能力或(3)不干扰相应的RNA转录物被翻译成蛋白质的能力的话，则称两个DNA序列有效地连接。因此，如果启动子区能够影响该DNA序列转录使得产生的转录物可被翻译成期望的蛋白质或多肽的话，则所述启动子区与编码序列有效地连接。
[0088] 基因表达所需的调控序列的准确性质可在物种或细胞类型之间有所不同，但大致上应包括(必要时)分别参与转录和翻译起始的5’非转录和5’非翻译序列，例如TATA框、加帽序列、CAAT序列等。通常，这样的5’非转录调控序列将包含启动子区，启动子区包含用于有效连接的基因之转录控制的启动子序列。如果需要，调控序列还可包含增强子序列或上游激活序列。本发明的载体可任选地包含5’前导或信号序列。合适载体的选择和设计在本领域普通技术人员的能力和判断内。
[0089] 在一些实施方案中，用于递送核酸分子的病毒载体选自腺病毒、腺相关病毒、痘病毒(包括痘苗病毒和减毒的痘病毒)、Semliki森林病毒(Semliki Forest virus)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equine encephalitis virus)、逆转录病毒、辛德比斯病毒(Sindbis virus)和Ty病毒样颗粒。已用于递送外源核酸的病毒和病毒样颗粒的实例包括：复制缺陷型腺病毒(例如，Xiang等，Virology 219：220-227，1996；Eloit等，J.Virol.7：5375-5381，1997；Chengalvala等，Vaccine 15：335-339，1997)、经修饰的逆转录病毒(Townsend等，J.Virol.71：3365-3374，1997)、非复制型逆转录病毒(Irwin等，J.Virol.68：5036-5044，1994)、复制缺陷型Semliki森林病毒(Zhao等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：3009-3013，1995)、金丝雀痘病毒(canarypox virus)和高度减毒的痘苗病毒衍生物(Paoletti，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11349-11353，1996)、非复制性痘苗病毒(Moss，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：11341-11348，1996)、复制型痘苗病毒(Moss，Dev.Biol.Stand.82：55-63，1994)、委内瑞拉马脑炎病毒(Davis等，J.Virol.70：3781-3787，1996)、辛德比斯病毒(Pugachev等，Virology212：587-594，1995)、慢病毒载体(Naldini L，等，Proc Natl Acad Sci U S A.1996年10月15日；93(21)：11382-8)和Ty病毒样颗粒(Allsopp等，Eur.J.Immunol 26：1951-1959，1996)。
[0090] 可用于某些应用的另一种病毒是腺相关病毒，其是一种双链DNA病毒。腺相关病毒能够感染广泛范围的细胞类型和物种并且可被改造成复制缺陷型。其还具有以下优点：例如热和脂质溶剂稳定性、在多样谱系的细胞(包括造血细胞)中的高转导频率以及缺乏超感染抑制作用从而允许多重系列的转导。腺相关病毒可以以位点特异性方式整合到人细胞DNA中，从而使插入诱变的可能性和插入基因表达的可变性最小化。此外，野生型腺相关病毒感染在不存在选择压力的情况下已在组织培养中追踪超过100代，表明腺相关病毒基因组整合是一个相对稳定的事件。腺相关病毒还可以以染色体外方式发挥功能。
[0091] 另一些可用病毒载体以其中非必需基因已被目的基因取代的非致细胞病变真核病毒为基础。非致细胞病变病毒包括某些逆转录病毒，其生命周期涉及基因组病毒RNA被逆转录成DNA，随后原病毒整合到宿主细胞DNA中。一般地，逆转录病毒是复制缺陷型的(即，能够指导期望转录物的合成，但不能够制造感染性颗粒)。此类经遗传改变的逆转录病毒表达载体一般用于体内基因的高效转导。用于产生复制缺陷型逆转录病毒的标准方案(包括以下步骤：将外源遗传物质并入质粒中、用质粒转染包装细胞系、通过所述包装细胞系产生重组逆转录病毒、从组织培养培养基收集病毒颗粒并用病毒颗粒感染靶细胞)在Kriegler，M.，“Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual”，W.H.Freeman Co.，New York(1990)和Murry，E.J.Ed.“Methods in Molecular Biology，”第7卷，Humana Press，Inc.，Clifton，New Jersey(1991)中提供。
[0092] 在另一个实施方案中，使用哺乳动物表达载体在哺乳动物细胞中表达本发明的核酸。重组哺乳动物表达载体可能能够指导核酸优先在特定细胞类型中表达(例如，使用组织特异性调控元件来表达核酸)。组织特异性调控元件在本领域中是已知的。合适的组织特异性启动子的非限制性实例包括肌球蛋白重链启动子、白蛋白启动子、淋巴特异性启动子、神经元特异性启动子、胰腺特异性启动子和乳腺特异性启动子。还包括发育调控型启动子，例如鼠hox启动子和甲胎蛋白启动子。
[0093] 本发明还包括用于增强RNA翻译或用于表达RNA的方法。所述方法通过在细胞或生物体中体内表达本文所述的杂合体RNA实现。
[0094] 所述方法可用于治疗对象(也称为生物体)中的疾病。本文使用的对象是哺乳动物，例如人、非人灵长类动物、牛、马、猪、绵羊、山羊、狗、猫或啮齿类动物。在所有实施方案中，优选人对象。根据本发明的方法可治疗的疾病是其中理想地表达稳定形式的RNA和任选的对应所述RNA的蛋白质的任何疾病。
[0095] 本发明的核酸通常是分离的核酸。本文相对于核酸使用的术语“分离的”意指：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)体外扩增的；(ii)通过克隆重组产生的；(iii)纯化的，如通过切割和凝胶分离纯化的；或(iv)通过例如化学合成合成的。分离的核酸是可容易地通过本领域中公知的重组DNA技术操作的核酸。因此，认为其中5’和3’限制性位点已知的载体中包含的核苷酸序列或者对于其的聚合酶链式反应(PCR)引物序列已经公开的核苷酸序列是分离的，而以其天然状态存在于其天然宿主中的核酸序列则不是分离的。分离的核酸可以是基本上纯化的，但不是必需的。例如，在克隆或表达载体内分离的核酸不是纯的，因为其可能包含仅很小百分数之其所在细胞中的物质。然而，当在本文中使用该术语时，这样的核酸也是分离的，因为其可容易地通过本领域普通技术人员已知的标准技术操作。
[0096] 本发明的一些方面涉及用于改变细胞的表型性质的方法。所述方法包括向细胞施用本发明的RNA，从而导致期望的蛋白质在细胞或组织中表达，这样可导致其他蛋白质、核酸或因子的上调、下调、激活或失活，或者甚至将细胞的分化表型改变成另一期望细胞类型的分化表型。由于本发明的方法涉及RNA而非DNA或蛋白质的施用，因此所述方法不会导致永久改变基因组或者具有潜在的意外诱变效应。
[0097] 因为，本发明的一些方面涉及在体外、体内或离体细胞中诱导蛋白质表达以修饰所述细胞。用于引入试剂或诱导基因表达的传统方法利用外源DNA或重组病毒载体。然而，基因治疗方法具有潜在的风险。本发明的方法避免了基因治疗相关的风险并提供了有效的和特异性的蛋白质表达。
[0098] 在一些实施方案中，本发明提供了使用本发明的核酸来治疗疾病的方法。待治疗的疾病类型将取决于被表达的RNA，反之亦然。根据本发明可治疗的疾病包括但不限于增殖性疾病、自身免疫病、神经变性疾病、心血管疾病、肌病、脂质体贮积病(liposomal storage disease)、皮肤病、与遗传缺陷或功能丧失相关的疾病以及感染性疾病。
[0099] 本发明的RNA还可用于在细胞中表达蛋白质以改变所述细胞的一个或更多个表型性质。例如，所述蛋白质可参与组织产生或再生，或者其可以是用于治疗疾病的治疗性蛋白质或抑制性蛋白质。例如，所述蛋白质可用于治疗癌症或其他的增殖性病症、神经变性疾病、自身免疫病、心血管疾病、肌肉疾病和病症。
[0100] 因此，所述方法可用于将编码目的蛋白的RNA递送至细胞以用于治疗对象中的疾病或病症。例如，所述方法可用在用于体内蛋白质替代治疗的方法中。在一些实施方案中，在用于治疗在其中期望蛋白质表达的多种不同疾病的方法中，可将本发明之编码目的蛋白的RNA递送至用于体内蛋白质表达的组织和/或器官。例如，涉及功能丧失的疾病(例如肌营养不良、囊性纤维化或涉及特定蛋白质之低水平蛋白质表达的另一些疾病)可根据本发明治疗。
[0101] 因此，在一些实施方案中，所述方法和组合物可用在用于治疗肌营养不良的方法中。肌营养不良表示肌肉的遗传性疾病家族。一些形式影响儿童(例如，Duchenne营养不良)并且在20至30年内是致命的。成年形式趋向较缓慢地进展。已鉴定出对于多种肌营养不良的基因，包括Duchenne营养不良(由肌养蛋白基因中的突变引起)以及青少年和成年发作的Miyoshi营养不良或其变化形式、肢带型营养不良2B或LGMD-2B(由dysferlin基因中的突变引起)。这些是阻止相关蛋白质在肌肉中表达从而引起肌肉营养障碍的“功能丧失”突变。将本发明的核酸递送到一个或更多个肌肉组织靶标以替代与疾病相关的缺陷蛋白质。例如，可递送编码肌养蛋白的RNA以用于治疗Duchenne/Becker肌营养不良。或者，可向患有Emery-Dreyfuss肌营养不良的对象施用编码伊默菌素(Emerin)蛋白和/或核纤层蛋白的RNA。
[0102] RNA可全身或局部递送以获得治疗益处。局部施用包括，例如将编码肌养蛋白和/或伊默菌素蛋白和/或核纤层蛋白的RNA递送到与病症特别相关的肌肉组织。例如，疾病与由胸膈弱化而引起的呼吸不足和由弱姿势肌而引起的无法走动有关。对于膈注射，可使用胸腔镜方法将RNA递送到膈肌中。或者，可直接注射到骨骼肌中，例如可分别直接注射到与维持姿势和大量臂运动(gross arm movement)相关的骨盆带和肩胛带肌中。
[0103] 对于囊性纤维化的治疗，可向对象的组织(例如，膈)施用编码CFTR蛋白的RNA。在一些实施方案中，可将编码CFTR的RNA通过直接实质注射和/或支气管内注射进行递送。
[0104] 所述方法还可用于治疗心血管疾病。心血管疾病包括但不限于充血性心力衰竭、心肌病、心肌梗死、组织缺血、心脏缺血、血管病、后天性心脏病、先天性心脏病、动脉粥样硬化、心肌病、功能障碍性传导系统、功能障碍性冠状动脉、肺听高压(pulmonary heard hypertension)、冠状动脉病、心肌梗死、心肌缺血、动脉粥样硬化、心肌病、特发性心肌病、心律失常、肌营养不良、肌质量异常、肌变性、感染性心肌炎、药物或毒素诱发的肌异常、超敏性心肌炎和自身免疫性心内膜炎。
[0105] 已知很多蛋白质对心脏病的治疗有用。可施用本发明的RNA以在体内产生这些蛋白质从而治疗疾病。用于治疗心血管疾病的蛋白质的实例包括但不限于VEGF多肽(例如人VEGF(hVEGF))、α1抗-胰蛋白酶多肽、促进心细胞存活和/或生长的任何心肌营养因子或生长因子、TGF-β配体(例如激活蛋白A、激活蛋白B)、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子利尿钠因子、胰岛素、白血病抑制因子(LIF)、表皮生长因子(EGF)、TGFα、BMP或cripto途径的产物和细胞分化剂(例如细胞因子和生长因子)。心肌营养因子在本领域中是公知的并且包括但不限于心肌营养剂、肌酸、肉碱和牛磺酸。所述RNA可局部或全身递送，如在本文所述的任何疾病的治疗中。一些局部递送方法的实例包括通过心内膜心肌、心肌外膜、心室内、冠状动脉内(intracoronary)、后窦、动脉内、心包内或静脉内施用途径向对象施用。
[0106] 在一些情况下，根据本发明可治疗的疾病是功能丧失性疾病。功能丧失性疾病是与基因中引起蛋白质功能降低或消除的突变有关的疾病。本文使用的“功能丧失”指基因或基因产物正常活性的降低或消除。活性丧失可由RNA的转录和/或加工减少，基因产物的翻译、稳定性、运输或活性降低或其任意组合引起。功能丧失性基因包括但不限于肿瘤抑制基因或负责DNA修复、细胞分裂周期检查点、细胞运动性、转录调控和凋亡之基因中的突变。肿瘤抑制基因和怀疑是肿瘤抑制基因的基因包括，但不限于，BRCA1、BRCA2、MLH1、MSH2、MSH6、EPHA3、EPHA4、APHB2、INI1、AXIN1、AXIN2、MLL3、EP300、NF1、TP53、APC、VHL、SMAD2、SMAD4、KEAP1、CDKN2A、RBI、MEN、NF2/SCH、PTCH、TGFBR1、TGFBR2、ACVR1B、AVCR2、MRE11、MAP2K4和LKB1/STK11。功能丧失性疾病包括，a-地中海贫血、β-地中海贫血、特纳综合征(Turner Syndrome)、视网膜母细胞瘤。
[0107] 本发明的方法还包括RNA用于治疗神经变性病症的用途。本文使用的术语“神经变性疾病”或“神经变性病症”指可用刺激新神经元产生的药剂逆转、阻止、控制、治疗、改善或消除的任何病症。神经变性病症的实例包括：(i)慢性神经变性疾病，例如家族性和散发性肌萎缩性侧索硬化(分别为FALS和ALS)、家族性和散发性帕金森病(Parkinson’s disease)、亨廷顿病(Huntington’s disease)、家族性和散发性阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)、多发性硬化、橄榄体脑桥小脑萎缩、多系统性萎缩、进行性核上性麻痹、弥漫性Lewy体疾病、皮质齿状核(corticodentatonigral)变性、进行性家族性肌阵挛型癫痫、纹状体黑质变性、扭转张力失常(torsion dystonia)、家族性震颤、唐氏综合征(Down，s Syndrome)、多发性抽动秽语综合征(Gilles de la Tourette syndrome)、哈-施病(Hallervorden Spatz disease)、糖尿病性周围神经病、拳击员痴呆、AIDS痴呆(AIDS Dementia)、年龄相关的痴呆、年龄相关性记忆损伤，和淀粉样变相关的神经变性疾病，例如由与传播性海绵状脑病(克-雅病(Creutzfeldt Jakob disease)、格-施-沙综合症(Gerstmann Straussler Scheinker syndrome)、瘙瘁病和库鲁病)有关的朊病毒蛋白(PrP)引起的那些，和由过量的抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C累积引起的那些(遗传性抑半胱氨酸蛋白酶蛋白C血管病)；以及(ii)急性神经变性病症，例如创伤性脑损伤(例如手术相关的脑损伤)、脑水肿、外周神经损伤、脊髓损伤、利氏病(Leigh′s disease)、吉-巴综合征(Guillain-Barre syndrome)、溶酶体体贮积病症(例如脂褐素病)、阿尔珀斯病(Alper′s disease)、由CNS变性引起的眩晕；由长期酒精或药物滥用引起的病理包括，例如，蓝斑和小脑中的神经元变性；由老化引起的病理，包括导致认知和运动损伤的小脑神经元和皮质神经元变性；和由长期苯丙胺滥用引起的病理，包括导致运动损伤的基底神经节神经元变性；由病灶性创伤引起的病理变化，例如卒中、病灶性缺血、血管功能不全、缺氧缺血性脑病、高血糖症、低血糖或直接创伤；作为治疗性药物和治疗之有害副作用而引起的病理(例如，响应于抗惊厥剂量的NMDA类谷氨酸受体之拮抗剂的扣带和内嗅区皮层神经元变性)和韦-科相关性痴呆(Wernicke Korsakoff’s related dementia)。影响感觉神经元的神经变性疾病，包括弗里德赖希共济失调(Friedreich′s ataxia)、糖尿病、周围神经病和视网膜神经元变性。其他的神经变性疾病包括神经损伤或与脊髓损伤相关的创伤。边缘和皮层系统的神经变性疾病包括脑淀粉样变性、皮克萎缩(Pick′s atrophy)和Retts综合征。前述的实例并不是全面的，而仅作为术语“神经变性病症”的示例说明。
[0108] 帕金森病是一种其中肌肉变得僵硬和迟缓的随意运动失调。这种疾病的症状包括肌肉组的艰难且不可控制的有节奏颤搐，从而产生颤抖或震颤。目前，这种疾病由脑(特别是脑干)中的突触前多巴胺能神经元变性引起。作为变性的结果，在神经元活动期间发生化学递质多巴胺的释放不足。
[0109] 肌萎缩性侧索硬化(ALS)，也称为Lou Gehrig病，是一种进行性致命神经疾病。在脑和脊髓中控制随意运动的特定神经细胞逐渐变性并引起受其控制的肌肉弱化和衰弱时发生ALS，从而导致麻痹。编码14kDa血管核糖核酸酶的ANG是在ALS中鉴定出的功能丧失性基因。本发明的方法考虑在治疗ALS中使用本发明的RNA来递送所述14kDa血管核糖核酸酶。
[0110] 目前，用多种不同的化合物及组合来治疗帕金森病。通常，给予在脑中被转化成多巴胺的左旋多巴(L-dopa)来修复肌肉控制。使用穿过血脑屏障的ACE抑制剂培哚普利(perindopril)来改善患者对L-dopa的运动响应。将卡比多巴与L-dopa一起施用以延迟L-dopa转化成多巴胺直至其到达脑，并且其还减轻L-dopa的副作用。帕金森病治疗中使用的其他药物包括多巴胺模仿物Mirapex(二盐酸普拉克索)和Requip(盐酸累匹利洛)，以及Tasmar(托卡朋)，其是一种在左旋多巴到达脑之前阻断导致其分解之关键酶的COMT抑制剂。
[0111] 阿尔兹海默病是一种以认知和非认知的神经精神病症状为特征的变性脑病症。精神病症状在阿尔兹海默病中是常见的，其中精神病(幻觉和妄想)存在于大约50％的罹病患者中。与精神分裂症类似，阳性神经病症状在阿尔兹海默病中是常见的。通常，妄想比幻觉发生得更频繁。阿尔兹海默病患者还表现出阴性症状，例如解脱、情感淡漠、情绪反应减少、意志丧失和主动性降低。实际上，用于缓解精神分裂症之精神病的抗精神病剂对减轻阿尔兹海默病患者中的精神病也有用。本文使用的术语“痴呆”指认知和智力功能丧失而不损伤知觉或意识。痴呆通常以定向障碍、记忆受损、判断受损和智力受损以及浅度情绪不稳定(shallow labile affect)为特征。
[0112] 孤独症(也称为孤独症谱系病症(Autism Spectrum Disorder)或ASD)是一种严重削弱个体功能的病症。其以自吸收、与外部世界的交流能力或对外部世界的反应能力降低、仪式行为(ritual)和强迫现象以及智力迟钝为特征。此外，孤独症个体发生癫痫发作病症(例如癫痫)的风险增加。尽管不知道孤独症的实际病因，但是其似乎包括一个或更多个遗传因素，如以下事实所指出的：与二卵双生相比，单卵双生中有更高的相似比，并且还可涉及免疫和环境因素，例如饮食、毒性化学物质和感染。
[0113] 可用于治疗神经变性病症的蛋白质包括但不限于早老蛋白和ANG。早老蛋白对阿尔兹海默病的治疗有用。
[0114] 编码目的蛋白的RNA还可用于治疗皮肤病症，例如白斑、湿疹(通常与聚丝蛋白基因的功能丧失有关)、白化病，例如赫-普综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)(与HPS 1和HPS3基因等中的突变有关)、色素失禁症(与1KB KG基因中的突变有关)、眼皮肤白化病(与MC1R、OCA2、SLC45A2、TYR、SLC45A2和TYRP1基因中一个或更多个的突变有关)、瓦尔登伯格综合征(与EDN3、EDNRB、MITF、PAX3、SNAI2和SOX10基因中的突变有关)或着色性干皮病(Xeroderma pigmentosum)(与ERCC2、ERCC3、POLH、XPA和XPC基因中的突变有关)。因此，本发明涉及通过体内表达与皮肤病症有关的蛋白质来治疗这些病症。任选地，对皮肤的施用可以是表面的。
[0115] 本文所述的方法和组合物还对增殖性疾病的治疗有用。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是实体瘤。在一些实施方案中，所述增殖性疾病是恶性血液肿瘤(hematological malignancy)。在某些实施方案中，所述增殖性疾病是良性赘生物。在另一些实施方案中，所述赘生物是恶性赘生物。在某些实施方案中，所述增殖性疾病是癌症。在一些实施方案中，相对于例如被认为肿瘤是已由其产生的细胞类型和/或在正常细胞中观察到的典型数值，至少一些肿瘤细胞过表达蛋白质。在此情况下，可利用本发明的方法来例如递送干扰或中断过表达之蛋白质的表达或活性的蛋白质。替代地或另外地，所述方法可包括递送具有配体结合结构域的RNA分子，其中所述配体是所述过表达的蛋白质，并且响应于与过表达的蛋白质接触而产生的蛋白质可用于杀伤细胞或者通过其他方式治疗癌症。
在另一些情况下，癌细胞可低表达蛋白质。在此实情况下，本发明的方法可引起蛋白质递送和表达的增加。
在另一些情况下，癌细胞可低表达蛋白质。在此实情况下，本发明的方法可引起蛋白质递送和表达的增加。
[0116] 在一些实施方案中，肿瘤是多个器官系统之一的恶性肿瘤(例如，肉瘤、腺癌或癌)，例如以下中的那些：肺、乳腺、淋巴、胃肠(例如，结肠)道和泌尿生殖(例如，肾、膀胱上皮或睾丸瘤)道、胰腺、咽、前列腺和卵巢。在一些实施方案中，肿瘤可以是具有基质层的肿瘤。在一些实施方案中，癌症是非小细胞肺癌。在一些实施方案中，癌症是腺癌。在一些实施方案中，癌症是胰腺导管腺癌(PDAC)。腺癌的实例包括，但不限于结肠直肠癌、肾细胞癌、肝癌、非小细胞肺癌和小肠癌。另外的示例性实体瘤包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮肉瘤、淋巴管肉瘤(lymphangiosarconia)、淋巴管内皮肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因瘤(Ewing′s tumor)、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃肠系统癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、泌尿生殖系统癌、卵巢癌、前列腺癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、囊腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、内分泌系统癌、睾丸瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺癌、膀胱癌、上皮癌、神经胶质瘤、星形细胞瘤、meduilobias oma、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。
[0117] RNA可单独使用或者与标准化学治疗剂联合施用。在一些情况下，由所述RNA表达的蛋白质是导致癌细胞的化学治疗敏感性表型的蛋白质。例如，所述蛋白质可使得抗性癌细胞变得对化学治疗剂敏感。或者，所述蛋白质可用于防止癌细胞发生化学治疗耐药表型。本文使用的术语“化学治疗剂”指在以异常细胞生长为特征的疾病治疗中具有治疗用途的任何化学或生物学药剂。这样的疾病包括肿瘤、赘生物和癌症以及以增生性生长为特征的疾病。化学治疗剂包括但不限于烷化剂/生物碱剂、抗代谢物、激素或激素类似物，和各种抗肿瘤药物。化学治疗剂在本领域中是公知的(例如参见Slapak和Kufe，Principles of Cancer Therapy，Harrison′s Principles of Internal Medicine，第14版中的第86章；Perry等，Chemotherapy，Abeloff，Clinical Oncology第2版中的第17章，2000Churchill Livingstone，Inc；Baltzer L，Berkery R(编辑)：Oncology Pocket Guide to Chemotherapy，第2版St.Louis，Mosby-Year Book，1995；Fischer D S，Knobf M F，Durivage H J(编辑)：The Cancer Chemotherapy Handbook，第4版St.Louis，Mosby-Year Book，1993)。
[0118] 因此，本发明的RNA可编码在细胞中有用的任何蛋白质。细胞操作或疾病治疗中使用的特定RNA/蛋白质类型将取决于疾病的类型。用于在本发明的方法中表达的示例性蛋白质和编码这些蛋白质的示例性基因包括但不限于VEGF蛋白，α1抗胰蛋白酶多肽，心肌营养因子(例如肌酸、肉碱和牛磺酸)，促进心细胞存活和/或生长的生长因子，TGF-β配体(例如激活蛋白A、激活蛋白B)、胰岛素样生长因子、骨形态发生蛋白、成纤维细胞生长因子、血小板衍生生长因子利尿钠因子、胰岛素、白血病抑制因子(LIF)、表皮生长因子(EGF)、TGFα、BMP或cripto途径的产物、和细胞分化剂(例如细胞因子生长因子)、TDGF1、vWF、GATA-4、GATA-6、Nkx2.5、Mef2-c、LGMD-2B、dysferlin、肌养蛋白、伊默菌素、核纤层蛋白A/C、α-1抗胰蛋白酶、CFTR、ANG、早老蛋白、ISl1、SERCA1a或2a、受磷蛋白、β-ARK、β-肾上腺素能受体、Akt、腺苷酸环化酶V1、神经调节蛋白1、ErbB4、Periostin、HAND1、E2F4、Skp2、BRCA1、BRCA2、MLH1、MSH2、MSH6、EPHA3、EPHA4、APHB2、INI1、AXIN1、AXIN2、MLL3、EP300、NF1、TP53、APC、VHL、SMAD2、SMAD4、KEAP1、CDKN2A、RB I、MEN、NF2/SCH、PTCH、TGFBR1、TGFBR2、ACVR1B、AVCR2、MRE11、MAP2K4、LKB1/STK11、HERG、KCNQ1、SCN5A、ANK2、KCNE1、KCNE2、KCNJ2、CACNA1c、SCN4B SERCA、KCNQ2、SCN1B和KCNE3。
[0119] 本文所述的方法包括体内、体外和离体应用。如上文所讨论的，可通过向对象体内施用RNA组合物来在靶组织或器官中治疗地表达目的蛋白。本发明还包括治疗方法，所述方法包括出于治疗、诊断或研究目的而使一个或更多个细胞与RNA组合物离体接触，然后将这些细胞施用于对象。首先，可将细胞通过传统的离体方法从对象中移出、通过能够将RNA运输到所述细胞中的任何方法(例如电穿孔或脂转染)转染，并重新引入所述对象。或者，可从不同的来源获得细胞，然后在将其首次引入对象中之前将RNA引入所述细胞中。
[0120] 本发明还用在开发用于研究的动物模型中。例如，可向动物施用本发明的RNA以产生用于研究全器官和全身病理生理学以及用于药物筛选和测试的动物模型。所述方法包括开发用于测试和/或治疗发展的小型动物模型和大型动物模型两者，例如鼠、灵长类动物和猪模型。
[0121] 因此，本发明提供了用于产生非人脊椎动物(例如，非人哺乳动物)的方法。本发明的非人脊椎动物可用于广泛多种目的。在一些实施方案中，非人脊椎动物用作用于病症的模型以促进所述病症的研究。在一些实施方案中，非人脊椎动物用作用于病症的模型以寻求针对所述病症的预防性或治疗性药物。如果候选药物降低病症在动物模型中的存在程度或进行程度或使所述病症逆转(部分或全部)，则所述候选药物是待施用来治疗所述病症的药物。
[0122] 本发明还包括再生医学方法。例如，在一些实施方案中，可用编码有助于细胞群形成组织之蛋白质的RNA处理能够形成所述组织的所述细胞群。可体内用RNA处理所述细胞群或者可将它们在临植入前体外处理或者可将它们体外进行处理、种植在骨架上并在培养基中培养，之后植入。在一些实施方案中，细胞群是干细胞群。
[0123] 因此，本发明包括组织产生、组织再生和组织工程的方法。“组织再生”指细胞群、器官或组织在疾病或创伤之后再生长。术语“组织产生”指组织由初始细胞群生长。
[0124] 组织工程包括使用细胞和骨架或支持材料来产生组织或组织结构。这样的工程化组织或组织结构可用于治疗目的以改善或替代生物学功能，例如在修复或替代部分或全部组织(例如，皮肤、心脏、心组织、骨、软骨、胰腺、肝、肾、血管、膀胱等)中，或者在用于鉴定改变部分或整个器官的功能而无需从对象获得这些器官之药剂的测定中。
[0125] “骨架”或“支持物”指使用本文所述的方法和组合物产生的细胞能够自身与其附着或粘附的任何合适的载体材料。骨架或支持物可以是平的或者其可具有三维形式。骨架可以是具有可成形成需要修复或替代之期望结构的表面的聚合物，使得其提供允许细胞与其附着并在其上生长的支持构架。骨架可呈任何期望的几何构造，例如平板、螺旋、椎形或v样结构。然后，可将经培养的细胞群在骨架上生长，其提供细胞-细胞相互作用所需的合适间隙距离以及适用于后期植入的尺寸和形状。通常，如果将骨架植入对象中，则所述骨架将是生物相容性骨架。“生物相容性骨架”是无毒的，使得其一旦被植入对象中不会引起毒性作用。
[0126] 可将骨架设计成有助于控制正经历分化或转分化的细胞。例如，骨架可包括控制和指导细胞分化成特定组织的环境线索。被改造成提供环境线索的骨架可包括，例如纳米至微米至毫米至肉眼可见的长度，和/或可基于以下因素例如，但不限于材料机械性质、材料溶解性、生物活性化合物的空间模式、拓扑特征的空间模式、可溶性生物活性化合物、机械扰动(周期性或静态应变、应激、剪切等)、电刺激和热扰动。
[0127] 骨架是通常聚合的。用于产生骨架的聚合物的实例包括，但不限于聚乳酸(PLA)、聚-L-乳酸(PLLA)、聚-D-乳酸(PDLA)、聚乙醇酸交酯、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-共-乙醇酸(PLGA)、聚二 烷酮(polydioxanone)、聚葡糖酸酯(polygluconate)、聚乳酸-聚环氧乙烷共聚物、改性纤维素、胶原蛋白、聚羟基丁酸酯、聚羟基丙酸、聚磷酸酯、聚(α-羟基酸)、聚己酸内酯、聚碳酸酯、聚酰胺、聚酐类、聚氨基酸、聚原酸酯、聚缩醛类、聚氰基丙烯酸酯、可降解氨基甲酸乙酯、脂肪族聚酯聚丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯、酰基取代的纤维素乙酸酯、不可降解聚氨基甲酸乙酯、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚氟乙烯，聚乙烯基咪唑、氯磺化聚TM烯烃(chlorosulphonated polyolifin)、聚环氧乙烷、聚乙烯醇、Teflon 、尼龙硅、和形状记忆材料，例如聚(苯乙烯-嵌段-丁二烯)、聚降冰片烯、水凝胶、金属合金和作为切换片段的寡(e-己内酯)二醇/作为物理交联的寡(对二氧环己酮)二醇。另一些合适的聚合物可通过参考The Polymer Handbook，第3版(Wiley，N.Y.，1989)获得，其内容通过引用整体并入本文。
[0128] 聚合物还可以是经包被的或者是与生物聚合物混合的，所述生物聚合物例如胞外基质(ECM)蛋白(例如，指导细胞粘附和功能的胶原蛋白、纤连蛋白、层粘连蛋白等)、生长因子(例如，神经生长因子、骨形态发生蛋白、血管内皮生长因子等)、脂质、脂肪酸、类固醇(例如，甘油酯，非甘油酯、饱和和不饱和脂肪酸、胆固醇、皮质类固醇、性类固醇等)、糖类和其他生物学活性碳水化合物(例如单糖、寡糖、蔗糖、葡萄糖、糖原等)、蛋白聚糖(具有硫酸软骨素、硫酸皮肤素、肝素、硫酸乙酰肝素和/或硫酸角质素之附加侧链的蛋白质核心)；糖蛋白[例如，选择蛋白、免疫球蛋白、激素(例如，促蛋白合成类固醇、性激素、人绒毛膜促性腺激素、胰岛素、血管紧张素等)、甲胎蛋白和促红细胞生成素(EPO)等]；蛋白脂质(例如，N-肉豆蔻酰化、棕榈酰化和异戊烯化的蛋白质)；以及糖脂(例如甘油糖脂、鞘糖脂、糖磷脂酰肌醇等)、核酸(例如，DNA、RNA等)、激素、细胞表面配体和受体(例如整联蛋白、选择蛋白、钙黏着蛋白等)、细胞骨架丝、动力蛋白(例如，中间丝、微管、肌动蛋白丝，动力蛋白，驱动蛋白、肌球蛋白等)、丝、酶(类型：氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶、连接酶；实例：胰蛋白酶、胶原蛋白酶、基质金属蛋白酶等)、多蛋白(例如，聚(赖氨酸)、聚乳酸和聚乙醇酸以及聚-L-赖氨酸)或其任意组合。
[0129] 在将细胞接种在骨架上之前可用本发明的RNA处理所述细胞。或者，除用RNA预处理之外或不用RNA预处理，可将细胞接种在骨架上之后用所述RNA处理。在一些实施方案中，将本发明的RNA附着于骨架或并入骨架中。另外地，可将治疗剂并入骨架中或骨架上。或者，可将接种在骨架上的细胞用除本发明RNA之外的治疗剂处理。
[0130] 治疗剂包括但不限于抗病毒剂；抗微生物剂和/或抗生素，例如红霉素、杆菌肽、新霉素、青霉素、多粘菌素B、四环素、金霉素、氯霉素和链霉素、头孢唑啉、氨苄青霉素、氨曲南、妥布霉素、克林霉素和庆大霉素等；杀生物/生物抑制糖类，例如葡聚糖、葡萄糖等；氨基酸；肽；维生素；无机元素；用于蛋白质合成的辅因子；激素；内分泌组织或组织碎片；
合成剂；酶，例如碱性磷酸酶、胶原蛋白酶、肽酶、氧化酶等；血管生成剂；胶原蛋白网格(collagen lattice)；抗原剂；细胞骨架剂；软骨碎片；活细胞，例如软骨细胞、骨髓细胞、间充质干细胞；天然提取物；经遗传改造的活细胞或通过其他方式修饰的活细胞；经扩增或经培养的细胞；脱矿物质的骨粉；自体组织，例如血液、血清、软组织、骨髓等；生物粘合剂；骨形态发生蛋白(BMP)；骨诱导因子(IFO)；纤连蛋白(FN)；内皮细胞生长因子(ECGF)；
血管内皮生长因子(VEGF)；牙骨质附着提取物(cementum attachment extract，CAE)；酮色林(ketanserin)；人生长激素(HGH)；动物生长激素；表皮生长因子(EGF)；白细胞介素；
例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)；人α-凝血酶；转化生长因子(TGF-β)；
胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF-2)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF、BFGF等)；牙周纤维趋化因子(PDLGF)；釉基质蛋白；生长和分化因子(GDF)；刺猬蛋白家族；蛋白质受体分子；衍生自上述生长因子的小肽；骨启动子；细胞因子；促生长素；
骨消化剂；抗肿瘤剂；细胞引诱剂和附着剂；免疫抑制剂；渗透增强剂，例如，脂肪酸酯(例如聚乙二醇的月桂酸酯、肉豆蔻酸酯和硬脂酸单酯)、烯胺衍生物、α-酮醛等；以及核酸。
合成剂；酶，例如碱性磷酸酶、胶原蛋白酶、肽酶、氧化酶等；血管生成剂；胶原蛋白网格(collagen lattice)；抗原剂；细胞骨架剂；软骨碎片；活细胞，例如软骨细胞、骨髓细胞、间充质干细胞；天然提取物；经遗传改造的活细胞或通过其他方式修饰的活细胞；经扩增或经培养的细胞；脱矿物质的骨粉；自体组织，例如血液、血清、软组织、骨髓等；生物粘合剂；骨形态发生蛋白(BMP)；骨诱导因子(IFO)；纤连蛋白(FN)；内皮细胞生长因子(ECGF)；
血管内皮生长因子(VEGF)；牙骨质附着提取物(cementum attachment extract，CAE)；酮色林(ketanserin)；人生长激素(HGH)；动物生长激素；表皮生长因子(EGF)；白细胞介素；
例如白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)；人α-凝血酶；转化生长因子(TGF-β)；
胰岛素样生长因子(IGF-1、IGF-2)；血小板衍生生长因子(PDGF)；成纤维细胞生长因子(FGF、BFGF等)；牙周纤维趋化因子(PDLGF)；釉基质蛋白；生长和分化因子(GDF)；刺猬蛋白家族；蛋白质受体分子；衍生自上述生长因子的小肽；骨启动子；细胞因子；促生长素；
骨消化剂；抗肿瘤剂；细胞引诱剂和附着剂；免疫抑制剂；渗透增强剂，例如，脂肪酸酯(例如聚乙二醇的月桂酸酯、肉豆蔻酸酯和硬脂酸单酯)、烯胺衍生物、α-酮醛等；以及核酸。
[0131] 可使用本发明的RNA组合物来改变细胞的发育潜能。例如，由本发明的外源RNA表达蛋白质的能力允许改变或逆转细胞的发育潜能，即重编程(reprogram)细胞，和细胞定向分化成更加分化的表型两者。改变细胞发育潜能过程的一个重要组成是需要细胞中的一个或更多个发育潜能的重编程因子持续并延长地表达。通常，该持续表达可使用外源DNA或病毒载体来实现。然而，已发现本发明的RNA可被直接递送至细胞，避开了使用DNA或病毒载体的需要。
[0132] 因此，本发明的RNA可用于从具有分化表型的细胞产生多潜能干细胞。为了实现该实施方案，将所述RNA递送至具有分化表型的细胞。一旦所述RNA在细胞内，其被翻译成引起细胞产生较不分化表型的重编程因子。与未经处理的细胞相比，所得到的细胞具有更高的发育潜能，并且随后可变成干细胞的来源以用于进一步操作。
[0133] 还可根据本发明对按照上文所述产生的干细胞或任何其他来源的干细胞进行处理以产生更加分化的细胞。例如，可通过诱导蛋白质表达以使干细胞分化成期望的细胞类型来对干细胞进行操作。使用这种类型的定向分化以产生具有期望表型的细胞。用本发明的RNA处理干细胞，其被翻译成引起细胞产生分化表型的分化因子。
[0134] 因此，通过使用本文所述的技术，干细胞可由分化细胞产生，并且干细胞可被分化成一种或更多种期望的细胞类型。本文使用的“干细胞”是未分化或部分分化的细胞，其能够自我更新并且具有分化成多种细胞类型的发育潜能。多潜能细胞是具有在不同条件下分化成具有所有三个细胞胚层(即，内胚层(例如，肠组织)、中胚层(包括血液、肌肉和血管)和外胚层(例如皮肤和神经))之特征的细胞类型的发育潜能的细胞。
[0135] 多能细胞是具有分化成一个或更多个胚层，而不是所有三个胚层细胞之发育潜能的细胞。这些细胞包括，例如，成年干细胞，例如造血干细胞和神经干细胞。干细胞可具有分化表型的倾向。然而，可诱导这些细胞逆转和重新表达干细胞表型。这个过程称为“去分化”或“重编程”。
[0136] 干细胞是受其在单细胞水平的自我更新和分化产生后代细胞能力所限定的未分化细胞，包括自我更新的祖细胞、不可更新的祖细胞和终末分化细胞。基于其分化水平的干细胞的特征还在于其能够体外由多个胚层(内胚层、中胚层和外胚层)分化成多个细胞谱系的功能细胞，并能够在移植后生成多个胚层的组织。干细胞可以是胚胎干细胞或成体干细胞。术语“胚胎干细胞”通常用于指胚胎胚泡的内细胞团的多潜能干细胞，其可以在发育期间产生所有三个初级胚层(外胚层、内胚层和中胚层)的衍生物。相比之下，本文使用的“成体干细胞”指来自非胚胎组织(包括胎组织、青少年组织和成年组织)的任何多潜能干细胞(pluripotent stem cell)或多能干细胞(multipotent stem cell)。已从广泛的多种成年组织分离出天然成体干细胞，所述成年组织包括血液、骨髓、脑、嗅上皮、皮肤、胰腺、骨骼肌和心肌。相比之下，“分化细胞”是非多潜能的体细胞。
[0137] 本文使用的术语“重编程”指使细胞或细胞群(例如，体细胞)的发育潜能逆转的过程。因此，重编程指驱动细胞至具有更高发育潜能的状态(即返回较不分化状态)的过程。待重编程的细胞在进行重编程之前可以是部分或终末分化的。在一些实施方案中，重编程包括分化状态的完全或部分逆转，即细胞的发育潜能增加至具有多潜能状态细胞的发育潜能。在一些实施方案中，重编程包括驱动体细胞至多潜能状态，使得所述细胞具有胚胎干细胞的发育潜能，即胚胎干细胞表型。在一些实施方案中，重编程还包括细胞(例如体细胞或单能细胞)的分化状态部分逆转或细胞的发育潜能部分增加至多能状态。重编程还包括使细胞的分化状态部分逆转至一定的状态，该状态致使所述细胞在进行另外的操作时更易被完全重编程至多潜能状态。
[0138] 本文使用的“重编程因子”指发育潜能改变因子，其表达有助于将细胞(例如体细胞)重编程至较不分化或未分化状态，例如至多潜能状态或部分多潜能状态的细胞。重编程因子包括但不限于OCT4、SOX1、SOX 2、SOX 3、SOX15、SOX 18、NANOG、KLF1、KLF 2、KLF 4、KLF 5、NR5A2、c-MYC、1-MYC、n-MYC、REM2、TERT和LIN28。
[0139] 本文使用的术语“分化因子”指发育潜能改变因子，在本文中对该术语进行定义(例如蛋白质、RNA或小分子)时，诱导细胞分化成期望细胞类型，即分化因子降低细胞的发育潜能。向特定细胞类型的分化可涉及同时和/或持续表达多于一种分化因子。这可通过向细胞递送编码一种或更多种分化因子的一种或更多种RNA，并且任选地向细胞递送一种或更多种蛋白质形式的分化因子来实现。
[0140] 在一些方面，本发明涉及根据本发明的方法操作的细胞。此类细胞是分离的细胞。术语“分离的细胞”指已从其最初被发现的生物体中移出的细胞或该细胞的后代。随后，可将这些细胞引入第二生物体中或者重新引入这样的生物体中，所述细胞从所述生物体中分离出来(或者细胞或细胞群是所述生物体的后代)。然而，一旦根据本发明的方法进行了操作，这样的细胞就仍被认为是分离的细胞。干细胞可以是分离的，这基于是否存在特定的目的标志物。例如，可使用试剂来识别干细胞标志物，例如可使用识别并与细胞表面标志物或者期望干细胞上的抗原结合的标记抗体来分开并分离期望的干细胞，这通过使用荧光激活细胞分选(FACS)、淘选法、磁性颗粒选择、颗粒分选选择和本领域技术人员已知的其他方法(包括密度分离)来实现。
[0141] 在一些实施方案中，根据本发明处理的干细胞是癌干细胞。癌干细胞存在于一些人肿瘤中。这些细胞代表少数的肿瘤总细胞质量，但被认为是负责肿瘤生长之肿瘤细胞的亚群。癌干细胞广泛增殖并产生另外的肿瘤干细胞以及缺乏肿瘤发生潜能的其他肿瘤细胞。癌干细胞的另一个特性是其对治疗(例如化学治疗)的抗性。小部分肿瘤干细胞及其直接子细胞群增殖并被最终证明是致命的。本发明的癌干细胞可用于研究逆转或通过其他方式干扰细胞之化学治疗抗性的因素。
[0142] 干细胞可获自任何的哺乳动物物种，例如人、灵长类动物、马、牛、猪、犬、猫、啮齿类动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)。
[0143] 根据本发明方法处理的分化或多潜能细胞群可在用于这些细胞类型的标准条件下进行操作。所述细胞的处理可在体外、离体或体内进行。例如，所述细胞可存在于体内或存在于培养基中。操作可在高氧或低氧条件下进行。
[0144] “培养基”包含维持细胞生存力并支持增殖的营养物质。典型的培养基包含：盐、缓冲液、氨基酸、葡萄糖或其他糖类、抗生素、血清或血清替代物，和/或其他组分(例如肽生长因子等)。用于获得并维持多潜能细胞的细胞培养基在本领域中是已知的。培养基还可包含细胞特异性生长因子，例如血管生成素、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-2、骨形态发生蛋白-3、骨形态发生蛋白-4、骨形态发生蛋白-5、骨形态发生蛋白-6、骨形态发生蛋白-7、骨形态发生蛋白-8、骨形态发生蛋白-9、骨形态发生蛋白-10、骨形态发生蛋白-11、骨形态发生蛋白-12、骨形态发生蛋白-13、骨形态发生蛋白-1、骨形态发生蛋白-15、骨形态发生蛋白受体IA、骨形态发生蛋白受体IB、脑衍生神经营养因子、睫状神经营养因子、睫状神经营养因子受体α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子1、细胞因子-诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2α、细胞因子诱导的嗜中性粒细胞趋化因子2β、β-内皮细胞生长因子、内皮1、表皮生长因子、上皮衍生嗜中性粒细胞引诱剂、成纤维细胞生长因子4、成纤维细胞生长因子5、成纤维细胞生长因子6、成纤维细胞生长因子7、成纤维细胞生长因子8、成纤维细胞生长因子b、成纤维细胞生长因子c、成纤维细胞生长因子9、成纤维细胞生长因子10、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、胶质细胞系衍生嗜中性粒细胞因子受体-α1、神经胶质细胞系衍生嗜中性粒细胞因子受体-α2、生长相关蛋白、生长相关蛋白-α、生长相关蛋白-β、生长相关蛋白-γ，肝素结合表皮生长因子、肝细胞生长因子、肝细胞生长因子受体、胰岛素样生长因子I、胰岛素样生长因子受体、胰岛素样生长因子II、胰岛素样生长因子结合蛋白、角质形成细胞生长因子、白血病抑制因子、白血病抑制因子受体-α、神经生长因子、神经生长因子受体、神经营养蛋白-3、神经营养蛋白-4、胎盘生长因子、胎盘生长因子2、血小板衍生内皮细胞生长因子、血小板衍生生长因子、血小板衍生生长因子A链、血小板衍生生长因子AA、血小板衍生生长因子AB、血小板衍生生长因子B链、血小板衍生生长因子BB、血小板衍生生长因子受体-α、血小板衍生生长因子受体-β、前B细胞生长刺激因子、干细胞因子、干细胞因子受体、转化生长因子-α、转化生长因子-β、转化生长因子-β1、转化生长因子-β-1-2、转化生长因子-β2、转化生长因子-β3、转化生长因子-β5、潜伏转化生长因子-β1、转化生长因子-β-结合蛋白I、转化生长因子-β-结合蛋白II，转化生长因子-β-结合蛋白III、I型肿瘤坏死因子受体、II型肿瘤坏死因子受体、尿激酶型纤溶酶原激活物受体、血管内皮生长因子以及其嵌合蛋白质和生物学或免疫学活性片段。
[0145] 可使用本领域中已知的用于进行这些评价的任何方法来评价细胞的分化状态。例如，可将根据本文所述的方法处理的细胞的分化状态与未经处理的细胞或用DNA处理的细胞进行比较，用DNA处理的细胞使用病毒载体来递送DNA从而导致表达相同的重编程或分化因子。
[0146] 本发明的方法还对疫苗接种有用。本发明的RNA可用于表达针对细胞或对象的抗原。例如，递送至细胞的RNA可编码抗原，例如针对其产生期望免疫应答的抗原。示例性的抗原包括来自病原生物体(例如细菌或病毒或其他微生物)的蛋白质或其片段，以及来自细胞(例如，癌细胞)的蛋白质或其片段。所述抗原可以单纯地是免疫原性蛋白质或其片段，或者其可以是融合蛋白，包括与载体肽融合的抗原性蛋白质或其片段。所述载体肽可以是第二抗原性肽或者其可以是无免疫原性的。
[0147] 抗原可以是完全蛋白质或表位，例如MHC I类表位、MHC II类表位或者B或T细胞表位。由MHC I类分子所呈递的T细胞表位可以是约8至11个氨基酸的肽。与MHC I类分子相比，由MHC II类分子所呈递的T细胞表位可更长。表位可使用多种基于网页的预测工具进行预测，例如http：//tools.immuneepitope.org/main/html/tcell tools.html。
[0148] 病毒抗原是来源于病毒的免疫原性蛋白质或其片段。慢性人病毒感染中的多种重要病毒包括但不限于HPV、HBV、丙型肝炎病毒(HCV)、逆转录病毒(例如人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2))、疱疹病毒(例如EB病毒(Epstein Barr Virus，EBV))、巨细胞病毒(CMV)、HSV-1和HSV-2以及流感病毒。可用的抗原包括HBV表面抗原或HBV核心抗原；CMV的ppUL83或pp89；HIV-1的gp120、gp41或p24蛋白的抗原；HSV的ICP27、gD2、gB；或者流感血凝素或核蛋白(Anthony，L S等，Vaccine 1999；17：373-83)。其他的病毒包括埃布尔森白血病病毒(Abelson leukemia virus)、埃布尔森鼠白血病病毒(Abelson murine leukemia virus)、埃布尔森病毒(Abelson′s virus)、急性喉气管支气管炎病毒、阿德莱德河病毒(Adelaide River virus)、腺相关病毒组(Adeno associated virus group)、腺病毒、非洲马病病毒(African horse sickness virus)、非洲猪瘟病毒(African swine fever virus)、AIDS病毒、阿留申貂病细小病毒(Aleutian mink disease parvovirus)、α逆转录病毒、α病毒(Alphavirus)、ALV相关病毒、阿马帕里病毒(Amapari virus)、口蹄疫病毒(Aphthovirus)、水生呼肠孤病毒(Aquareovirus)、虫媒病毒(Arbovirus)、虫媒病毒C、虫媒病毒组A、虫媒病毒组B、沙粒病毒组(Arenavirus group)、阿根廷出血热病毒(Argentine hemorrhagic fever virus)、阿根廷出血热病毒、动脉炎病毒、星状病毒、蛛猴疱疹病毒组(Ateline herpesvirus group)、Aujezky病病毒(Aujezky′s disease virus)、奥拉病毒(Aura virus)、Ausduk病病毒(Ausduk disease virus)、澳大利亚蝙蝠狂犬病病毒(Australian bat lyssavirus)、禽腺病毒、禽类成红细胞增生病毒、禽源传染性支气管炎病毒、禽类白血病病毒、鸟类造白细胞组织增生病毒、禽淋巴瘤病病毒(avian lymphomatosis virus)、禽类成髓细胞性白血病病毒、禽副黏病毒、禽类肺脑炎病毒(avian pneumoencephalitis virus)、禽类网状内皮组织增殖病毒、禽肉瘤病毒、禽类C型逆转录病毒组、禽肝病毒(Avihepadnavirus)、禽痘病毒、B病毒、B19病毒、Babanki病毒、狒狒疱疹病毒、杆状病毒、巴马森林病毒(Barmah Forest virus)、贝巴鲁病毒(Bebaru virus)、贝里马病毒(Berrimah virus)、β逆转录病毒(Betaretrovirus)、双RNA病毒、比特纳病毒(Bittner virus)、BK病毒、黑港渠 病毒(Black Creek Canal virus)、蓝 舌病 毒(bluetongue virus)，玻利维亚出血热病毒(Bolivian hemorrhagic fever virus)、Boma病病毒(Boma disease virus)、绵羊边界病病毒(border disease of sheep virus)、波尔纳病毒、牛α疱疹病毒1型、牛α疱疹病毒2型、牛冠状病毒、牛短暂热病毒(bovine ephemeral fever virus)、牛免疫缺陷病毒、牛白血病病毒、牛造白细胞组织增生病毒、牛乳头炎病毒、牛乳头瘤病毒、牛丘疹性口炎病毒、牛细小病毒、牛合胞病毒、牛C型肿瘤病毒、牛病毒性腹泻病毒、博吉河病毒(Buggy Creek virus)、弹状病毒组、布尼奥罗病毒超群(Bunyamwera virus supergroup)、布 尼病 毒(Bunyavirus)、伯基 特淋 巴瘤 病 毒(Burkitt′ s lymphoma virus)、布 汪 巴 热(Bwamba Fever)、CA病 毒、杯 状 病 毒(Calicivirus)、加利福尼亚脑炎病毒、骆驼痘病毒、金丝雀痘病毒、犬科疱疹病毒、犬冠状病毒、犬瘟病毒(canine distemper virus)、犬疱疹病毒、犬微小病毒(canine minute virus)、犬细小病毒、卡尼奥德尔加蒂图病毒(Cano Delgadito virus)、山羊关节炎病毒、山羊脑炎病毒、山羊疱疹病毒、山羊痘病毒、心病毒(Cardiovirus)、豚鼠疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒1型(Cercopithecid herpesvirus 1)、猕猴疱疹病毒1型、猕猴疱疹病毒2型、金迪普拉病毒(Chahdipura virus)、昌吉诺拉病毒(Changuinola virus)、斑点叉尾鯝病毒(channel catfish virus)、沙勒维尔病毒(Charleville virus)、水痘病毒、屈曲病毒(Chikungunya virus)、黑猩猩疱疹病毒、鲢鱼呼肠孤病毒(chub reovirus)、大麻哈鱼病毒、科卡尔病毒(Cocal virus)、银大马哈鱼呼肠孤病毒(Coho salmon reovirus)、媾疹病毒(coital exanthema virus)、科洛拉多蜱传热病毒(Colorado tick fever virus)、Coltivirus、哥伦比亚SK病毒(Columbia SK virus)、普通感冒病毒、传染性eethyma病毒、传染性脓疱皮炎病毒、冠状病毒、科里帕塔病毒(Corriparta virus)、鼻炎病毒(Coryza virus)、牛痘病毒、柯萨奇病毒、CPV(质型多角体病毒)、蟋蟀麻痹病毒、克里米亚-刚果出血热病毒、致哮吼病毒、隐病毒、质型多角体病毒(Cypovirus)、巨细胞病毒、巨细胞病毒组、质型多角体病毒、鹿乳头瘤病毒、δ逆转录病毒、登革病毒、浓核病毒、依赖病毒、多理病毒(Dhori virus)、diploma病毒、果蝇C病毒(Drosophila C virus)、鸭乙型肝炎病毒、鸭肝炎病毒1型、鸭肝炎病毒2型、双层壳病毒(duovirus)、杜文黑基病毒(Duvenhage virus)、畸翅病毒DWV(Deformed wing virus DWV)、东部马脑炎病毒、东部马脑脊髓炎病毒、EB病毒、埃博拉病毒(Ebola virus)、埃博拉样病毒(Ebola-like virus)、艾柯病毒、艾柯病毒、艾柯病毒10型、艾柯病毒28型、艾柯病毒9型、鼠痘病毒(ectromelia virus)、EEE病毒、EIA病毒、EIA病毒、脑炎病毒、脑心肌炎组病毒、脑心肌炎病毒、肠道病毒、酶升高病毒、酶升高病毒(LDH)、流行性出血热病毒、动物流行性出血热病病毒、埃-巴病毒(Epstein-Barr virus)、马α疱疹病毒1型、马α疱疹病毒4型、马疱疹病毒2型、马流产病毒、马动脉炎病毒、马变性性脑病病毒、马传染性贫血病毒、马麻疹病毒、马鼻肺炎病毒、马鼻病毒、Eubenangu病毒、欧洲驼鹿乳头瘤病毒(European elk papillomavirus)、欧洲猪瘟病毒(European swine fever virus)、埃弗格赖德病毒(Everglades virus)、埃亚契病毒(Eyach virus)、猫疱疹病毒1型、猫杯状病毒、猫纤维肉瘤病毒、猫疱疹病毒、猫免疫缺陷病毒、猫传染性腹膜炎病毒、猫白血病/肉瘤病毒、猫白血病病毒、猫粒细胞缺乏症病毒、猫细小病毒、猫肉瘤病毒、猫合胞病毒、线状病毒(Filovirus)、弗兰杜病毒(Flanders virus)、黄病毒(Flavivirus)、口蹄疫病毒、摩根堡病毒(Fort Morgan virus)、四角汉坦病毒(Four Corners hantavirus)、家禽腺病毒1型、禽痘病毒、弗罗德病毒(Friend virus)、γ逆转录病毒(Gammaretrovirus)、GB肝炎病毒、GB病毒、德国麻疹病毒(German measles virus)、盖塔病毒(Getah virus)、长臂猿白血病病毒、腺热病毒、山羊痘病毒、金色美鳊鱼病毒(golden shinner virus)、枯叶蛾病毒(Gonometa virus)、鹅细小病毒、颗粒体症病毒、格罗斯病毒(Gross’virus)、地松鼠乙型肝炎病毒、组A虫媒病毒、瓜纳瑞托病毒(Guanarito vrius)、豚鼠巨细胞病毒，豚鼠C型病毒、汉坦病毒(Hantaan virus)、汉坦病毒(Hantavirus)、文蛤呼肠孤病毒、兔纤维瘤病毒、HCMV(人巨细胞病毒)、血细胞吸附病毒2型、日本血凝病毒、出血热病毒、亨德拉病毒(hendra 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(Paramyxovirus)、副痘病毒(Parapoxvirus)、副痘苗病毒(paravaccinia virus)、细小病毒(Parvovirus)、细小病毒B19、细小病毒组、瘟疫病毒(Pestivirus)、白蛉病毒、海豹瘟热病病毒、小DNA病毒(Picodnavirus)、小RNA病毒(Picodnavirus)、猪巨细胞病毒-鸽痘病毒、皮里病毒(Piry virus)、皮春纳病毒(Pixuna virus)、小鼠肺炎病毒、肺病毒、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒、多DNA病毒、多面体病毒、多瘤病毒、多瘤病毒
(Polyomavirus)、牛多瘤病毒(Polyomavirus bovis)、猕猴多瘤病毒(Polyomavirus cercopitheci)、人多瘤病毒2型、maccacae多瘤病毒1型、鼠多瘤病毒1型(Polyomavirus muris 1)、鼠多瘤病毒2型(Polyomavirus muris 2)、狒狒多瘤病毒1型(Polyomavirus papionis 1)、狒狒多瘤病毒2型(Polyomavirus papionis 2)、sylvilagi多瘤病毒(Polyomavirus sylvilagi)、猿疱疹病毒1型(Pongine herpesvirus 1)、猪流行性腹泻病毒、猪血凝集脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪传播性胃肠炎病毒、猪C型病毒、痘病毒、痘病毒、天花痘病毒(poxvirus variolas)、希望山病毒(Prospect Hill virus)、原病毒(Provirus)、伪牛痘病毒、假狂犬病病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔肾空泡病毒、兔乳头瘤病毒、狂犬病病毒、浣熊细小病毒、浣熊痘病毒、Ranikhet病毒、大鼠巨细胞病毒、大鼠细小病毒、大鼠病毒、劳舍尔病毒(Rauscher’s virus)、重组痘苗病毒、重组病毒、呼肠孤病毒、呼肠孤病毒1型、呼肠孤病毒2型、呼肠孤病毒3型、爬行动物C型病毒、呼吸道感染病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道病毒、网状内皮组织增殖病毒、弹状病毒、carpia弹状病毒(Rhabdovirus carpia)、猴病毒(Rhadinovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、根前毛菌病毒(Rhizidiovirus)、立夫特山谷热病毒(Rift Valley fever virus)、Riley病毒(Riley’s virus)、牛瘟病毒、RNA肿瘤病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)、轮状病毒(Rotavirus)、麻疹病毒、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、风疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒(Rubivirus)、俄罗斯秋季脑炎病毒(Russian autumn encephalitis virus)、SA11猿猴病毒、SA2病毒、萨比亚病毒(Sabia virus)、鹭山病毒(Sagiyama virus)、松鼠猴疱疹病毒1型(Saimirine herpesvirus 1)、唾液腺病毒、白蛉热病毒组、圣德吉姆巴病毒(Sandjimba virus)、SARS病毒、SDAV(唾液腺泪腺炎病毒(sialodacryoadenitis virus))、海豹痘病毒、Semliki森林病毒、汉城病毒(Seoul virus)、绵羊痘病毒、兔纤维瘤病毒(Shope fibroma virus)、兔乳头瘤病毒(Shope papilloma virus)、猿猴泡沫病毒、猿猴甲型肝炎病毒、猿猴人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴副流感病毒、猿猴T细胞淋巴营养病毒、猿猴病毒、猿猴病毒40、单纯病毒(Simplexvirus)、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)、辛德比斯病毒、天花病毒、南美出血热病毒(South American hemorrhagic fever virus)、麻雀痘病毒、泡沫病毒(Spumavirus)、松鼠纤维瘤病毒、松鼠猴逆转录病毒、SSV1病毒组、STLV(猿猴嗜T淋巴细胞病毒)I型、STLV(猿猴嗜T淋巴细胞病毒)II型、STLV(猿猴嗜T淋巴细胞病毒)III型、丘疹性口炎病毒、豚鼠唾腺巨细胞病毒(submaxillary virus)、猪α疱疹病毒1型、猪疱疹病毒2型、猪痘病毒(Suipoxvirus)、沼泽热病毒、猪痘病毒、Swiss小鼠白血病病毒、TAC病毒、塔卡里伯复合病毒(Tacaribe complex virus)、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、特纳痘病毒(Tanapox virus)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、丁鲷呼肠孤病毒(Tench reovirus)、泰勒脑脊髓炎病毒、泰勒病毒、索戈托病毒(Thogoto virus)、索塔帕拉亚姆病毒(Thottapalayam virus)、蜱传脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、刁曼病毒(Tioman virus)、披膜病毒(Togavirus)、环状病毒(Torovirus)、肿瘤病毒、图帕伊阿病毒(Tupaia virus)、火鸡鼻气管炎病毒、火鸡痘病毒、C型逆转录病毒、D型肿瘤病毒、D型逆转录病毒组、溃疡性疾病弹状病毒、乌纳病毒(Una virus)、Uukuniemi病毒组、痘苗病毒、空泡病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒(Varicellovirus)、天花病毒(Varicola virus)、大天花病毒、天花病毒、Vasin Gishu病病毒、VEE病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉出血热病毒、水疱性口炎病毒、水泡性病毒、Vilyuisk病毒、蝰逆转录病毒、病毒性出血性败血症病毒、髓鞘脱落-呼吸急促病毒(Visna Maedi virus)、绵羊髓鞘脱落病毒(Visa virus)、田鼠痘病毒、VSv(水疱性口炎病毒)、沃洛尔病毒(Wallal virus)、沃里戈病毒(Warrego virus)、疣病毒、WEE病毒、西尼罗病毒(West Nile virus)、西部马脑炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒(Whataroa virus)、冬季呕吐病毒(Winter Vomiting Virus)、土拨鼠乙型肝炎病毒、卷毛猴肉瘤病毒、伤瘤病毒、WRSV病毒、亚巴猴肿瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)、亚巴病毒(Yaba virus)、亚塔痘病毒(Yatapoxvirus)、黄热病病毒或尤格波格丹诺夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus)。
(Paramyxovirus)、副痘病毒(Parapoxvirus)、副痘苗病毒(paravaccinia virus)、细小病毒(Parvovirus)、细小病毒B19、细小病毒组、瘟疫病毒(Pestivirus)、白蛉病毒、海豹瘟热病病毒、小DNA病毒(Picodnavirus)、小RNA病毒(Picodnavirus)、猪巨细胞病毒-鸽痘病毒、皮里病毒(Piry virus)、皮春纳病毒(Pixuna virus)、小鼠肺炎病毒、肺病毒、脊髓灰质炎病毒、脊髓灰质炎病毒、多DNA病毒、多面体病毒、多瘤病毒、多瘤病毒
(Polyomavirus)、牛多瘤病毒(Polyomavirus bovis)、猕猴多瘤病毒(Polyomavirus cercopitheci)、人多瘤病毒2型、maccacae多瘤病毒1型、鼠多瘤病毒1型(Polyomavirus muris 1)、鼠多瘤病毒2型(Polyomavirus muris 2)、狒狒多瘤病毒1型(Polyomavirus papionis 1)、狒狒多瘤病毒2型(Polyomavirus papionis 2)、sylvilagi多瘤病毒(Polyomavirus sylvilagi)、猿疱疹病毒1型(Pongine herpesvirus 1)、猪流行性腹泻病毒、猪血凝集脑脊髓炎病毒、猪细小病毒、猪传播性胃肠炎病毒、猪C型病毒、痘病毒、痘病毒、天花痘病毒(poxvirus variolas)、希望山病毒(Prospect Hill virus)、原病毒(Provirus)、伪牛痘病毒、假狂犬病病毒、鹦鹉痘病毒、鹌鹑痘病毒、兔纤维瘤病毒、兔肾空泡病毒、兔乳头瘤病毒、狂犬病病毒、浣熊细小病毒、浣熊痘病毒、Ranikhet病毒、大鼠巨细胞病毒、大鼠细小病毒、大鼠病毒、劳舍尔病毒(Rauscher’s virus)、重组痘苗病毒、重组病毒、呼肠孤病毒、呼肠孤病毒1型、呼肠孤病毒2型、呼肠孤病毒3型、爬行动物C型病毒、呼吸道感染病毒、呼吸道合胞病毒、呼吸道病毒、网状内皮组织增殖病毒、弹状病毒、carpia弹状病毒(Rhabdovirus carpia)、猴病毒(Rhadinovirus)、鼻病毒(Rhinovirus)、根前毛菌病毒(Rhizidiovirus)、立夫特山谷热病毒(Rift Valley fever virus)、Riley病毒(Riley’s virus)、牛瘟病毒、RNA肿瘤病毒、罗斯河病毒(Ross River virus)、轮状病毒(Rotavirus)、麻疹病毒、劳斯肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)、风疹病毒、麻疹病毒、风疹病毒(Rubivirus)、俄罗斯秋季脑炎病毒(Russian autumn encephalitis virus)、SA11猿猴病毒、SA2病毒、萨比亚病毒(Sabia virus)、鹭山病毒(Sagiyama virus)、松鼠猴疱疹病毒1型(Saimirine herpesvirus 1)、唾液腺病毒、白蛉热病毒组、圣德吉姆巴病毒(Sandjimba virus)、SARS病毒、SDAV(唾液腺泪腺炎病毒(sialodacryoadenitis virus))、海豹痘病毒、Semliki森林病毒、汉城病毒(Seoul virus)、绵羊痘病毒、兔纤维瘤病毒(Shope fibroma virus)、兔乳头瘤病毒(Shope papilloma virus)、猿猴泡沫病毒、猿猴甲型肝炎病毒、猿猴人免疫缺陷病毒、猿猴免疫缺陷病毒、猿猴副流感病毒、猿猴T细胞淋巴营养病毒、猿猴病毒、猿猴病毒40、单纯病毒(Simplexvirus)、辛诺柏病毒(Sin Nombre virus)、辛德比斯病毒、天花病毒、南美出血热病毒(South American hemorrhagic fever virus)、麻雀痘病毒、泡沫病毒(Spumavirus)、松鼠纤维瘤病毒、松鼠猴逆转录病毒、SSV1病毒组、STLV(猿猴嗜T淋巴细胞病毒)I型、STLV(猿猴嗜T淋巴细胞病毒)II型、STLV(猿猴嗜T淋巴细胞病毒)III型、丘疹性口炎病毒、豚鼠唾腺巨细胞病毒(submaxillary virus)、猪α疱疹病毒1型、猪疱疹病毒2型、猪痘病毒(Suipoxvirus)、沼泽热病毒、猪痘病毒、Swiss小鼠白血病病毒、TAC病毒、塔卡里伯复合病毒(Tacaribe complex virus)、塔卡里伯病毒(Tacaribe virus)、特纳痘病毒(Tanapox virus)、沙鼠痘病毒(Taterapox virus)、丁鲷呼肠孤病毒(Tench reovirus)、泰勒脑脊髓炎病毒、泰勒病毒、索戈托病毒(Thogoto virus)、索塔帕拉亚姆病毒(Thottapalayam virus)、蜱传脑炎病毒(Tick borne encephalitis virus)、刁曼病毒(Tioman virus)、披膜病毒(Togavirus)、环状病毒(Torovirus)、肿瘤病毒、图帕伊阿病毒(Tupaia virus)、火鸡鼻气管炎病毒、火鸡痘病毒、C型逆转录病毒、D型肿瘤病毒、D型逆转录病毒组、溃疡性疾病弹状病毒、乌纳病毒(Una virus)、Uukuniemi病毒组、痘苗病毒、空泡病毒、水痘带状疱疹病毒、水痘病毒(Varicellovirus)、天花病毒(Varicola virus)、大天花病毒、天花病毒、Vasin Gishu病病毒、VEE病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、委内瑞拉马脑脊髓炎病毒、委内瑞拉出血热病毒、水疱性口炎病毒、水泡性病毒、Vilyuisk病毒、蝰逆转录病毒、病毒性出血性败血症病毒、髓鞘脱落-呼吸急促病毒(Visna Maedi virus)、绵羊髓鞘脱落病毒(Visa virus)、田鼠痘病毒、VSv(水疱性口炎病毒)、沃洛尔病毒(Wallal virus)、沃里戈病毒(Warrego virus)、疣病毒、WEE病毒、西尼罗病毒(West Nile virus)、西部马脑炎病毒、西部马脑脊髓炎病毒、沃达罗河病毒(Whataroa virus)、冬季呕吐病毒(Winter Vomiting Virus)、土拨鼠乙型肝炎病毒、卷毛猴肉瘤病毒、伤瘤病毒、WRSV病毒、亚巴猴肿瘤病毒(Yaba monkey tumor virus)、亚巴病毒(Yaba virus)、亚塔痘病毒(Yatapoxvirus)、黄热病病毒或尤格波格丹诺夫奇病毒(Yug Bogdanovac virus)。
[0149] 细菌抗原来源于细菌，例如橙黄弗拉托菌(Acetobacter aurantius)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、以色列放线菌(Actinomyces israelii)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、茎瘤固氮根瘤菌(Azorhizobium caulinodans)、棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)、嗜吞噬细胞无形体(Anaplasma phagocytophilum)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、蕈状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、牙龈 拟 杆菌 (Bacteroides gingivalis)、Bacteroides melaminogenicus(产黑普雷沃氏菌(Prevotella melaminogenica))、汉赛巴尔通体(Bartonella henselae)、五日热巴尔通体(Bartonella quintana)、支气管败血性博德特氏菌(Bordetella bronchiseptica)、百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)、伯氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、流产布鲁氏杆菌(Brucella abortus)、马尔他布鲁氏杆菌(Brucella melitensis)、猪布鲁氏杆菌(Brucella suis)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)、类鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pseudomallei)、洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholderia cepacia)、肉芽肿荚膜杆菌(Calymmatobacterium granulomatis)、结肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、胎儿弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠弯曲杆菌(Campylobacter j ejuni)、幽门弯曲杆菌(Campylobacter pylori)、沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)、肺炎嗜衣原体(Chlamydophila pneumoniae)(肺炎衣原体，Chlamydia pneumoniae)、鹦鹉嗜衣原体(Chlamydophila psittaci)(鹦鹉热衣原体，Chlamydia psittaci)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)(先前称作魏氏梭菌(Clostridium welchii))、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、白喉棒状杆菌(Corynebacterium diphtheria)、梭形棒状杆菌(Corynebacterium fusiforme)、贝氏柯克斯体(Coxiella burnetii)、查非埃利希氏体(Ehrlichia chaffeensis)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鸟肠球菌(Enterococcus avium)、耐久肠球菌(Enterococcus durans)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、galllinarum肠球菌(Enterococcus galllinarum)、maloratus肠球菌(Enterococcus maloratus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、土拉热弗朗西丝菌(Francisella tularensis)、具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)、阴道加德那菌(Gardnerella vaginalis)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza)、副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenza)、百日咳嗜血杆菌(Haemophilus pertussis)、阴道嗜血杆菌(Haemophilus vaginalis)、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumonia)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜肺军团菌(Legionella pneumophila)、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)、扭脱甲烷杆菌(Methanobacterium extroquens)、多形微杆菌(Microbacterium multiforme)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)、白喉分枝杆菌(Mycobacterium diphtheria)、胞内分枝杆菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)、鼠麻风分枝杆菌(Mycobacterium lepraemurium)、草分枝杆菌(Mycobacterium phlei)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans)、生殖器支原体(Mycoplasma genitalium)、人型支原体(Mycoplasma hominis)、穿透支原体(Mycoplasma penetrans)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumonia)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus Bulgaricus)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitides)、出血败血性巴斯德菌(Pasteurella multocida)、土拉巴斯德菌(Pasteurella tularensis)、消化链球菌属(Peptostreptococcus)、牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)、铜绿色假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)、放射根瘤菌(Rhizobium radiobacter)、普氏立克次氏体(Rickettsia prowazekii)、鹦鹉热立克次氏体(Rickettsia psittaci)、五日热立克次氏体(Rickettsia Quintana)、立氏立克次氏体(Rickettsia rickettsii)、沙眼立克次氏体(Rickettsia trachomas)、亨氏罗克利马体(Rochalimaea hensela)、五日热罗克利马体(Rochalimaea quintana)、龋齿罗菌(Rothia dentocariosa)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、鸟链球菌(Streptococcus avium)、牛链球菌(Streptococcus bovis)、大鼠链球菌(Streptococcus cricetus)、屎链球 菌(Streptococcus faceium)、粪链 球菌(Streptococcus faecalis)、野 生链 球 菌 (Streptococcus ferus)、鹑 鸡 链 球 菌(Streptococcus gallinarum)、乳链球 菌(Streptococcus lactis)、轻 型链 球菌(Streptococcus mitior)、缓症 链球 菌(Streptococcus mitis)、变 形 链 球 菌(Streptococcus mutans)、口 腔 链 球菌(Streptococcus oralis)、肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumonia)、酿 脓 链球 菌(Streptococcus pyogenes)、鼠 链 球 菌(Streptococcus rattus)、唾 液 链 球菌(Streptococcus salivarius)、血 链球 菌(Streptococcus sanguis)、表 兄 链 球菌(Streptococcus sobrinus)、苍白密螺旋体(Treponema pallidum)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、霍乱弧菌(Vibrio cholera)、逗点弧菌(Vibrio comma)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)、鼠疫耶尔森氏菌(Yersinia pestis)或假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)。
[0150] 真菌抗原来源于真菌，例如伞状犁头霉(Absidia corymbifera)、荚膜阿耶罗菌(Ajellomyces capsulatus)、皮炎组织胞浆菌(Ajellomyces dermatitidis)、苯黑末节皮真菌(Arthroderma benhamiae)、粉节皮菌(Arthroderma fulvum)、石膏样节皮菌(Arthroderma gypseum)、内弯节皮菌(Arthroderma incurvatum)、太田节皮菌(Arthroderma otae)万博节皮菌(Arthroderma vanbreuseghemii)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigates)、黑曲霉(Aspergillus niger)、皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)、白色念珠菌(Candida albicans)、光滑念珠菌(Candida glabrata)、吉利蒙念珠菌(Candida guilliermondii)、克鲁斯念珠菌(Candida krusei)、近平滑念珠菌(Candida parapsilosis)、热带念珠菌(Candida tropicalis)、菌膜念珠菌(Candida pelliculosa)、卡氏枝孢霉(Cladophialophora carrionii)、粗球孢子菌(Coccidioides immitis)、新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)、小克银汉霉属(Cunninghamella sp.)、絮状表皮癣菌(Epidermophyton floccosum)、皮炎外瓶霉(Exophiala dermatitidis)、新型线黑粉菌(Filobasidiella neoformans)、裴氏着色霉(Fonsecaea pedrosoi)、茄病镰刀菌(Fusarium solani)、白地霉(Geotrichum candidum)、荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)、威尼克外瓶霉(Hortaea werneckii)、东方伊萨酵母(Issatschenkia orientalis)、灰马杜拉分支菌(Madurella grisae)、糠秕马拉色菌(Malassezia furfur)、球形马拉色菌(Malassezia globosa)、钝形马拉色菌(Malassezia obtuse)、厚皮马拉色菌(Malassezia pachydermatis)、限制性马拉色菌(Malassezia restricta)、斯洛菲马拉色菌(Malassezia slooffiae)、合轴马拉色菌(Malassezia sympodialis)、犬小孢子菌(Microsporum canis)、黄褐色小孢子菌(Microsporum fulvum)、石膏样小孢子菌(Microsporum gypseum)、卷枝毛霉菌(Mucor circinelloides)、红球丛赤壳菌(Nectria haematococca)、多变拟青霉(Paecilomyces variotii)、巴西副球孢子菌(Paracoccidioides brasiliensis)、马内菲青霉(Penicillium marneffei)、异常毕赤酵母(Pichia anomala)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、卡氏肺囊虫(Pneumocystis carinii)、波氏假阿利什霉(Pseudallescheria boydii)、稻根霉菌(Rhizopus oryzae)、深红类酵母菌(Rhodotorula rubra)、尖 端 赛多 孢 子菌(Scedosporium apiospermum)、裂 褶菌 (Schizophyllum commune)、申 克 孢 子 丝 菌 (Sporothrix schenckii)、须 毛 癣 菌 (Trichophyton mentagrophytes)、红色毛癣菌(Trichophyton rubrum)、疣状毛癣菌(Trichophyton verrucosum)、紫色毛癣菌(Trichophyton violaceum)、阿氏丝孢酵母(Trichosporon asahii)、皮肤毛孢子菌(Trichosporon cutaneum)、墨汁丝孢酵母(Trichosporon inkin)和粘性丝孢酵母(Trichosporon mucoides)。
[0151] 寄生抗原包括但不限于来自以下寄生物的免疫原性蛋白质或其片段：棘阿米巴属(Acanthamoeba)、非洲锥虫病(African trypanosomiasis)、细粒棘球蚴(Echinocococcus granu losus)、多 房 棘 球 绦虫 (Echinococcus multilocularis)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、克氏锥虫(Trypanosoma cruzi)、人蛔虫(Ascarislumbricoides)、广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)、异尖线虫(anisakid nematode)、果氏巴贝虫(Babesia microti)、结肠小袋纤毛虫(Balantidium coli)、温带臭虫(Cimex lectularius)、巴氏阿米巴(Balamuthia mandrillaris)、贝利蛔线虫属(Baylisascaris)、曼氏血吸虫(Schistosoma mansoni)、埃及血吸虫(S.haematobium)、日本血吸虫(S.japonicum)、曼氏裂体吸虫(Schistosoma masoni)、刚果血吸虫(Schistosoma intercalatum)、人芽囊原虫(B.hominis)、体虱(body lice)、肝毛细线虫(Capillaria hepatica)、菲律宾毛细线虫(Capillaria philippinensis)、瓦格拉蒂澳毕吸虫(Austrobilharzia variglandis)、迈氏唇鞭毛虫(Chilomastix mesnili)、微小内蜒(Endolimax nana)、结肠内阿米巴(Entamoeba coli)、迪斯帕内阿米巴(Entamoeba dispar)、哈特曼内阿米巴(Entamoeba hartmanni)、波列基内阿米巴(Entamoeba polecki)、布氏嗜碘阿米巴(Iodamoeba buetschlii)、华支睾吸虫(C.sinensis)、巴西钩口线虫(Ancylostoma brazilense)、犬钩口线虫(A.caninum)、锡兰钩口线虫(A.ceylanicum)、狭首钩刺线虫(Uncinaria stenocephala)、虱(lice)、隐孢子虫属(Cryptosporidium)、环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)、绦虫属(Taenia)、贝氏囊等孢虫(Cystoisospora belli)、脆双核阿米巴(Dientamoeba fragilis)、阔节裂头绦虫(Diphyllobothrium latum)、犬复孔绦虫(Dipylidium caninum)、麦地那龙线虫(Dracunculus medinensis)、肠贾第虫(Giardia intestinalis)、马来丝虫(Brugia malayi)、溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)、蛲虫(Enterobius vermicularis)、肝片吸虫(Fasciola hepatica)、大片吸虫(Fasciola gigantica)、布氏姜片 虫(Fasciolopsis buski)、刚地弓 形虫(Toxoplasma gondii)、旋毛 虫(Trichinella spiralis)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、十二指肠贾第鞭毛虫(Giardia duodenalis)、棘颚口线虫(Gnathostoma spinigerum)、异形异形吸虫(Heterophyes heterophyes)、微小膜壳绦虫(Hymenolepis nana)、利什曼原虫前鞭毛体(Leishmania promastigotes)、头虱(Pediculus humanus capitis)、体虱(Pediculus humanus corporis)、阴虱(Pthirus pubis)、罗阿丝虫(Loa loa)、间日疟原虫(Plasmodium vivax)、卵形疟原虫(Plasmodium ovale)、恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、三日疟原虫(Plasmodium malariae)、约氏疟原虫(Plasmodium yoelii)、水牛疟原虫(Plasmodium bubalis)、并列核疟原虫(Plasmodium iuxtanucleare)、弯曲疟原虫(Plasmodium circumflexum)、残疟原虫(Plasmodium relictum)、残疟原虫(Plasmodium relictum)、沃 氏 疟 原 虫 (Plasmodium vaughani)、minasense疟 原 虫 (Plasmodium minasense)、Plasmodium agamae、dominicum疟 原 虫(Plasmodium dominicum)、小 孢子虫(Brachiola algerae)、康氏短粒虫(B.connori)、小泡短粒虫(B.vesicularum)、兔脑炎微孢子虫(Encephalitozoon cuniculi)、海伦脑炎微孢子虫(E.hellem)、肠艾美尔球虫(E.intestinalis)、比氏肠微孢子虫(Enterocytozoon bieneusi)、锡兰微孢子虫(Microsporidium ceylonensis)、非洲微孢子虫(M.africanum)、眼微粒虫(Nosema ocularum)、匹里虫属(Pleistophora sp.)、人气管普孢虫(Trachipleistophora hominis)、害人气管普孢虫(T.anthropophthera)、角膜条微孢虫(Vittaforma corneae)、人疥螨(Sarcoptes scabiei var.hominis)、人肤皮蝇(Dermatobia hominis)、福氏耐格里阿米巴(Naegleria fowleri)、犬弓蛔虫(Toxocara canis)、猫弓蛔虫(Toxocara cati)、旋盘尾丝虫(Onchocerca volvulus)、猫后睾吸虫(Opisthorchis felineus)、卫氏并殖吸虫(Paragonimus westermani)、杰氏肺囊虫(Pneumocystis jirovecii)、双核匀变虫(Sappinia diploidea)、pedata均变虫(Sappinia pedata)、布氏锥虫(Trypanosoma brucei)、毛首鞭虫(Trichuris trichiura)、人蛔虫(Ascaris lumbricoides)、十二指肠钩虫(Anclostoma duodenale)、美洲板口线虫(Necator americanus)、粪类圆线虫(Strongyloides stercoralis)、fiilleborni类圆线虫(Strongyloides fiilleborni)、菲律宾毛细线虫(Capillaria philippinensis)、牛肉绦虫(Taenia saginata)、猪肉绦虫(Taenia solium)、亚洲绦虫(Taenia asiatica)、刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)、旋毛虫(Trichinella)或阴道毛滴虫(Trichomonas vaginalis)。
[0152] 癌抗原是对单个肿瘤具有特异性的蛋白质或其片段。例如，认为与来自同一个体或正常组织的对照样品或者已知标准对照值相比在肿瘤样品中过表达的蛋白质是肿瘤特异性抗原。可向细胞施用编码肿瘤特异性抗原的RNA以产生肿瘤特异性抗原。肿瘤特异性抗原或癌抗原或其片段可包括，例如，选自以下的抗原：HER2、BRCA1、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、MART-1/MelanA、前列腺血清抗原(PSA)、鳞状细胞癌抗原(SCCA)、卵巢癌抗原(OCA)、胰腺癌相关抗原(PaA)、MUC-1、MUC-2、MUC-3、MUC-18、癌胚抗原(CEA)、多形性上皮黏蛋白(PEM)、Thomsen-Friedenreich(T)抗原、gp100、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2、NY-ESO-1、CDK-4、b-联蛋白、MUM-1、胱天蛋白酶-8、KIAA0205、HPVE7、SART-1、SART-2、PRAME、BAGE-1、DAGE-1、RAGE-1、NAG、TAG-72、CA125、突变的p21ras、突变的p53、HPV16E7、RCC-3.1.3、MAGE-1、MAGE-2、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-11、GAGE-I、GAGE-6、GD2、GD3、GM2、TF、sTn、gp75、EBV-LMP 1、EBV-LMP 2、HPV-F4、HPV-F6、HPV-F7、甲胎蛋白(AFP)、CO17-1A、GA733、gp72、p-HCG、gp43、HSP-70、p17mel、HSP-70、gp43、HMW、HOJ-1、HOM-MEL-55、NY-COL-2、HOM-HD-397、HOM-RCC-1.14、HOM-HD-21、HOM-NSCLC-11、HOM-MEL-2.4、HOM-TES-11、黑素瘤神经节苷脂、TAG-72、前列腺酸性磷酸酶、蛋白质MZ2-E、叶酸结合蛋白LK26、截短的表皮生长因子受体(EGFR)、GM-2和GD-2神经节甘脂、多形性上皮黏蛋白、叶酸结合蛋白LK26、胰腺癌胚抗原、癌抗原15-3、癌抗原19-9、癌抗原549、癌抗原195或其片段。
[0153] 本发明的RNA还可编码阿尔茨海默病抗原或其片段。阿尔茨海默氏病抗原是选择性地在患有阿尔茨海默病的对象中表达的抗原。选择性地在患有阿尔茨海默病的对象中表达的抗原是这样的抗原，其在具有阿尔茨海默病的对象中表达而在没有患阿尔茨海默病的对象中不表达或以较低水平表达。或者，其是相对于没有患阿尔茨海默病的对象，在患有阿尔茨海默病的对象中过表达的抗原。阿尔茨海默病抗原可以是，例如，A68、Aβ40、Aβ42或其片段。
[0154] 可使用递送载剂或转染试剂(例如脂质体、纳米胶囊、微米颗粒、微球、脂质颗粒、囊泡等)来将本发明的核酸导入细胞和生物体中。特别地，可将核酸配制成用于包裹在脂质颗粒、脂质体、囊泡、纳米球或纳米颗粒等中递送。
[0155] 转染试剂包括但不限于阳离子脂质，例如lipofectin；阳离子甘油衍生物；和聚阳离子分子，例如聚赖氨酸。市售的转染试剂的实例包括，例如
TM TM
Lipofectamine (Invitrogen；Carlsbad，CA)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen；
TM TM
Carlsbad，CA)、293fectin (Invitrogen；Carlsbad，CA)、Cellfectin (Invitrogen；
TM TM
Carlsbad，CA)、DMRIE-C (Invitrogen；Carlsbad，CA)、FreeStyle MAX(Invitrogen；
TM
Carlsbad，CA)、Lipofectamine 2000CD(Invitrogen ；Carlsbad，CA)、
TM
Lipofectamine (Invitrogen；Carlsbad，CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad，CA)、TM TM
Oligofectamine (Invitrogen；Carlsbad，CA)、Optifect (Iuvitrogen；Carlsbad，CA)、X-tremeGENE Q2转染试剂(Roche；Grenzacherstrasse，Switzerland)、DOTAP脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse，Switzerland)、DOSPER脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse，Switzerland) 或 Fugene(Grenzacherstrasse，Switzerland)、Transfectam(R) 试 剂TM TM
(Promega Madison，WI)、TransFast 转 染 试 剂(Promega Madison，WI)、Tfx -20 试TM TM
剂 (Promega Madison，WI)、Tfx -50 试 剂 (Promega Madison，WI)、DreamFect (OZ Biosciences；Marseille，France)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille，
3 TM
Frahce)、TransPassD1转染试剂(New England Biolabs；Ipswich，MA，USA)、LyoVec /TM
LipoGen (Invitrogen；San Diego，CA，USA)、PerFectin转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、NebroPORTER转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、GenePORTER转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、Cytofectin转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、BaculoPORTER转染试TM
剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、TroganPORTER 转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、RiboFect(Bioline；Taunton，MA，USA)、PlasFect(Bioline；Taunton，MA，USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View，CA，USA)、SureFECTOR(B-Bridge TM
International；Mountain View，CA，USA)或HiFecf (B-Bridge International，Mountain TM
View，CA，USA)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKOTM ，Minis Bio LLC，Madison，WI)。
TM TM
Lipofectamine (Invitrogen；Carlsbad，CA)、Lipofectamine 2000 (Invitrogen；
TM TM
Carlsbad，CA)、293fectin (Invitrogen；Carlsbad，CA)、Cellfectin (Invitrogen；
TM TM
Carlsbad，CA)、DMRIE-C (Invitrogen；Carlsbad，CA)、FreeStyle MAX(Invitrogen；
TM
Carlsbad，CA)、Lipofectamine 2000CD(Invitrogen ；Carlsbad，CA)、
TM
Lipofectamine (Invitrogen；Carlsbad，CA)、RNAiMAX(Invitrogen；Carlsbad，CA)、TM TM
Oligofectamine (Invitrogen；Carlsbad，CA)、Optifect (Iuvitrogen；Carlsbad，CA)、X-tremeGENE Q2转染试剂(Roche；Grenzacherstrasse，Switzerland)、DOTAP脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse，Switzerland)、DOSPER脂质体转染试剂(Grenzacherstrasse，Switzerland) 或 Fugene(Grenzacherstrasse，Switzerland)、Transfectam(R) 试 剂TM TM
(Promega Madison，WI)、TransFast 转 染 试 剂(Promega Madison，WI)、Tfx -20 试TM TM
剂 (Promega Madison，WI)、Tfx -50 试 剂 (Promega Madison，WI)、DreamFect (OZ Biosciences；Marseille，France)、EcoTransfect(OZ Biosciences；Marseille，
3 TM
Frahce)、TransPassD1转染试剂(New England Biolabs；Ipswich，MA，USA)、LyoVec /TM
LipoGen (Invitrogen；San Diego，CA，USA)、PerFectin转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、NebroPORTER转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、GenePORTER转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、GenePORTER 2转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、Cytofectin转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、BaculoPORTER转染试TM
剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、TroganPORTER 转染试剂(Genlantis；San Diego，CA，USA)、RiboFect(Bioline；Taunton，MA，USA)、PlasFect(Bioline；Taunton，MA，USA)、UniFECTOR(B-Bridge International；Mountain View，CA，USA)、SureFECTOR(B-Bridge TM
International；Mountain View，CA，USA)或HiFecf (B-Bridge International，Mountain TM
View，CA，USA)或基于非阳离子脂质的载体(例如，Transit-TKOTM ，Minis Bio LLC，Madison，WI)。
[0156] 这些制剂可优选用于引入本文公开核酸的可药用制剂。脂质体的形成和使用是本领域技术人员公知的。最近，开发了具有改善的血清稳定性和循环半衰期的脂质体(美国专利No.5,741,516)。此外，已描述了脂质体和脂质体样制备物作为潜在药物载体的多种方法(美国专利No.5,567,434；5,552,157；5,565,213；5,738,868和5,795,587)。
[0157] 脂质体已被成功用于很多通常对通过其他方法的转染具有抗性的细胞类型。此外，脂质体免受基于病毒的递送系统所特有的DNA长度约束。脂质体已被有效用于将基因、药物、放射治疗剂、病毒、转录因子和别构剂引入多种培养的细胞系和动物中。此外，检测脂质体介导之药物递送的有效性的一些成功临床试验也已完成。
[0158] 脂质体由分散在水性介质中的磷脂形成，并自发形成多层同心双层囊泡(也称为多层囊泡(MLV))。MLV的直径一般为25nm至4μm。对MLV进行超声导致形成直径为200.ANG至500.ANG、芯中包含水性溶液的小单层裳泡(SUV)。
[0159] 在一些实施方案中，可使用纳米颗粒或微米颗粒来将核酸递送至生物体或对象。本文使用的术语纳米颗粒或微米颗粒指平均颗粒尺寸(即直径)分别为纳米或更小或者微米或更小的颗粒。该术语包括所有形式的颗粒，其包括固体和多孔颗粒以及空心球和胶囊以及杂合和多相颗粒。例如，所述颗粒可包括聚合物壳(纳米胶囊)、聚合物基质(纳米球)或嵌段共聚物，其可以是交联的或者被脂质层或双层包围。
[0160] 可将本发明的核酸并入这些颗粒中、分散在其上、与其缀合或通过其他方式与其附着。
[0161] 已提出很多聚合物用于合成聚合物-药剂缀合物，其包括聚氨基酸、多糖(例如糊精或葡聚糖)和合成的聚合物(例如N-(2-羟基丙基)甲基丙烯酰胺(HPMA)共聚物)。合适的制备方法在本领域中进行了描述，例如在Veronese等(1999)IL Farmaco 54：497-516中。其他的合适聚合物可以是制药领域中已知的任何聚合物，并且包括但不限于天然存在的聚合物例(如羟基乙基淀粉、蛋白质、糖肽和脂质)。合成的聚合物还可以是直链或支链的、取代或未取代的、均聚物、共聚物或者两种或更多种不同合成单体的嵌段共聚物。
[0162] 纳米胶囊一般可以以稳定且可重复的方式包封物质。可使用能够体内降解的聚合物来设计这些超细颗粒(尺寸为约0.1μm)以避免由于细胞内聚合物过载而引起的副作用。考虑使用满足这些要求的生物可降解聚烷基-氰基丙烯酸酯纳米颗粒。
[0163] 以下实施例出于说明实践本发明的一些具体实例的目的而提供，并非旨在限制本发明的范围。如对本领域普通技术人员明显的，本发明将应用于多种组合物和方法中。实施例
[0164] 材料和方法：
[0165] 构建表达质粒
[0166] 将此前描述的质粒经如下改良以产生CMV-cGFP-mMALAT1_3’表达构建体(Gutschner等2011)：将CMV启动子和cGFP开放阅读框克隆到pCRII-TOPO载体(Life Technologies)的多克隆位点中。将mMALAT1_3’区(GenBank登陆号EF177380的nt
6581至6754)以有义方向(以产生CMV-cGFP-mMALAT1_3’有义)或反义方向(以产生
CMV-cGFP-mMALAT1_3’反义)插入到cGFP下游的NotI克隆位点中。类似地，使用NotI克隆位点来产生以SV40多腺苷酸化信号、bGH多腺苷酸化信号、mMENβ_3’区和所有的突变体mMALAT1_3’区结尾的CMV-cGFP表达质粒。将小鼠MALAT1的nt 1676至3598插入到CMV-cGFP-mMALAT1_3’有义质粒的EcoRV和BstEII克隆位点中以产生CMV-核斑F2-mMALAT1_3’表达质粒。在表1中提供所有质粒插入物的序列(从上到下为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.61)。
6581至6754)以有义方向(以产生CMV-cGFP-mMALAT1_3’有义)或反义方向(以产生
CMV-cGFP-mMALAT1_3’反义)插入到cGFP下游的NotI克隆位点中。类似地，使用NotI克隆位点来产生以SV40多腺苷酸化信号、bGH多腺苷酸化信号、mMENβ_3’区和所有的突变体mMALAT1_3’区结尾的CMV-cGFP表达质粒。将小鼠MALAT1的nt 1676至3598插入到CMV-cGFP-mMALAT1_3’有义质粒的EcoRV和BstEII克隆位点中以产生CMV-核斑F2-mMALAT1_3’表达质粒。在表1中提供所有质粒插入物的序列(从上到下为SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.61)。
[0167] 表1
[0168]
[0169]
[0170]
[0171]
[0172]
[0173]
[0174]
[0175]
[0176]
[0177]
[0178] 转染和RNA分析
[0179] 将HeLa细胞在37℃、5％CO2下培养在包含高葡萄糖、补充有青霉素-链霉素和10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)(Life Technologies)中。使用Lipofectamine 2000(Life Technologies)转染CMV-cGFP表达质粒并使用Trizol(Life Technologies)按照制造商的说明分离总RNA。如前所述进行Northern印迹(Wilusz等2008)。对于RNase H处理，首先将9μg总RNA与20pmol反义寡核苷酸混合，并加热至
65℃，持续10分钟。在允许反义寡核苷酸通过缓慢冷却退火之后，将RNA在37℃下用RNase H(New England Biolabs)处理30分钟，随后进行Northern印迹分析。如前所述进行核和细胞质分级(Wilusz等2008)。在表2中提供所有的寡核苷酸探针序列(从上到下为SEQ ID NO.62至SEQ ID NO.69)。如前所述使用微RNA克隆接头3(microRNA Cloning Linker
3)(Integrated DNA Technologies)进行3’RACE PCR(Wilusz等2008)。
65℃，持续10分钟。在允许反义寡核苷酸通过缓慢冷却退火之后，将RNA在37℃下用RNase H(New England Biolabs)处理30分钟，随后进行Northern印迹分析。如前所述进行核和细胞质分级(Wilusz等2008)。在表2中提供所有的寡核苷酸探针序列(从上到下为SEQ ID NO.62至SEQ ID NO.69)。如前所述使用微RNA克隆接头3(microRNA Cloning Linker
3)(Integrated DNA Technologies)进行3’RACE PCR(Wilusz等2008)。
[0180] 表2
[0181]
[0182]用于cGFP转录物的RNase H寡核苷酸 Cgcgcttctcgttggggtcc(SEQ ID No.68)
用于mCherry转录物的RNase H寡核苷酸Ttcgtactgttccacgatgg(SEQ ID NO.69)
用于mCherry转录物的RNase H寡核苷酸Ttcgtactgttccacgatgg(SEQ ID NO.69)
[0183] 蛋白质分析
[0184] 使用Nu-PAGE Bis-Tris电泳系统(Life Technologies)按照制造商的说明进行Western印迹。cGFP抗体获自GenScript，而黏着斑蛋白抗体获自Sigma-Aldrich。
[0185] 两色荧光报道系统
[0186] 两色荧光报道载体在之前已进行了描述(Mukherji等2011)，其在mCherry的3’UTR中包含SV40多腺苷酸化信号。使用位于SV40多腺苷酸化信号侧翼的EcoRV和AatII克隆位点来用mMALAT1_3’区替换该多腺苷酸化信号。使用HindIII和SalI克隆位点将用于let-7的靶位点插入到mCherry的3’UTR中，并且在表1中提供了该序列。在使用Lipofectamine 2000转染等同量(250ng)的报道质粒和rtTA前20小时，将HeLa细胞以
175,000个细胞/12孔板的孔接种。在转染时，将培养基更换成补充有2μg/mL多西环素(Sigma)的完全DMEM。在指定之处，将对照siRNA(siGENOME非靶向siRNA#2，Dharmacon)或鼠let-7g的siRNA等同物(Dharmacon)以40nm的终浓度共转染。在转染后18至20小时进行流式细胞术或RNA分离。流式细胞术、QPCR和原始数据处理如前所述进行(Mukherji等2011)并在本文中进行了进一步描述。
175,000个细胞/12孔板的孔接种。在转染时，将培养基更换成补充有2μg/mL多西环素(Sigma)的完全DMEM。在指定之处，将对照siRNA(siGENOME非靶向siRNA#2，Dharmacon)或鼠let-7g的siRNA等同物(Dharmacon)以40nm的终浓度共转染。在转染后18至20小时进行流式细胞术或RNA分离。流式细胞术、QPCR和原始数据处理如前所述进行(Mukherji等2011)并在本文中进行了进一步描述。
[0187] 结构模型预测
[0188] 使用Rosetta 3.4版本(rosettacommons.org)来进行从头RNA折叠(Das和Baker2007；Das等2010)。对于MALAT1Comp.14转录物3’端的收敛模型，将前五个核苷酸(AAGGG)去除。限定疑似的螺旋相互作用(限定所有的9U-A·U碱基三联体)并对2,000个模型进行计算。模型在 至 间收敛(参见图14C)。对全长(59-nt)Comp.14 3’端进行相同的程序，但是由于5’端具有高的灵活性而不能获得收敛性。
[0189] 流式细胞术、QPCR和数据处理
[0190] 如前所述进行流式细胞术和原始数据处理(Mukherji等2011)。简单地，将约100,000个细胞在使用FACSDiva软件的LSRII分析仪(Becton Dickinson)上运行。使用FlowJo将活的单细胞群根据前向和侧向散射图进行设门。由来自转染样品每个细胞的eYFP和mCherry值减去平均自体荧光加两倍的未转染细胞的标准偏差作为背景荧光的对照。将与背景无法区别的细胞(在减除背景后荧光值小于0)排除，而不再进行进一步分析。
使用常规的MATLAB脚本(MathWorks)进行背景减除和下游分析。
使用常规的MATLAB脚本(MathWorks)进行背景减除和下游分析。
[0191] 使用Trizol分离总RNA、用TURBO无DNA试剂盒(Life Technologies)处理并使用Superscript III(Life Technologies)由随机六聚体进行逆转录。将得到的cDNA一式三份地使用Power SYBR Green(Life Technologies)进行QPCR反应，在Applied Biosystems7500实时PCR仪器上进行。QPCR引物序列(SEQ ID NO 169至SEQ ID NO.171)：eYFP正向(5’-CCACCTACGGCAAGCTGACC)、eYFP反 向(5’-GGTAGCGGGCGAAGCACT)、mCherry 正 向(5’-GAACGGCCACGAGTTCGAGA)和mCherry反向(5’-CTTGGAGCCGTACATGAACTGAGG)。
[0192] 实施例1：产生准确重演MALAT1 3’端加工的表达质粒
[0193] 尽管显然切割MALAT1以产生mascRNA(Wilusz等2008)，但是尚未报道重演该体内加工事件的质粒表达系统。可能如下产生这样的质粒：在CMV启动子下游插入珊瑚绿色荧光蛋白(cGFP)开放阅读框(ORF)，其后是小鼠MALAT1基因座3’端的174-nt片段(mMALAT1的nt 6581-6754)(图1D)。该区域(即指mMALAT1_3’)从人到斑马鱼在进化上是高度保守的(图1B)，并且包含非常保守的富含U的基序和富含A的基序、RNase P切割位点(在nt 6690之后)以及mascRNA(nt 6691-6748)。作为对照，产生具有以反义方向克隆到cGFP下游之mMALAT1_3’区的质粒以验证mascRNA的表达取决于CMV驱动的转录物的加工。
[0194] 将CMV-cGFP-mMALAT1_3’有义和反义质粒瞬时转染到人HeLa细胞中并在24小时后分离总RNA。对于这样准确重演MALAT1 3’端加工的系统，其必须产生两种转录物：约850-nt的cGFP-MALATl_3’RNA以及已经由RNases P和Z以及CCA加成酶加工的成熟(61-nt)小鼠mascRNA(图1D)。小鼠和人mascRNA之间存在四个序列变化(Wilusz等2008)，从而使设计的寡核苷酸探针能够区分同源物(图1E中“仅小鼠mascRNA”所指的探针)或者通过Northern印迹分析检测小鼠和人mascRNA两者(图1E中“所有mascRNA”所指的探针)。在转染有义而非反义表达质粒的细胞中，产生成熟的mascRNA并且其表达超过在模拟处理的细胞中观察到的水平约16倍(图1E)。使用3’RACE PCR来证实由所述质粒产生的mascRNA是经适当加工的并且其3’端在转录后添加了CCA(数据未示出)。同时，对使用该质粒表达的突变mascRNA转录物进行CCACCA添加，并且其在体内快速降解(图8)，从而证实之前的发现：CCA加成酶在tRNA质量控制中发挥关键作用(Wilusz等2011)。这些结果表明此质粒产生真实mascRNA(bona fide mascRNA)。
[0195] 为了确定有义质粒是否在体内表达稳定且经RNase P在其3’端适当加工的cGFP-MALATl_3’RNA，将来自转染的总RNA首先与临近cGFP ORF 3’端互补的寡核苷酸杂交，然后进行RNase H消化。将转录物切割成较小的尺寸以允许Northern印迹以高分辨率进行来验证RNase P切割的准确性。用有义质粒观察到预期尺寸(190-nt)的单一条带，而用反义质粒则没有(图1E)。这些结果表明cGFP-MALAT1_3’有义初级转录物被RNase P有效切割以产生两种预期的成熟转录物(图1D)，因而准确地重演体内MALAT1的3’端加工。反义质粒可能不能产生稳定的cGFP mRNA，因为转录物不包含功能多腺苷酸化信号，从而导致所述转录物通过核监督途径(nuclear surveillance pathway)快速降解。
[0196] 由于mascRNA由CMV启动子驱动的转录物有效产生(图1E)，因此发现MALAT1启动子并不是RNase P或任何其他tRNA加工因子募集到新生RNA所需要的。此外，发现体内产生mascRNA所需的唯一的MALAT1初级转录物区是tRNA样结构自身(图9)。与当前通过RNase P识别底物的模型一致(Kirsebom 2007)，所述酶将可能识别并切割任何tRNA样结构，不管用于产生转录物的启动子为何。实际上，在我们的表达系统中，将MENβtRNA-样结构置于cGFP的下游类似地产生有效的RNase P切割(图10)。
[0197] 实施例2：保守的富含U的基序保护MALAT1的3’端免受降解
[0198] 由于紧邻MALAT1RNase P切割位点上游存在的高度保守的富含U和富含A的基序不是mascRNA生物发生所需要的(图1B和图9)，因此假设它们可能替代用于防止MALAT1的核输出和/或用于在RNase P切割后稳定长非编码RNA。使用生物化学分级来从经转染的HeLa细胞分离核和细胞质总RNA，发现cGFP-MALAT1_3’报道RNA被有效输出到细胞质(图2B)。实际上，该转录物与以规范poly A尾结尾的cGFP转录物一样有效地被输出(图2A、2B)。因此，MALAT1的3’端在核滞留中不起作用。作为替代，在小鼠MALAT1体(nt 1676-3598)中鉴定这样的区域，其在被插入到表达构建体(以产生CMV-核斑F2-mMALAT1_3’质粒，图2A)时足以引起核滞留(图2C)。这与此前的报道一致，所述报道表明该区域对靶向内源MALAT1至核斑是重要的(Tripathi等2010；Miyagawa等2012)。
[0199] 为了替代地探究高度保守的富含U的基序在MALAT1RNA稳定性中的可能作用，产生包含在富含U的基序1、富含U的基序2或两个基序中5-nt突变的cGFP-mMALAT1_3’表达质粒并将其转染(图2D)。这些突变对RNase P切割或mascRNA生物发生无影响(图2E，下面)，但引起成熟cGFP-MALATl_3’RNA被有效降解(图2E，上面)。将类似的突变引入到核滞留的报道转录物中也引起RNA不能被Northern印迹分析检测到(1图11b)，这表明富含U的基序1和2两者均是在核和细胞质中稳定MALAT1的3’端所需要的。
[0200] 使用基于连接的3’RACE PCR方法来了解突变转录物被降解的机制。除检测到从其3’端发生不同程度简单降解的转录物之外，还意外地检测到很多以短的转录后添加的富含U尾结尾的cGFP-MALATl_3’转录物(在56个经测序的RACE克隆中的10个)，表明在野生型和突变MALATl3’端两者的降解中发生尿苷化(图2F)。观察到几种降解模式：(1)MALAT1 3’端在尿苷化之前发生非模板腺苷酸化(例如Mut U1 RACE#1)，(2)向全长转录物添加富含U的尾(例如Mut U2 RACE#1)和(3)3’端在尿苷化之前发生部分降解(例如WT RACE#1)(图2F)。最后的这种模式特别令人感兴趣，因为其暗示正降解MALAT1 3’端时3’-5’外切核酸酶停止作用。然后，可能添加U尾以提供新的单链尾用于外切核酸酶识别并重新开始衰变过程(Houseley等2006)。还使用核滞留的报道转录物检测到尿苷化衰变中间产物(图11C)，表明尿苷化可能发生在核和细胞质两者中。这些结果表明富含U的基序1和2可能在通过防止尿苷化和3’-5’外切核酸酶的降解来稳定MALAT1的3’端方面是关键的。
[0201] 实施例3：在MALAT1和MENβ的3’端处形成三螺旋
[0202] 已鉴定出富含U的基序1和2对于MALAT1 3’端的稳定性是关键的，研究稳定cGFP-MALATl_3’转录物所需的最小序列元件。使用大量的诱变，发现可将MALATl 3’端的110个核苷酸中的51个(Comp.14，图2D)去除而对cGFP-MALATl_3’RNA的稳定性具有很小影响或没有影响(图2G和图12)。与MALAT1(图1B)和MENβ(图1C)的进化保守模式一致，非常保守的富含A的基序和富含U的基序以及保守茎环的下半部分是cGFP-MALATl_3’稳定性所需要的(图2D和图3A)。相比之下，更加变化(divergent)的区域(例如富含U的基序2与富含A的段之间的序列)是非必要的或者在稳定MALAT1的3’端中仅具有轻微的支持作用(图12)。
[0203] 使用Mfold的最小功能性MALAT1 3’端的二级结构预测表明富含A的段应与富含U的基序2碱基配对(图3A)。由于这些潜在的碱基对在整个进化中完全保守(图1B、C)，因此产生cGFP-MALATl_3’表达质粒，其中特定碱基对受到破坏(图3B和图18)。如图3C和3D中所示，当在富含U的基序2或富含A的段中引入两个错误匹配时，cGFP-MALATl_3’RNA不能累积。当通过在这两个基序中引入突变来重建碱基配对时，检测到cGFP-MALATl_3’RNA的水平发生显著拯救(rescue)(图3C、D)。这表明富含U的基序2与富含A的段之间的碱基配对对于稳定MALAT1的3’端是关键的。有趣的是，因富含A的段中的GC被突变成AA而以短均聚poly A尾结尾的cGFP-MALATl_3’在体内也被降解(数据未示出)，表明短poly A尾不能在功能上替代MALAT1 3’端的碱基配对。如所预期的，当将6个碱基对破坏时，突变的cGFP-MALATl_3’转录物不能体内累积(图3E)。然而，预料不到的是引入重建这6个碱基对的补偿性突变仍不能拯救cGFP-MALATl_3’的转录物水平(图3E)，表明富含U的基序2与富含A的段之间的碱基配对是必需的但对于MALAT1稳定性而言是不够的。
[0204] 由于富含U的基序1也是MALAT1 3’端稳定性所需要的(图2E)、是高度保守的(图1B、C)并且被预计紧邻富含U的基序2和富含A的段(图3A)，因此我们猜测富含U的基序1也可能与双螺旋(例如三螺旋中的二螺旋)相互作用(图4A)。Felsenfeld、Davies和Rich在1957年的创始工作首次描述了U-A·U三螺旋结构，其中poly(U)第三链与poly A/poly(U)之Watson-Crick碱基配对螺旋的大沟形成Hoogsteen氢键(Felsenfeld等1957)(图4B)。最近，已在端粒酶RNA(Qiao和Cech 2008))中以及通过Kaposi肉瘤相关孢疹病毒和相关γ疱疹病毒产生之非编码RNA的3’端(Mitton-Fry等2010；Tycowski等2012)鉴定出天然存在的U-A·U RNA三螺旋结构。在后一种情况下，这种结构是稳定RNA所必需的。C-G·C三螺旋在结构上与U-A·U类似，但是该结构的完全稳定需要第三链中胞嘧啶的质子化，从而使C-G·C三螺旋在酸性条件下是有利的(图4B)。重要的是，在MALAT1和MENβ的3’端处，富含U的基序和富含A的基序是经适当定向的以允许通过富含U的基序1与Watson-Crick碱基配对螺旋大沟的Hoogsteen氢键键合形成分子内三螺旋结构，而所述Watson-Crick碱基配对螺旋由富含U的基序2和富含A的段形成(图4A)。
[0205] 使用具有全原子细化(full atom refinement)的RNA的片段拼接(也称为FARFAR)来评估MALAT1的3’端形成三螺旋的能力(Das等2010)。这种基于Rosetta的算法将低能量三级RNA结构从头预测至接近原子分辨率(Das和Baker 2007)。如图4C中所示，预测59-nt Comp.14mMALAT1_3’区将能够折叠成在连续Watson-Crick碱基配对螺旋的每端均具有环的杠铃样结构，其部分进一步与大沟中结合的富含U的基序1形成三螺旋结构。
通过富含A的段中A核苷酸的Hoogsteen面与富含U的基序1中U核苷酸的Watson-Crick面之间的碱基配对能够形成9个U-A·U碱基三联体(图4C、D和图14)。从建模不清楚是否形成C-G·C三联体。尽管FARFAR不允许Hoogsteen碱基处的质子化胞苷残基建模(图
4D)，但是其他的空间约束可防止该C-G·C三联体的形成。该预测结构缺乏链断开并且具有合理的立体化学，表明不存在阻断三螺旋形成的结构约束。恰好地，经预测，对MALAT1 3’端稳定性不关键并因此由Comp.14转录物(图2D)缺失的核苷酸均位于在物理上与芯三螺旋分开的杠铃样结构末端的环区中(图4A、C)。此外，该结构模型表明MALAT1的3’末端核苷酸是芯三螺旋的一部分，并因此被很好地保护而免受非模板核苷酸的添加或外切核酸酶影响。可能的是，解开该三螺旋将需要显著的自由能。与该模型一致，3’RACE揭示了3’-5’外切核酸酶常常在该结构中暂停(图2F)。
通过富含A的段中A核苷酸的Hoogsteen面与富含U的基序1中U核苷酸的Watson-Crick面之间的碱基配对能够形成9个U-A·U碱基三联体(图4C、D和图14)。从建模不清楚是否形成C-G·C三联体。尽管FARFAR不允许Hoogsteen碱基处的质子化胞苷残基建模(图
4D)，但是其他的空间约束可防止该C-G·C三联体的形成。该预测结构缺乏链断开并且具有合理的立体化学，表明不存在阻断三螺旋形成的结构约束。恰好地，经预测，对MALAT1 3’端稳定性不关键并因此由Comp.14转录物(图2D)缺失的核苷酸均位于在物理上与芯三螺旋分开的杠铃样结构末端的环区中(图4A、C)。此外，该结构模型表明MALAT1的3’末端核苷酸是芯三螺旋的一部分，并因此被很好地保护而免受非模板核苷酸的添加或外切核酸酶影响。可能的是，解开该三螺旋将需要显著的自由能。与该模型一致，3’RACE揭示了3’-5’外切核酸酶常常在该结构中暂停(图2F)。
[0206] 尽管所述结构模型预测了可形成三螺旋结构，但是其并未证明所述三螺旋结构确实在体内形成。尽管如此，许多独立的证据线支持所述三螺旋结构在体内的存在和功能显著性。第一，在MALAT1(图1B)和MENβ(图1C)的3’端处的所有碱基三联体在整个进化中是接近完全保守的。第二，图3中的突变分析揭示富含U的基序2和富含A的段之间的碱基配对是必需的但不足以用于稳定MALAT1的3’端。特别关注的是Mut U2/A-CGAAAA转录物(图3B、E)，其中在富含U的基序2和富含A的段之间形成6个碱基对的核苷酸在螺旋之间交换。这些核苷酸交换不能改变双螺旋的结构完整性，但能消除形成碱基三联体的潜力，从而为该结构稳定MALAT1提供间接支持。第三，为了直接测试体内三螺旋的存在，我们研究了将MALAT1 3’端的4个U-A·U碱基三联体(图4A中以紫色所示)转变成C-G·C碱基三联体的效果(图4E)。将4个连续的A核苷酸突变成G(泳道4，图4E)导致cGFP-MALATl_3’转录物变得不稳定并在体内不被翻译(有关翻译的更多信息参见下文)。与只能够用C-G碱基对形成双螺旋的转录物(泳道5)相比，当能够形成C-G·C碱基三联体时，观察到显著更高的蛋白质表达(泳道6，图4E)。这强烈证明了体内形成功能性三螺旋。
[0207] 为了随后研究整个三螺旋结构是否对于体内稳定MALAT1的3’端是必需的，产生了cGFP-MALATl_3’表达质粒，其中选择的碱基三联体通过突变富含U的基序1而受到破坏(图4F)。有趣的是，发现富含U的基序1中间的突变(Mut U1.1和Mut U1.2)对cGFP-MALATl_3’转录物水平无影响(图4F)。该结果与来自图3C和3D的数据一致，其中该中间区域中的富含U的基序2和富含A的段之间的碱基配对是RNA稳定性所必需的，但双螺旋任意一侧上的核苷酸的身份(和因此形成或不形成碱基三联体的能力)则不是关键的。相比之下，三螺旋两端的碱基三联体对稳定cGFP-MALATl_3’则均是关键的(Mut U1.3至Mut U1.5，图4F)。这些结果支持这样的模型，其中MALAT1三螺旋每端的U-A·U碱基三联体确保整个结构的结构稳定性并防止转录物被3’-5’外切核酸酶降解。
[0208] 实施例4：三螺旋结构还起翻译增强子元件作用
[0209] 由于cGFP-MALATl_3’报道mRNA是稳定的并被有效地输出到细胞质(图2B)，因此对cGFP开放阅读框是否得到翻译进行研究。预料不到的是，与以poly A尾结尾的那些转录物相比，从以mMALAT1_3’区结尾的cGFP转录物观察到类似的蛋白质表达水平(图5A)。这表明MALAT1的3’端还可起促进翻译的功能。类似地，MENβ的3’端也支持显著的cGFP蛋白表达(图10C)。这些结果是特别预料不到的，因为考虑到外源mMALAT1和MENβ是核滞留的转录物并因此认为不与翻译机器相互作用。
[0210] 为了更好地定量相对于从以poly A尾结尾的转录物获得的翻译输出而从以MALAT1 3’端结尾的转录物获得的翻译输出，使用两色荧光报道系统来允许测量单哺乳动物细胞中的基因表达(Mukherji等2011)。该构建体由双向的Tet可诱导启动子组成，所述启动子驱动标记有核定位序列之荧光蛋白mCherry和增强的黄色荧光蛋白(eYFP)的表达(图5)。在mCherry的3’UTR中插入SV40多腺苷酸化信号或mMALAT1_3’区。相比之下，eYFP的3’UTR总是以SV40多腺苷酸化信号结尾，从而使eYFP表达能够用作内归一化对照，因为其是所述双向启动子转录和翻译活动的敏感性报道子。使用流式细胞术来监测单个细胞中的蛋白质表达，当两种转录物均以规范poly A尾结束时对获得的mCherry和eYFP蛋白的水平进行比较。通过计算在每个分析细胞中检测到的mCherry蛋白与eYFP蛋白的比，发现与预期的一样，荧光蛋白的表达是高度相关的(比值为0.91+/-0.05)(图5C和图15A)。当通过定量PCR(QPCR)在细胞群间测量时，这种相关性反映在转录水平上(图5D)。接下来进行比较的是在mMALAT1_3’区被插入到mCherry下游时获得的mCherry和eYFP蛋白以及mRNA的水平。与图5A中cGFP报道子的结果一致，mMALAT1_3’区支持强翻译(mCherry/eYFP蛋白比值为1.00+/-0.05)(图5C、D和图15B)。Northern印迹证实mCherry转录物以mMALAT1_3’区(如通过RNase P产生的)结尾，因此消除了观察到的有效翻译由潜在的多腺苷酸化信号负责的可能性(图15E)。接下来，将两色荧光报道子(图5B)转染到小鼠间充质干细胞中以确定三螺旋在另外的不相关细胞类型中支持翻译的能力。使用流式细胞术来监测单个细胞中的蛋白质表达，当两种转录物均以规范poly(A)尾结束时或当mMALAT1_3’区插入到mCherry下游时，对获得的mChery和eYFP蛋白水平进行比较。在这两种情况下，均发现荧光蛋白的表达是高度相关的(图19)，表明MALAT1三螺旋在HeLa细胞和小鼠间充质干细胞两者中均促进有效翻译。
[0211] 为了确定mMALAT1_3’区中有效翻译所需的序列元件，将包含RNA稳定性(图2G和图5F)以及有效翻译(图5G)所需之最小元件的cGFP-MALATl_3’Comp.14转录物突变(图2D)以测试是否能够鉴定出稳定但不被充分翻译的转录物。通过突变在MALAT1 3’端上而不存在于芯三螺旋区中的每个核苷酸(在维持保守茎环中的碱基配对的同时)(图5E中所示的Comp.15)来鉴定稳定(图5F)但不被充分翻译(图5G)的cGFP转录物。与Comp.14相比，Comp.15所示的转录物被同样有效地输出到细胞质，表明翻译效率的这种降低不是由转录物的核滞留增加引起(图5H)。为了证实这些结果，当将mMALAT1_3’Comp.15区置于两色荧光报道系统中的mCherry下游时(图5B)，与WT mMALAT1_3’区相比，观察到翻译效率降低约5倍，而mRNA水平仅降低约2倍(图5C、D和图15C、D)。
[0212] 然后，进行另外的诱变以确定Comp.15区中存在的27个突变中哪些是这样的翻译效率降低所需要的(图5E)。有趣的是，该分析揭示了27个突变的某些子集(Comp.27，图5E)导致转录物不再稳定(图5F)。尽管如此，可能鉴定出产生稳定(图5F)但不被充分翻译(图5G)的cGFP转录物的其他突变子集(Comp.25和Comp.26，图5E)。这表明直接位于芯三螺旋区每侧侧翼的核苷酸在促进翻译中具有关键作用(图5I)。
[0213] 由于这些结果表明MALAT1和MENβ的3’端均存在强翻译增强子元件，因此研究是否存在任何证据证明这些外源非编码RNA的翻译。尽管MENβ转录物在小鼠胚胎干(ES)细胞中低表达(数据未示出)，但是MALAT1被高表达并且核糖体图谱(Ingolia等2011)显示MALAT1 5’端附近的可复制和非随机区受到核糖体保护(图6)。虽然我们不能在这些区域中鉴定出明显非常保守的开放阅读框，但是可能是这样的：因为在小鼠中核糖体聚集的一些区域附近存在潜在的起始密码子，所以由MALAT1的5’端产生物种特异性短肽。
[0214] 三螺旋结构促进RNA的稳定性和人LINE-1mRNA的翻译
[0215] 对几种报道mRNA进行测试以确定MALAT1三螺旋是否可以在功能上取代多种信使RNA序列3’端的poly(A)尾。如已示出的，当将三螺旋置于编码荧光报道蛋白GFP(图5A)或mCherry(图5C)的两种不同mRNA的3’端时，观察到与用多腺苷酸化形式的报道mRNA获得的翻译水平不可区分的翻译水平。
[0216] 然后，在人长散布元件-1(Long Interspersed Element-1，LINE-1或L1)mRNA的下游对MALAT1三螺旋进行测试。L1序列是人基因组中主要类别的自主逆转录转座子。尽管99.9％以上的L1序列不再能够通过逆转录转座而活动，但是人基因组平均具有大约80至100个能够逆转录转座的L1元件(综述于Beck等2011中)。能够复制的L1的长度约6kb、包含两个非重叠的开放阅读框(ORF1和ORF2)并以其后是poly(A)尾的3’UTR结尾(图20A)。使用前述基于L1附加体的表达载体(pAD2TE1)(Doucet等2010)来确定用MALAT1三螺旋取代L1poly(A)尾的效果。该载体在ORF1的C末端包含T7表位标签而在ORF2的C末端包含TAP标签，从而有利于检测ORF1和ORF2的蛋白质表达。
[0217] 将pAD2TE1 L1表达载体或其中L1多腺苷酸化信号被mMALAT1_3’序列替代(以产生以三螺旋结尾的L1mRNA)的改良形式转染到HeLa细胞中并使用Trizol分离总RNA。如通过Northern印迹分析所确定的，以MALAT1三螺旋结尾的L1mRNA累积到与多腺苷酸化L1mRNA类似的水平(图20B，探针序列(SEQ ID NO.172)：5’-GCGCCTGAGCACCATTTAGC)。为了验证L1-MALAT1_3’RNA在其3’端被RNase P体内正确地加工，首先将来自转染物的总RNA与ORF2 3’端附近的寡核苷酸(5’-GCGCTTTGGCTTGGGTCATC)(SEQ ID NO.173)杂交，并进行RNase H消化。将转录物切割成较小的尺寸允许Northern印迹以高分辨率进行从而验证RNase P切割的准确性。对L1-MALAT1_3’RNA观察到预期大小(234nt)的单一条带(图20C)。相比之下，对多腺苷酸化L1mRNA观察到拖尾，表明添加的poly(A)尾的长度有所不同。这些结果表明MALAT1三螺旋能够有效稳定L1mRNA。
[0218] 对ORF1和ORF2蛋白质的产生进行定量以进而确定MALAT1三螺旋是否能够支持L1mRNA翻译。使用识别T7或TAP表位标签的抗体(以分别测量ORF1蛋白或ORF2蛋白的表达)进行免疫印迹和免疫荧光以确保只对由L1表达载体(而非由基因组中的任何内源L1元件)翻译的蛋白质进行定量。如图20D中的免疫印迹所示，当L1转录物以poly(A)尾或MALAT1三螺旋结尾时观察到类似的ORF1和ORF2蛋白质水平。这些结果通过免疫荧光而得到证实，其证明ORF1和ORF2蛋白在细胞的细胞质中累积到高水平，不管L1mRNA上的3’末端序列为何(图20E)。总而言之，这些结果表明三螺旋能够稳定L1mRNA的3’端以及确保两种编码的L1蛋白质得以有效产生。
[0219] 实施例5：微RNA有效抑制以MALAT1三螺旋结尾的转录物
[0220] 由于大多数缺乏poly A尾的长转录物在细胞中被快速降解，因此一般难以定义poly A尾或poly A结合蛋白(PABP)在体内的调控作用。现在围绕MALAT1的3’端建立的表达系统代表了一种解决这些问题的独特且有价值的工具，因为其在体内产生缺乏poly A尾的稳定转录物。在其3’端具有mMALAT1_3’序列的转录物不能与PABP相互作用，因为这种蛋白质需要至少12个连续的A残基以用于结合(Sachs等1987)。研究微RNA对以MALAT1三螺旋结尾的转录物的抑制是否与其对多腺苷酸化转录物的抑制一样有效，以证明该系统用于研究如何在体内调控非多腺苷酸化转录物的用途。微RNA起到部分RISC(RNA诱导的沉默复合物)的作用并与靶mRNA中部分互补的位点结合，从而引起转移抑制和/或转录物降解(Bartel 2009)。由于芯RISC蛋白组分GW182可与PABP以及去腺苷化酶(deadenylase)直接相互作用(Braun等2011)，因此出现了一种这样的模型，其中微RNA的最大抑制需要RISC与PABP之间的相互作用(Fabian等2009；Huntzinger等2010；Moretti等2012)。然而，这些相互作用的功能重要性一直存在争议(Fukaya和Tomari 2011；Mishima等2012)。
[0221] 利用两色荧光报道系统来研究poly A尾在微RNA介导的体内抑制中的作用，并将微RNA结合位点插入到SV40多腺苷酸化信号或mMALAT1_3’区上游的mCherry的3’UTR中(图7A)。特别地，插入两个凸起(bulged)的let-7结合位点(命名为let-7bg)或与let-7完全互补的序列(命名为let-7pf)，从而将靶标与微RNA之间的相互作用转变成催化性RNA干扰型抑制。使用天然表达let-7微RNA的HeLa细胞，发现当mCherry以规范poly A尾结尾时，两个凸起let-7结合位点的添加引起3.2+/-0.2倍的抑制，通过蛋白质表达测量(图7B和图16A)。预料不到的是，当将两个凸起的let-7位点添加到以MALAT1三螺旋结尾的mCherry时，观察到2.9+/-0.4倍的抑制(图7B和图16B)，这样的抑制水平在统计学上与存在poly A尾时获得的抑制水平没有差异。不管mCherry是否以poly A尾或MALAT1三螺旋结尾，这些作用均反映在转录水平上(图7C)，表明对蛋白质产生的作用可能至少部分由RNA水平降低引起。当转染合成的let-7以提高微RNA在HeLa细胞中的水平后，观察到微RNA介导的抑制水平一致地提高，不管存在的3’末端序列为何(图7B、C)。这些结果表明poly A尾不是微RNA的体内最大抑制所必需的，并因此表明微RNA还可有效地靶向细胞中的非多腺苷酸化转录物。尽管不清楚非多腺苷酸化转录物响应于微RNA的降解机理，但是这些结果表明有效的微RNA介导的沉默并不总是需要去腺苷酸化。
[0222] 实施例6：半衰期测量
[0223] 将HeLa细胞用CMV-cGFP-mMALAT1_3’报道质粒瞬时转染24小时。为了进而估计以MALAT1三螺旋结尾的cGFP报道mRNA的半衰期，将1μN转录抑制剂放射菌素D(ActD)添加至培养基并在转录抑制后0、1、2、4、6、8和10小时收获细胞。Northern印迹显示以三螺旋结尾的cGFP转录物在HeLa细胞中的半衰期为约5小时。结果示于图18中。此前的工作已估算出以poly(A)尾结尾的GFP转录物的半衰期为约4.8小时(Kudla，G等(2006).High guanine and cytosine content increases mRNA levels in mammalian cells.PLoS Biol.4：e180.)，表明测试RNA分子上的三螺旋和poly(A)尾均能够将转录物的3’端稳定至类似程度。
[0224] 实施例7：体外转录的以三螺旋结尾的mRNA可在细胞提取物中被翻译
[0225] 使用从噬菌体(例如，SP6、T3或T7)分离的RNA聚合酶可由DNA模板体外合成大量的mRNA。当转染到细胞中或在细胞提取物中孵育时，可使用内源细胞翻译机器有效翻译体外合成的以poly(A)尾结尾的mRNA。使用经充分表征的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)体外翻译测定来确定体外转录的以三螺旋结尾的mRNA是否同样可以在与细胞翻译机器孵育时被翻译(Gilbert等2007；Rojas-Duran和Gilbert 2012)。按照之前所述(Rojas-Duran和Gilbert 2012)，产生包含受T7启动子控制的萤火虫荧光素酶开放阅读框(ORF)的报道构建体。DNA模板中荧光素酶ORF下游插入的是(i)62个核苷酸的poly(A)尾、(ii)野生型MALAT1三螺旋或(iii)Comp.27形式的MALAT1三螺旋，其包含使三螺旋结构显著去稳定并因此靶向mRNA以快速降解的突变(图5E)。
[0226] 如下体外合成加帽的荧光素酶mRNA：用T7聚合酶进行失控转录，随后用痘苗加帽7
酶进行加帽。将纯化的mG加帽mRNA通过琼脂糖凝胶的密度计量法(densitometry)定量。
然后，将等量的每个mRNA添加至野生型酵母提取物并按照(Rojas-Duran和Gilbert 2012)进行翻译测定。使用荧光素酶活性确定每个mRNA的翻译活性，发现poly(A)尾和野生型MALAT1三螺旋均促进翻译显著超过背景水平(通过Comp.27突变体确定)(图21)。因此，这些结果表明体外转录的以三螺旋结尾的mRNA可被添加至细胞提取物以获得显著的蛋白质产生水平。
酶进行加帽。将纯化的mG加帽mRNA通过琼脂糖凝胶的密度计量法(densitometry)定量。
然后，将等量的每个mRNA添加至野生型酵母提取物并按照(Rojas-Duran和Gilbert 2012)进行翻译测定。使用荧光素酶活性确定每个mRNA的翻译活性，发现poly(A)尾和野生型MALAT1三螺旋均促进翻译显著超过背景水平(通过Comp.27突变体确定)(图21)。因此，这些结果表明体外转录的以三螺旋结尾的mRNA可被添加至细胞提取物以获得显著的蛋白质产生水平。
[0227] 讨论
[0228] 尽管缺乏poly A尾，长非编码RNA MALAT1是稳定的转录物，其在体内的表达水平与很多蛋白质编码基因相当或者更高(Wilusz等2008；Zhang等2012)。在本研究中，我们证明了MALAT1的3’端可被保护而免受进化上保守的三螺旋的降解。我们进一步鉴定了稳定MENβ长非编码RNA 3’端的高度类似的三螺旋结构。预料不到的是，这些三螺旋区还起强翻译增强子元件作用，从而允许非多腺苷酸化mRNA与具有规范poly A尾之mRNA一样有效地进行翻译。已在多种细胞系中观察到这些结果。以三螺旋结尾的转录物被微RNA有效抑制，认为poly A尾并不是有效的体内微RNA介导的沉默所需要的。我们的数据为如何在体内稳定并调控缺乏poly A尾的MALAT1、MENβ及其他可能转录物提供了新认识。
[0229] 尿苷化在RNA降解中的作用不断增加
[0230] 破坏MALAT1三螺旋的完整性导致转录物被有效地降解。我们意外地发现在转录物正经历降解时，很多以转录后添加的短富含U的尾结尾的cGFP-MALATl_3’转录物(图2F和图11C)，表明衰变过程中发生尿苷化。寡尿苷化与很多类小RNA的降解有关，包括tRNA(图8)、微RNA前体(Heo等2009)、成熟micoRNA(Li等2005)和转录起始位点相关RNA(Choi等2012)。尽管目前用于体内长转录物上U尾的证据较少，但尿苷化可促进mRNA脱帽(Song和Kiledjian 2007；Rissland和Norbury 2009)并且已在微RNA定向切割的产物上发现U尾(Shen和Goodman 2004)。有趣的是，组蛋白mRNA在完成DNA合成后进行尿苷化和降解(Mullen和Marzluff 2008)。与我们在MALAT1高度结构化的3’端观察到的类似(图2F和图11C)，Mullen和Marzluff在似乎此前已被3’-5’外切核酸酶缩短的组蛋白mRNA上也观察到短U尾。我们还在靶向降解的突变mascRNA转录物的3’端观察到类似现象(图8)。这些结果表明与我们目前所了解的相比，寡尿苷化在广泛RNA二级结构区的降解中可能发挥更显著的作用。特别地，我们表明当3’-5’外切核酸酶在广泛二级结构区暂停作用时，可添加寡(oligo)(U)尾，从而提供随后被衰变因子识别并用于重新开始降解过程的单链尾。
[0231] 三螺旋对MALAT1和MENβ功能的影响(implication)
[0232] 不同于很多被快速降解并因此以近乎检测不到的水平表达的长非编码RNA(Wyers等2005；Preker等2008)，MALAT1和MENβ是半衰期大于12小时的稳定转录物(Wilusz等2008；Sunwoo等2009)。通过防止这些非编码RNA3’端降解，三螺旋不仅在确保RNA稳定性方面而且在允许这些转录物进行重要的细胞功能方面发挥关键作用。例如，MENβ非编码RNA是细胞核中旁斑(paraspeckle)的必需结构组分(Sunwoo等2009)。当MENβ从细胞中耗尽后，不再观察到这样的亚核结构域并且替代地分散旁斑相关的蛋白质和RNA。目前，MALAT1的确切细胞功能是一个争论的问题，因为已发表了相互矛盾的结果(Tripathi等2010；Yang等2011b；Eissmann等2012；Zhang等2012)。尽管如此，MALAT1普遍在很多癌症中过表达，表明其在恶性表型中的潜在作用。
[0233] 我们的发现，即MALAT1和MENβ三螺旋起强翻译增强子元件作用，在这些核滞留的转录物可能如何起作用方面增加了另外预料不到的缠绕。考虑到Xist长非编码RNA由编码蛋白质的基因进化而来(Duret等2006)，其可能是这样的：对于MALAT1和MENβ同样如此，并且因此其相关的翻译控制元件仅是其进化过往的遗物。或者，这些非编码RNA可与核糖体相互作用，并可能产生短肽，如对其他曾经被认为是非编码的转录物已经示出的(Galindo等2007；Ingolia等2011)。在小鼠胚胎干细胞中的MALAT1上发现可重复的且非随机的核糖体印迹(图6)，但是并未鉴定出明显非常保守的开放阅读框。还可能的是，MALAT1和MENβ可简单地与翻译机器的组件相互作用，从而用作防止这些因子与mRNA结合的“海绵(sponge)”。
[0234] 最后，产生无poly A尾之稳定细胞质mRNA的表达载体的可用性将允许对用于涉及这样的非模板编码结构之翻译控制的机制进行体内测试。例如，我们发现与以MALAT1三螺旋结尾的mRNA相比，微RNA同样有效地调控具有poly A尾的靶mRNA的表达。
[0235] 总之，我们已在非腺苷酸化MALAT1和MENβ长非编码RNA的3’端鉴定出高度保守的三螺旋结构，其起防止RNA衰变的作用。当被置于开放阅读框的下游时，所述三螺旋结构另外地起促进有效翻译的作用。我们已证明体外转录的以三螺旋结尾的mRNA也可在体外翻译。因此，我们的发现为如何能够稳定、调控并翻译缺乏规范poly A尾的转录物揭示了新范例。考虑到人转录组的复杂性以及存在很多其他可能缺乏poly A尾的转录物，可能的是三螺旋和其他的RNA结构元件可在确保转录物稳定性和调控基因表达方面具有其他未认识到的作用。
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