新颖的基因SMS43
阅读：793发布：2023-02-16
专利汇可以提供新颖的基因SMS43专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及新鉴定出的基因，其编码L- 抗坏血酸 (下文中也称为维生素C)和/或2- 酮 -L-古洛酸(下文中也称为2-KGA)合成中涉及的 蛋白质 。本发明还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其 片段 ，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为 生物 技术工具在从 微生物 生产维生素C和/或2-KGA中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对所述微生物中生产所述 发酵 产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C和/或2-KGA的用途。，下面是新颖的基因SMS43专利的具体信息内容。
1.选自下组的多核苷酸或其互补链，所述组由：
(a)编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
(b)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
(c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；
(d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有转移酶[EC 2]的活性，优选地具有转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7]的活性；
(e)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7]的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及(f)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7]多肽的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；
构成。
2.含有如权利要求1所述的多核苷酸的载体。
3.如权利要求2所述的载体，其中所述多核苷酸与允许在原核或真核宿主细胞中表达的表达控制序列可操作地连接。
4.用如权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2或3的载体遗传工程改造的微生物。
5.如权利要求4所述的微生物，其能以300mg/l或更多的量从D-山梨糖醇直接生产维生素C，所述的量是在20小时温育之后以静止细胞方法测量的。
6.如权利要求5所述的微生物，其能以800mg/l或更多的量从L-山梨糖直接生产维生素C。
7.如权利要求4所述的微生物，其能以至少500mg/l的量从D-山梨糖醇或L-山梨糖生产2-KGA。
8.如权利要求1所述的多核苷酸编码的多肽。
9.用于生产能表达权利要求8所述的多肽的细胞的工艺，其包括下述步骤：用权利要求2或3所述的载体或用权利要求1所述的多核苷酸对细胞进行遗传工程改造。
10.权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2或3所述的载体或权利要求4到7中任一项所述的微生物用于生产维生素C和/或2-KGA的用途。
11.如权利要求10所述的用途，其中所述多核苷酸与表达控制序列可操作地连接，并被引入微生物。
12.如权利要求11所述的用途，其中，所述表达控制序列包含调控序列和/或启动子序列和/或终止子序列，并且，这些序列中的至少一种被改变，所述改变以使得所述微生物对维生素C和/或2-KGA的生产的产率和/或效率提高的方式进行。
13.如权利要求12所述的用途，其中，所述表达控制序列包含调控序列和/或启动子序列和/或终止子序列，并且，这些序列中的至少一种被改变，所述改变以使得转移酶[EC
2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7]的活性增加和/或提高的方式进行。
14.如权利要求4到7中任一项所述的微生物或含有包含权利要求1所述的多核苷酸的基因的微生物，所述微生物经过遗传改变，所述改变以使得所述微生物对维生素C和/或
2-KGA的生产的产率和/或效率提高的方式进行。
15.如权利要求14所述的微生物，其生产出具有增加的和/或提高的转移酶[EC 2]活性的、权利要求8所述的多肽，所述转移酶[EC 2]优选地是转移含磷基团的磷酸转移酶[EC
2.7]。
16.如权利要求4-7、14或15中任意一项所述的微生物，其中，根据权利要求1所述的多核苷酸被过量表达。
17.如权利要求4到7或14到16中任意一项所述的微生物，所述微生物选自由Pseudomonas、Pantoea、Escherichia、Ketogulonicigenium和乙酸细菌组成的组。
18.如权利要求17所述的微生物，其中所述乙酸细菌选自Gluconobacter、Acetobacter或Gluconacetobacter，优选地是Acetobactersp.、Acetobacter aceti、Gluconobacter frateurii、Gluconobacter cerinus、Gluconobacter thailandicus、Gluconobacter oxydans，更优选地是Gluconobacter oxydans，最优选地是Gluconobacter oxydans DSM 17078。
19.在微生物中生产增强的转移酶[EC 2]基因的工艺，所述微生物包含权利要求1所述的多核苷酸，所述转移酶[EC 2]优选是转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7]，所述工艺包括如下步骤：以使得所述微生物对维生素C和/或2-KGA的生产的产率和/或效率提高的方式来改变所述多核苷酸。
20.用于生产能产生维生素C和/或2-KGA的微生物的工艺，所述工艺包括如下步骤：
改变所述微生物，使得所述微生物生产出具有增加的和/或提高的转移酶[EC 2]活性的多肽，优选地，具有转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7]活性的多肽，导致所述微生物对维生素C和/或2-KGA的生产产率和/或效率提高。
21.用于生产含有下述内源基因的微生物的工艺，所述内源基因包含权利要求1的多核苷酸，所述工艺包括如下步骤：改变所述微生物，使得所述内源基因被过量表达，导致所述微生物对维生素C和/或2-KGA的生产产率和/或效率提高。
22.用于生产含有如权利要求1所述的多核苷酸的微生物的工艺，所述工艺包括如下步骤：向所述微生物中引入一个或多个拷贝的如权利要求1所述的多核苷酸，导致所述微生物对维生素C和/或2-KGA的生产产率和/或效率提高。
23.如权利要求22所述的工艺，其还包括下述步骤：改变所述微生物使得被引入的多核苷酸过量表达，导致所述微生物对维生素C和/或2-KGA的生产产率和/或效率提高。
24.如权利要求20到23中任一项所述的工艺，其用于生产根据权利要求14至18中任意一项所述的微生物。
25.用根据权利要求14至18或权利要求4至7中任意一项所述的微生物生产维生素C和/或2-KGA的工艺，其中，在水性培养基中，在允许从D-山梨糖醇或L-山梨糖对维生素C和/或2-KGA进行直接生产的条件下培养所述微生物，以及，可选地，维生素C和/或
2-KGA作为发酵产物被分离。
新颖的基因SMS 43
[0001] 本发明涉及新鉴定出的基因，其编码L-抗坏血酸(下文中也称为维生素C)和/或2-酮-L-古洛酸(下文中也称为2-KGA)合成中涉及的蛋白质。本发明还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C和/或2-KGA中的用途，其中对所述多核苷酸和/或被编码的多肽的修饰对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还包括使用所述多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法/工艺。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素C和/或2-KGA的用途。
[0002] 维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身合成维生素C。
[0003] 在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产的发展被概括于Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry，5th Edition，Vol.A27(1996)，pp.547ff中。
[0004] 维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下进行。因此，可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从L-山梨糖或D-山梨糖醇起始来生产2-KGA(这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C的中间产物)，或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-KGA。
[0005] 目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征，例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年中，人们已在研究更加经济且环保的用微生物转化来制造维生素C的其它方法。
[0006] 从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来直接生产维生素C已在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类、酵母和乙酸细菌，其中使用了不同的培养方法。已知能直接生产维生素C的细菌的例子包括，例如，来自Gluconobacter、Gluconacetobacter、Acetobacter、Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas 或Escherichia属的菌株。已知酵母或藻类的例子包括，例如Candida、Saccharomyces、Zygosaccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces或Chlorella。
[0007] 能吸收D-山梨糖醇用于生长的微生物通常具有能将该化合物氧化为普遍性的同化吸收底物(例如D-果糖)的酶。能在L-山梨糖上生长的微生物还拥有一种酶——NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶，该酶可将该化合物还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。被D-果糖激酶磷酸化之后，D-果糖成为很多微生物生长的优秀底物。
[0008] 例如，在乙酸细菌(其是专性需氧的革兰氏阴性微生物，属于Acetobacter、Gluconobacter和Gluconacetobacter属)的情况下，这些微生物能将D-山梨糖醇转运进胞质溶胶(cytosol)，并通过胞质溶胶中的NAD-依赖性D-山梨糖醇脱氢酶将其转化为D-果糖。一些个体菌株，例如Gluconobacter oxydans IFO 3292和IFO 3293还能将L-山梨糖转运进胞质溶胶，并通过胞质溶胶中的NAD(P)H-依赖性L-山梨糖还原酶将其还原为D-山梨糖醇，D-山梨糖醇再被进一步氧化为D-果糖。在这些细菌中，Embden-Meyerhof-Parnas途径以及三羧酸循环并不具有完全活性，将糖导向中央代谢的主要途径是磷酸戊糖途径。通过磷酸化反应从D-果糖获得的D-果糖-6-磷酸进入磷酸戊糖途径，其被进一步代谢，产生以NAD(P)H形式存在的还原能量和生长及维持所必需的三羧基化合物。
[0009] 乙酸细菌因其能不完全氧化不同底物(例如醇、糖、糖醇和醛)的能力而为人们公知。这些过程为人们所已知并通常被称为氧化发酵或不完全氧化，它们已被长时间应用于食品和化学工业中，尤其是对醋和L-山梨糖的生产中。已知能用属于Gluconobacter属的菌株从D-山梨糖醇或L-山梨糖进行不完全氧化获得的有用产物是2-KGA。
[0010] 乙酸细菌通过位于周质空间中、周质膜上或胞质中的不同脱氢酶来完成这些不完全氧化反应。不同的脱氢酶使用不同的辅助因子，最常见的是用于膜结合酶或周质酶的PQQ和FAD，以及用于胞质酶的NAD/NADP。
[0011] 虽然这些氧化反应的所有产物都通过外层膜分散回到外界水环境，但是它们中的一些可被主动或被动转运进细胞，并进一步用于与生长和能量形成有关的代谢途径。细胞中，氧化产物可被还原酶多次还原回它们的最初底物，然后被导向进入中央代谢。
[0012] 在D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢中具有活性的蛋白质，尤其是酶和转运蛋白，在本文中被称为涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统(Sorbitol/Sorbose Metabolization System)。此类蛋白质在本文中被缩写为SMS蛋白，其在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代谢中发挥作用。
[0013] D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢包括：一方面，将这些化合物吸收进胞质溶胶，以及进一步转化为可用于吸收途径的代谢物，所述吸收途径例如Embden-Meyerhof-Parnas途径、磷酸戊糖途径、Entner-Doudoroff途径以及三羧酸循环，它们都涉及对于活的细胞的生长和维持来说必要的全部关键的能量形成和合成代谢反应。另一方面，D-山梨糖醇或L-山梨糖的代谢还包括通过所谓的不完全氧化过程将这些化合物转化为经进一步氧化的产物，例如L-山梨糖酮、2-KGA和维生素C。
[0014] 本发明的一个目的是提高维生素C和/或2-KGA生产的产率和/或生产能力。
[0015] 令人吃惊地，我们发现，SMS蛋白或此类蛋白的涉及对D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮的吸收或转化或具有针对此的活性的亚基在对维生素C和/或2-KGA的生物技术生产中具有重要作用。
[0016] 在一种实施方式中，本发明的SMS蛋白选自转移酶[EC 2]例如激酶和磷酸酶，优选地选自转移含磷基团[EC 2.7]，更优选地选自以含氮基团作为受体的磷酸转移酶[EC2.7.3]。
[0017] 此外，本发明的SMS蛋白可选自与膜结合的PQQ依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶、与膜结合的FAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、胞质NAD依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶、NAD(P)依赖性的D-山梨糖醇脱氢酶(也被称为NADPH依赖性的山梨糖还原酶)、NAD依赖性的木糖醇脱氢酶、NAD依赖性的醇脱氢酶、与膜结合的L-山梨糖脱氢酶、NAD(P)H依赖性的L-山梨糖还原酶、胞质NADP依赖性的山梨糖酮脱氢酶、胞质NAD(P)H依赖性的L-山梨糖酮还原酶、与膜结合的醛脱氢酶、胞质醛脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶以及SMS功能中涉及的其它蛋白质构成的组，所述其它蛋白质包括任何上述脱氢酶和还原酶的调节(例如信号传导)中涉及的蛋白质，例如作为感受传导蛋白激酶/磷酸酶，其为具有发送器(transmitter)和接收器(receiver)模块、尤其具有规范组氨酸激酶发送器和天冬氨酸接收器模块的多(例如二)-组分调节蛋白系统。
[0018] 特别地，现已发现，具有下述核苷酸序列的多核苷酸编码的SMS蛋白在对维生素C和/或2-KGA的生物技术生产中具有重要作用，该核苷酸序列能在优选高度严谨条件下与SEQ ID NO：1所示的序列杂交。现还已发现，通过在能直接生产维生素C的微生物(例如Gluconobacter)中对根据本发明的核苷酸的表达水平进行遗传改变，可很大程度地提高所述微生物对维生素C和/或2-KGA的直接发酵。
[0019] 随后，本发明涉及选自下述组的多核苷酸或此类多核苷酸的互补链，所述组由：
[0020] (a)编码包含根据SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0021] (b)包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸；
[0022] (c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；
[0023] (d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有转移酶[EC 2]的活性，优选地具有转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7](SMS43)的活性；
[0024] (e)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7](SMS43)多肽的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及
[0025] (f)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7](SMS43)多肽的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少60％相同，例如
70％、85％、90％或95％相同；
70％、85％、90％或95％相同；
[0026] 构成。
[0027] 我们发现，本文中描述的SEQ ID NO：2示出的从Gluconobacteroxydans DSM17078分离的SMS蛋白是特别有用的SMS蛋白，因为看起来其在微生物(特别是细菌，例如乙酸细菌，例如Gluconobacter，Acetobacter和Gluconacetobacter)中的直接维生素C生产中发挥关键作用。因此，本发明涉及编码根据SEQ ID NO：2的多肽的多核苷酸。该蛋白可由SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列编码。本发明因此还涉及包含根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列的多核苷酸。
[0028] 上文确定的核苷酸序列和氨基酸序列被用作为“查询序列”，以便用来自National Center for Biotechnology[NCBI]的BLAST或Blast2程序(版本2)针对数据库PROSW-SwissProt(完全发布版本加上增加的更新)进行搜索。根据这些搜索结果，将根据SEQ ID NO：1的SMS 43多核苷酸标注为编码具有组氨酸激酶/磷酸酶发送器和天冬氨酸接收器活性的蛋白质。SEQ ID NO：2编码的蛋白质发挥下述各个蛋白质的调节物/活化物的作用，所述蛋白质包括脱氢酶，尤其是可由根据SEQ ID NO：9的多核苷酸编码的例如SEQ ID NO：10中所示的L-山梨糖酮脱氢酶。本发明的蛋白质可与其它调节蛋白质组合发挥作用，所述其它调节蛋白质例如为可由根据SEQ ID NO：11或NO：13的多核苷酸编码的如SEQ ID NO：12或NO：14中所示的蛋白质。
[0029] 可使用cDNA、mRNA或基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物(例如根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的核苷酸引物)，按照标准PCR扩增技术，通过核酸扩增来获得根据本发明的核酸。由此扩增出的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析对其进行表征。
[0030] 用于反应的模板可以是通过对从已知包含或怀疑包含根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆和测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。
[0031] 然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒(cosmid)cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。
[0032] 因此，本发明涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列可使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得。
[0033] 本发明还涉及下述多核苷酸，其包含编码本文所述的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有SMS多肽(优选地，SMS 43多肽)的活性。
[0034] 本发明还涉及下述多核苷酸，其编码SMS多肽(优选地，SMS 43多肽)，其互补链能在严谨条件下与本文定义的多核苷酸杂交。
[0035] 本发明还涉及下述多核苷酸，其与本文定义的多核苷酸至少60％相同，并且其编码SMS多肽；本发明还涉及是上文定义的多核苷酸的互补链的多核苷酸。
[0036] 本发明还涉及下述引物、探针和片段，其可用于扩增或检测根据本发明的DNA，和用于鉴定也带有这类基因的相关种或科的微生物。
[0037] 本发明还涉及包含本发明多核苷酸的载体，和用多核苷酸或所述载体遗传工程改造过的微生物。
[0038] 本发明还涉及用于生产下述微生物的方法，所述微生物能够表达上文定义的多核苷酸编码的多肽和如上文所定义的多核苷酸编码的多肽。
[0039] 本发明还涉及下述微生物，其中，SMS多肽(优选地，SMS 43多肽)的活性增强和/或提高，使得从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C和/或2-KGA的产率增加。这可例如通过将根据本发明的多核苷酸转入重组或非重组微生物来完成，所述为生物可以含有SMS 43基因的内源等同物，或者可以不含。
[0040] 技术人员将知道如何增强和/或提高SMS蛋白(优选地，SMS 43蛋白)的活性。这些可以例如增加SMS蛋白(优选地，SMS 43蛋白)的比活性，或者通过对宿主生物进行遗传修饰来完成，所述遗传修饰以较之野生型生物产生更多或更稳定的SMS蛋白(优选地，SMS 43蛋白)的拷贝的方式来进行。
[0041] 在下述说明书中，将对达到此目的(即，通过增加SMS 43蛋白的活性，增加从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产的维生素C和/或2-KGA的产率和/或产量)的方案进行详细描述。在进行必要修正后，这些方案可应用于其它SMS蛋白。
[0042] 为获得产生更多拷贝的SMS 43基因(即，过量表达该基因)和/或蛋白的生物进行的修饰包括：使用强启动子，或者对SMS 43基因(的部分)或其调控元件加以突变(例如，插入、缺失或点突变)。这还可包括将多个拷贝的基因插入到合适的微生物中。SMS 43蛋白比活性的增加也可通过本领域已知的方法来完成。此类方法可包括对SMS 43基因(的部分)的突变(例如，插入、缺失或点突变)。如果基因的转录水平较之野生型基因有所增强，那么认为该基因被“过量表达”。这可通过例如对mRNA的量加以定量的Northern印迹分析来测量，mRNA的量被用作为对基因表达的指示。在本文中，如果产生的mRNA的量较之野生型基因产生的mRNA的量增加至少1％、2％、5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％或者甚至超过500％，那么基因就是过量表达的。
[0043] 本领域中还已知可以通过将SMS 43蛋白与特定增强子相接触或与能与SMS 43蛋白发生特异性相互作用的其它物质相接触，来增强给定蛋白质活性。为鉴定出此类特定增强子，可表达SMS 43蛋白，并对存在怀疑能增强SMS 43蛋白活性的化合物时的活性加以测试。还可通过对编码SMS 43的信使RNA进行稳定化来增加SMS 43蛋白的活性。此类方法也是本领域已知的，见，例如Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y. 和 Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)。
[0044] 合适的宿主细胞包括下述微生物细胞，其能够生产给定的发酵产物，例如将给定的碳源直接转化成维生素C和/或2-KGA，和带有SMS 43基因或其等同物或同源物。带有这类基因或其等同物的合适的微生物可选自细菌，尤其是乙酸细菌，它们可以是野生型菌株或通过标准的诱变方法和选择方法获得的突变体菌株以及重组菌株。此类细菌的例子可以是，例如，Gluconobacter、Acetobacter、Gluconacetobacter、Ketogulonicigenium、Methylobacterium和Magnetospirillum。 优选 的是 Gluconobacter或Acetobacter，例 如，G.oxydans、G.cerinus、G.frateurii、G.industrius、G.thailandicus、G.rubiginosus、G.melanogenus、A.aceti、A.aceti subsp.xylinum、A.aceti subsp.orleanus、Methylobacterium sp.4-46、Methylobacterium chloromethanicum CM4、Methylobacterium extorquensPA1、Methylobacterium populi BJ001、Magnetospirillum gryphiswaldenseMSR-1或Magnetospirillum magneticum AMB-1，更优选地是G.oxydans。
[0045] 可用于本发明的微生物可被公众从不同来源获得，例如，DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)，Inhoffenstr.7B，D-38124 Braunschweig，Germany、American Type Culture Collection(ATCC)，P.O.Box 1549，Manassas，VA20108 USA 或 Culture Collection Division，NITE Biological Resource Center，
2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，Japan( 以 前 是 Institue for Fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka
532-8686，Japan)。这类菌株的合适的例子可在例如WO 2006/084719中找到或列于表1中，包括下述微生物，其带有编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因，例如编码与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)或其等同物的基因，如SEQ ID NO：9中所示和WO2005/017159中所公开。
特别优选的是Gluconobacter oxydans DSM 17078(先前已知为Gluconobacter oxydans N44-1并描述于Sugisawa等，Agric.Biol.Chem.54：1201-1209，1990中)，其在2005年1月26日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)on
26.January 2005。
2-5-8，Kazusakamatari，Kisarazu-shi，Chiba，292-0818，Japan( 以 前 是 Institue for Fermentation，Osaka(IFO)，17-85，Juso-honmachi 2-chome，Yodogawa-ku，Osaka
532-8686，Japan)。这类菌株的合适的例子可在例如WO 2006/084719中找到或列于表1中，包括下述微生物，其带有编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因，例如编码与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)或其等同物的基因，如SEQ ID NO：9中所示和WO2005/017159中所公开。
特别优选的是Gluconobacter oxydans DSM 17078(先前已知为Gluconobacter oxydans N44-1并描述于Sugisawa等，Agric.Biol.Chem.54：1201-1209，1990中)，其在2005年1月26日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)on
26.January 2005。
[0046] 在关于本发明的方面，应当理解，上述微生物还包括此类菌株的具有同样生理属性的异名(synonym)或基原异名(basonym)，其如International Code of Nomenclature of Prokaryotes所定义。本文中使用的对微生物的命名是International Committee on Systematics of Prokaryotes andthe Bacteriology and Applied Microbiology Division of the International Unionof Microbiological Societies官方接受的(在优先权申请的提交日期时)，并被其官方出版物International Journal of Systematic and EvolutionaryMicrobiology(IJSEM)所公开。具体的参考文献是Urbance et al.，IJSEM(2001)vol 51：1059-1070，以及IJSEM(2001)vol 51：1231-1233上的修订通知，其中描述了对作为Ketogulonicigenium vulgare的G.oxydans DSM 4025的分类学上的重新归类。
[0047] 本发明涉及经修饰的微生物，其中所述修饰导致从底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨糖)直接生产维生素C和/或2-KGA的提高的产率、产量和/或效率。这可通过提高本文所述的SMS 43基因的活性来进行。另外，本发明的微生物可在DNA水平或蛋白质水平上携带其它修饰(见上文所述)，只要此类修饰对从底物(例如D-山梨糖醇或L-山梨糖)直接生产维生素C和/或2-KGA的产率、产量和/或效率具有直接影响即可。此类其它修饰可以例如影响编码上文所述的SMS蛋白的其它基因，特别是，编码与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶或与膜结合的PQQ结合D-山梨糖醇脱氢酶的基因。进行此类修饰的方法是本领域已知的，一些例子在本文中有进一步描述。用于直接生产维生素C的这样的与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶及其核苷酸和氨基酸序列公开于WO 2005/017159中。修饰也可以影响涉及所述脱氢酶(优选L-山梨糖酮脱氢酶)调节的其它基因，尤其是WO2005/017159中公开的基因。一个特定的例子是下述修饰，其影响例如SEQ ID NO：11所示的编码根据SEQ ID NO：12的蛋白质的基因或其同源物。导致直接生产维生素C和/或2-KGA的提高的产率、产量和/或效率的修饰可以是编码根据SEQ ID NO：12的蛋白质的DNA序列中的修饰，优选地是位于SEQ ID NO：12所示序列的300位和600位之间的至少一个突变，更优选地是563位上的替换，进一步更优选地是用另一氨基酸置换T563，最优选地是用I563置换T563，如例如SEQ ID NO：14中所示。应当理解，本发明的重组微生物可以带有例如影响SMS 43基因或其同源物的一个修饰，或者可带有例如影响本文所述的多核苷酸的多个修饰(即多于1、2、3个或更多的修饰)加上脱氢酶(尤其是根据WO 2005/017159的L-山梨糖酮脱氢酶)和/或所述脱氢酶调节物(尤其是根据SEQ ID NO：11的基因或同源物，尤其是根据SEQ ID NO：13的基因)中的修饰。
[0048] 另外，这类修饰可例如影响下述基因，所述基因编码D-山梨糖醇和/或L-山梨糖代谢中涉及的多肽(其例如发挥SMS 43的阻抑物或诱导物/活化物的作用)和/或编码上述脱氢酶，尤其是导致所述阻抑物的活性降低或消除或所述诱导物/活化物活性提高的修饰。
[0049] 技术人员应当知道如何降低所述阻抑物的活性。这可以例如通过如下任一来实现：以使宿主生物比野生生物生产更少拷贝的阻抑物或不生产所述阻抑物的方式遗传修饰宿主生物，或者降低或者消除所述阻抑物的比活性。
[0050] 目的是使生物生产更少拷贝的阻抑物基因和/或蛋白质或者不生产阻抑物基因和/或蛋白质的修饰包括：使用弱启动子，或突变(例如插入、缺失或点突变)基因(的部分)或其调节元件，从而敲除或足抑制所述阻抑物，从而在被引入合适的宿主细胞时提高发酵产物生产的产率、产量和/或效率。降低或消除蛋白质的比活性也可以通过本领域已知的方法完成。这类方法可包括基因(的部分)的突变(例如插入、缺失或点突变)。这可例如影响蛋白质N-端区域介导的与DNA的相互作用，或者与其它效应器分子的相互作用。在本文中使用时，“基因表达的阻抑”包括完全或部分阻抑，以及在特定条件下的阻抑，还有两个等位基因任一的表达的阻抑。
[0051] 本领域还已知的是通过将各自的阻抑物蛋白质与特异性抑制剂或与所述蛋白质特异性相互作用的其它物质接触，来降低或消除给定蛋白质的活性的方法。为了鉴定这类特异性抑制剂，可以在存在怀疑抑制所述蛋白质活性的化合物时，表达和测试所述蛋白质。可能的抑制性化合物可以例如是针对所述蛋白质的单克隆或多克隆抗体。这类抗体可通过合适的实验室动物的常规免疫流程获得。
[0052] 根据本发明的另一目的，提供了本文定义的多核苷酸或者已用此类多核苷酸进行过遗传工程改造的微生物在生产维生素C和/或2-KGA中的用途。
[0053] 本发明还涉及在微生物中表达内源基因的工艺，涉及在微生物中生产上文定义的多肽的工艺，以及生产能产生维生素C和/或2-KGA的微生物的工艺。所有这些工艺都可包含改变微生物的步骤，其中，本文中使用的“改变”包括下述工艺，该工艺以使得发酵产物的产率和/或生产能力较之野生型生物有所提高的方式来进行“遗传改变”或“改变细胞培养基的组成和/或改变用于培养的方法”。本文中使用的“维生素C的提高的产率”表示较之野生型微生物(即，没有被遗传改变的微生物)而言增加至少5％、10％、25％、30％、40％、50％、75％、100％、200％或者甚至超过500％。对2-KGA生产而言，“2-KGA的提高的产率”表示较之野生型微生物(即，没有被遗传改变的微生物)而言增加至少1％、2％、5％、10％、
20％、30％、40％或者甚至超过100％。
20％、30％、40％或者甚至超过100％。
[0054] 术语“遗传工程改造”或“遗传改变”表示对活的生物体中遗传物质结构的科学改变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地，这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程改造或修饰的生物。遗传工程改造可通过本领域已知的多种方法来进行，例如，基因替换，基因扩增，基因打断，使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的生物，例如，经遗传修饰的微生物通常还被称作重组生物，例如重组微生物。
[0055] 因此，本发明可包括以下任一：(1)除了其天然基因(例如编码SMS43的基因)以外，还带有更多拷贝的所述基因的重组微生物，所述更多拷贝的所述基因通过用本领域已知和例如本文所例举的技术遗传工程改造所述微生物来引入；或(2)如上经遗传工程改造的重组微生物，但是其不天然地带有这类基因，例如编码SMS 43的基因。优选地，本发明的重组微生物被修饰，使得其带有比野生型微生物更多拷贝的编码SMS 43的DNA，尤其是因为用带有一个或多个拷贝的编码SMS 43的DNA的质粒转化，或者将编码SMS 43的这类DNA整合进其基因组中而造成。
[0056] 根据本发明，提供了经遗传工程改造/重组产生的宿主细胞(也被称为重组细胞或经转化细胞)，其携带有此类经修饰的多核苷酸，其中，相连的蛋白的功能较之野生型细胞而言被显著修饰，使得对一种或多种发酵产物(例如维生素C)的生产的产率、产量和/或效率被提高。宿主细胞可选自能从给定的碳源直接生产一种或多种发酵产物(例如维生素C和/或2-KGA)的微生物，特别是Gluconobacter oxydans，优选地，G.oxydansDSM17078和本文所述的微生物。
[0057] “经转化细胞”或“重组细胞”是已通过重组DNA技术向其(或其祖先细胞)中引入了根据本发明的核酸的细胞，或者是其中(内源)SMS43蛋白的活性已被增加和/或增强的细胞。合适的宿主细胞包括能生产给定发酵产物(例如，能将给定碳源直接转化为维生素C和/或2-KGA)的微生物的细胞。可用于实施本发明并且天然不带有这类基因(例如编码SMS 43的基因)而是通过引入所述基因而被遗传修饰的宿主细胞包括但不限于来自Pseudomonas(例如P.putida、Pantoea)、Escherichia(例如E.coli)和Corynebacterium属的菌株。
[0058] 本发明的实施方式既包括遗传上改变带有编码SMS 43蛋白质或其等同物的内源基因的微生物，使得所述基因产物的活性提高，也包括向下述合适的宿主生物中引入一个或多个拷贝，例如1、2、3、4、5、6或更多拷贝所述多核苷酸或其等同物，所述宿主生物不天然带有这样的基因并且能够从上文所述给定的底物生产维生素C和/或2-KGA，还能够表达所述被引入的基因。所述被引入的多核苷酸的活性还可通过如本文所述的遗传改变被提高，导致提高的维生素C和/或2-KGA生产。
[0059] 通过对从Gluconobacter oxydans DSM 17078获得的基因组克隆进行测序，来测定包含编码SMS 43蛋白的SEQ ID NO：1的核苷酸序列的基因的序列。
[0060] 本发明还涉及编码SEQ ID NO：2所示的SMS 43多肽的至少一个生物活性片段或衍生物的多核苷酸。
[0061] 本文中使用的“生物活性片段或衍生物”表示保留有与SEQ ID NO：2所示的多肽基本相同的生物功能或活性的多肽。生物活性的例子可以例如是酶活、信号传递活性或抗体反应活性。术语“相同的生物功能”或“功能等同物”在本文中使用时表示蛋白质与SEQ ID NO：2所示的多肽具有基本相同的生物活性，例如，酶活性、信号传递活性或者抗体反应活性。
[0062] 通常，可通过技术人员公知的方法来测定SMS蛋白的生物活性、酶活性或其它活性，所述方法例如：在存在其底物、电子受体或供体(包括吩嗪硫酸甲酯(PMS)、二氯苯酚-吲哚苯酚(DCIP)、NAD、NADH、NADP、NADPH，可通过光度、色度或荧光方法对其消耗进行直接或间接测量)以及其它可能与活性的发展相关的无机组分的情况下，温育含有SMS蛋白的膜级分(membrane fraction)。因此，例如，可在下述试验中测量与膜结合的D-山梨糖醇脱氢酶的活性，所述试验中，在存在pH 6的磷酸盐缓冲液、D-山梨糖醇和人工电子受体DCIP和PMS的情况下，温育含有该酶的膜级分。可在600nm处测量DCIP的消耗速率，其与膜级分中存在的D-山梨糖醇脱氢酶活性直接成正比。
[0063] SMS蛋白质(尤其是SMS 43蛋白质)的生物、酶或其它活性可以通过本领域技术人员公知的方法测量，例如通过本领域技术人员已知的方法(例如Northern印迹、转录融合分析、微阵列分析、目标酶活性分析、目标酶蛋白质水平等等)测定已知处于SMS 43蛋白质控制下的基因的表达。
[0064] 本发明的多肽和多核苷酸优选以经分离的形式提供，优选地，被纯化至均质。
[0065] 术语“经分离的”表示：物质被移出其原来的环境(例如，如果其天然存在的话，就是天然环境)。例如，活的微生物中存在的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但与天然系统中的一些或全部共存物质分开的同样的多核苷酸或多肽就是经分离的。此类多核苷酸可以是载体的一部分和/或此类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是经分离的，因为此类载体或组合物并非其天然环境的一部分。
[0066] 本文中使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是这样的DNA或RNA，它们与从中获得该多核苷酸或核酸的生物的天然存在的基因组中紧密相邻的两条编码序列(5’末端一条，3’末端一条)并非紧密相邻。因此，在一种实施方式中，核酸包括与编码序列紧密相邻的5’非编码(例如，启动子)序列的一些或全部。术语“经分离的多核苷酸”因此包括，例如，加入到载体中、加入到自主复制质粒或病毒中，或者加入到原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或者作为独立于其它序列的单独分子(例如，通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)存在的重组DNA。其还包括是杂合体基因的一部分的重组DNA，所述基因编码基本不含细胞物质、病毒物质或培养基(当通过重组DNA技术生产时)或化学前体或其它化学物质(当通过化学方式合成时)的额外多肽。此外，“经分离的核酸片段”是这样的核酸片段：其天然并不作为片段存在，并且将不会在天然状态被发现。
[0067] 本文中使用的术语“多核苷酸”、“基因”和“重组基因”指可与染色体DNA分离开的、包括编码蛋白质(例如，G.oxydans DSM 17078SMS蛋白)的开放读码框的核酸分子。多核苷酸可包括，例如，SEQ IDNO：1所示的多核苷酸序列或其片段以及基因序列上游或下游的区域，所述区域可包括，例如，对于由其获得的多肽的适当表达和稳定来说重要的启动子区域、调控子区域和终止子区域。
[0068] 基因可包括编码序列、非编码序列(例如，位于基因编码区域3’末端和5’末端的非翻译序列)和调控序列。此外，基因指本文定义的经分离的核酸分子。技术人员还将理解，导致SMS蛋白氨基酸序列的变化的DNA序列多态性可存在于种群(population)中，例如，Gluconobacter oxydans种群中。SMS 43基因中的此类遗传多态性可由于天然变异存在于种群的个体间，或者存在于不同种群的细胞中。典型地，此类天然变异可导致SMS 43基因核苷酸序列中1-5％的变化度。作为天然变异结果的、并且不会改变SMS蛋白的功能活性的SMS 43中的任何以及全部此类核苷酸变异和由此得到的氨基酸多态性也包括在本发明的范围内。
[0069] 本文中使用的术语“多核苷酸”或“核酸分子”意欲包括DNA分子(例如，cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。可使用寡核苷酸类似物或衍生物(例如，肌苷或磷硫酰核苷酸)来合成核酸。此类寡核苷酸可用于：例如，制备具有改变的碱基配对能力或增加的对核酸酶的抗性的核酸。
[0070] 本文中提供的序列信息不应被狭义理解为需要包括进被错误鉴定的碱基。本文公开的特定序列可以很容易地用于从能将给定碳源直接转化为维生素C和/或2-KGA的重组或非重组微生物(特别是Gluconobacteroxydans，优选地，Gluconobacter oxydans DSM17078)中分离出完整基因，随后可容易地对该基因进行进一步的序列分析，由此鉴定出测序错误。
[0071] 除非特别指明，本文中通过对DNA分子进行测序来确定的所有核苷酸序列都是用自动DNA测序仪(测定的，并且，本文测定的DNA分子编码的多肽的所有氨基酸序列都是通过对按照上文所述测定的DNA序列进行翻译来推测的。因此，如本领域所已知的，对由该自动方法所测定的任何DNA序列而言，本文所测定的任何核苷酸序列都可能含有一些错误。典型地，通过自动方法测出的核苷酸序列与被测序的DNA分子的实际核苷酸序列至少大约
90％同源，更典型地，至少大约95％至至少大约99.9％相同。通过其它方法，包括本领域内公知的人工DNA测序方法，可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的，测得的核苷酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框位移，使得：从此类插入或缺失的点开始，测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
90％同源，更典型地，至少大约95％至至少大约99.9％相同。通过其它方法，包括本领域内公知的人工DNA测序方法，可对实际序列进行更为精确的测定。也如本领域所已知的，测得的核苷酸序列中较之实际序列的单个插入或缺失将会导致核苷酸序列翻译中的读码框位移，使得：从此类插入或缺失的点开始，测得的核苷酸序列编码的预计氨基酸序列完全不同于被测序的DNA分子实际编码的氨基酸序列。
[0072] 本领域技术人员能鉴定出此类被错误鉴定的碱基，并且知道如何改正此类错误。
[0073] 根据本发明的核酸分子可以仅包含本发明提供的核酸序列(例如，SEQ ID NO：1示出的序列)的一部分或片段，例如，可用作为探针或引物的片段(例如SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4)或编码根据本发明的蛋白的一部分的片段。从对SMS 43基因的克隆测定的核苷酸序列允许产生被设计来鉴定和/或克隆SMS 43家族其它成员以及来自其它物种的SMS43同源体的探针和引物。典型地，该探针/引物包含基本纯化的寡核苷酸，其典型地包含与SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或其片段或衍生物的至少大约12或15个、优选大约18或20个、更优选大约22或25个、进一步更优选大约30、35、40、45、50、55、60、65或75个或更多个连续核苷酸杂交(优选地，在高度严谨条件下杂交)的核苷酸序列区域。
[0074] 还可通过聚合酶链式反应(PCR)，使用基于本文含有的序列信息设计的合成寡核苷酸引物，分离出包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的全部或一部分的核酸分子。
[0075] 可按照标准PCR扩增技术，用cDNA、mRNA或者基因组DNA作为模板，使用合适的寡核苷酸引物，来扩增本发明的核酸。由此扩增的核酸可被克隆进合适的载体，并通过DNA序列分析加以表征。
[0076] 根据本发明的多核苷酸的片段还可包含不编码功能多肽的多核苷酸。此类多核苷酸可作为探针或引物用于PCR反应。
[0077] 不管其编码功能或非功能多肽，根据本发明的核酸都可用作为杂交探针或聚合酶链式反应(PCR)引物。不编码具有SMS 43活性的多肽的本发明核酸分子的用途包括：(1)从cDNA文库(例如来自除Gluconobacter oxydans外的其它生物)分离编码本发明蛋白的基因或其等位变体，以及(2)用于探测特定细胞中所述蛋白的mRNA的表达的Northern印迹分析，或(3)用于增强和/或提高同源SMS 43基因在所述其它生物中的功能或活性。
[0078] 基于本文提供的核苷酸序列的探针可用于检测编码同样或同源蛋白(例如，其它生物中的)的转录本或基因组序列。可基于其与本文公开的G.xoydans SMS 43核酸的同源性，使用G.oxydans DNA或其一部分作为杂交探针，按照标准杂交技术，优选在高度严谨杂交条件下，分离出对应于本发明的G.xoydans SMS 43 DNA的天然变体或非G.oxydans同源体的核酸分子，它们也包括在本发明内。
[0079] 在优选的实施方式中，探针还包含与其附着的标记基团，例如，标记基团可以是放射性同位素、荧光化合物、酶或酶的辅助因子。
[0080] 例如，可使用基于本文教导的核苷酸序列设计的两套简并寡核苷酸引物库，进行PCR来分离同源基因序列。
[0081] 用于反应的模板可以是通过对从已知能表达或怀疑能表达根据本发明的多核苷酸的菌株制备的mRNA进行逆转录获得的cDNA。PCR产物可被亚克隆及测序，以确保扩增出的序列代表本文所述的新的核酸序列或其功能等同物的序列。
[0082] 然后可通过多种已知方法，用PCR片段分离全长cDNA克隆。例如，可标记扩增出的片段，用其筛选噬菌体或粘粒cDNA文库。或者，经标记的片段可用于筛选基因组文库。
[0083] PCR技术还可用于从其它生物分离全长cDNA。例如，可按照标准方案，从合适的细胞或组织来源分离RNA。可在RNA上进行逆转录反应，其中使用与扩增片段的5’最末端具有特异性的寡核苷酸引物，以引导第一链合成。
[0084] 然后可使用标准的末端转移酶反应，对得到的RNA/DNA杂交体“加尾”(例如，用鸟嘌呤)，可用RNaseH消化杂交体，然后可(例如，用poly-C引物)引导第二链合成。由此，可容易地分离扩增的片段上游的cDNA序列。关于有用的克隆策略的综述，参见，例如上文所述的Sambrook et al.和上文所述的Ausubel et al.。
[0085] 此外，编码SMS 43家族其它成员、具有与根据SEQ ID NO：1的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。此外，编码来自其它物种的SMS 43蛋白、具有与SEQ ID NO：1示出的核苷酸序列不同的核苷酸序列的核酸也在本发明的范围内。
[0086] 本发明还涉及经分离的多核苷酸，其可在严谨条件下(优选地，高度严谨条件下)与本发明的多核苷酸(例如，SEQ ID NO：1所示的多核苷酸)杂交。有利地，此类多核苷酸可从能将给定的碳源直接转化为维生素C的微生物(特别是Gluconobacter oxydans，优选地，Gluconobacteroxydans DSM 17078)中获得。
[0087] 本文中用到的术语“杂交”被用来描述杂交和洗涤，在所述杂交和洗涤条件下，典型地，互相之间同源性为至少约50％、至少约60％、至少约70％、更优选为至少约80％、进一步优选为至少约85％到90％、最优选为至少95％的核苷酸序列保持相互杂交的状态。
[0088] 在一种实施方式中，本发明的核酸与SEQ ID NO：1所示的核酸序列或其互补序列至少40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％同源或更同源。
[0089] 此类严谨杂交条件的一个优选的非限制的例子是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，大约45℃下杂交，随后在1xSSC、0.1％SDS中，50℃下进行一次或多次洗涤，洗涤优选在55℃下，更优选在60℃下，进一步优选在65℃下进行。
[0090] 高度严谨条件包括：使用经标记的DNA探针(例如，用地高辛(DIG)标记的DNA探针)在42℃温育数天(例如2-4天)，接着在2xSSC和0.1％SDS中于室温下洗一次或多次，以及在65-68℃，于0.5xSSC和0.1％SDS或0.1xSSC和0.1％SDS中洗一次或多次。特别地，高度严谨条件包括，例如，在溶液中，例如含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基磺酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸和2％封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，使用地高辛(DIG)标记的DNA探针(例如通过用RocheDiagnostics GmbH，68298 Mannheim，Germany的DIG标记系统来制备的)在42℃温育2小时至4天，接着在
2xSSC和0.1％SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在65-68℃，于0.5xSSC和0.1％SDS或0.1xSSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。
2xSSC和0.1％SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在65-68℃，于0.5xSSC和0.1％SDS或0.1xSSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。
[0091] 优选地，与本发明的核苷酸序列杂交(优选在高度严谨条件下杂交)的本发明的经分离的核酸对应于天然存在的核酸分子。本文中使用的“天然存在的”核酸分子指具有天然存在的核苷酸序列的RNA或DNA分子(例如，编码天然蛋白质)。在一种实施方式中，核酸编码天然的G.oxydans SMS 43蛋白。
[0092] 技术人员知道何种条件适合用于严谨杂交条件及高度严谨杂交条件。本领域中易于获得关于此类条件的其它指导，例如，在Sambrook et al.，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，N.Y.；和Ausubel et al.(eds.)，1995，Current Protocols in Molecular Biology，(John Wiley & Sons，N.Y.)中。当然，仅与poly(A)序列(例如mRNA的3’末端poly(A)区)或仅与T(或U)残基的互补性延伸区段(stretch)杂交的多核苷酸将不会被包括在用于与本发明核酸的一部分特异性杂交的本发明多核苷酸中，因为此类多核苷酸将与任何含有poly(A)延伸区段的核酸分子或其互补序列(例如，实际上是任何双链的cDNA克隆)杂交。
[0093] 采用典型手段，可以对从其它生物，例如能将给定碳源直接转化为维生素C和/或2-KGA的微生物(特别是其它Gluconobacter物种)构建的DNA文库进行筛选。
[0094] 例如，可以通过Southern和/或Northem印迹分析来对Gluconobacter的菌株进行筛选。在探测到与本发明多核苷酸同源的转录本之后，可以利用本领域技术人员公知的标准技术，由分离自合适菌株的RNA来构建cDNA文库。或者，可以使用能与本发明多核苷酸杂交的探针来对全基因组DNA文库进行筛选。
[0095] 可使用标准的分子生物学技术以及本文提供的序列信息，来分离本发明的核酸序列，例如SEQ ID NO：1所示的核酸分子或其片段或衍生物。例如，可使用标准杂交和克隆技术(例如，Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.2nd，ed.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989所述)，使用SEQ ID NO：1所示的核酸分子的全部或一部分作为杂交探针，分离根据本发明的核酸分子。
[0096] 此外，可通过标准合成技术(例如，使用自动DNA合成仪)来制备对应于本发明的核苷酸序列的寡核苷酸或可与本发明的核苷酸序列杂交的寡核苷酸。
[0097] 术语“同源性”或“相同性百分比”在本文中可互换使用。就本发明的目的而言，在此定义：为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的相同性百分比，本着最优比较的目的(例如，可以在第一条氨基酸序列或核苷酸序列上引入缺口，以与第二条氨基酸序列或核苷酸序列达到最佳的比对)，对序列进行比对。然后对相应氨基酸位置或核苷酸位置上的氨基酸残基或核苷酸进行比较。如果第一条序列上某位置的氨基酸残基或核苷酸与第二条序列上相应位置的相同，那么这些分子在此位置就是相同的。两条序列间的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的数量的函数(即，％相同性＝相同位置的数量/位置(即重叠位置)总数x100)。优选地，这两条序列长度相同。
[0098] 技术人员会知道有若干计算机程序可被用于确定两条序列间的同源性。例如，可以使用数学算法来完成对序列的比对和对两条序列间相同性百分比的确定。在一种优选的实施方式中，使用Needleman和Wunsch(J.Mol.Biol.(48)：444-453(1970))算法来确定两条氨基酸序列间的相同性百分比，所述算法已被合并到GCG软件包(可从http://www.accelrys.com获得)的GAP程序中，其中使用Blossom 62矩阵或PAM250矩阵，缺口权重为16、14、12、10、8、6或4，长度权重为1、2、3、4、5或6。技术人员会意识到：上述的所有不同参数将导致有细微区别的结果，但是使用不同算法时两条序列的总体％相同性不会有显著改变。
[0099] 在又一种实施方式中，使用GCG软件包(可从http://www.accelrys.com获得)的GAP程序来确定两条核苷酸序列间的相同性百分比，其中使用NWSgapdna.CMP矩阵，缺口权重为40、50、60、70或80，长度权重为1、2、3、4、5或6。在另一种实施方式中，使用E.Meyers和W.Miller(CABIOS，4：11-17(1989))的算法来确定两条氨基酸序列或核苷酸序列的相同性百分比，所述算法已被合并到ALIGN程序(2.0版)(可从http://vega.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi获得)中，其中使用PAM120权重残基表，缺口长度惩罚(penalty)为12，缺口惩罚为4。
[0100] 本发明的核酸和蛋白质序列可以进一步地被用作“查询序列”来进行针对公众数据库的搜索，例如，去鉴定相关序列或家族中其它成员。可以使用Altschul，et al.(1990)J.Mol.Biol.215：403-10的BLASTN和BLASTX程序(2.0版)来进行此类搜索。可以用BLASTN程序，以分数＝100，字长(word length)＝12来进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，以分数＝50，字长＝3来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。本着比较的目的，为获得有缺口的比对，可以利用Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述的Gapped BLAST。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0101] 在另一种优选的实施方式中，本发明的经分离的核酸分子包含是本发明的核苷酸序列(例如，SEQ ID NO：1所示的序列)的互补序列的核酸分子。与本文公开的核苷酸序列互补的核酸分子是这样的序列：其与SEQID NO：1所示的核苷酸序列足够互补，从而其可与所述核苷酸序列杂交，由此形成稳定的双链体(duplex)。
[0102] 在另一种优选的实施方式中，SEQ ID NO：1所示的本发明的核酸或其互补序列含有至少一处突变，所述突变导致基因产物具有经修饰的功能/活性。所述至少一处突变可通过本文所述的方法引入。在一个方面，所述至少一处突变导致产生这样的SMS 43蛋白：其功能和/或活性较之野生型副本而言有所增强或提高。用于引入此类突变的方法是本领域公知的。
[0103] 本文中使用的术语——活性的“增加”包括：增加生产生物中一种或多种多肽的活性，所述多肽是本文所述的相应的多核苷酸编码的。本领域中可获得用于增加给定蛋白(在本文的情况下是SMS 43蛋白)活性的多种方法。通常，可增加蛋白质的比活性或者可以增加蛋白质的拷贝数。术语增加活性或者等同物表达还包括下述情形：其中，SMS 43蛋白活性被引入以前不含该活性的细胞，这例如通过将编码SMS 43的基因引入以前不含该基因等同物的细胞或以前不能表达相应蛋白的活性形式的细胞来实现。
[0104] 为协助这种增加，对应于本文所述多核苷酸的基因的拷贝数可被增加。或者，可使用强启动子来指导多核苷酸的表达。在另一种实施方式中，基因的启动子、调控区域和/或核糖体结合位点可被改变，以增加表达。还可以通过增加信使RNA的相对半寿期来增强或强加表达。在另一种实施方式中，还可以通过在多肽氨基酸序列中利用能增加活性的一处或多处突变来增加多肽自身的活性。例如，改变多肽与其相应底物的亲和性可导致活性提高。类似地，可增加肽的相对半寿期。在基因表达增强或者比活性增加的情况下，可通过改变细胞培养基的组成和/或用于培养的方法来达成这种提高。本文中使用的“增强的表达”或“提高的活性”表示较之野生型蛋白、多核苷酸、基因、或多核苷酸或多肽被增强和/或提高之前存在的蛋白的活性和/或浓度而言，至少5％、10％、25％、50％、75％、100％、200％或者甚至超过500％的增加。还可通过将蛋白与其活性的特异性或一般性增强剂相接触来增加SMS 43蛋白的活性。
[0105] 本发明的另一方面涉及载体，所述载体含有编码本发明蛋白质的核酸或其功能等同物或一部分。在本文中使用的术语“载体”指能运送连接到其上的另一个核酸分子的核酸分子。一种载体类型是“质粒”，“质粒”指环状的双链DNA环，另外的DNA片断可以连接到所述的环上。另一种载体的类型是病毒载体，其中，另外的DNA片断可以连接到病毒基因组中。某些载体能在其被引入的宿主细胞中进行自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体)。其它载体在被引入宿主细胞之后就被整合进宿主细胞的基因组中，因此它们与宿主基因组一同复制。
[0106] 此外，某些载体能指导可操作地连接到其上的基因的表达。此类载体在本文中被称为“表达载体”。一般而言，在重组DNA技术中用到的表达载体通常是质粒的形式。在本文中术语“质粒”和“载体”可以互换使用，因为质粒是最常用到的载体形式。然而，本发明也将包括其它形式的表达载体，例如病毒载体(例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)，它们能提供等同的功能。
[0107] 本发明的重组表达载体包含本发明的核酸，所述核酸存在的形式适合于该核酸在宿主细胞中的表达，这意味着该重组表达载体包括一段或多段调控序列，所述调控序列是基于将用于表达的宿主细胞来选择的，其被可操作地连接到将要表达的核酸序列上。在重组表达载体中，“可操作地连接”被用来表示：人们感兴趣的核苷酸序列被连接到调控序列上，所述的连接以允许该核苷酸序列表达(例如，在体外转录/翻译系统中表达，或者当载体被引入宿主细胞中时，在该宿主细胞中的表达)的方式进行。术语“调控序列”将包括启动子、增强子和其它表达控制元件(例如，弱化子)。例如，在Goeddel；Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中对此类调控序列进行了描述。调控序列包括在很多种宿主细胞中指导核苷酸序列的组成型或诱导型表达的调控序列，也包括仅在某些宿主细胞中指导核苷酸序列表达的调控序列(例如，组织特异性调控序列)。本领域的技术人员将意识到，对表达载体的设计可能取决于以下因素：例如：对将被转化的宿主细胞的选择，期望获得的蛋白质的表达水平等。本发明的表达载体可以被引入宿主细胞，由此生产本文所述的核酸编码的蛋白质或肽，其包括但不限于：本文所述的核酸编码的突变体蛋白、其片段、其变体或功能等同物以及融合蛋白，例如，SMS
43蛋白、SMS 43蛋白的突变体形式、融合蛋白等。
43蛋白、SMS 43蛋白的突变体形式、融合蛋白等。
[0108] 为了在合适的微生物中表达SMS 43蛋白，可对本发明的重组表达载体加以设计。例如，根据本发明的蛋白可在细菌细胞中表达，例如，在属于Gluconobacter、Gluconacetobacter或Acetobacter属的菌株中表达。在本发明中有用的表达载体包括源自染色体、游离体和病毒的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体的载体和源自上述物质的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传元件的载体，例如粘粒和噬菌粒(phagemid)。
[0109] DNA插入应当被可操作地连接到合适的启动子上，启动子可以是组成型启动子或可诱导的启动子。技术人员知道如何选择合适的启动子。表达构建体可以含有用于转录起始、终止的位点，还可在转录区域含有核糖体结合位点，以用于翻译。由构建体表达的成熟转录本的编码部分可优选包括处于起点的起始密码子，以及恰当地定位于待翻译的多肽末尾的终止密码子。
[0110] 可通过传统的转化或转染技术将载体DNA引入合适的宿主细胞。本文中使用的术语“转化”、“转桥联(transconjugation)”和“转染”意指本领域内已知的、用于将外源核酸(例如DNA)引入到宿主细胞中的多种技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、转导、感染、脂质转染、阳离子脂介导的转染或电穿孔。用于对宿主细胞进行转化和转染的合适方法可在Sambrook，et al.(上文所述的)，Davis et al.，Basic Methods in Molecular Biology(1986)及其它实验手册中找到。
[0111] 为对已将外源DNA整合进它们基因组的细胞进行鉴定和选择，通常，将编码选择标记(例如，对抗生素的抗性)的基因与感兴趣的基因一起引入宿主细胞。优选的选择标记包括赋予对药物(例如卡纳霉素、四环素、氨苄青霉素和链霉素)抗性的那些。编码选择标记的核酸优选在与编码根据本发明的蛋白的载体相同的载体上引入宿主细胞，或者其可在单独的载体上引入，该载体例如是自杀性载体，其不能在宿主细胞中复制。可通过药物选择鉴定出经过引入的核酸稳定转染的细胞(例如，已合并有选择标记基因的细胞将存活，而其它细胞会死亡)。
[0112] 本发明还提供了经分离的多肽，其具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列或可通过在合适的宿主中表达本发明的多核苷酸(例如，SEQ IDNO：1所示的多核苷酸序列)获得的氨基酸序列。
[0113] 根据本发明的多肽可仅含对SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中一个或多个氨基酸的保守取代，或对非关键氨基酸的取代、插入或缺失。因此，非关键氨基酸是SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中可被改变、且不会对生物功能造成实质性影响的残基。例如，在本发明的蛋白质之间保守的氨基酸残基被预计为对改变特别不敏感。此外，在根据本发明的蛋白质和其它SMS 43蛋白之间保守的氨基酸也对改变不太敏感。
[0114] 在一个实施方式中，本发明涉及经修饰的微生物，其中所述修饰导致从如本文所述的底物直接生产维生素C和/或2-KGA的提高的产率、产量和/或效率，这尤其通过提高本文所述的SMS 43基因的活性来进行，并且其中所述微生物还包含选自下组的多核苷酸或其互补链，所述组由以下组成：
[0115] (a)编码包含根据SEQ ID NO：10的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0116] (b)包含根据SEQ ID NO：9的核苷酸序列的多核苷酸；
[0117] (c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：17和SEQID NO：18的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；
[0118] (d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有氧化还原酶[EC 1]的活性，优选地具有L-山梨糖酮脱氢酶的活性；
[0119] (e)编码氧化还原酶[EC 1]，优选地编码L-山梨糖酮脱氢酶的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及
[0120] (f)编码氧化还原酶[EC 1]，优选地编码L-山梨糖酮脱氢酶的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；
[0121] 构成。
[0122] 在另一实施方式中，本发明涉及经修饰的微生物，其中所述修饰导致从如本文所述的底物直接生产维生素C和/或2-KGA的提高的产率、产量和/或效率，这尤其通过提高本文所述的SMS 43基因的活性来进行，并且其中所述微生物还包含选自下组的多核苷酸或其互补链，所述组由以下组成：
[0123] (a)编码包含根据SEQ ID NO：14的氨基酸序列的多肽的多核苷酸；
[0124] (b)包含根据SEQ ID NO：13的核苷酸序列的多核苷酸；
[0125] (c)包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列能够使用来自微生物的基因组DNA作为模板，并使用根据SEQ ID NO：15和SEQID NO：16的引物组，通过核酸扩增(例如聚合酶链式反应)来获得；
[0126] (d)多核苷酸，其包含编码被(a)至(c)中任一项的多核苷酸编码的多肽的片段或衍生物的核苷酸序列，其中，在所述衍生物中，一个或多个氨基酸残基较之所述多肽被保守取代，并且，所述片段或衍生物具有转移酶[EC 2]的活性，优选地具有转移含磷基团的磷酸转移酶[EC 2.7]的活性；
[0127] (e)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7]的多核苷酸，且其互补链能在严谨条件下与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸杂交；以及[0128] (f)编码转移酶[EC 2]，优选地编码转移含磷基团的磷酸转移酶[EC2.7]多肽的多核苷酸，且其与(a)至(d)中任一项所定义的多核苷酸至少60％相同，例如70％、85％、90％或95％相同；
[0129] 构成。
[0130] 术语“保守取代”用于表示下述取代，其中，氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基所取代。这些家族是本领域已知的，其包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸和组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸和谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带beta支链侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
[0131] 如上所述，本发明的多核苷酸可用于对合适的宿主细胞进行遗传工程改造，使其在发酵中更好且更有效，例如，在对维生素C和/或2-KGA的直接发酵工艺中更好且更有效。
[0132] 还可通过修饰SMS 43基因获得提高的基因表达，例如，通过将一处或多处突变引入SMS 43基因来实现，其中，所述突变导致较之野生型蛋白而言功能显著提高的SMS 43蛋白。
[0133] 因此，在另一种实施方式中，从SEQ ID NO：1所示的多核苷酸或其等同物获得携带至少一处突变的多核苷酸。
[0134] 本文中使用的突变可以是导致功能更强或更稳定的多肽(例如，功能更强或更稳定的SMS 43基因产物)的任何突变。这可包括，例如，在微生物基因组中的下述改变：其提高了SMS 43的合成，或者导致SMS 43蛋白以改变的氨基酸序列表达，该改变使得该蛋白的功能较之具有未被改变的氨基酸序列的野生型副本而言被提高和/或增强。提高可在转录水平、翻译水平或翻译后水平上发生。
[0135] 微生物基因组中的改变可例如通过单交叉重组或多交叉重组用含有改变的DNA序列替换野生型DNA序列来进行。为了能方便地选择出基因组被改变的微生物转化子，该改变可以例如是编码抗生素抗性基因的DNA序列，或者编码补足微生物可能的营养缺陷型的基因的DNA序列。突变可包括但不限于：缺失-插入突变。
[0136] 还可通过下述方法获得微生物基因组中导致功能更强的多肽的改变：使用例如化学诱变剂、辐射或转座子对微生物基因组进行随机诱变，以及选择或筛选出是一种或多种发酵产物的更好的或更有效的生产菌株的突变体。用于筛选和选择的标准方法是技术人员已知的。
[0137] 用于SMS 43蛋白的上述诱变策略可导致想要的化合物(特别是维生素C和/或2-KGA)的产率增加。这些策略的列出并不意味着限制；对这些诱变策略的变化对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。可通过这些机制，用本发明的核酸和蛋白质分子产生出微生物，例如表达经突变SMS 43核酸和蛋白分子的Gluconobacter oxydans或细菌的相关菌株，使得对想要的化合物(例如维生素C和/或2-KGA)的生产的产率、生产能力和/或产量被提高。
[0138] 本文所述的核酸分子、多肽、载体、引物和重组微生物可用于下述方法中的一种或多种：鉴定Gluconobacter oxydans以及相关的生物；绘制与Gluconobacter oxydans相关的生物的基因组图谱；对感兴趣的Gluconobacter oxydans序列进行鉴定和定位；进化研究；测定功能所需的SMS 43蛋白区域；调节SMS 43蛋白活性或功能；调节RCS途径的活性；以及调节对想要的化合物(例如，维生素C和/或2-KGA)的细胞内生产。
[0139] 本发明提供了筛选能调节SMS 43蛋白活性的分子的方法，这种调节或者通过与蛋白本身或底物或SMS 43蛋白的结合伴侣的相互作用或者通过调节本发明的SMS 43核酸分子的转录或翻译来实现。在此类方法中，将表达一种或多种本发明的SMS 43蛋白的微生物与一种或多种测试化合物接触，并评估每种测试化合物对于SMS 43蛋白表达水平或活性的影响。
[0140] 本发明提供了通过直接发酵生产维生素C和/或2-KGA的工艺。具体地，本发明提供了用于直接生产维生素C和/或2-KGA的工艺，包括将底物转化为维生素C和/或2-KGA。
[0141] 若干种底物可在本发明的工艺(即，用于将给定的底物直接转化为维生素C和/或2-KGA的工艺，例如上文提到的)中用作为碳源。特别适用的碳源是可以容易地从D-葡萄糖或D-山梨糖醇代谢途径获得的那些，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖、L-山梨糖酮、2-酮基-L-古洛糖酸盐/酯、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯，或2，5-二酮基-葡萄糖酸盐/酯。优选地，底物选自，例如，D-葡萄糖、D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮，最优选地，选自D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨糖酮。在涉及使用微生物进行上述工艺时，术语“底物”和“生产底物”在本文中可互换使用。
[0142] 在本文中用于使用微生物进行的上述工艺的培养基可以是用于生产维生素C和/或2-KGA的任何合适的培养基。典型地，该培养基是包含例如盐和(多种)底物，并具有一定pH的水性培养基。其中底物被转化为维生素C和/或2-KGA的培养基也被称为生产培养基。
[0143] 本文中使用的“发酵”或“生产”或“发酵工艺”可以是：利用技术人员已知的培养基、条件和方案，使用生长中的细胞或非生长中的所谓静止细胞，这在适合于将合适的底物转化为想要的产物(例如维生素C)的条件下，使用技术人员已知的培养基、条件和方案对所述静止细胞进行培养之后进行。优选地，用静止细胞来生产维生素C。用于生产维生素C的这类方法的一个例子描述于WO 2005/017159中。优选地，使用生长中的细胞，例如分批、补料分批或连续模式培养的细胞来生产2-KGA(参阅例如EP 518136)。
[0144] 术语“直接发酵”、“直接生产”、“直接转化”等意指微生物能通过一个或多个生物转化步骤将某底物转化为特定的产物，而无需任何额外的化学转化步骤。例如，术语“将D-山梨糖醇直接转化为维生素C”意在描述下述过程，其中，微生物生产维生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作为碳源提供，而无需中间产物化学转化步骤。能直接发酵维生素C的单种微生物是优选的。在允许本文定义的从底物开始的此类转化进行的条件下培养所述微生物。
[0145] 本文中使用的静止细胞指下述微生物的细胞，所述微生物例如是存活但不能活-1跃生长的，或者是以低的比生长速率生长的，例如，低于0.02h 的生长速率，优选地，低于-1
0.01h 。显示出上述生长速率的细胞被称为“静止细胞模式”。
0.01h 。显示出上述生长速率的细胞被称为“静止细胞模式”。
[0146] 如上所述使用微生物来进行的本发明的工艺可以以不同的步骤或阶段来进行：优选地，在第一个步骤(也被称为步骤(a)或生长阶段)中，于能够生长的条件下对微生物进行培养。通过改变条件来终止该阶段，其中，所述条件改变使得微生物的生长速率降低，导致静止细胞产生，这也被称为步骤(b)，接着是用(b)的静止细胞从底物来生产维生素C，这也被称为生产阶段。
[0147] 使用微生物的上述工艺中进行的生长阶段和生产阶段可在同样的容器中进行，即，仅有一种容器，或在两种或更多的不同容器中进行，在两个阶段之间具有可选的分离步骤。可通过任何合适的手段从细胞中回收得到产生的维生素C。“回收”指，例如，可将维生素C从生产培养基中分离出来。可选地，可对由此产生的维生素C进行进一步加工。
[0148] 就关于使用微生物进行上述工艺的本发明的目的而言，术语“生长阶段”、“生长步骤”和“生长时期”在本文中可互换使用。这同样适用于“生产阶段”、“生产步骤”、“生产时期”。
[0149] 进行本发明的使用微生物的上述工艺的一种途径可以是下述工艺，其中：微生物生长于第一容器(所谓的生长容器)中，它们作为静止细胞的来源，细胞中的至少一部分被转移到第二容器(所谓的生产容器)中。生产容器中的条件可以是：使得从生长容器中转移出的细胞变为上文定义的静止细胞的条件。维生素C在第二容器中产生，并从其中被回收。
[0150] 在关于使用微生物进行上述工艺的方面，在一个方面，生长步骤可在水性培养基中进行，即，补充有用于在需氧条件下生长的合适营养物的生长培养基。培养可以以，例如，分批、补料分批、半连续或连续模式来进行。培养时间可以例如随所用的宿主、pH、温度和营养培养基而变化，其可以为例如：以分批或补料分批模式进行时，大约10小时至大约10天之间，优选为大约1天至大约10天之间，更优选地，大约1至大约5天，这取决于所述微生物。如果细胞以连续模式被培养，驻留时间可以例如为大约2至大约100小时，优选地，大约2至大约50小时，这取决于所述微生物。如果微生物选自细菌，培养可进行于大约3.0至大约9.0的pH下，优选为大约4.0至大约9.0，更优选地，大约4.0至大约8.0，进一步更优选地，大约5.0至大约8.0。如果使用了藻类或酵母，培养可进行于低于大约7.0的pH下，优选低于大约6.0，更优选低于大约5.5，最优选地，低于大约5.0。用于使用细菌进行培养的合适的温度范围可以为，例如，大约13℃至大约40℃，优选地，大约18℃至大约37℃，更优选地，大约13℃至大约36℃，最优选地，大约18℃至大约33℃。如果使用藻类或酵母，用于进行培养的合适的温度范围可以例如为，大约15℃至大约40℃，优选地，大约20℃至大约45℃，更优选地，大约25℃至大约40℃，进一步更优选地，大约25℃至大约38℃，最优选地，大约30℃至大约38℃。用于进行培养的培养基通常可以含有下述营养物作为可被吸收的碳源，例如，甘油、D-甘露醇、D-山梨糖醇、L-山梨糖、赤藻糖醇、核糖醇、木糖醇、阿糖醇、肌糖、半乳糖醇、D-核糖、D-果糖、D-葡萄糖、蔗糖和乙醇，优选地，L-山梨糖、D-葡萄糖、D-山梨糖醇、D-甘露醇、甘油和乙醇；以及含有可消化的氮源，例如，有机物质，例如，蛋白胨、酵母提取物和氨基酸。所述培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或面包酵母。多种无机物质也可被用作为氮源，例如，硝酸盐和铵盐。此外，生长培养基通常含有无机盐，例如，硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和碳酸钙。然后可在与上文所述大致相同的模式、温度和pH条件下，存在例如D-山梨糖醇、L-山梨糖或D-葡萄糖等底物时，进一步温育使用上述方案获得的细胞，以使得所述细胞将底物直接转化为维生素C和/或2-KGA。温育可在富含氮的培养基中进行，培养基中含有，例如，有机氮源，例如，蛋白胨、酵母提取物、面包酵母、尿素、氨基酸和玉米浸出液，或无机氮源，例如硝酸盐和铵盐，这种情况下，细胞将能够在产生维生素C和/或2-KGA的同时进一步生长。或者，温育可在氮贫乏的培养基中进行，在这种情况下，细胞将基本不生长，其将处于静止细胞模式，或生物转化模式。在所有情况下，温育培养基还可含有无机盐，例如硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾和氯化钙。
[0151] 在关于使用微生物进行上述工艺的方面，在生长阶段中，比生长速率例如为至少-10.02h 。对于以分批、补料分批或半连续模式生长的细胞而言，生长速率取决于，例如，生长-1
培养基的组成、pH、温度等。通常，生长速率可以例如在大约0.05至大约0.2h 的范围内，-1 -1
优选地，在大约0.06至大约0.15h 的范围内，最优选地，在大约0.07至大约0.13h 的范围内。
培养基的组成、pH、温度等。通常，生长速率可以例如在大约0.05至大约0.2h 的范围内，-1 -1
优选地，在大约0.06至大约0.15h 的范围内，最优选地，在大约0.07至大约0.13h 的范围内。
[0152] 在使用微生物进行的上述方法的另一个方面，可通过在琼脂平板(作为生长容器)上对个别微生物进行培养来提供静止细胞，其中使用了基本上相同的条件，例如，如上所述的培养时间、pH、温度、营养培养基，并添加有琼脂。
[0153] 在使用微生物进行上述工艺的方面，如果生长和生产阶段进行于两种不同的容器中，那么来自生长阶段的细胞可被收获或浓缩，并转移至第二容器(所谓的生产容器)中。该容器可以含有补充有任何适用的生产底物(可通过细胞被转化为维生素C)的水性培养基。可通过任何合适的操作来收获或浓缩来自生长容器的细胞，所述操作例如，离心、膜横流(membrane crossflow)超滤或微滤、过滤、倾析、絮凝。由此获得的细胞还可以以原始培养液的形式从生长容器转移至生产容器中，而不用被收获、浓缩或洗涤，即，以细胞悬浮液的形式被转移。在一种优选的实施方式中，细胞以细胞悬浮液的形式从生长容器被转移至生产容器，在它们之间没有任何洗涤或分离步骤。
[0154] 因此，在使用微生物进行的上述工艺的一种优选的实施方式中，上文所述的本发明方法的步骤(a)和(c)不被任何洗涤和/或分离步骤分开。
[0155] 在使用微生物进行上述工艺的方面，如果生长和生产阶段进行于同样的容器中，细胞可以生长于适当的条件下，以达到理想的细胞密度，接着用含有生产底物的生产培养基来替换生长培养基。此类替换可以例如是，在从容器中收回或收获上清液的同时，并以与之相同的速度，将生产培养基补入到容器中。为将静止细胞保留于容器中，可以使用用于细胞回收或驻留的操作，例如，细胞回收步骤。此类回收步骤，例如包括但不限于如下的方法：使用离心机、过滤器、超滤步骤的膜横流微滤、膜反应器、絮凝或在合适的多孔、非多孔或聚合物基质上的细胞固定。在转移阶段之后，对容器应用下述工艺条件：在此条件下，细胞以如上文定义的静止细胞模式存在，并且，生产底物能有效地转化为维生素C。
[0156] 在使用微生物进行上述工艺的方面，用于生产步骤中的生产容器中的水性培养基在下文中被称为生产培养基，其可以仅含有将被转化为维生素C的生产底物，或可以含有额外的无机盐，例如，氯化钠、氯化钙、硫酸镁、硫酸锰、磷酸钾、磷酸钙和碳酸钙。生产培养基还可以含有可消化的氮源，例如有机物质，例如，蛋白胨、酵母提取物、尿素、氨基酸和玉米浸出液；以及无机物质，例如，氨、硫酸铵和硝酸钠，其浓度为使得细胞被保持为上文定义的静止细胞模式的浓度。培养基可以含有或不含有尿素和/或玉米浸出液和/或烘焙酵母。生产步骤可以，例如，以分批、补料分批、半连续或连续模式进行。在补料分批、半连续或连续模式下，来自生长容器和生产培养基的两种细胞都可以以合适的补料速率被连续或间歇地补入到生产容器中。或者，仅生产培养基可被连续或间歇补入到生产容器中，而来自生长容器的细胞被同时转移至生产容器。来自生长容器的细胞可在生产容器中用作为细胞悬浮液，或者可被用作为：例如，在任何固相(例如，多孔或聚合物基质)上絮凝或固定的细胞。
生长时期被定义为从底物进入到生产容器中开始，到收获含有维生素C的上清液(即所谓的收获流)之间的时期，该时期可根据，例如，使用的细胞的浓度和种类、pH、温度和营养培养基而变动，其优选在大约2至大约100小时之间。pH和温度可与生长步骤中的pH和温度不同，但应与生长步骤中的基本上相同。
生长时期被定义为从底物进入到生产容器中开始，到收获含有维生素C的上清液(即所谓的收获流)之间的时期，该时期可根据，例如，使用的细胞的浓度和种类、pH、温度和营养培养基而变动，其优选在大约2至大约100小时之间。pH和温度可与生长步骤中的pH和温度不同，但应与生长步骤中的基本上相同。
[0157] 在使用微生物进行上述工艺的一种优选的实施方式中，生产步骤可以以连续模式进行，这意味着，含有来自生长容器的细胞的第一种补料流和含有底物的第二种补料流被连续或间歇补入到生产容器中。第一种流可以仅含有从生长培养基中分离/分开的细胞，或可以含有直接来自生长步骤的细胞悬浮液，即，悬浮于生长培养基中的细胞，而没有任何中间的细胞分离、洗涤和/或分离步骤。在本文中定义的第二种补料流可以包括生产步骤的操作所需要的所有其它补料流，例如，以一种或多种不同的流的形式存在的包含底物的生产培养基、用于稀释的水以及用于控制pH的碱。
[0158] 在关于使用微生物进行上述工艺的方面，当两种流都连续补料时，第一种流的补料速率与第二种流的补料速率之比可在大约0.01至大约10之间变动，优选地，在大约0.01至大约5之间变动，最优选地，在大约0.02至大约2之间变动。该比例取决于第一种和第二种流中各自的细胞和底物的浓度。
[0159] 进行本发明的使用微生物的上述工艺的另一种途径可以是：在生长容器中使用一定细胞密度的静止细胞的工艺。通过技术人员已知的方法，于600nm处，细胞密度作为吸收单位(光学密度)被测得。在一种优选的实施方式中，生产步骤中的细胞密度为至少大约10，更优选地，大约10至大约200之间，进一步更优选地，大约15至大约200之间，进一步更优选地，大约15至大约120之间，最优选地，大约20至大约120之间。
[0160] 在关于使用微生物进行上述工艺的方面，为在生产阶段期间(例如，以连续或半连续模式进行的)，以想要的细胞密度将细胞保持于生产容器中，本领域内已知的任何手段都可以使用，例如，通过离心、过滤、微滤的膜横流超滤、倾析、絮凝进行的细胞再利用，通过膜设备进行的细胞驻留，或细胞固定。此外，在生产步骤以连续或半连续模式进行的情况下，从生长容器中连续或间歇补入细胞，生产容器中的细胞密度可被保持于恒定的水平，这例如，通过从生产容器中收获一定量的细胞来进行，所述的量对应于从生长容器中补入的细胞的量。
[0161] 在关于使用微生物进行上述工艺的方面，从生产容器中回收/收获在所谓的收获流中含有的产生出的维生素C。收获流可以包括，例如，来自生产容器的不含细胞的水溶液或含有细胞的水溶液，其中含有通过生产容器中的静止细胞从生产底物转化得到的维生素C。可通过本领域内已知的任何操作，将仍处于收获流中的细胞与维生素C分开，例如，过滤、离心、倾析、膜横流超滤或微滤、切线流超滤或微滤或死端(dead end)过滤。在该细胞分离操作之后，收获流中基本不含细胞。
[0162] 在关于使用微生物进行上述工艺的一个方面，本发明的工艺导致维生素C的产率通常为至少约高于5.7g/l，例如，10g/l、20g/l、50g/l、100g/l、200g/l、300g/l、400g/l或者超过600g/l。在一种实施方式中，通过本发明的工艺生产的维生素C的产率在大约高于5.7g/l至大约600g/l的范围内。维生素C的产率指直接来自生产容器的收获流(即包含维生素C的不含细胞上清液)中维生素C的浓度。
[0163] 在一种优选的实施方式中，本发明涉及生产维生素C和/或2-KGA的方法，其中，将根据本发明的核苷酸或上文所述的经修饰多核苷酸序列引入如本文所述合适的微生物，在允许以高生产能力、产率和/或效率生产维生素C和/或2-KGA的条件下培养重组微生物，从培养基中分离产生的发酵产物，以及可选地，进一步纯化。
[0164] 在本发明的一个方面，提供了能从合适的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山梨糖)直接生产维生素C的微生物(特别是Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter属的)。当例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量时，发现这些生物能以分别高至280mg/l和670mg/l的水平从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产维生素C。
在本发明的另一个方面，提供了下述微生物，当从D-山梨糖醇起始时，其能以300mg/l或更多的量直接生产维生素C，或者当从L-山梨糖起始时，其能以800mg/l或更多的量直接生产维生素C，所述的量是例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量的。这可以通过增加SMS多肽(优选地，SMS 43多肽)的活性来获得。从D-山梨糖醇产生的维生素C的产率甚至可以高达400、600、1000mg/l，或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50g/l。从L-山梨糖产生的维生素C的产率甚至可以高达1000mg/l，或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50g/l。优选地，维生素C的这些量可以是例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量获得的。
在本发明的另一个方面，提供了下述微生物，当从D-山梨糖醇起始时，其能以300mg/l或更多的量直接生产维生素C，或者当从L-山梨糖起始时，其能以800mg/l或更多的量直接生产维生素C，所述的量是例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量的。这可以通过增加SMS多肽(优选地，SMS 43多肽)的活性来获得。从D-山梨糖醇产生的维生素C的产率甚至可以高达400、600、1000mg/l，或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50g/l。从L-山梨糖产生的维生素C的产率甚至可以高达1000mg/l，或者甚至超过1.5、2、4、10、20、50g/l。优选地，维生素C的这些量可以是例如以静止细胞方法在20小时的温育期之后测量获得的。
[0165] 本文中使用的以“静止细胞方法”进行的测量包括(i)通过本领域技术人员公知的任何方法培养细胞，(ii)从生长培养基收获细胞，以及(iii)在含有将被转化为想要的产物(例如维生素C)的培养基中，于其中细胞不再生长的条件下，温育收获的细胞(即，在该所谓的转化步骤期间，生物质没有量上的增加)。静止细胞方法的更一般的说明描述于例如WO 2005/017159和之前的段落中。
[0166] 在本发明的一个方面中，提供了能够从合适的碳源(例如D-山梨糖醇和/或L-山梨糖)直接生产2-KGA的微生物(尤其是来自Gluconobacter、Gluconacetobacter和Acetobacter属)。例如通过实施例6的方法测量时，发现这些生物能够以约至少500mg/l，例如约至少700、900、1000、2000mg/l，优选地约0.5到约0.7g/l的量从D-山梨糖醇或L-山梨糖直接生产2-KGA。在本发明的另一方面中，提供了从L-山梨糖开始时能够以约7、8、9、10g/l或更多或甚至约50、60、70、80、90、100g/l的量直接生产2-KGA的微生物。这可通过提高SMS多肽(优选地为G.oxydans DSM17078中的SMS 43多肽)的活性来实现。
[0167] 携带有例如经修饰的SMS 43基因并且能以显著更高的产率、生产能力和/或效率生产发酵产物的重组微生物可在上文所述的需氧条件下被培养于补充有合适营养物的水性培养基中。
[0168] 在另一个方面，本发明的工艺可组合有将产生的维生素C和/或2-KGA与收获流中含有的其它组分分离和/或纯化的额外步骤，即，所谓的下游加工步骤。这些步骤可包括技术人员已知的任何手段，例如，浓缩、结晶、沉淀、吸附、离子交换、电渗析、两极膜电渗析和/或反渗透。维生素C可作为游离酸形式或其已知的任何盐的形式被进一步纯化，这是通过下述操作手段来进行的，例如，用活性炭进行处理、离子交换、吸附和洗脱、浓缩、结晶、过滤和干燥。特别地，将维生素C与收获流中其它组分的第一次分离可通过例如下述方法的任何合适的组合或重复来进行，所述方法例如：两区室或三区室电渗析、两极膜电渗析、反渗透或吸附(其进行于，例如，离子交换树脂上或非离子树脂上)。如果获得的维生素C的形式为L-抗坏血酸的盐，将该盐形式转化为游离酸形式可通过例如，两极膜电渗析、离子交换、模拟移动床色谱技术等来进行。上述步骤的组合也可使用，例如，将电渗析和两极膜电渗析组合为一个步骤，以及使用模拟移动床色谱方法的多个离子交换步骤的组合。上述任何方案单独或组合就构成了用于分离和纯化产物(即维生素C)的方便的手段。由此获得的产物还可被进一步分离(例如，通过浓缩、结晶、沉淀、对晶体的洗涤和干燥的方式来进行)和/或进一步纯化(用活性炭处理、离子交换和/或重结晶)。
[0169] 在一种优选的实施方式中，通过一系列上述下游加工步骤来从收获流中纯化维生素C，而不必在该加工中的任何时刻将其转移到非水性溶液中，即，所有步骤都在水性环境中进行。此类优选的下游加工方案可以包括，例如，通过两区室或三区室电渗析对来自生产容器的收获流进行浓缩，通过两极膜电渗析和/或离子交换将浓缩溶液中以其盐的形式存在的维生素C转化为其酸的形式，通过例如用活性炭、离子交换或非离子树脂进行处理等方法来进行纯化，接着进行进一步的浓缩步骤和结晶。这些晶体可被分离、洗涤和干燥。如果必要的话，晶体还可被重新溶解于水中，用活性炭和/或离子交换树脂对其进行处理，并重结晶。然后可对上述晶体进行分离、洗涤和干燥。
[0170] 在一个尤其优选的实施方式中，本发明涉及用于生产维生素C和/或2-KGA的工艺，其中使用本文所述底物之一在静止细胞条件下温育如本文所述的重组G.oxydans菌株(尤其是G.oxydans DSM 17078)，尤其是使用2％D-山梨糖醇在30℃和220rpm下温育20小时，并且其中关于下述(1)和(2)对所述菌株进行遗传修饰，所述(1)为优选地在高度严谨条件下与SEQ ID NO：1(SMS 43基因)所示序列杂交的核苷酸序列编码的SMS 43多肽，(2)为优选地在高度严谨条件下与SEQ ID NO：9(sndhai基因)所示序列杂交的核苷酸序列编码的本文所述的SNDHai多肽，并且其中所述修饰导致各个基因的提高的活性。如果如本文所述使用除G.oxydans DSM17078之外的其它菌株例如G.oxydans IFO 3293，则所述重组菌株优选地在优选地在高度严谨条件下与SEQ ID NO：11中所示序列杂交的核苷酸序列编码的如本文所述的SMS 44多肽中带有突变，尤其是位于对应于SEQID NO：12第563位的氨基酸位置上的突变，优选地是用I563置换T563。
[0171] 从上述描述中可显而易见：根据本发明的方法的发酵产物可不仅限于维生素C。本文中使用的“想要的化合物”或“发酵产物”可以是Gluconobacter oxydans的任何天然产物，其包括生物合成途径的终产物和中间产物，例如，L-山梨糖、L-山梨糖酮、D-葡萄糖酸盐/酯、2-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯、5-酮基-D-葡萄糖酸盐/酯、2，5-二酮基-葡萄糖酸盐/酯和2-酮基-L-古洛糖酸盐/酯(2-KGA)，特别是对维生素C的生物合成生产。
[0172] 因此，本发明涉及本文所述的多核苷酸、多肽、载体、引物和重组微生物在生产维生素C(即将碳源直接转化为维生素C)中的用途。在一种优选的实施方式中，本文所述的经修饰的多核苷酸、多肽、载体和重组微生物用于提高对维生素C生产的产率、生产能力和/或效率。
[0173] 术语“产量”或“生产能力”是本领域已知的，其包括给定的时间和给定的发酵体积中形成的发酵产物(例如维生素C)的浓度(例如，每升每小时的kg产物)。术语“生产效率”包括：获得的特定水平的生产所需要的时间(例如，细胞达到发酵产物的特定速率输出所需时间有多长)。术语“产率”是本领域已知的，其包括碳源向产物(例如，维生素C)转化的效率。这通常写作，例如，kg产物/kg碳源。“增加”化合物的“产率和/或产量和/或生产能力”表示，给定的时间中给定量的培养物中回收的该化合物分子或回收的该化合物有用分子的量增加。术语“生物合成”或“生物合成途径”是本领域已知的，其包括：通过细胞，以可能是多步骤且被高度调控的过程，从中间产物化合物对化合物(优选地，有机化合物)的合成。措辞“代谢”是本领域已知的，其包括对生物中发生的生化反应的总称。然后，特定化合物的代谢(例如，氨基酸(例如甘氨酸)的代谢)包含细胞中与该化合物相关的总的生物合成、修饰和降解途径。措辞“转运”或“运入”是本领域已知的，其包括一种或多种分子在协助下移动经过该分子本来不能经过或不能高效经过的细胞膜。
[0174] 本文中使用的维生素C可以是水溶液中发现的L-抗坏血酸的任何化学形式，例如未离解的、以其游离酸形式存在的或离解为阴离子的。L-抗坏血酸的溶解的盐形式的特征为：在通常发现于发酵上清液中的任何种类的阳离子(例如，钾、钠、铵或钙)存在时的阴离子。还包括在内的可以有L-抗坏血酸的游离酸形式的经过分离的晶体。另一方面，用其相应的盐的名称来命名L-抗坏血酸的盐形式的经过分离的晶体，即抗坏血酸钠、抗坏血酸钾、抗坏血酸钙等。
[0175] 在本文中使用时，2-KGA可以是存在于水性溶液中的2-酮古洛酸的任何化学形式，例如未解离的形式、游离酸形式或解离的离子形式。2-酮古洛酸的溶解盐形式可以被表征为存在发酵上清液中通常存在的任何种类阳离子(例如钾、钠或钙)时的阴离子。还可包括在内的是游离酸形式2-酮古洛酸的经分离的结晶。另一方面，盐形式2-酮古洛酸的经分离的结晶通过它们相应盐的名称来命名，即2-酮古洛酸钠、2-酮古洛酸钾、2-酮古洛酸钙等等。
[0177] 将通过下述实施例进一步阐述本发明，所述实施例不应被理解为起限制作用。本文提到的所有参考文献、专利申请、专利和公开的专利申请(尤其是WO 2005/017159、WO2006/084719和EP 518136)的内容都通过引用并入本文。
[0178] 实施例1 制备染色体SMS 43 DNA以及通过PCR扩增DNA片段
[0179] 在由25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)和3g/l细菌蛋白胨(Difco)构成的液体甘露糖醇培养基(MB)中，于30℃对Gluconobacter oxydans DSM 17078的细胞进行一天的培养，通过Sambrooket al(1989)″Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Second Edition″，ColdSpring Harbor Laboratory Press所述的方法，从培养的细胞制备Gluconobacter oxydans DSM 17078的染色体DNA。
[0180] 使用按照上文所述制备的染色体DNA以及一组引物——Pf(SEQ IDNO：3)和Pr(SEQ ID NO：4)，通过PCR来制备DNA片段。按照厂商说明书，用Expand High Fidelity PCR试剂盒(Roche Diagnostics)和10ng染色体DNA以10μl的总体积来进行反应，获得了含有SMS 43 DNA序列(SEQ ID NO：1)的PCR产物。从反应体系中回收PCR产物，并验证了其正确序列。
[0181] 实施例2：在其它生物中鉴定和克隆SMS 43基因和等同物
[0182] 可通过简单的DNA杂交实验来测定其它生物(而非本文前面公开的那些，例如表1中提到的生物)中SEQ ID NO：1和/或等同物的存在。
[0183] 在含有5g/l细菌蛋白胨(Difco)、5g/l酵母提取物(Difco)、5g/l葡萄糖、5g/l甘露糖醇、1g/l MgSO4·7H2O、5ml/l乙醇和15g/l琼脂的No.350培养基上，于27℃，对菌株Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO13693和IFO 13773进行3天的培养。在含有25g/l甘露糖醇、5g/l酵母提取物(Difco)、3g/l细菌蛋白胨(Difco)和18g/l琼脂(Difco)的甘露糖醇培养基(MB)型琼脂培养基上，于27℃，对所有其它Acetobacter、Gluconacetobacter菌株和所有Gluconobacter菌株进行3天的培养。在Luria Broth琼脂培养基上培养E.coli K-12。在厂商推荐的培养基上或者按照本领域已知的方法培养其它菌株。按照例如Sambrook et al，1989，″Molecular Cloning：A Laboratory Manual/Second Edition″，Cold SpringHarbor Laboratory Press所述，从合适的生物(例如表1提到的)提取基因组DNA。
[0184] 用限制性酶EcoRI或HindIII消化基因组DNA制备物，通过琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖)分离出1μg的DNA片段。用0.25N HCl对凝胶进行15分钟的处理，接着再用0.5N NaOH处理30分钟，然后按照厂商说明书，用Vacuum Blotter Model 785(BIO-RAD Laboratories AG，Switzerland)将凝胶印到硝酸纤维素或尼龙膜上。然后用得到的印迹与含有探针(例如具有SEQ ID NO：1序列的DNA片段，或含有SEQ IDNO：1序列的部分或全部的DNA片段)的溶液接触或杂交，以从测试生物中探测阳性DNA片段。按照实施例1，用PCR-DIG标记试剂盒(RocheDiagnostics)和引物组SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4来制备DIG标记的探针，例如SEQ ID NO：1。此印迹杂交结果示于表1中。
[0185] 杂交在严谨条件或高度严谨条件下进行。在严谨条件下的杂交是在6x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中，大约45℃下进行，随后在1xSSC、0.1％SDS中，50℃下至少洗涤一次，其中洗涤温度可以高达约55℃，甚至高达约60℃或65℃。高度严格条件下的杂交在含或不含100μg/ml的鲑鱼精DNA的DigEasyHyb溶液(Roche Diagnostics GmbH)中，或包含50％甲酰胺、5x SSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、0.02％十二烷基磺酸钠、0.1％N-月桂酰肌氨酸和2％封闭试剂(Roche Diagnostics GmbH)的溶液中，于42℃温育2小时至4天，接着在2x SSC和0.1％SDS中，于室温下，洗两次膜，每次5至15分钟，然后在65-68℃，于
0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。为检测出与探针DNA具有较低相同性的DNA片段，最后的洗涤步骤可在较低温度(例如50-65℃)进行较短的洗涤时间(例如1-15分钟)。此实验的结果如表1(信号1)所示。
0.5x SSC和0.1％SDS或0.1x SSC和0.1％SDS中洗两次，每次15-30分钟。为检测出与探针DNA具有较低相同性的DNA片段，最后的洗涤步骤可在较低温度(例如50-65℃)进行较短的洗涤时间(例如1-15分钟)。此实验的结果如表1(信号1)所示。
[0186] 可通过本领域公知的PCR方法，对表1所示各生物中阳性信号对应的基因加以克隆，这使用此生物的基因组DNA与合适的引物组(例如，SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)在实施例1所述条件下进行，或者按照这样进行：每个反应使用5至100ng基因组DNA(总体积50μl)。使用Expand High Fidelity PCR系统(Roche Diagnostics)，采用下述反应条件：94℃ 2分钟；30个循环的(i)94℃ 15秒的变性步骤，(ii)60℃ 30秒的退火步骤，(iii)72℃ 0.5至5分钟(取决于目标DNA长度，1分钟/1kb)的合成步骤；72℃延伸7分钟。此实验的结果如表1(信号2)所示。
[0187] 或者，用简并引物来进行PCR，对简并引物的设计可基于SEQ IDNO：2或基于作为共有序列的氨基酸序列(通过对由序列搜索程序(例如BLASTP，或当核苷酸序列被用作“查询序列”时，BLASTX)获得的若干氨基酸序列进行比对选出的)，以找到与SEQ ID NO：2的蛋白相似的蛋白。对使用简并引物进行的PCR而言，第二个退火步骤的温度(见上文)被降低至55℃，或者甚至50-45℃。此实验的结果如表1(信号3)所示。
[0188] 通过琼脂糖凝胶电泳来分离PCR反应的样品，在用例如溴化乙啶染色后，用透照器(transilluminator)来观察条带，从凝胶对条带进行分离，验证正确的序列。
[0189] 表1：其它生物中SMS 43基因的等同物。
[0190]菌株 信号1 信号2 信号3
G.oxydans DSM 17078 ++++ ++++ +
G.oxydans IFO 3293 ++++ ++++ +
G.oxydans IFO 3292 ++++ + +
G.oxydans ATCC 621H ++++ ++++ +
G.oxydans IFO 12528 ++++ ++++ +
G.oxydans G 624 ++++ + +
G.oxydans T-100 ++++ + +
G.oxydans IFO 3291 ++++ + +
G.oxydans IFO 3255 ++++ + +
G.oxydans ATCC 9937 ++++ + +
G.oxydans IFO 3244 ++++ + +
G.cerinus IFO 3266 ++++ + +
G.frateurii IFO 3260 ++++ + +
G.oxydans IFO 3287 ++++ + +
Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO 3259 - - +
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13693 - - +
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13773 - - +
Acetobacter sp.ATCC 15164 - - +
G.thailandicus NBRC 100600 + - +
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC 14835 ++ - +
Gluconacetobacter polyoxogenes NBI 1028 + - +
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037 - - +
Gluconacetobacter europaeus DSM 6160 - - +
Acetobacter aceti 1023 - - +
Acetobacter pasteurianus NCI 1193 - - +
Methylobacterium sp.4-46 + + +
Methylobacterium chloromethanicum CM4 + + +
Methylobacterium extorquens PA1 + + +
Methylobacterium populi BJ001 + + +
Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 + + +
Magnetospirillum magneticum AMB-1 + + +
E.coli - - -
Saccharomyces cerevisiae - - -
Aspergillus niger - - -
小鼠 - - -
G.oxydans DSM 17078 ++++ ++++ +
G.oxydans IFO 3293 ++++ ++++ +
G.oxydans IFO 3292 ++++ + +
G.oxydans ATCC 621H ++++ ++++ +
G.oxydans IFO 12528 ++++ ++++ +
G.oxydans G 624 ++++ + +
G.oxydans T-100 ++++ + +
G.oxydans IFO 3291 ++++ + +
G.oxydans IFO 3255 ++++ + +
G.oxydans ATCC 9937 ++++ + +
G.oxydans IFO 3244 ++++ + +
G.cerinus IFO 3266 ++++ + +
G.frateurii IFO 3260 ++++ + +
G.oxydans IFO 3287 ++++ + +
Acetobacter aceti subsp.orleanus IFO 3259 - - +
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13693 - - +
Acetobacter aceti subsp.xylinum IFO 13773 - - +
Acetobacter sp.ATCC 15164 - - +
G.thailandicus NBRC 100600 + - +
Gluconacetobacter liquefaciens ATCC 14835 ++ - +
Gluconacetobacter polyoxogenes NBI 1028 + - +
Gluconacetobacter diazotrophicus ATCC 49037 - - +
Gluconacetobacter europaeus DSM 6160 - - +
Acetobacter aceti 1023 - - +
Acetobacter pasteurianus NCI 1193 - - +
Methylobacterium sp.4-46 + + +
Methylobacterium chloromethanicum CM4 + + +
Methylobacterium extorquens PA1 + + +
Methylobacterium populi BJ001 + + +
Magnetospirillum gryphiswaldense MSR-1 + + +
Magnetospirillum magneticum AMB-1 + + +
E.coli - - -
Saccharomyces cerevisiae - - -
Aspergillus niger - - -
小鼠 - - -
[0191]
[0192] 信号1：在使用不同菌株的基因组DNA，用SEQ ID NO：1作为经标记探针进行的印迹杂交试验上对DNA的探测。信号2：使用引物对SEQID NO：3和SEQ ID NO：4在PCR反应中对不同菌株DNA的探测。信号3：使用简并引物进行的PCR反应中对不同菌株DNA的探测。更多解释参见文本。
[0193] 实施例3：构建过表达SMS 43基因或其等同物的菌株
[0194] 为对SMS 43基因或等同基因(参阅实施例2和表1)的表达进行上调，使用采用质粒构建体的过量表达系统。本文中，SMS 43基因或等同基因被融合到强组成型启动子上，然后将构建体引入各自的宿主细胞例如G.oxydans DSM 17078。通过本领域技术人员已知的标准方法测定SMS 43基因或等同基因的过量表达，所述方法例如使用Northern印迹杂交、RT-PCR或其它技术进行转录分析，使用Western印迹杂交、二维凝胶电泳来进行蛋白质表达测定，使用特异性酶试验或者通过直接测量产物形成或底物转化来进行酶活性测定。
[0195] 启动子可以是在Gluconobacter oxydans中展示出强组成型活性的任何启动子，例如，来自Escherichia coli的tufB启动子、来自Gluconobacteroxydans的tufB启动子、来自Gluconobacter oxydans的sldh启动子、或者来自Gluconobacter oxydans的sndh启动子。在以下的详述中，使用来自Gluconobacter oxydans的sldh启动子(Psndh)。
[0196] 用于基于质粒的过量表达系统的质粒可以是在Escherichia coli和Gluconobacter oxydans中均能复制并且可在这两个物种间转移的任何质粒。该质粒方便地含有选择性标记，使得该质粒的转移可被监测，选择性标记例如抗生素抗性标记、针对原营养型的补足标记。此类质粒包括：pVK100、pGE1、pBBR1MCS-2、RSF1010以及它们的衍生物(具有目录号或信息来源的载体，pVK100＝ATCC 37156，pGE1＝J.Ferment Bioeng.79，95，
1995，pBBR1MCS-2＝NCCB 3434，RSF1010＝NCCB 3110)。在以下的详述中，使用pVK100。
1995，pBBR1MCS-2＝NCCB 3434，RSF1010＝NCCB 3110)。在以下的详述中，使用pVK100。
[0197] 使用引物对PsndhSMS 43+1(SEQ ID NO：5)(其5’端含有互补的Psndh启动子悬突序列)和SMS 43 HindIII-1(SEQ ID NO：4，在5’末端含有GAGAAAGCTT)，通过PCR扩增出整条SMS 43基因。使用引物对PsndhXhoI+1(SEQ ID NO：7)和SMS 43Psndh-1(SEQ ID NO：8)(其5’端含有互补的SMS 43 DNA悬突序列)通过PCR扩增Psndh启动子(SEQ IDNO：6)。
用Gluconobacter oxydans DSM 17078基因组DNA作为模板，反应条件由35个循环的94℃变性30秒、50℃退火30秒和72℃延伸1分钟组成。在两种情况下均使用GC-rich PCR试剂盒(Roche MolecularBiochemicals)。因为两个片段具有互补的悬突，因此将各PCR片段混合并使用引物对PsndhXhoI+1/SMS 43HindIII-1来再扩增，以扩增全长产物，藉此将选择的启动子插入SMS 43基因上游。第二轮反应的PCR反应条件由94℃、2分钟，然后10个循环的[94℃ 30秒，63℃ 30秒，68℃ 6分钟]，之后20个循环的[94℃ 30秒，63℃ 30秒，
68℃ 6分钟和每个循环额外的20秒]和68℃ 10分钟的最终延伸组成。对PCR产物加以纯化，用XhoI和HindIII进行双消化，克隆进用XhoI-HindIII消化过的pVK100载体。将连接-1
混合物转化进E.coli TOP10细胞，在含有终浓度为10μg ml 的四环素的Luria-Bertani琼脂上对转化子加以选择。使用引物对PsndhXhoI+1/SMS 43HindIII-1通过菌落PCR筛选可能的转化子。捡出阳性转化子，制备小份的质粒(plasmid minipreps)，验证插入片段的DNA序列。将展示出正确序列的质粒转化进感受态G.oxydans DSM 17078细胞，在含有-1
终浓度为10μg ml 的四环素的甘露糖醇培养基型琼脂培养基上对转化子加以选择。观察到若干个可能的转化子，再使用引物对PsndhXhoI+1/SMS 43HindIII-1通过PCR对其中四个进行分析，以验证质粒的存在。发现所有菌株都含有SMS 43过量表达质粒，它们被命名为G.oxydans DSM 17078-SMS 43up1、G.oxydans DSM 17078-SMS 43up2、G.oxydans DSM
17078-SMS 43up3和G.oxydans DSM 17078-SMS 43up4。使用对SMS 43特异性的抗体，通过Western印迹测试与野生型状况相比SMS 43蛋白质的过表达。技术人员还知道其它方法，例如测定磷酸转移酶活性(ATP水解)或测定受SMS 43多肽调节的目标基因的表达。
用Gluconobacter oxydans DSM 17078基因组DNA作为模板，反应条件由35个循环的94℃变性30秒、50℃退火30秒和72℃延伸1分钟组成。在两种情况下均使用GC-rich PCR试剂盒(Roche MolecularBiochemicals)。因为两个片段具有互补的悬突，因此将各PCR片段混合并使用引物对PsndhXhoI+1/SMS 43HindIII-1来再扩增，以扩增全长产物，藉此将选择的启动子插入SMS 43基因上游。第二轮反应的PCR反应条件由94℃、2分钟，然后10个循环的[94℃ 30秒，63℃ 30秒，68℃ 6分钟]，之后20个循环的[94℃ 30秒，63℃ 30秒，
68℃ 6分钟和每个循环额外的20秒]和68℃ 10分钟的最终延伸组成。对PCR产物加以纯化，用XhoI和HindIII进行双消化，克隆进用XhoI-HindIII消化过的pVK100载体。将连接-1
混合物转化进E.coli TOP10细胞，在含有终浓度为10μg ml 的四环素的Luria-Bertani琼脂上对转化子加以选择。使用引物对PsndhXhoI+1/SMS 43HindIII-1通过菌落PCR筛选可能的转化子。捡出阳性转化子，制备小份的质粒(plasmid minipreps)，验证插入片段的DNA序列。将展示出正确序列的质粒转化进感受态G.oxydans DSM 17078细胞，在含有-1
终浓度为10μg ml 的四环素的甘露糖醇培养基型琼脂培养基上对转化子加以选择。观察到若干个可能的转化子，再使用引物对PsndhXhoI+1/SMS 43HindIII-1通过PCR对其中四个进行分析，以验证质粒的存在。发现所有菌株都含有SMS 43过量表达质粒，它们被命名为G.oxydans DSM 17078-SMS 43up1、G.oxydans DSM 17078-SMS 43up2、G.oxydans DSM
17078-SMS 43up3和G.oxydans DSM 17078-SMS 43up4。使用对SMS 43特异性的抗体，通过Western印迹测试与野生型状况相比SMS 43蛋白质的过表达。技术人员还知道其它方法，例如测定磷酸转移酶活性(ATP水解)或测定受SMS 43多肽调节的目标基因的表达。
[0198] 如下进行SMS 43基因等同物(参阅实施例2和表1)的过表达：将实施例2中获得的PCR产物(即含有SMS 43基因的等同物，并在下文中称作基因X)克隆进
pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，并用于转化E.coli TG1，得到带有pCR2.1-TOPO-基因X(即带有实施例2中获得的PCR产物)的Apr转化体。使用一组引
物PfNdeI[SEQ IDNO：3，5′-端带有CCCAT]和PrHindIII[SEQ ID NO：4，5′-端带有CCAAGCTT]，通过PCR扩增插入物。用NdeI和HindIII消化得到的PCR产物，并将所述片段与经XhoI和NdeI消化的PcrtE-SD(Shine-Dalgarno)片段(WO 02/099095)一起插入pVK100(ATCC 37156)的XhoI和HindIII位点之间。用连接产物转化E.coli TG1，得到带有质粒pVK-PcrtE-SD-基因X的Tcr转化体，然后使用它通过电穿孔转化G.oxydans DSM
17078，得到例如Tcr G.oxydans DSM 17078/pVK-PcrtE-SD-基因X。使用特异性抗体，通过Western印迹测试蛋白质的表达(见上文)。
pCR2.1-TOPO(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)中，并用于转化E.coli TG1，得到带有pCR2.1-TOPO-基因X(即带有实施例2中获得的PCR产物)的Apr转化体。使用一组引
物PfNdeI[SEQ IDNO：3，5′-端带有CCCAT]和PrHindIII[SEQ ID NO：4，5′-端带有CCAAGCTT]，通过PCR扩增插入物。用NdeI和HindIII消化得到的PCR产物，并将所述片段与经XhoI和NdeI消化的PcrtE-SD(Shine-Dalgarno)片段(WO 02/099095)一起插入pVK100(ATCC 37156)的XhoI和HindIII位点之间。用连接产物转化E.coli TG1，得到带有质粒pVK-PcrtE-SD-基因X的Tcr转化体，然后使用它通过电穿孔转化G.oxydans DSM
17078，得到例如Tcr G.oxydans DSM 17078/pVK-PcrtE-SD-基因X。使用特异性抗体，通过Western印迹测试蛋白质的表达(见上文)。
[0199] 上述方法均可可交换地用于分别扩增SMS 43基因及其等同物。
[0200] 实施例4：构建过表达SMS 43基因和SNDHai基因或其等同物的菌株
[0201] 构建过表达编码SEQ ID NO：9中所示L-山梨糖酮脱氢酶(SNDHai)的基因的菌株，其中使用实施例3中所述使用质粒构建体的过表达体系。WO 2005/017159中描述了从G.oxydans DSM 17078中克隆SNDHai基因和从其它菌株中克隆其等同物。
[0202] 将SMS 43基因或其等同物和SNDHai二者与强组成型启动子融合，然后将构建体引入各自的宿主细胞例如G.oxydans DSM 17078中。通过本领域技术人员已知的标准方法测定各自基因的过表达。过表达的菌株分别被称为G.oxydans DSM 17078-(SMS43-SNDHai)up和G.oxydans DSM17078-(基因X-SNDHai)up，其中基因X定义SMS 43基因的等同物。使用特异性抗体(见上文)或如WO 2005/017159中所公开地，通过Western印迹分析测试蛋白质的表达。
[0203] 实施例5：构建过表达SMS 43基因、SNDHai基因或其等同物并且在SMS 44基因或其等同物中带有突变的菌株
[0204] 实施例4中获得的G.oxydans DSM 17078的重组菌株已经含有根据SEQ ID NO：11的SMS 44基因或其等同物的突变版本，即根据SEQ IDNO：13的突变的SMS 44基因。已知根据SEQ ID NO：12的SMS 33多肽，尤其是根据SEQ ID NO：14的突变的多肽，作为与SMS43组合发挥作用的SNDHai基因的其它活化物/调剂物而发挥作用。
[0205] 使用根据表1的其它菌株例如G.oxydans IFO 3293时，如下进行导致用I563置换T563的SMS 44多肽的突变：通过使用PCR和各自引物组PrSMS44(SEQ ID NO：15)/PfSMS44(SEQ ID NO：16)从G.oxydans DSM17078中扩增经修饰的SMS 44基因来实现菌株的构建，其中野生型SMS44基因被突变的SMS 44基因置换。将扩增产物与抗生素盒连接，使得可以用PCR产物转化含有野生型SMS 44基因的菌株(例如G.oxydans IFO3293菌株)，并通过涂布在所述抗生素盒抵抗的抗生素的培养基上进行选择。通过测定序列来测试突变的验证。
[0206] 将经突变的SMS 44基因引入实施例4的菌株(即过表达SMS 43基因、SNDHai基因或其等同物的菌株)中。使用特异性抗体(见上文)或如WO 2005/017159中所公开地，通过Western印迹分析测试蛋白质的表达。
[0207] 实施例6：在静止细胞反应中生产维生素C
[0208] 在含有70g/l D-山梨糖醇、0.5g/l甘油、7.5g/l酵母提取物(Difco)、2.5g/l MgSO4·7H2O、10的CaCO3和18g/l琼脂(Difco)的No.3BD琼脂培养基上，于27℃对G.oxydans DSM 17078、G.oxydans DSM 17078-SMS 43up1、G.oxydans DSM 17078-SMS43up2、G.oxydans DSM 17078-SMS 43up3 和 G.oxydans DSM 17078-SMS 43up4、DSM
17078/pVK-PcrtE-SD- 基 因 X、G.oxydans DSM 17078-(SMS 43-SNDHai)up、G.oxydans DSM 17078-(基因X-SNDHai)up、G.oxydans DSM17078-(SMS 43-SNDHai)up-SMS 44mut和G.oxydans DSM 17078-(基因X-SNDHai)up-SMS 44mut的细胞进行3天的培养。
17078/pVK-PcrtE-SD- 基 因 X、G.oxydans DSM 17078-(SMS 43-SNDHai)up、G.oxydans DSM 17078-(基因X-SNDHai)up、G.oxydans DSM17078-(SMS 43-SNDHai)up-SMS 44mut和G.oxydans DSM 17078-(基因X-SNDHai)up-SMS 44mut的细胞进行3天的培养。
[0209] 从琼脂平板上刮下细胞，将其悬浮于蒸馏水中，用于在30℃，220rpm振荡下进行并如WO 2005/017159所述的静止细胞反应。用处于反应混合物(还含有0.3％NaCl和1％CaCO3)中的2％D-山梨糖醇来进行一系列反应(0.5ml反应混合物，处
于5ml反应试管中)，用终浓度为OD600＝10的细胞进行温育。20小时的温育后，
用 具 有 与 Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad，Reinach，Switzerland) 相 连 的LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck，Darmstadt，Germany)的Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies，Wilmington，USA)，通过高效液相色谱(HPLC)来对反应混合物样品进行分析。移动相是流速为0.6ml/分钟的0.004M硫酸。用UV探测器(波长
254nm)组合折射率探测器，记录下两个信号。此外，用具有UV探测的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II，YMC，Inc.，Kyoto，Japan)在254nm处来进行对L-抗坏血酸的鉴定。移动相为50mM NH4H2PO4和乙腈(40∶60)。
于5ml反应试管中)，用终浓度为OD600＝10的细胞进行温育。20小时的温育后，
用 具 有 与 Aminex-HPX-78H(300x7.8mm)柱(Biorad，Reinach，Switzerland) 相 连 的LiChrospher-100-RP18(125x4.6mm)柱(Merck，Darmstadt，Germany)的Agilent1100HPLC系统(Agilent Technologies，Wilmington，USA)，通过高效液相色谱(HPLC)来对反应混合物样品进行分析。移动相是流速为0.6ml/分钟的0.004M硫酸。用UV探测器(波长
254nm)组合折射率探测器，记录下两个信号。此外，用具有UV探测的氨基柱(YMC-Pack Polyamine-II，YMC，Inc.，Kyoto，Japan)在254nm处来进行对L-抗坏血酸的鉴定。移动相为50mM NH4H2PO4和乙腈(40∶60)。
[0210] 用Agilent Series 1100 HPLC-质谱(MS)系统来鉴定L-抗坏血酸。用电喷雾界面在正离子模式下来操作MS。用0.1％蚁酸和甲醇(96∶4)的混合物作为移动相，用LUNA-C8(2)柱(100x4.6mm)(Phenomenex，Torrance，USA)来进行分离。L-抗坏血酸以3.1分钟的驻留时间被洗脱出来。通过驻留时间和该化合物的分子量来确认L-抗坏血酸的身份。
[0211] 用突变体菌株G.oxydans DSM 17078-SMS 43up1、G.oxydans DSM17078-SMS43up2、G.oxydans DSM 17078-SMS 43up3和G.oxydans DSM17078-SMS 43up4的细胞温育的反应混合物的上清液平均含有2.8g/l的维生素C，相比之下，用G.oxydans DSM 17078细胞为1.0g/l。
[0212] 使用突变体菌株DSM 17078/pVK-PcrtE-SD-基因X、G.oxydans DSM17078-(SMS43-SNDHai)up、G.oxydans DSM 17078-(基因X-SNDHai)up、G.oxydans DSM 17078-(SMS
43-SNDHai)up-SMS 44mut和G.oxydans DSM17078-(基因X-SNDHai)up-SMS 44mut的细胞时，在反应混合物的上清液中测量到平均7g/l的维生素C。
43-SNDHai)up-SMS 44mut和G.oxydans DSM17078-(基因X-SNDHai)up-SMS 44mut的细胞时，在反应混合物的上清液中测量到平均7g/l的维生素C。
[0213] 在使用G.oxydans DSM 17078菌株的重组细胞和相应野生型菌株、用1％L-山梨糖酮作为底物的静止细胞反应中，重组细胞能够生产与野生型菌株相比至少多20％的维生素C。
[0214] 实施例7：生产2-KGA
[0215] 根据实施例6进行使用例如G.oxydans菌株DSM 17078的重组细胞和相应的野生型菌株生产2-KGA。
[0216] 在使用G.oxydans DSM 17078菌株的重组细胞和相应野生型菌株、用1％L-山梨糖酮作为底物的静止细胞反应中，重组细胞能够生产与野生型菌株相比至少多20％的2-KGA。使用2％D-山梨糖醇作为底物时获得相同的结果。
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