用脑信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症专利检索-过继细胞治疗疗法专利检索查询-专利查询网

用脑 信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症

阅读：573发布：2020-10-17

专利汇可以提供用脑信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供了一种用于抑制、延迟或减少患有癌症的对象中恶性细胞生长的方法，所述方法包括给予所述对象联合疗法，所述联合疗法包括有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段和有效量的表观遗传调节剂，例如组蛋白脱乙酰酶(HDAC) 抑制剂 (HDACi),DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)或其任意组合。本公开还提供了包含所述联合疗法的药物组合物。，下面是用脑信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于抑制、延迟或减少患有癌症的对象中恶性细胞生长的方法，所述方法包括给予所述对象联合疗法，所述联合疗法包括有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段和有效量的表观遗传调节剂。
2.如权利要求1所述的方法，其中，所述抗体或其片段抑制SEMA4D与其受体的相互作用。
3.如权利要求2所述的方法，其中，所述受体是丛蛋白-B1、丛蛋白-B2或CD72。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其片段抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。
5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含分别含有SEQ ID NO:2、3和4的VH CDR 1-3，而所述可变轻链(VL)包含分别含有SEQ ID NO:6、7和8的VL CDR 1-3。
6.如权利要求5所述的方法，其中，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述表观遗传调节剂包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)、DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)或其任意组合。
8.如权利要求7所述的方法，其中，所述表观遗传调节剂包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)。
9.如权利要求8述的方法，其中，所述HDAC包括I型HDAC、IIA型HDAC、IIB型HDAC、IV型HDAC或其任意组合，或者其中所述HDAC包括含锌催化结构域。
10.如权利要求9所述的方法，其中，所述HDACi能够结合所述HDAC的含锌催化结构域。
11.如权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述HDACi包含选自下述的化学部分：
异羟肟酸或其盐，环四肽，缩酚酸肽，苯甲酰胺，亲电性酮，脂肪酸或其盐，或其任意组合。
12.如权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，所述HDACi包括伏立诺他，罗米地辛，西达本胺，帕比司他，贝利司他，丙戊酸或其盐，莫西司他，阿贝司他，恩替诺特，帕思诺特，雷米诺特，吉凡诺特，奎斯诺特，凯维特林，CUDC-101，AR-42，特菲诺特(CHR-2845)，CHR-
3996，4SC-202，CG200745，ACY-1215，ACY-241，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。
13.如权利要求12所述的方法，其中，所述HDACi是恩替诺特(吡啶-3-基甲基N-[[4-[(2-氨基苯基)氨基甲酰基]苯基]甲基]氨基甲酸酯)。
14.如权利要求7所述的方法，其中，所述表观遗传调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)。
15.如权利要14所述的方法，其中，所述DNMT包括DNMT1、DNMT-3a、DNMT-3b或其任意组合。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中，所述DNMTi是核苷类似物，反义寡核苷酸，小分子酶抑制剂或其任意组合。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中，所述DNMTi包括氮杂胞苷，地西他滨，
4-脱氧尿苷，SGI-110，表没食子儿茶素没食子酸酯，MG98，RG108，普鲁卡因胺，肼苯哒嗪，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。
18.如权利要求17所述的方法，其中，所述DNMTi是氮杂胞苷。
19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述抗体或其抗原结合片段和所述表观遗传调节剂分开地或同时地给予。
20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中，相对于单独给予所述抗体或其片段或所述表观遗传调节剂，所述联合疗法的给予获得增强的治疗功效。
21.如权利要求20所述的方法，其中，所述增强的治疗功效大于累加效应。
22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其中，癌症包括实体瘤，血液恶性病，其任何转移，或其任意组合。
23.如权利要求22所述的方法，其中，所述癌症是实体瘤或其转移。
24.如权利要求23所述的方法，其中，所述实体瘤是肉瘤，癌，黑色素瘤，其任何转移，或其任意组合。
25.如权利要求24所述的方法，其中，所述实体瘤是鳞状细胞癌，腺癌，基底细胞癌，肾细胞癌，乳腺导管癌，软组织肉瘤，骨肉瘤，黑素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胃癌，胰腺癌，神经内分泌癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，脑癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，食道癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，头颈癌，其任何转移，或其任意组合。
26.如权利要求22所述的方法，其中，所述癌症是血液恶性病或其转移。
27.如权利要求26所述的方法，其中，所述血液恶性病是白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，其任何转移，或其任意组合。
28.如权利要求1-27中任一项所述的方法，其还包括给予其他癌症疗法。
29.如权利要求28所述的方法，其中，所述其他疗法包括，手术，化疗、放疗，癌症疫苗，给予免疫刺激剂，过继性T细胞或抗体疗法，给予免疫检查点阻断抑制剂，给予调节性T细胞(Treg)调节剂及其组合。
30.如权利要求1-13或19-29中任一项所述的方法，其中：
(a).所述特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段包括含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL，和
(b).所述表观遗传调节剂包含HDACi恩替诺特。
31.如权利要求1-7或14-29中任一项所述的方法，其中：
(a).所述特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段包括含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL，和
(b).所述表观遗传调节剂包含DNMTi氮杂胞苷。
32.一种药物组合物，所述药物组合物包含有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段和有效量的表观遗传调节剂。
33.如权利要求32所述的药物组合物，其还包含运载体、赋形剂或其任意组合。
34.如权利要求32或33所述的药物组合物，其中，所述抗体或其片段包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含分别含有SEQ ID NO:2、3和4的VH CDR 1-3，而所述可变轻链(VL)包含分别含有SEQ ID NO:6、7和8的VL CDR 1-3。
35.如权利要求34所述的药物组合物，其中，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。
36.如权利要求32-35中任一项所述的药物组合物，其中，所述表观遗传调节剂包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)、DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)或其任意组合。
37.如权利要求36所述的药物组合物，其中，所述表观遗传调节剂包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)。
38.如权利要求37所述的药物组合物，其中，所述HDACi包括伏立诺他，罗米地辛，西达本胺，帕比司他，贝利司他，丙戊酸或其盐，莫西司他，阿贝司他，恩替诺特，帕思诺特，雷米诺特，吉凡诺特，奎斯诺特，凯维特林，CUDC-101，AR-42，特菲诺特(CHR-2845)，CHR-3996，
4SC-202，CG200745，ACY-1215，ACY-241，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。
39.如权利要求38所述的药物组合物，其中，所述HDACi是恩替诺特(吡啶-3-基甲基N-[[4-[(2-氨基苯基)氨基甲酰基]苯基]甲基]氨基甲酸酯)。
40.如权利要求36所述的药物组合物，其中，所述表观遗传调节剂包括DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)。
41.如权利要求40所述的药物组合物，其中，所述DNMTi包括氮杂胞苷，地西他滨，4-脱氧尿苷，SGI-110，表没食子儿茶素没食子酸酯，MG98，RG108，普鲁卡因胺，肼苯哒嗪，其任意组合，或任何其盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。
42.如权利要求41所述的药物组合物，其中，所述DNMTi是氮杂胞苷。
43.一种药物组合物，包含：
(a).有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:1和VL氨基酸序列SEQ ID NO:5，和(b).有效量的HDACi恩替诺特。
44.一种药物组合物，包含：
(a).有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其片段包含VH氨基酸序列SEQ ID NO:1和VL氨基酸序列SEQ ID NO:5，和(b).有效量的DNMTi氮杂胞苷。

说明书全文

用脑信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2017年3月20日提交的美国临时专利申请系列号62/473,731的优先权，其公开内容通过引用全文纳入本文。

[0003] 序列表陈述

[0004] 用本申请提交的电子提交ASCII文本文件序列表(名称：58008_172854_Seq-List_ST25.txt；大小：5936字节；创建日期：2018年2月28日)的内容通过引用全文纳入本文。

背景技术

[0005] 脑信号蛋白4D(SEMA4D)，也称作CD100，是一种属于脑信号蛋白基因家族的跨膜蛋白。SEMA4D在细胞表面上表达为同二聚体，但在细胞激活之后，SEMA4D可通过蛋白水解切割从细胞表面上释放以生成该蛋白质的溶解形式sSEMA4D，这也是有生物活性的。参见Suzuki等，Nature Rev.Immunol.3:159-167(2003)；Kikutani等，Nature Immunol.9:17-23(2008)。

[0006] SEMA4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑和肾脏的非淋巴器官中以高水平表达。在淋巴器官中，SEMA4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞和抗原呈递细胞(APC)如树突细胞(DC)上弱表达。然而，在用各种免疫刺激激活之后，其表达在这些细胞中上调。细胞激活也增加了可溶性SEMA4D从免疫细胞的释放。SEMA4D已与某些癌症的发展密切关联(Ch’ng等，Cancer 110:164–72(2007)；Campos等，Oncology Letters,5:1527-35(2013)；Kato等，Cancer Sci.102:2029-37(2011))并且几篇报道表明这种影响的一个机制是SEMA4D在促进肿瘤血管生成中的作用(Conrotto等，Blood 105:4321-4329
(2005).Basile等，J Biol.Chem.282:34888–34895(2007)；Sierra等，J.Exp.Med.205:1673(2008)；Zhou等，Angiogenesis 15:391-407(2012))。肿瘤生长和转移涉及肿瘤细胞、基质和免疫浸润物，以及内皮细胞和血管系统之中复杂的串扰过程。SEMA4D在各种各样的肿瘤类型中过表达，并且还通过招募至肿瘤微环境的炎性细胞产生。最近的研究表明，SEMA4D对构成肿瘤基质的不同细胞类型的迁移、存活、分化和组织十分重要(Evans等,Cancer
Immunol.Res.3:689–701(2015))。

[0007] 通过经由表观遗传机制修饰基因表达，癌症细胞可以适用于避免宿主免疫识别，并且不改变基因组DNA的序列。表观遗传机制主要集中在改变基因组DNA甲基化以及转录后修饰组蛋白，产生例如染色质结构和DNA对于转录的可及性的改变。通过这些表观遗传机制，癌细胞可以建立改变的可遗传的基因表达概况，其促进扩增和免疫逃避。参见例如，Maio,等,Clin.Cancer Res.21:4040-4047(2015)。

[0008] 细胞可以经由组蛋白乙酰化酶(HAT)控制组蛋白周围DNA的成螺旋和解螺旋，所述组蛋白乙酰化酶(HAT)使核心组蛋白中的赖氨酸残基乙酰化，产生较不紧密且转录上更有活性的染色质以及组蛋白乙酰化酶(HDAC)，所述组蛋白去乙酰化酶(HDAC)从赖氨酸残基去除乙酰基，导致形成压缩并且转录沉默的染色质。通过肿瘤细胞调节HAT/HDAC活性可以导致肿瘤细胞中基因表达的广泛表观遗传调节，允许细胞逃避患者的免疫系统监管。参见例如，Maio,等,Clin.Cancer Res.21:4040-4047(2015)。

[0009] 组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi(本文以单数和复数使用))已经作为癌症治疗剂出现。通过诱导广泛的转录变化，激活和/或抑制各种基因(通过调节组蛋白和/或非组蛋白蛋白(如转录因子)的乙酰化作用/脱乙酰作用)，HDACi可以抑制肿瘤细胞的增殖。Chueh,A.C.等,Antioxidants&Redox Signaling 23:66-84(2015)。HDACi可以干扰细胞增殖和存活，例如，干扰癌细胞的细胞周期、分化和凋亡。HDACi还可以增强免疫原性和肿瘤细胞的抗原呈递并提供将HDACi与免疫疗法相结合的原理(Gameiro SR等,Oncotarget 7:7390-7402(2016))。几种化合物当前处于早期临床研究中，以单一疗法或与细胞毒素和分化剂联用作为实体和血液癌的潜在治疗方法。参见例如，Mottamal,M.等,Molecules 20:3898-3941(2015)。

[0010] 基因组DN的甲基化是一种广泛表征的表观遗传修饰。DNA的甲基化产生转录静止，导致基因沉默。Gravina G.L.等,Mol.Cancer 9:305-320(2010)。甲基化通过DNA甲基化转移酶(DNMT)促进，所述DNMT催化向胞嘧啶残基的5'碳添加甲基基团，同上。超甲基化DNA在肿瘤和其他癌细胞常见。当前，在各种癌症治疗中使用并测试了各种DNA甲基化抑制剂(DNMTi(本文中以单数和复数使用))。这些包括脱氧核糖核苷类似物，如氮杂胞苷和非核苷类似物，如反义寡核苷酸和小分子酶抑制剂，同上。发明内容

[0011] 本公开提供了一种用于抑制、延迟或减少患有癌症的对象中恶性细胞生长的方法，所述方法包括给予所述对象这样的联合疗法，所述联合疗法包括有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段和有效量的表观遗传调节剂。根据所提供的方法，抗-SEMA4D抗体或其片段可以抑制SEMA4D与其受体例如丛蛋白-B1、丛蛋白-B2或CD72的相互作用。例如，根据所提供的方法，抗-SEMA4D抗体或其片段可以抑制SEMA4D-介导的丛蛋白-B1信号转导。

[0012] 在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其片段包含可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:2、3和4的VH CDR 1-3，而所述可变轻链(VL)包含分别具有氨基酸序列SEQ ID NO:6、7和8的VL CDR 1-3。在某些方面中，VH和VL的氨基酸序列分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5或者SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

[0013] 在某些方面中，表观遗传调节剂可以包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)、DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)或其任意组合。

[0014] 在某些方面中，表观遗传调节剂可以包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)。在某些方面中，HDAC可以是I型HDAC、IIA型HDAC、IIB型HDAC、IV型HDAC或其任意组合，或者HDAC可以包括含锌催化结构域。在某些方面中，HDACi可以结合HDAC的含锌催化结构域。在某些方面中，HDACi可以包含选自下组的化学部分：异羟肟酸或其盐，环四肽，缩酚酸肽，苯甲酰胺，亲电性酮，脂肪酸或其盐，或其任意组合。例如，在某些方面中，HDACi可以是伏立诺他(Vorinostat)，罗米地辛(Romidepsin)，西达本胺(Chidamide)，帕比司他
(Panobinostat)，贝利司他(Belinostat)，丙戊酸或其盐，莫西司他(Mocetinostat)，阿贝司他(Abexinostat)，恩替诺特(Entinostat)，帕思诺特(Pracinostat)，雷米诺特
(Resminostat)，吉凡诺特(Givinostat)，奎斯诺特(Quisinostat)，凯维特林(Kevetrin)，CUDC-101，AR-42，特菲诺特(Tefinostat)(CHR-2845)，CHR-3996，4SC-202，CG200745，ACY-
1215，ACY-241，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。在某些方面中，HDACi是恩替诺特(Entinostat)(吡啶-3-基甲基N-[[4-[(2-氨基苯基)氨基甲酰基]苯基]甲基]氨基甲酸酯)。

[0015] 在某些方面中，表观遗传调节剂可以包括DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)。在某些方面中，DNMT可以是DNMT1、DNMT-3a、DNMT-3b或其任意组合。在某些方面中，DNMTi可以是核苷类似物，反义寡核苷酸，小分子酶抑制剂或其任意组合。例如，在某些方面中，DNMTi可以是氮杂胞苷，地西他滨，4-脱氧尿苷(zebularine)，SGI-110，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)，MG98，RG108，普鲁卡因胺，肼苯哒嗪，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。在某些方面中，DNMTi是氮杂胞苷。

[0016] 在所提供方法的一个特定方面中，特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段包括含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL，而表观遗传调节剂包含HDACi恩替诺特。在所提供方法的另一特定方面中，特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段包括含有氨基酸序列SEQ ID NO:
1的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL，而表观遗传调节剂包含DNMTi氮杂胞苷。

[0017] 根据所提供的方法，抗体或其抗原结合片段和表观遗传调节剂可以单独地给予，或者它们可以同时给予。

[0018] 在所提供方法的某些方面中，相对于单独给予抗体或片段或表观遗传调节剂，联合疗法的给予可以获得增强的治疗功效。例如，在某些方面中，所述增强的治疗功效大于累加效应，例如，协同效应。

[0019] 在所提供方法的某些方面中，待治疗的癌症可以是实体瘤，血液恶性病，其任何转移，或其任意组合。在某些方面中，实体瘤可以是，例如，肉瘤，癌症，黑色素瘤，其任何转移，或其任意组合。更具体地，实体瘤可以是，例如，鳞状细胞癌，腺癌，基底细胞癌，肾细胞癌，乳腺导管癌，软组织肉瘤，骨肉瘤，黑素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胃癌，胰腺癌，神经内分泌癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，脑癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，食道癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，头颈癌，其任何转移，或其任意组合。

[0020] 在所提供方法的某些方面中，待治疗的癌症可以是血液恶性病或其转移。在某些方面中，血液恶性病可以是白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，其任何转移，或其任意组合。

[0021] 在某些方面中，本文所提供的方法可以进一步包括给予其他癌症疗法，例如，手术，化疗，放疗，癌症疫苗，给予免疫刺激剂，过继性T细胞或抗体疗法，给予免疫检查点阻断抑制剂，给予调节性T细胞(Treg)调节剂及其组合。

[0022] 本公开还提供了这样的药物组合物，所述药物组合物包含有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段，和有效量的表观遗传调节剂。在某些方面中，药物组合物可以进一步包含运载体，赋形剂或其任意组合。

[0023] 在某些方面中，提供的组合物的抗体或其片段可以包括可变重链(VH)和可变轻链(VL)，所述可变重链(VH)包含分别含有SEQ ID NO:2、3和4的VH CDR 1-3，而所述可变轻链(VL)包含分别含有SEQ ID NO:6、7和8的VL CDR 1-3。在某些方面中，所提供化合物的抗体或其片段可以包含VH和VL，所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

[0024] 在某些方面中，所提供药物组合物中包含的表观遗传调节剂可以包括组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)、DNA甲基转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)或其任意组合。

[0025] 其中组合物包含HDACi，所述HDACi可以是例如伏立诺他(Vorinostat)，罗米地辛(Romidepsin)，西达本胺(Chidamide)，帕比司他(Panobinostat)，贝利司他(Belinostat)，丙戊酸或其盐，莫西司他(Mocetinostat)，阿贝司他(Abexinostat)，恩替诺特(Entinostat)，帕思诺特(Pracinostat)，雷米诺特(Resminostat)，吉凡诺特
(Givinostat)，奎斯诺特(Quisinostat)，凯维特林(Kevetrin)，CUDC-101，AR-42，特菲诺特(Tefinostat)(CHR-2845)，CHR-3996，4SC-202，CG200745，ACY-1215，ACY-241，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。在某些方面中，HDACi是恩替诺特(吡啶-3-基甲基N-[[4-[(2-氨基苯基)氨基甲酰基]苯基]甲基]氨基甲酸酯)。

[0026] 其中，组合物包含DNMTi，所述DNMTi可以是例如氮杂胞苷，地西他滨，4-脱氧尿苷(zebularine)，SGI-110，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)，MG98，RG108，普鲁卡因胺，肼苯哒嗪，其任意组合，或其任何盐、晶体、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、异构体或前药。在某些方面中，DNMTi可以是氮杂胞苷。

[0027] 在一个特定方面中，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段和有效量的HDACi恩替诺特，其中所述抗体或其片段包含有VH氨基酸序列SEQ ID NO:1和VL氨基酸序列SEQ ID NO:5。在另一特定方面中，本公开提供了药物组合物，所述药物组合物包含有效量的特异性结合脑信号蛋白-4D(SEMA4D)的分离抗体或其抗原结合片段和有效量的DNMTi氮杂胞苷，其中所述抗体或其片段包含有VH氨基酸序列SEQ ID NO:1和VL氨基酸序列SEQ ID NO:5。

[0028] 附图简述

[0029] 图1显示了实施例1和2中联合疗法实验的实验设计。

[0030] 图2A显示了实施例1中各种处理的随时间的平均肿瘤体积。

[0031] 图2B显示了实施例1中各种处理的随时间的存活百分比。使用Mantel Cox对数秩检验确定统计学显著性。Prism报告结果，P>0.05时为不显著(ns)，0.01

[0032] 图2C是显示实施例1中各种处理的完全肿瘤消退(肿瘤体积<50mm3)百分比的柱状图。使用费舍尔精确检验确定统计学显著性，Prism报告结果，P>0.05时为不显著(ns)，0.01

[0033] 图2D显示了与图2C相同的数据，将其分成成肿瘤在消退之前是否超过至少3
100mm。

[0034] 图3A显示了实施例2中各种处理的随时间的平均肿瘤体积。使用双因素ANOVA确定统计学显著性。Prism报告结果，P>0.05时为不显著(ns)，0.01

[0035] 图3B显示了实施例2中各对照动物随时间的肿瘤体积。

[0036] 图3C显示了实施例2中用抗-SEMA4D抗体处理的各动物随时间的肿瘤体积。

[0037] 图3D显示了实施例2中用恩替诺特(ENT)和对照抗体处理的各动物随时间的肿瘤体积。

[0038] 图3E显示了实施例2中用ENT和抗-SEMA4D抗体处理的各动物随时间的肿瘤体积。

[0039] 图3F显示了实施例2中各种处理的随时间的存活百分比。使用Mantel Cox对数秩检验确定统计学显著性。Prism报告结果，0.01

[0040] 图4显示了实施例3中联合疗法实验的实验设计。

[0041] 图5A显示了实施例3中各种处理的随时间的平均肿瘤体积。使用双因素ANOVA确定统计学显著性。**P≤0.01。

[0042] 图5B显示了实施例3中各种治疗随时间的存活百分比。使用Mantel Cox对数秩检验确定统计学显著性。Prism报告结果，P>0.05时为不显著，或者P≤0.01时为非常显著(“**”)。

[0043] 图5C是显示实施例3中各种处理的完全肿瘤消退(肿瘤体积<50mm3)百分比的柱状图。使用费舍尔精确检验确定统计学显著性，Prism报告结果，P≤0.05时为显著(用“*”表示)，或者P≤0.01时为非常显著(“**”)。

具体实施方式

[0044] 定义

[0045] 应注意，术语“一个”或“一种”实体指一种或多种该实体；例如，“一种结合分子”应理解为代表一种或多种结合分子。如此，本文所述术语“一个”(或“一种”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可互换使用。

[0046] 此外，本文所用“和/或”应被视作具体公开了两种特征或组分的每一种，伴随或不伴随另一种。因此，本文短语“A和/或B”中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)、和“B”(单独)。类似地，在词组中使用的术语和和“/或”(例如“A、B和/或C”)指包括以下例子：A、B、和C；A、B、或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；和C(单独)。

[0047] 除非另有定义，本文使用的科技术语与本公开所属领域普通技术人员所理解的通常含义相同。例如，《生物医药和分子生物学简明词典》(Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology)，Juo,Pei-Show，第2版，2002，CRC出版社(CRC Press)；《细胞和分子生物学词典》(The Dictionary of Cell and Molecular Biology)，第3版，1999，学术出版社(Academic Press)；和《牛津生物化学和分子生物学辞典》(Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology)，修订，2000，牛津大学出版社(Oxford University Press)，向技术人员提供了本公开使用的很多术语的常用词典。

[0048] 单位、前缀和符号以它们的国际单位制(SI)接受的形式表示。数值范围包括限定该范围的数值。除非另外说明，氨基酸以氨基到羧基的取向从左到右书写。本文提供的标题不是本公开各种方面或某方面的限制，可以参考说明书整体理解本公开的各种方面或实施方式。因此，下面紧接着定义的术语完全参考说明书全文定义。

[0049] 在任何用语言“包括”描述的实施方式中，也提供了“由……组成”和/或“基本由……组成”的其他类似实施方式。

[0050] 本文中氨基酸由IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的公知三字母符号或单字母符号表示。同样，核苷酸按其普遍接受的单字母代码指称。

[0051] 本文所用术语“癌症”和“癌”是指或描述哺乳动物中的生理病症，其中细胞群的特征在于不受调控的细胞生长。可以对癌症进行分类，例如，实体瘤或恶性病或血液癌或恶性病。这两种类型都可以因为转移而迁移到远处。可以对实体瘤进行分类，例如，肉瘤、癌、黑色素瘤或其转移。

[0052] 术语“增殖性病症”和“增殖性紊乱”是指与异常细胞增殖相关的病症，如癌症。

[0053] 本文所用的“肿瘤”和“瘤"是指由良性(非癌性)或恶性(癌性)的过度细胞生长或增殖产生的任意组织块，包括癌前损伤。在某些实施方式中，本文所述的肿瘤表达SEMA4D受体，例如，丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和/或CD72，和/或能表达SEMA4D。

[0054] 本文所用术语“转移”、“转移癌”、“转移性”或其他语法同义词是指从最初位置(例如，原发肿瘤)或身体的其他区域扩散或转移并在新位置处发展类似的癌损伤的癌细胞。“转移性”或“转移中”的细胞是丧失与相邻细胞的粘合接触并且通过血流或淋巴从疾病的原发部位迁移以侵入相邻的身体结构。该术语也指转移的过程，其包括但不限于癌细胞从原发肿瘤的癌细胞上脱落，癌细胞进入血管到循环中，它们存活并迁移到不同部位，从循环中粘附并外渗到新的部位，并且在不同的部位微定植，并且在不同的部位肿瘤生长和发展。

[0055] 这类实体瘤的实例可以包括，例如，鳞状细胞癌，腺癌，基底细胞癌，肾细胞癌，乳腺导管癌，软组织肉瘤，骨肉瘤，黑素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)，肺腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胃癌，胰腺癌，神经内分泌癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，脑癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，食道癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，头颈癌，其任何转移，或其任意组合。

[0056] 血液癌症或恶性病的实例包括但不限于，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，其任何转移，或其任意组合。

[0057] 在某些实施方式中，适于通过本文提供的方法治疗的癌症包括但不限于肉瘤，乳腺癌，卵巢癌，宫颈癌，头颈癌，NSCLC，食道癌，胃癌，肾癌，肝癌，膀胱癌，结直肠癌和胰腺癌。在某些实施方式中，适于通过本文提供的方法治疗的癌症或肿瘤细胞表达SEMA4D相关的丛蛋白-B1、丛蛋白-B2或CD72受体。

[0058] 本文所用的术语“多肽”意在包括单数形式“多肽”和复数形式“多肽”，指由酰胺键(也称肽键)线性连接的多个单体(氨基酸)所组成的分子。术语"多肽"指的是两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链，并且不表示特定长度的产物。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或其它任何用于指两个或多个氨基酸的一条或多条链的术语均包含于“多肽”的定义内，术语“多肽”可与任意这些术语替代或互换使用。术语“多肽”还指多肽表达后修饰的产物，所述修饰包括但不限于糖基化、乙酰基化、磷酸化、酰胺化，和通过已知保护/阻断基团、蛋白酶切割或非天然产生氨基酸修饰的衍生化。多肽可由生物来源衍生或由重组技术产生，但不必定由指定核酸序列翻译而来。其可以任何方式产生，包括通过化学合成。

[0059] 本文公开的多肽的大小可以是约3个或更多个、5个或更多个、10个或更多个、20个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、1,000个或更多个或者2,000个或更多个氨基酸。多肽可具有确定的三维结构，但它们不必定具有这种结构。具有确定三维结构的多肽被称为折叠多肽，不具有确定三维结构但能采用大量不同构象的多肽被称为非折叠多肽。本文所用的术语糖蛋白指偶联至至少一个糖部分的蛋白质，所述糖部分通过某一氨基酸如丝氨酸或天冬酰胺的含氧或含氮侧链连接于该蛋白质。

[0060] “分离的”多肽或其片段、变体或衍生物指不处于其天然环境中的多肽。对具体纯化水平没有要求。例如，可从其原生或天然环境中移出分离的多肽。在宿主细胞中表达的重组产生多肽和蛋白质被认为是如本文公开的分离的，通过任何合适技术分离、分级，或者部分或基本上纯化的天然或重组多肽也如此。

[0061] 本文中所用的术语“非天然产生的多肽”或其任何语法变化形式，是条件性的限定，其明确地排除，但仅排除，被法官或管理部门或司法机关或可能会被法官或管理部门或司法机关确定或解释为“天然产生的”那些多肽形式。

[0062] 本文公开的其它多肽是前述多肽的片段、衍生物、类似物或变体，及其任何组合。本文所述的术语"片段"、"变体"、"衍生物"和"类似物"包括保持对应的原始抗体或多肽的至少一些性质(例如，特异性结合至抗原)的任何多肽。除本文他处讨论的具体抗体片段外，多肽的片段还包括，例如，蛋白酶水解片段以及缺失片段。例如，多肽的变体包括如上所述的片段，以及因氨基酸取代、缺失或插入而具有改变的氨基酸序列的多肽。在某些方面中，变体可以是非天然产生的。可使用本领域已知的诱变技术生成非天然产生变体。变体多肽可包含保守或非保守性氨基酸取代、缺失或添加。衍生物是经改变从而显示原始多肽上不存在的其它特征的多肽。例子包括融合蛋白。多肽变体在本文中也可称作“多肽类似物”。本文所用的多肽的"衍生物"还可指：具有通过功能侧基的反应经由化学方法衍生的一个或多个氨基酸的对象多肽。“衍生物”还包括含有20种标准氨基酸中的一个或多个衍生形式的那些肽。例如，4-羟基脯氨酸可取代脯氨酸；5-羟基赖氨酸可取代赖氨酸；3-甲基组氨酸可取代组氨酸；高丝氨酸可取代丝氨酸；且鸟氨酸可取代赖氨酸。

[0063] “保守性氨基酸取代”是其中一个氨基酸被具有相似侧链的另一个氨基酸替代的情况。本领域中已定义了具有类似侧链的氨基酸的家族，包括碱性侧链(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，苯丙氨酸取代成酪氨酸是保守取代。在某些实施方式中，本公开的多肽和抗体的序列中的保守取代不废除包含所述氨基酸序列的多肽或抗体与所述结合分子结合的抗原的结合。鉴定不消除抗原结合的核苷酸和氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的(参见，例如，Brummell等，Biochem.32:1180-1 187
(1993)；Kobayashi等，Protein Eng.12(10):879-884(1999)；和Burks等，
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:.412-417(1997))。

[0064] 术语“多核苷酸”意在包括单个核酸和多个核酸，指分离的核酸分子或构建物，例如信使RNA(mRNA)、cDNA或质粒DNA(pDNA)。多核苷酸可包含常规磷酸二酯键或非常规键(如酰胺键，如肽核酸(PNA)中发现的酰胺键)。术语“核酸”或“核酸序列”指多核苷酸中存在的任何一种或多种核酸区段，如DNA或RNA片段。

[0065] "分离的"核酸或多核苷酸意为与其原始环境分离的核酸或多核苷酸的任何形式。例如，凝胶纯化的多核苷酸，或载体中编码所含多肽的重组多核苷酸将被视作是“分离的”。
并且，认为已被工程改造以具有供于克隆的限制性位点的多核苷酸区段，例如，PCR产物，是“分离的”。分离的多核苷酸的其它示例包括在异源性宿主细胞中维持的重组多核苷酸或在非原始溶液(例如缓冲液或盐水)中(部分地或基本上)纯化的重组多核苷酸。分离的RNA分子包括多核苷酸的体内或体外RNA转录本，其中，所述转录本不是自然中存在的转录本。分离的多核苷酸或核酸还包括通过合成方式产生的此类分子。此外，多核苷酸或核酸可以是或可包括调节元件例如启动子、核糖体结合位点，或转录终止子。

[0066] 本文中所用的术语“非天然产生的多核苷酸”或其任何语法变化形式，是条件性的限定，其明确地排除，但仅排除，被判定机构或管理部门或司法机关或可能会被被判定机构或管理部门或司法机关确定或解释为“天然产生的”那些核酸或多核苷酸形式。

[0067] 本文所用的术语“编码区”指由翻译成氨基酸的密码子组成的核酸部分。虽然“终止密码子”(TAG、TGA或TAA)不翻译成氨基酸，但它可被认为是编码区的一部分，而任何侧接序列如启动子、核糖体结合位点、转录终止子、内含子等均不是编码区的一部分。两个或更多个编码区可存在于单一多核苷酸构建物中，例如在单一载体上，或者在分开的多核苷酸构建物中，例如在单独(不同)载体上。此外，任何载体均能包含单一编码区，或可包含两个或更多个编码区，例如，单一载体可分开编码免疫球蛋白重链可变区和免疫球蛋白轻链可变区。此外，载体、多核苷酸或核酸可包括异源性的编码区，其融合或不融合至另一个编码区。异源性的编码区包括不限于，编码专有的元件或基序(例如分泌信号肽或异源性的功能结构域)的那些。

[0068] 在某些实施方式中，所述多核苷酸或核酸是DNA。对DNA而言，包含多肽编码核酸的多核苷酸通常包含启动子和/或其它转录或翻译控制元件，这些元件与一个或多个编码区操作性连接。操作性连接指当基因产物如多肽的编码区与一个或多个调控序列以此方式连接时，将该基因产物的表达置于所述调控序列的影响或控制下。如果启动子功能的诱导使编码所需基因产物的mRNA转录，且如果两个DNA片段间连接的属性不干扰表达调控序列指导基因产物表达或不干扰转录DNA模板的能力，则两个DNA片段(如多肽编码区及其相连的启动子)“操作性连接”。因此，如果启动子能够影响核酸的转录，则启动子区域与多肽编码核酸操作性连接。启动子可以是在预定细胞中指导DNA实质转录的细胞特异性启动子。启动子以外的其它转录控制元件如增强子、操纵基因、阻遏物和转录终止信号，能与多核苷酸可操作连接以指导细胞特异性转录。

[0069] 多种转录控制区对于本领域技术人员而言是已知的。它们包括但不限于在脊椎动物细胞中发挥作用的转录控制区，例如但不限于，来自巨细胞病毒(立即早期启动子，与内含子-A联用)、猿病毒40(早期启动子)和逆转录病毒(如劳氏肉瘤病毒)的启动子和增强子区段。其它转录控制区包括源自脊椎动物基因的那些，例如肌动蛋白、热激蛋白、牛生长激素和兔β-珠蛋白，以及能够控制真核细胞中的基因表达的其它序列。其它合适的转录控制区包括组织特异性启动子和增强子以及淋巴因子诱导型启动子(例如，通过干扰素或白介素诱导的启动子)。

[0070] 类似地，本领域普通技术人员了解各种翻译控制元件。它们包括但不限于：核糖体结合位点、翻译起始和终止密码子以及衍生自小核糖核酸病毒的元件(特别是内部核糖体进入位点或IRES，也称为CITE序列)。

[0071] 在其它实施方式中，多核苷酸可以是RNA，例如，信使RNA(mRNA)、转移RNA或核糖体RNA的形式。

[0072] 多核苷酸和核酸编码区可与编码分泌或信号肽的其它编码区相关联，所述编码分泌或信号肽引导本文所述的多核苷酸编码的多肽的分泌。根据信号假说，哺乳动物细胞分泌的蛋白质具有信号肽或分泌前导序列，一旦生长的蛋白质链跨粗面内质网的输出启动，所述序列从成熟蛋白质上切除。本领域普通技术人员了解，脊椎动物细胞分泌的多肽可具有融合于所述多肽N末端的信号肽，它们从完整或“全长”多肽上切割产生分泌或“成熟”形式的多肽。在某些实施方式中，使用天然信号肽，例如免疫球蛋白重链或轻链信号肽，或者使用仍然能够指导与其操作性相连多肽分泌的该序列的功能衍生物。或者，可采用异源性的哺乳动物信号肽或其功能衍生物。例如，野生型前导序列可用小鼠β-葡萄糖醛酸酶或人组织纤溶酶原激活剂(TPA)的前导序列取代。

[0073] 本文公开了某些结合分子，或抗原结合片段、变体、或其衍生物。除非特定地述及全尺寸抗体，否则术语“结合分子”涵盖全尺寸抗体以及所述抗体的抗原结合亚基、片段、变体、类似物或衍生物，例如，以类似于抗体分子的方式结合抗原但采用不同的支架的工程改造的抗体分子或片段。

[0074] 本文中所用的术语“结合分子”以其最宽泛的含义指特异性结合至受体(例如，表位或抗原决定簇)的分子。如本文进一步描述，结合分子可包含本文所述的多种“抗原结合结构域”之一。结合分子的非限制性示例是抗体或其保持抗原-特异性结合性的片段。

[0075] 本文中所用的术语“结合结构域”或“抗原结合结构域”指的是必需且足以特异性结合至表位的结合分子的区域。例如，“Fv”，例如，抗体的可变重链和可变轻链，以两个分开多肽亚基或作为单一链形式，被视作是“结合结构域”。其它结合结构域包括，但不限于，源自骆驼科物种的抗体的可变重链(VHH)，或在纤连蛋白支架上表达的六个免疫球蛋白互补决定区(CDR)。本文所述的“结合分子”可包括一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或更多个“抗原结合结构域”。

[0076] 术语“抗体”和“免疫球蛋白”在本文中可互换使用。抗体(或其片段、变体或衍生物，如本文所述)包括：至少重链的可变区(对于骆驼科物种而言)或至少重链和轻链的可变区。脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构是相对较好地了解的。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)。除非另有说明，术语“抗体”涵盖从抗体的小抗原结合片段到全尺寸抗体的范围内的任何物质，例如，IgG抗体，其包括两个完整重链和两个完整轻链，IgA抗体，其包括四个完整重链和四个完整轻链，并且任选地包括J链和/或分泌型组分，或IgM抗体，其包括十个或十二个完整重链和十个或十二个完整轻链且任选地包括J链。

[0077] 正如下文中更详细讨论，术语“免疫球蛋白”包括可通过生化性质区分的各种类型多肽。本领域技术人员应理解，重链分为伽马、缪、阿尔法、德尔塔或伊普西龙(γ、μ、α、δ、ε)，其中还有一些亚类(如γ1-γ4或α1-α2)。该链的特性决定抗体“类别”分别为IgG、IgM、IgA、IgG或IgE。免疫球蛋白亚类(同种型)如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、IgA2等已被充分表征，且已知提供功能性特化。根据本文公开内容，本领域技术人员不难区分这些类别和同种型的修饰形式，因此，它们涵盖在本公开范围内。

[0078] 轻链分类为κ或λ(kappa或lambda)。各重链类别可与κ或λ轻链结合。通常，轻链和重链互相共价结合，并且当由杂交瘤、B细胞或遗传工程改造的宿主细胞生成免疫球蛋白时，两条重链的“尾”部分通过共价二硫键或非共价连接结合在一起。在重链中，氨基酸从Y构型的分叉末端处的N-端到各条链的底部处的C-端。某些抗体(例如，IgG抗体)的基础结构包括两个重链亚基和两个轻链亚基，其通过二硫键共价连接以形成“Y”结构，也在本文中称为“H2L2”结构。

[0079] 轻链和重链都被划分成具有结构和功能同源性的区域。从功能角度使用术语“恒定”和“可变”。在这方面，应理解可变轻(VL)链或可变重(VK)链部分的可变区决定抗原识别和特异性。相反，轻链(CL)和重链(CH1、CH2或CH3)的恒定区赋予生物学特性，例如分泌、跨胎盘移动、Fc受体结合、补体结合等。按照习惯，恒定区结构域的编号随着远离抗原结合位点或抗体的N末端而增加。N末端部分是可变区，并且C末端部分是恒定区；CH3(或者，在IgM的情况中，CH4)和CL结构域实际上分别包括重链和轻链的羧基端。

[0080] 如上所述，可变区(即“结合结构域”)允许结合分子选择性地识别抗原上的表位并特异性地结合该表位。也就是说，例如抗体的结合分子的VL结构域和VH结构域、或这些互补决定区(CDR)亚组组合形成确定三维抗原结合位点的可变区。更具体地，抗原结合位点由各VH和VL链上的三个CDR确定。某些抗体形成较大结构。例如，IgA可形成这样的分子，该分子包括两个H2L2单元、J链和分泌组件，其全部通过二硫键共价连接，并且IgM可形成这样的五聚或六聚分子，该分子包括五个或六个H2L2单元和任选地通过二硫键共价连接的J链。

[0081] 抗体抗原结合结构域中存在的六个“互补决定区”或“CDR”是氨基酸的非连续短序列，其特异性地定位，以随着抗体在水性环境中采用其三维构型而形成结合结构域。结合结构域中的其余氨基酸称为“构架”区，显示较小的分子间差异。构架区主要采用β-片层构象，并且CDR形成连接β-片层结构且在某些情况下形成β-片层结构的部分的环。因此，构架区用于通过链间非共价相互作用形成为CDR提供正确方向位置的支架。由定位的CDR形成的结合结构域确定了与免疫反应性抗原上的表位互补的表面。这种互补表面促进了抗体与其互补表位的非共价结合。任何给定的重或轻链可变区中分别组成CDR和构架区域的氨基酸均可由本领域普通技术人员容易地鉴定，因为它们已以多种不同的方式被定义(参见，"免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)"，Kabat,E.等，美国卫生及公共服务部(U.S.Department of Health and Human Services)，(1983)；和Chothia和Lesk，J.Mol.Biol.,196:901-917(1987)，其通过引用其全文纳入本文)。

[0082] 除非明确表述为相反的含义，否则在本领域内所使用和/或接受的某一术语有两种或多种定义的情况下，本文所用的术语定义应包括所有这些含义。具体示例是使用术语“互补决定区”(“CDR”)描述在重链和轻链多肽的可变区内发现的非毗连抗原结合位点。这些具体的区域已被描述，例如，由Kabat等，美国卫生及公共服务部，"免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)"(1983)，和由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，其通过引用纳入本文。Kabat和Chothia定义包括氨基酸在彼此比较时的重叠或子集。不过，除非另有说明，述及抗体或其变体的CDR的定义(或本领域普通技术人员已知的其它定义)意图落在本文定义或所用的术语范围之内。合适的氨基酸残基包括上文引用的各参考文献中定义的CDR，如下表1所示以作对比。涵盖具体CDR的确切氨基酸编号将根据CDR的序列和大小而变化。鉴于抗体的可变区氨基酸序列，本领域技术人员能够常规地确定哪些氨基酸包含具体CDR。

[0083] 表1：CDR定义1

[0084] Kabat Chothia
VH CDR1 31-35 26-32
VH CDR2 50-65 52-58
VH CDR3 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32
VL CDR2 50-56 50-52
VL CDR3 89-97 91-96

[0085] 1表1中所有CDR定义的编号均按照Kabat等所述的编号

[0086] 规则(见下文)。

[0087] Kabat等还定义了适用于任何抗体的可变区序列的编号系统。本领域普通技术人员能明确地将所述“Kabat编号”系统应用于任何可变区序列，而不依赖序列本身外的任何实验数据。本文所用的“Kabat编号”指由Kabat等，美国卫生与公众服务部，“免疫学热门蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)”(1983)中所述的编号系统。除非明确注明采用Kabat编号系统，否则，对本公开的全部氨基酸序列采用连贯的编号。

[0088] 结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，包括但不限于，多克隆、单克隆、人、人源化的或嵌合抗体、单一链抗体、表位-结合片段，例如，Fab、Fab'和F(ab')2、Fd、Fvs、单链Fvs(scFv)、单链抗体、二硫键连接的Fvs(sdFv)、包含VL或VH结构域的片段、通过Fab表达文库产生的片段。ScFv分子是本领域已知的，并且描述于例如美国专利号5,892,019。本公开所涵盖的免疫球蛋白或抗体分子可以是任何类型(如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA和IgY)、类(如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2等)或小类的免疫球蛋白分子。

[0089] “特异性结合”一般表示结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物通过其抗原结合结构域结合表位，并且该结合需要抗原结合结构域和表位之间的一些互补性。按照这一定义，当结合分子通过其抗原结合结构域与表位结合比其与随机、无关的表位结合更容易时，称该结合分子“特异性结合”该表位。本文中使用术语“特异性”定性分析某一抗体与某一表位结合的相对亲和性。例如，可认为结合分子“A”比结合分子“B”对给定表位具有更高特异性，或者可以说结合分子“A”以比其对相关表位“D”的特异性更高的特异性结合表位“C”。

[0090] 可以说本文公开的结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物，以小于或等于5x 10-2秒-1、10-2秒-1、5X 10-3秒-1、10-3秒-1、5X 10-4秒-1、10-4秒-1、5X 10-5秒-1、或10-5秒-1 5X
10-6秒-1、10-6秒-1、5X 10-7秒-1或10-7秒-1的解离速率(k(off))结合靶标抗原。

[0091] 可以说本文公开的结合分子，例如，抗体或抗原结合片段、变体或衍生物，以大于或等于103M-1秒-1、5X 103M-1秒-1、104M-1秒-1、5X 104M-1秒-1、105M-1秒-1、5X 105M-1秒-1、106M-1秒-1、或5X 106M-1秒-1或107M-1秒-1的结合速率(k(on))结合靶标抗原。

[0092] 如果结合分子，例如抗体或其片段、变体或衍生物，以一定程度上阻断参比抗体或抗原结合片段与表位的结合的程度优先结合该表位，则可以说，该结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物竞争性地抑制参比抗体或抗原结合片段与给定的表位的结合。可通过本领域已知的任意方法确定竞争性抑制，例如，竞争ELISA试验。可以说，结合分子竞争性地抑制参比抗体或抗原结合片段与给定表位的至少90％、至少80％、至少70％、至少60％或至少50％的结合。

[0093] 本文所用的术语“亲和力”指单独表位与例如免疫球蛋白分子的一个或多个结合结构域结合的强度量度。参见例如，Harlow等，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，第2版，1988)，第27-28页。本文中所用的术语“亲合力(avidity)”指的是结合结构域的群和抗体之间的复合物的总体稳定性。参见，例如，Harlow，第29-34页。亲合力既与群体中单独结合结构域与特定表位的亲和力相关，也与免疫球蛋白分子和抗原的价态相关。例如，二价单克隆抗体和具有高度重复表位结构的抗原例如多聚体之间的相互作用是具有高亲合力的一个例子。二价单克隆抗体与以高密度存在于细胞表面上的受体之间的相互作用也将具有高亲合力。

[0094] 本文公开的结合分子或其抗原结合片段、变体或衍生物也可就其交叉反应性进行描述或说明。本文所用的术语“交叉反应性”指，结合分子(例如抗体或其片段、变体或衍生物)对某一种抗原具有特异性、与第二种抗原发生反应的能力；它是两种不同抗原性物质之间关联性的量度。因此，如果结合分子与诱导其形成的表位以外的其他表位结合，则具有交叉反应性。交叉反应性表位通常含有许多与诱导表位相同的互补结构特征，在某些情况下甚至比原始表位更匹配。

[0095] 结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物还可就它们与抗原的结合亲和性来描述或说明。例如，结合分子可以不超过5x 10-2M、10-2M、5x 10-3M、10-3M、5x 10-4M、10-4M、5x 10-5M、10-5M、5x 10-6M、10-6M、5x 10-7M、10-7M、5x 10-8M、10-8M、5x 10-9M、10-9M、5x 10-10M、10-10M、5x 10-11M、10-11M、5x 10-12M、10-12M、5x 10-13M、10-13M、5x 10-14M、10-14M、5x 10-15M或10-15M的解离常数或KD结合抗原。

[0096] 包括单链抗体或其他结合域的抗体片段可单独存在或联合一种或多种以下存在：铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域，J链或分泌组件。还包括抗原结合片段，其可包括一个或多个可变区与铰链区、CH1、CH2、CH3或CH4结构域、J链或分泌型组分中的一个或多个的任何组合。结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段，可来自任何动物来源，包括鸟类和哺乳动物。所述抗体可以是人、鼠、驴、兔、山羊、豚鼠、骆驼、美洲鸵、马或鸡抗体。在另一个实施方式中，可变区可以是软骨鱼(condricthoid)来源(例如，来自鲨鱼)。本文中所用的“人”抗体包括，具有人免疫球蛋白的氨基酸序列的抗体，且包括从人免疫球蛋白文库分离的或来自一种或多种人免疫球蛋白的动物转基因的抗体，并且其可在一些示例中表达内源性免疫球蛋白，但一些则不是，如下文所述，例如，描述于Kucherlapati等的美国专利号5,939,598。

[0097] 本文中所用的术语“重链亚基”包括这样的氨基酸序列，其源自免疫球蛋白重链、结合分子，例如，包含重链亚基的抗体，包括如下至少一项：VH结构域、CH1结构域、铰链(例如，上部、中部和/或下部铰链区)结构域、CH2结构域、CH3结构域、CH4结构域，或其变体或片段。例如，结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物，除了VH结构域以外，还可包括但不限于：CH1结构域；CH1结构域，铰链和CH2结构域；CH1结构域和CH3结构域；CH1结构域，铰链和CH3结构域；或CH1结构域，铰链结构域，CH2结构域和CH3结构域。在某些方面中，结合分子，例如，抗体或其片段、变体或衍生物，除VH结构域以外，还可包括，CH3结构域和CH4结构域；或CH3结构域，CH4结构域和J链。此外，用于本公开的结合分子可缺乏某些恒定区部分，例如，CH2结构域的全部或部分。本领域普通技术人员应理解，可修饰这些结构域(例如重链亚基)，从而其氨基酸序列不同于原始免疫球蛋白分子。

[0098] 结合分子，例如抗体或其片段的重链亚基可以包括衍生自不同免疫球蛋白分子的结构域。例如，多肽的重链亚基可以包括衍生自IgG1分子的CH1结构域和衍生自IgG3分子的铰链区。在另一个示例中，重链亚基可以包括部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG3分子的绞链区。在另一个示例中，重链部分可以包括部分衍生自IgG1分子、部分衍生自IgG4分子的嵌合铰链。

[0099] 本文所用的术语“轻链亚基”包括衍生自免疫球蛋白轻链的氨基酸序列。轻链亚基包括至少VL或CL(例如，Cκ或Cλ)结构域中的至少一个。

[0100] 结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可就它们识别或特异性结合的表位或抗原部分进行描述或说明。靶抗原与抗体的抗原结合结构域特异性相互作用的部分是“表位”或“抗原决定簇”。靶抗原可包含单个表位，或至少两个表位，并可包括任意数量的表位，这取决于抗原的大小、构象和类型。

[0101] 如前所述，各种免疫球蛋白类别的恒定区的亚基结构和三维构型是众所周知的。本文所用的术语“VH结构域”包括免疫球蛋白重链的氨基末端可变区，术语“CH1结构域”包括免疫球蛋白重链的第一(最靠氨基末端)恒定区结构域。CH1结构域邻近VH结构域，并且位于典型免疫球蛋白重链分子的铰链区的氨基末端。

[0102] 本文所用的术语“CH2结构域”包括这样的重链分子部分，其例如从IgG抗体的约氨基酸244延伸到氨基酸360，采用常规的编号方案(氨基酸244至360，Kabat编号系统；和氨基酸231-340，EU编号系统；参见Kabat EA等，同前)。CH3结构域从CH2结构域延伸至IgG分子的C末端并且包含约108个氨基酸。某些免疫球蛋白类别，例如，IgM，还包括CH4区。

[0103] 本文所用的术语“绞链区”包括连接CH1结构域和CH2结构域的重链分子部分。该铰链区包含约25个氨基酸并且是柔性的，因此允许两个N末端抗原结合区域独立地移动。

[0104] 本文所用的术语“二硫键”包括两个硫原子之间形成的共价键。氨基酸半胱氨酸包含可形成二硫键或桥接第二巯基基团的巯基基团。在某些IgG分子中，CH1和CL区域通过二硫键连接，并且两条重链通过位于对应于使用Kabat编号系统的239和242位(EU编号系统是226或229位)的两个二硫键连接。

[0105] 本文所用的术语“嵌合抗体”指这样的抗体，其中免疫反应性区域或位点获自或衍生自第一物种，而恒定区(其可能是完整、一部分或修饰的)获自第二物种。在一些实施方式中，靶标结合区或位点将是来自非人来源(例如，小鼠或灵长类)并且恒定区是人的。

[0106] 术语“多特异性抗体”或“双特异性抗体”指的是在单一抗体分子中具有针对两个或更多个不同的表位的结合结构域的抗体。可构建除了标准抗体结构以外的具有两种结合特异性的其它结合分子。由双特异性抗体或多特异性抗体进行的表位结合可以是同时或相继的。三元杂交瘤(trioma)和杂合杂交瘤是可分泌双特异性抗体的细胞系的两个示例。双特异性抗体还可通过重组手段构建。

[0107] ( 和Heiss,Future Oncol.6:1387-94(2010)；Mabry和Snavely,IDrugs.13:543-9(2010))。双特异性抗体也可以是双抗体(diabody)。

[0108] 本文中所用的术语“工程改造的抗体”指的是这样的抗体，其中重链和轻链之一或两者中的可变区通过在CDR或构架区域的一个或多个氨基酸的至少部分替代而被改变。在某些方面中，来自具有已知特异性的抗体的整个CDR可被移植到异源性抗体的构架区域中。虽然替代性的CDR可衍生自与产生构架区的抗体属于同一类或甚至亚类的抗体，但CDR仍可衍生自不同类别的抗体，例如，不同物种的抗体。将来自具有已知特异性的非人抗体的一个或多个“供体”CDR移植到人重链或轻链构架区内形成的工程改造的抗体在本文中称为“人源化抗体”。在某些方面，并非全部CDR由来自供体可变区的完整CDR替代，而供体的抗原结合能力仍可被转移至受者可变结构域。鉴于例如美国专利号5,585,089、5,693,761、5,693,
762和6,180,370中给出的解释，本领域技术人员完全有能力通过进行常规实验法或通过试验和误差检定来获得有功能的工程改造的或人源化的抗体。

[0109] 本文所用的术语“工程改造的”包括通过合成手段(例如通过重组技术、体外肽合成，通过酶或化学偶联肽，或这些技术的一些组合)进行的核酸或多肽分子的操作。

[0110] 本文中所用的术语“连接的”、“融合的”或“融合(体)”或其它语法等同形式可互换使用。这些术语指表示包括化学偶联或重组方式在内的各种方式将两个或更多元件或组件接合在一起。“框内融合”指以维持原始多核苷酸开放阅读框(ORF)翻译读框的方式，将两个或多个ORF连接形成连续的较长ORF。因此，重组融合蛋白是包含两个或多个区段的单一蛋白质，所述区段对应原始ORF编码的多肽(这些区段在自然条件下通常不如此连接)。尽管因此阅读框在融合片段中是连续的，但区段仍可被物理或空间分隔，如框内接头序列。例如，编码免疫球蛋白可变区CDR的多核苷酸可框内融合，但用编码至少一个免疫球蛋白构架区或额外CDR区的多核苷酸间隔开，前提是“融合的”CDR作为连续多肽的一部分共同翻译。

[0111] 对于多肽而言，“线性序列”或“序列”是多肽中从氨基到羧基末端方向上氨基酸的顺序，在序列中彼此相邻的氨基酸是多肽一级结构中的毗连残基。多肽的部分位于在连续的多肽链中出现得较早的多肽的另一部分的“氨基末端”或“N末端”。类似地，多肽的部分位于在连续的多肽链中出现得较晚的多肽的另一部分的“羧基末端”或“C末端”。例如，在典型的抗体中，可变区位于恒定区的“N末端”，并且恒定区位于可变区的“C末端”。

[0112] 本文所用的术语“表达”指基因产生生化物质如多肽的过程。该过程包括在细胞内基因功能存在的任何表现，包括但不限于，基因敲减以及瞬时表达和稳定表达。它包括但不限于，基因转录成信使RNA(mRNA)和这类mRNA翻译成多肽。如果所需的最终产物是生化物质(biochemical)，则表达包括产生该生化物质和任何前体。基因的表达产生“基因产物”。本文中所用的基因产物可以是核酸，例如，通过基因转录产生的信使RNA，或由转录本翻译的多肽。本文所述的基因产物还包括具有转录后修饰的核酸，例如聚腺苷酸化，或具有翻译后修饰的多肽，如甲基化、糖基化、加入脂质、连接其它蛋白质亚基、经蛋白酶水解切割等。

[0113] 本文所用术语“表观遗传修饰”表示在并未改变DNA序列的情况下由于染色体改变导致的可稳定遗传的表型。在一些情况中，表观遗传修饰可以导致疾病或病症，如癌症。Berger,SL等,Genes Dev.23:781-783(2009)。表观遗传修饰通常涉及这样的染色质结构变化，其可以导致控制细胞过程如分化、增殖和/或凋亡的基因的过表达和/或抑制。这类修饰可以涉及，例如DNA甲基化和组蛋白乙酰化。参见例如，Gnyska,A.等,Anticancer Res.33:
2989-2996(2013)。

[0114] 本文所用术语“表观遗传调节剂”表示这样的物质，例如，治疗剂，其可以影响，例如阻断、减少、逆转或减轻，致病表观遗传修饰，从而治疗疾病，例如，癌症。示例性的表观遗传调节剂包括DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)和组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)。多种HDACi和DNMTi已被批准用于或正在测试用于某些癌症的治疗。本文他处公开了示例性物质。

[0115] 本文所用术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”或“HDAC抑制剂”或“HDACi”指的是这样的一种或多种化合物，所述化合物能够抑制体内、体外或两种情况下的组蛋白脱乙酰作用。HDAC抑制至少一种组蛋白脱乙酰酶的活性。抑制至少一种组蛋白脱乙酰作用的结果是出现乙酰化的组蛋白增加，并且乙酰化的组蛋白的累积可以提供用于评估HDAC活性的生物标志物。

[0116] 本文所用术语“DNA甲基转移酶抑制剂”、“DNMT抑制剂”或“DNMTi”指的是这样的一种或多种化合物，所述化合物能够抑制体内、体外或两种情况下的DNA超甲基化和/或DNA甲基化酶(“DNMT”)过表达。抑制DNMT过表达和/或DNMT活性的结果是，DNMTi可以例如恢复异常沉默的基因诸如肿瘤抑制基因的表达。

[0117] 本文所用术语“抗-SEMA4D结合分子”表示这样的分子，该分子特异性地结合SEMA4D，例如，抗体或其抗体结合片段、变体或衍生物。除非特别提到完整大小的抗体如天然产生的抗体，术语“抗-SEMA4D抗体”包括完整大小的抗体以及这种抗体的抗原结合片段、变体、类似物或衍生物，例如天然产生的抗体或免疫球蛋白分子，或以类似于抗体分子的方式结合抗原的经工程改造抗体分子或片段。

[0118] 术语例如“处理”或“治疗”或“以治疗”或“缓解”或“以缓解"指的是治愈、减缓、减少现存的已经诊断的病理病症或紊乱的症状，和/或截停或减缓现存的已经诊断的病理病症或紊乱的进展的治疗性措施。术语例如“预防”、“防御”、“避免”、“遏制”等指的是预防未经诊断的目标病理病症或紊乱的进展的预防性的或预防用的措施。因此，“需要治疗的那些(对象)”可包括已经患有疾病的那些(对象)；易于患有疾病的那些(对象)；和需要预防疾病的那些(对象)。

[0119] 术语“治疗有效量”是指对“治疗”对象或哺乳动物中的疾病或病症而言有效的抗体、多肽、多核苷酸、小有机分子或其他药物的量。在癌症的情况中，治疗有效量的药物可减少癌细胞的数量；阻滞或停止癌细胞分裂、降低或阻滞肿瘤尺寸增加；抑制，例如，压制、阻滞、防止、停止、延迟或逆转癌细胞浸润至周边器官，包括，例如，癌症扩散到软组织和骨；抑制，例如，压制、阻滞、防止、收缩、停止、延迟或逆转肿瘤转移；抑制，例如，压制、阻滞、防止、停止、延迟或逆转肿瘤生长；一定程度上缓解与癌症相关的一种或多种症状，降低发病率和死亡率；改善生活质量；或这些效果的组合。就药物预防生长和/或杀伤现存的癌细胞的程度而言，其可以指代抑制细胞生长的和/或细胞毒性的。

[0120] 述及“对象”或“个体”或“动物”或“患者”或“哺乳动物”，其指需要诊断、预防或治疗的任何对象，特别是哺乳动物对象。哺乳动物对象包括人、家养动物、家畜和动物园动物、竞技动物或宠物，如犬、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马、猪、奶牛、熊等。

[0121] 本文中所用的短语诸如“将受益于治疗的对象”和“有治疗需求的动物”包括这样的对象，如哺乳动物对象，其将受益于给予如本文所述的疗法，如抗体，包含一个或多个抗原结合结构域，并联合表观遗传调节剂，例如，HDACi、DNMTi和/或其任意组合。

[0122] 术语“免疫调节治疗”或“免疫疗法”是指通过诱导和/或强化对象中的免疫应答在该对象中影响疾病或病症的治疗。免疫调节治疗包括癌症疫苗、免疫刺激剂、过继性T细胞或抗体治疗和免疫检查点阻滞(Lizée等.Ann.Rev.Med.64:71-90(2013))。

[0123] 术语“免疫调节剂”是指免疫疗法的活性试剂。免疫调节剂包括各种各样的重组、合成和天然的制备物的组合。免疫调节剂的示例包括但不限于白介素如IL-2、IL-7、IL-12；细胞因子如粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、干扰素；各种趋化因子如CXCL13、CCL26、CXCL7；
免疫检查点阻滞的拮抗剂，如抗-CTLA-4、抗-PD-1或抗-PD-L1(PD-1的配体)、抗-LAG3、抗-TIM3、抗-B7-H3、合成胞嘧啶磷酸酯-鸟嘌呤(CpG)寡脱氧核苷酸、葡聚糖；和调节性T细胞(Treg)的调节剂如环磷酰胺。

[0124] 靶多肽描述-SEMA4D

[0125] 本文所用术语“脑信号蛋白-4D”、“SEMA4D”和“SEMA4D多肽”可互换使用，如“SEMA4D”和“Sema4D”。在某些实施方式中，SEMA4D表达在细胞表面上或由细胞分泌。在另一个实施方式中，SEMA4D是膜结合的。在另一个实施方式中，SEMA4D是可溶的，例如sSEMA4D。在另一实施方式中，SEMA4D可包括完整大小的SEMA4D或其片段，或SEMA4D变体多肽，其中SEMA4D或SEMA4D变体多肽的片段保留完整大小的SEMA4D的一些或全部功能性质。

[0126] 完整大小的人SEMA4D蛋白质是由2条150kDa的多肽链组成的同二聚体跨膜蛋白。SEMA4D属于脑信号蛋白家族细胞表面受体并且也称为CD100。人和小鼠SEMA4D/Sema4D从其跨膜形式经蛋白水解切割以形成120-kDa可溶性形式，产生两种Sema4D同种型(Kumanogoh等,J.Cell Science 116:3464(2003))。脑信号蛋白由原始定义为轴突引导因子的可溶性和膜结合蛋白组成，所述轴突引导因子在建立神经元与其合适靶标的精确连接中起到重要作用。从结构上考虑，IV类脑信号蛋白，SEMA4D由氨基末端信号序列接着特征性“Sema”结构域组成，其含有17个保守的半胱氨酸残基、Ig-样结构域、富赖氨酸伸长段、疏水性跨膜结构域和胞质尾。

[0127] SEMA4D多肽包含约13个氨基酸的信号序列，之后是约512个氨基酸的脑信号蛋白结构域，约65个氨基酸的免疫球蛋白样(Ig-样)结构域，104个氨基酸的富赖氨酸伸长段，约19个氨基酸的疏水性跨膜区，和110个氨基酸的胞质尾。胞质尾中酪氨酸磷酸化的共有位点支持SEMA4D与酪氨酸激酶的预测结合(Schlossman等编，(1995)《白细胞定型V》(Leucocyte Typing V)(牛津，牛经大学出版社(Oxford University Press,Oxford)))。

[0128] SEMA4D已知具有至少3个功能性受体，丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和CD72。丛蛋白-B1在非淋巴组织中表达并且已经显示为SEMA4D的高亲和性(1nM)受体(Tamagnone等，Cell 99:71-80(1999))。丛蛋白-B1信号转导的SEMA4D刺激已经显示出诱导神经元的生长锥塌陷，并且诱导少突细胞的过程延伸塌陷(process extension collapse)和凋亡(Giraudon等，J.Immunol.172:1246-1255(2004)；Giraudon等，NeuroMolecular Med.7:207-216(2005))。
在与SEMA4D结合之后，丛蛋白B1信号转导介导R-Ras的失活，导致整联蛋白介导的胞外基质粘附减少，以及RhoA的激活，导致由细胞骨架重排造成的细胞塌陷(Kruger等,Nature Rev.Mol.Cell Biol.6:789-800(2005)；Pasterkamp,TRENDS in Cell Biology 15:61-64(2005))。丛蛋白-B2对SEMA4D具有重等亲和力并且最近的报告指出丛蛋白-B2在角质细胞上表达并且激活SEMA4D阳性γδT细胞以有助于上皮细胞修复(Witherden等,Immunity 37:
314-25(2012))。

[0129] 在淋巴组织中，CD72用作低亲和性(300nM)SEMA4D受体(Kumanogoh等，Immunity 13:621-631(2000))。B细胞和抗原呈递细胞(APC)表达CD72，并且抗-CD72抗体具有许多与sSEMA4D相同的作用，如增强CD40-诱导的B细胞应答和CD23的B细胞脱落。CD72被认为通过招募酪蛋白磷酸酶SHP-1发挥B细胞应答的负调节物的作用，其可与许多抑制性受体联合。
SEMA4D与CD72的相互作用导致SHP-1的解离，以及这种负激活信号的失去。已经证明SEMA4D将促进T细胞刺激和B细胞体外聚集和存活。SEMA4D-表达细胞或sSEMA4D的添加在体外增强CD40-诱导的B细胞增殖和免疫球蛋白产生，并且在体内加快抗体应答(Ishida等，
Inter.Immunol.15:1027-1034(2003)；Kumanogoh和H.Kukutani，Trends in Immunol.22:
670-676(2001))。sSEMA4D增强CD40诱导的DC成熟，包括共刺激分子上调和增加的IL-12分泌。另外，sSEMA4D可抑制免疫细胞迁移，其可能通过添加阻断性抗-SEMA4D小鼠抗体来逆转(Elhabazi等，J.Immunol.166:4341-4347(2001)；Delaire等，J.Immunol.166:4348-4354(2001))。

[0130] Sema4D在包括脾脏、胸腺和淋巴结的淋巴器官中以及如脑、心脏和肾脏的非淋巴器官中以高水平表达。在淋巴器官中，Sema4D在静息T细胞上大量表达，但是仅在静息B细胞和抗原呈递细胞(APC)如树突细胞(DC)上弱表达。

[0131] 细胞激活增加了SEMA4D的表面表达以及可溶性SEMA4D(sSEMA4D)的生成。SEMA4D的表达特性表明其在免疫系统中起到重要的生理和病理作用。SEMA4D已经显示促进B细胞激活、聚集和存活；增强CD40-诱导的增殖和抗体产生；增强对T细胞以来抗原的抗体响应；增加T细胞增殖；增强树突细胞成熟和刺激T细胞的能力；和直接涉及脱髓鞘和轴突变性(Shi等，Immunity 13:633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002)；和Watanabe等，J Immunol 167:4321-4328(2001))。

[0132] 抗-SEMA4D抗体

[0133] 已经在本领域中描述了结合SEMA4D的抗体。参见，例如，美国公开号2008/0219971 A1、US 2010/0285036 A1和US 2006/0233793 A1、国际专利申请WO 93/14125、WO 2008/100995和WO 2010/129917，以及Herold等，Int.Immunol.7(1):1-8(1995)，其各自通过引用全文纳入本文。

[0134] 本发明一般涉及在对象，例如人癌症患者中抑制、延迟或降低肿瘤生长或转移的方法，包括给予特异性结合SEMA4D的抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物和有效量的表观遗传调节剂，例如，组蛋白脱乙酰酶(HDAC)抑制剂(HDACi)、DNA甲基化转移酶(DNMT)抑制剂(DNMTi)或其任意组合。本文他处详细描述了HDACi和DNMTi。在某些实施方式中，抗-SEMA4D抗体阻断SEMA4D与其受体中的一种或多种，例如丛蛋白-B1、丛蛋白-B2和/或CD72的相互作用。在某些实施方式中，癌细胞表达丛蛋白-B1和/或丛蛋白-B2。具有这些性质的抗-SEMA4D抗体可用于本文提供的方法。可使用的抗体包括，但不限于MAbs VX15/2503，67，76，2282及其抗原结合片段、变体或衍生物，其全部描述于US 2010/0285036 A1和US 2008/
0219971 A1。可用于本文提供的方法的其他抗体包括US 2006/0233793 A1中所述的BD16抗体及其抗原结合片段、变体或衍生物；或MAb 301、MAb 1893、MAb 657、MAb 1807、MAb 1656、MAb 1808、Mab 59、MAb 2191、MAb 2274、MAb 2275、MAb 2276、MAb 2277、MAb 2278、MAb
2279、MAb 2280、MAb 2281、MAb 2282、MAb 2283、MAb 2284和MAb 2285中的任意种，及其任意片段、变体或衍生物，如US 2008/0219971 A1所述。在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体结合人、鼠、或人和鼠SEMA4D。还可使用与任意前述抗体结合相同表位的抗体和/或竞争性抑制任意前述抗体的结合或活性的抗体。

[0135] 在某些实施方式中，可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物具有与参照抗-SEMA4D抗体分子的氨基酸序列具有至少约80％、约85％、约88％、约89％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％或约95％序列相同性的氨基酸序列，例如，上述的那些。在另一个实施方式中，所述结合分子与参照抗体共有至少约96％、约
97％、约98％、约99％或100％的序列相同性。

[0136] 在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可抑制SEMA4D与其受体例如丛蛋白-B1、丛蛋白-B2或CD72的相互作用。在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可抑制SEMA4D介导的丛蛋白-B1信号转导。

[0137] 在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物竞争性地抑制参照抗体结合SEMA4D，所述参照抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的可变重链区(VH)和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的可变轻链区(VL)。在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物结合与参照抗体相同的SEMA4D表位，所述参照抗体包含含有氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和含有氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL。在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的VH包含3个互补决定区(CDR)：HCDR1、HCDR2和HCDR3，并且VL包含3个CDR：LCDR1、LCDR2和LCDR3，所述CDR分别包含氨基酸序列SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8，除了在一个或多个CDR中至少一个、两个、三个、四个、五个或六个单个保守氨基酸取代之外。在某些方面中，CDR分别包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8。

[0138] 在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的VH包含与SEQ ID NO:1至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列并且抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的VL包含与SEQ ID NO:5至少70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列；或者VH包含与SEQ ID NO:9至少70％、75％、
80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列并且VL包含与SEQ ID NO:10至少70％、
75％、80％、85％、90％、95％或100％相同的氨基酸序列。在某些方面中，VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:1，而VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:5；或者VH包含氨基酸序列SEQ ID NO:9，而VL包含氨基酸序列SEQ ID NO:10。

[0139] 本文提供的方法中使用的还包括编码本文所述的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物的多肽，编码这类多肽的多核苷酸，包含这类多核苷酸的载体，和包含这类载体或多核苷酸的宿主细胞，全部用于产生用于本文所述方法的抗-SEMA4D抗体，或其抗原结合片段、变体或衍生物。

[0140] 本发明抗-SEMA4D抗体的合适生物活性变体可用于本发明的方法。这种变体将保持母体抗-SEMA4D抗体的所需结合性质。本领域中制备抗体变体的方法通常是可得的。

[0141] 诱变和改变核苷酸序列的方法本领域中熟知。参见例如，Walker和Gaastra编(1983)，Techniques in Molecular Biology(《分子生物学技术》)(纽约麦克米兰出版公司(MacMillan Publishing Company))；Kunkel，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492
(1985)；Kunkel等，Methods Enzymol.154:367-382(1987)；Sambrook等(1989)《分子克隆：
实验室手册》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(纽约州冷泉港(Cold Spring Harbor,N.Y.))；美国专利号4,873,192；以及其中引用的参考文献；其通过引用纳入本文。
有关不影响感兴趣多肽生物学活性的合适氨基酸取代的指南可参见下述文献中的模型：
Dayhoff等(1978)，Atlas of Protein Sequence and Structure(《蛋白质序列和结构图册》)(华盛顿特区的国家生物医学研究基金会(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.))，第345-352页，通过引用全文纳入本文。Dayhoff等的模型利用单点可接受突变(Point Accepted Mutation，PAM)氨基酸相似矩阵(PAM 250矩阵)来确定合适的保守性氨基酸取代。在某些方面中，使用保守取代，如用具有相似特性的另一氨基酸替换一种氨基酸。Dayhoff等模型的PAM 250矩阵中教导的保守性氨基酸取代的示例包括但不限于：
和

[0142] 构建所述抗-SEMA4D结合分子的变体如抗体或其抗原结合片段、感兴趣多肽时，生成修饰，从而变体持续拥有所需属性，如能特异性结合SEMA4D，如人、灵长动物、鼠、或者人和鼠的SEMA4D，例如在表面上表达或由细胞分泌，并具有SEMA4D阻断活性，如本文所述。在某些方面中，编码变体多肽的DNA中产生的突变维持阅读框并且不产生可生成二级mRNA结构的互补区。参见欧洲专利申请公开号75,444。

[0143] 测定抗-SEMA4D结合分子如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的结合特异性的方法包括但不限于：标准竞争结合实验、T细胞或B细胞的免疫球蛋白分泌的监测试验、T细胞增殖实验、凋亡实验、ELISA实验等。参见例如，WO 93/14125；Shi等，Immunity 13:633-642(2000)；Kumanogoh等，J Immunol 169:1175-1181(2002)；Watanabe等，J Immunol 167:
4321-4328(2001)；Wang等，Blood 97:3498-3504(2001)；和Giraudon等，J Immunol 172:
1246-1255(2004)公开的实验，其都通过引用纳入本文。

[0144] 用于测量抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的抗-血管生成能力的方法是本领域所熟知的。

[0145] 本文在讨论本文公开的任何具体多肽(包括恒定区、CDR、VH结构域或VL结构域)是否与另一多肽至少约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或者甚至约100％相同时，相同性％可采用本领域已知的方法和计算机程序/软件测定，例如但不限于BESTFIT程序(威斯康星序列分析软件包，用于Unix系统的第8版，遗传学计算机团队(Genetics Computer Group)，威斯康星州麦迪逊科学大道575大学研究园(University Research Park)，53711)。
BESTFIT利用Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489的局部同源性算法，以找到两条序列之间的最佳同源性区段。使用BESTFIT或任何其它序列比对程序来确定某具体序列是否与本发明所述参照序列(例如)95％相同时，当然要设定参数从而在参照多肽序列的全长上计算相同性百分数，并且在参照序列的氨基酸总数中允许多至5％的同源性缺口。

[0146] 出于本发明的目的，可采用史密斯-沃特曼(Smith-Waterman)同源性搜索算法测定序列相同性百分数，该算法使用仿射缺口搜索，其中缺口开放罚12分，缺口延伸罚2分，BLOSUM矩阵计62分。Smith和Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482-489中公开了史密斯-沃特曼同源性搜索算法。变体与参照抗CXCL13抗体(如MAb VX15/2503、67、76或2282)可以差异例如，少至1-15个氨基酸残基，少至1-10个氨基酸残基，如6-10个，少至5个，少至4、3、2、或者甚至1个氨基酸残基。

[0147] 可以多种方式使抗-SEMA4D抗体的恒定区突变从而改变效应物功能。例如，参见美国专利号6,737,056B1和美国专利申请公开号2004/0132101A1，其公开了优化抗体与Fc受体结合的Fc突变。

[0148] 在可用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体或其片段、变体或衍生物中，可使用本领域已知的技术突变Fc部分以降低效应物功能。例如，恒定区结构域的缺失或失活(通过点突变或其它方式)可降低循环的修饰抗体与Fc受体的结合，从而提高肿瘤定位。在其他情况中，与本发明一致的恒定区修饰对互补结合进行调节并因此缩短血清半衰期。可利用恒定区的其它修饰来改变二硫键连接或寡糖部分，能因抗原特异性或抗体灵活性提高而加强定位。无需过多实验，即可容易地利用熟知的免疫学技术测定或定量分析修饰所产生的生理学概况、生物利用度和其它生化作用，如肿瘤定位、生物分布和血清半衰期。

[0149] 用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包括修饰的衍生物，例如通过将任何类型的分子共价连接到抗体上，从而该共价连接不会阻碍抗体特异性结合其关联表位。例如但不限于，抗体衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白质等方法修饰的抗体。通过已知技术可进行任意多种化学修饰，包括但不限于：特异性化学切割、乙酰化、甲酰化等。此外，衍生物可包含一种或多种非经典氨基酸。

[0150] “保守性氨基酸取代”是氨基酸残基被具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基取代。本领域已定义具有带相似电荷的侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括：具有碱性侧链的氨基酸(如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电极性侧链的氨基酸(如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。或者，突变可沿着编码序列的全部或部分而随机导入，如通过饱和诱变，并且可筛选所得的突变体的生物活性以鉴定保持活性(例如，在对象，例如癌症患者中结合抗-SEMA4D多肽，以阻断SEMA4D与其受体的相互作用，或抑制、延迟或减少转移的能力)的突变体。

[0151] 例如，可能仅在抗体分子的构架区内或仅在CDR区内引入突变。导入的突变可以是沉默或天然错义突变，即对抗体结合抗原的能力没有或有很少的影响。可使用这些突变类型来优化密码子使用，或提高杂交瘤的抗体生成。或者，非天然错义突变可改变抗体结合抗原的能力。本领域技术人员将能够设计并测试具有所需性质的突变体分子，如没有抗原结合活性或结合活性的变化(例如，改善抗原结合活性或改变抗体特异性)。诱变之后，编码的蛋白质可经常规表达并且能使用本文所述的技术或者通过本领域已知的常规修饰技术来确定编码的蛋白质的功能和/或生物活性(例如，免疫特异性结合SEMA4D多肽的至少一个表位的能力)。

[0152] 在某些实施方式中，用于本文提供的方法的抗-SEMA4D抗体包含至少一个优化的互补决定区(CDR)。述及“优化的CDR”意指该CDR已经修饰并且经优化以提高包含优化的CDR的抗-SEMA4D抗体的结合亲和性和/或抗-SEMA4D活性。“抗-SEMA4D活性”或“SEMA4D阻断活性”可包括调节下列一种或多种SEMA4D相关活性的活性：B细胞活性、聚集和存活；CD40-诱导的增殖和抗体产生；对T细胞依赖抗原的抗体应答；T细胞或其他免疫细胞增殖；树突细胞成熟；脱髓鞘和轴突变性；多潜能神经前体和/或少突细胞的凋亡；诱导内皮细胞迁移；抑制自发性单核细胞迁移；抑制、延迟或减少肿瘤细胞生长或转移，与细胞表面丛蛋白B1或其他受体结合，或者与可溶性SEMA4D或SEMA4D+细胞表面上表达的SEMA4D相关的任意其他活性。在特定的实施方式中，抗-SEMA4D活性包括以下能力：抑制、延迟或减少肿瘤转移，与原代细胞生长和肿瘤转移的抑制、延迟或减少相联合，或独立于原代肿瘤细胞生长和肿瘤转移。
抗-SEMA4D活性也可导致与SEMA4D表达相关的疾病的发病或严重性降低，包括但不限于某些类型的癌症包括淋巴瘤，自身免疫疾病，炎性疾病包括中枢神经系统(CNS)和外周神经系统(PNS)炎性疾病，移植排斥和侵入性血管生成。基于鼠抗-SEMA4D MAb BD16的优化的抗体的示例描述于美国专利公开号2008/0219971A1、国际专利申请号WO 93/14125和Herold等，Int.Immunol.7:1-8(1995)，其各自通过引用全文纳入本文。修饰可包括取代CDR内的氨基酸残基，使得抗-SEMA4D抗体保留对SEMA4D抗原的特异性并且具有改善的结合亲和性和/或改善的抗-SEMA4D活性。

[0153] 组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACi)

[0154] 本文所用术语“组蛋白脱乙酰酶抑制剂”、“HDAC抑制剂”和“HDACi”可以互换使用并且表示单数的HDACi或复数的HDACi。

[0155] 组蛋白乙酰基转移酶(HAT)和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)调节组蛋白的乙酰化状态。组蛋白乙酰基转移酶是使核心组蛋白中的赖氨酸残基乙酰化的酶，导致较不紧凑和更多转录活性的染色质，进行导致基因表达。相反，HDAC是催化从核小体核心组蛋白氨基末端尾的赖氨酸残基去除乙酰基基团的酶。HDAC基于结构同源性可以分为3类。I类HDAC(HDAC 1、2、3和8)与酵母RPD3基因相关。IIA类(HDAC 4、5、7和9)具有与酵母Hda1基因的相似性。III类也称为乙酰化酶(sirtuin)，其与Sir2基因相关并且包括SIRT1-7。IV类仅包含HDAC11，其享有I和II类的特征。参见例如，Mottamal,M.,等,Molecules 20:3898-3941(2015)。

[0156] 某些HDAC抑制剂通过结合HDAC的含锌催化结构域作用。它们可以基于结合锌离子的化学部分进行分类，或作为环四肽，其通过巯基结合锌离子。参见例如，Drummond,D.C.,等,Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.45:495-528(2005)。它们包括但不限于，异羟肟酸(或异羟肟酸类(hydroxamates))，如曲古抑菌素A；环四肽(如trapoxin B)和缩酚酸肽；苯甲酰胺；亲电性酮；和脂肪酸化合物(短链脂肪酸(SCFA)，如苯基丁酸和丙戊酸。参见例如，Porcu,M.和Chiarugi,A.,Trends Pharmacolog.Sci.26:94-103(2005)。更具体地，HDAC抑制剂包括但不限于，异羟肟酸伏立诺他(SAHA)，贝利司他(PXD101)，LAQ824，和帕比司他(LBH589)；和苯甲酰胺：恩替诺特(MS-275)，CI994和莫西司他(MGCD0103)。III类去乙酰化酶HDAC依赖于NAD+，并且因此受到烟酰胺以及NAD的衍生物，二氢香豆素，甲萘酚吡喃酮(naphthopyranone)和2-羟基萘甲醛(2-hydroxynaphthaldehydes)的抑制，I同上。

[0157] 用于在恶性细胞中诱导终末分化、细胞生长停滞和/或凋亡，抑制组蛋白脱乙酰酶，和/或在肿瘤中诱导分化，细胞生长停滞和/或肿瘤细胞凋亡的HDAC抑制剂的非限制性实例列于表2中。应当理解的是，HDAC抑制剂包括本文所述HDAC抑制剂的任何盐、晶体结构、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、立体异构体，结构异构体和前药。

[0158] 表2：HDAC抑制剂的非限制性列表

[0159]

[0160]

[0161]

[0162]

[0163] 在某些实施方式中，能够用于本文所述方法的HDAC抑制剂包括恩替诺特(Entinostat)，伏立诺他(Vorinostat)，罗米地辛(Romidepsin)，西达本胺(Chidamide)，帕比司他(Panobinostat)，贝利司他(Belinostat)，丙戊酸，莫西司他(Mocetinostat)，阿贝司他(Abexinostat)，帕思诺特(Pracinostat)，雷米诺特(Resminostat)，吉凡诺特
(Givinostat)，奎斯诺特(Quisinostat)，凯维特林(Kevetrin)，CUDC-101，4SC-202，ACY-
241，AR-42，特菲诺特(Tefinostat)，CHR-3996，瑞科诺特(Ricolinostat)(ACY-1215)和/或CD200745。一些FDA批准的用于癌症治疗的HDAC抑制剂以及正在进行或已完成临床试验的HDAC抑制剂如下所示。

[0164] 食品和药物管理局(FDA)批准的HDAC抑制剂。伏立诺他于2006年10月经美国FDA核准用于治疗皮肤性T细胞淋巴瘤(CTCL)。罗米地辛(商品名Istodax)于2009年11月经美国FDA核准用于皮肤性T细胞淋巴瘤(CTCL)。西达本胺于2015年由中国批准用于外周性T细胞淋巴瘤(PTCL)。帕比司他(商品名Farydak)于2015年2月经美国FDA核准用于治疗多发性骨髓瘤。贝利司他(PXD101)在2014经FDA核准用于治疗外周性T细胞淋巴瘤。

[0165] 在一个非限制性的方面，HDAC抑制剂是恩替诺特(ENT)。恩替诺特具有IUPAC化学名称吡啶-3-基甲基N-[[4-[(2-氨基苯基)氨基甲酰基]苯基]甲基]氨基甲酸酯。ENT，也称为SNDX-275和MS-275，其是I类HDAC的抑制剂(Syndax制药公司(Syndax Pharmaceuticals))。ENT是这样的苯甲酰胺组蛋白脱乙酰酶抑制剂，其以0.51μM和1.7μM的IC50抑制HDAC1和HDAC3。ENT当前正在进行用于治疗各种癌症的临床试验。

[0166] DNA甲基转移酶抑制剂

[0167] 本文所用术语“DNA甲基转移酶抑制剂”、“DNMT抑制剂”和“DNMTi”可以互换使用并且表示单数的DNMTi或复数的DNMTi。

[0168] DNA甲基转移酶催化向胞嘧啶残基的5'碳原子添加甲基基团。在癌细胞中，肿瘤抑制基因的沉默通过DNMT介导的甲基化发生。Gravina等,Molecular Cancer 9:305-320(2010)。存在DNMT的数个亚型，包括DNMT1、DNMT-3a和DNMT-3b。同上。已经鉴定了各种DNMTi，并且其中两种已经在美国批准用于癌症治疗。分子的类别包括核苷类似物，反义寡核苷酸，小分子酶抑制剂，以及阻断DNMT与DNA相互作用的物质。

[0169] 用于抑制DNA甲基转移酶，在恶性细胞中诱导终末分化、细胞生长停滞和/或凋亡，和/或在肿瘤中诱导分化，细胞生长停滞和/或肿瘤细胞凋亡的DNMTi的非限制性实例列于表3中。应当理解的是，DNMTi包括本文所述DNMT抑制剂的任何盐、晶体结构、非晶结构、水合物、衍生物、代谢物、立体异构体，结构异构体和前药。

[0170] 表3：DNMT抑制剂的非限制性列表

[0171]

[0172]

[0173] 在某些实施方式中，能够用于本文所提供方法的DNMT抑制剂包括氮杂胞苷，地西他滨，4-脱氧尿苷(zebularine)，GI-110，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)，G98，RG108，普鲁卡因胺和/或肼苯哒嗪。一些FDA批准的用于癌症治疗的DNMT抑制剂以及正在进行或已完成临床试验的DNMT抑制剂如下所示。

[0174] 食品和药物管理局(FDA)批准和试验中的DNMTi。氮杂胞苷以市售，其于2004年5月19日经FDA批准用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)，并且处于晚期实体瘤的临床试验中。已经证明氮杂胞苷在临床前黑色素瘤和结肠癌模型中通过上调干扰素(IFN)途径并通过去抑制病毒抗原增强免疫检查点抑制剂(ICP)的活性，从而使肿瘤具有更高的免疫原性并对有效的ICP治疗易感(Li等,Oncotarget 5:587(2014)和Roulois等,Cell
162:961(2015))。已进一步证明氮杂胞苷上调肿瘤中癌症睾丸抗原(cancer testes
antigens)(CTA)的表达，导致针对患有MDS、急性髓性白血病(AML)和慢性粒单核细胞白血病(CMML)的患者中CTA的T细胞活性增强(Gang,AO.等Blood Cancer J.doi:10.1038/
bcj.2014.14.(2014))。Juergens,RA.等,(Cancer Discov.1:598-607(2011))在难治性晚期NSCLC使用了氮杂胞苷和恩替诺特。来自该试验的6名患者参加了使用免疫检查点抑制剂的另一试验(Wrangle,J.等,Oncotarget 4:2067-2079(2013))，其中5名患者发生应答。同样参见：blogs.biomedcentral.com/on-biology/2015/03/26/improving-lung-cancer-immunoth erapy-using-epigenetic-approaches/(访问日期2017年3月16日)。

[0175] 地西他滨以市售，其被批准用于治疗MDS，并且在欧洲也被批注用于治疗AML并处于AML临床试验中。SGI-110处于针对AML治疗的II期临床试验中。MG98完成了针对晚期实体瘤的I期临床试验。ECGC完成了针对前列腺癌的II期临床试验。

[0176] 在一非限制性的方面，DNMTi是氮杂胞苷。氮杂胞苷是核苷胞嘧啶的化学类似物。除了其他活性以外，氮杂胞苷可以纳入DNA，通过与DNMT的共价结合引起DNA的低甲基化，防止DNA合成并导致捕获的DNMT的细胞毒性和降解。Stresemann,C.和Lyko,F.,Int.J.Cancer
123:8-13(2008)。

[0177] 使用治疗性抗-SEMA4D结合分子和表观遗传调节剂(例如，HDACi和/或DNMTi)的治疗方法

[0178] 本公开提供了一种用于抑制、延迟或减少患有癌症的对象中恶性细胞生长的方法，所述方法通过给予所述对象联合疗法，所述联合疗法包括有效量的特异性结合SEMA4D的分离的结合分子(例如，抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)，联合有效量的表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi或其任意组合)。示例性的抗-SEMA4D抗体和示例性的表观遗传调节剂在本文其他处详述。在某些方面中，给予本文所提供的联合疗法可以部分或完全抑制肿瘤或恶性细胞生长，可以延迟对象中肿瘤和哺乳动物细胞生长的进展，可以预防对象中转移扩散，可以减小对象的肿瘤大小，例如，以允许更成功的手术去除，可以减少肿瘤脉管系统，或者可以导致对象中的积极治疗响应的任何组合。本文描述了可以实现的示例性治疗响应。

[0179] 在某些方面中，相对于单独给予抗-SEMA4D抗体或其片段或表观遗传调节剂，联合疗法的给予可以增强治疗功效。在某些方面中，改善的治疗功效是协同的，并且大于各单独物质的累加功效。在某些方面中，经测量的改善的治疗功效，例如，在增加肿瘤生长延迟(TGD)，增加肿瘤消退(例如，完全肿瘤消退)的频率或增加存活方面优于单独给予的物质至少5％、至少10％、至少20％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、至少550％、至少600％、至少650％、至少700％、至少750％、至少800％、至少850％、至少900％、至少950％或至少
1000％。在某些方面中，经测量的改善的治疗功效，例如，在增加肿瘤生长延迟(TGD)，增加肿瘤消退(例如，完全肿瘤消退)的频率，或增加存活方面优于相单独给予两种物质的累加功效至少5％、至少10％、至少20％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少100％、至少150％、至少200％、至少
250％、至少300％、至少350％、至少400％、至少450％、至少500％、至少550％、至少600％、至少650％、至少700％、至少750％、至少800％、至少850％、至少900％、至少950％或至少
1000％。

[0180] 在某些方面中，抗-SEMA4D抗体或片段可以是be VX15/2503、mAb 67或其抗原结合片段、变体或衍生物。例如，抗体或其片段可以包含含有VH CDR 1-3的可变重链(VH)和含有VL CDR 1-3可变轻链(VL)，所述VH CDR 1-3分别含有SEQ ID NO:2、3和4，所述VL CDR 1-3分别含有SEQ ID NO:6、7和8，或者所述VH和VL分别包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10。

[0181] 在某些方面中，本文所提供的方法包括给予抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以及抑制HDAC的HDACi，所述HDAC可以是I型、IIA型、IIB型、IV型HDAC，和/或其任意组合，例如，HDAC包含含锌催化结构域。在某些方面中，HDACi可以包含这样的部分，所述部分结合HDAC的含锌催化结构域。例如，在某些方面中，HDACi可以包含一种或多种化学部分或化学部分的组合，所述化学部分例如但不限于：异羟肟酸或其盐，环四肽，缩酚酸肽，苯甲酰胺，亲电性酮，和/或脂肪酸或其盐。可以用于本文所提供治疗方法的HDACi包括伏立诺他(Vorinostat)，罗米地辛(Romidepsin)，西达本胺(Chidamide)，帕比司他(Panobinostat)，贝利司他(Belinostat)，丙戊酸，莫西司他(Mocetinostat)，阿贝司他(Abexinostat)，恩替诺特(Entinostat)，帕思诺特(Pracinostat)，雷米诺特
(Resminostat)，吉凡诺特(Givinostat)，奎斯诺特(Quisinostat)，凯维特林(Kevetrin)，CUDC-101，AR-42，特菲诺特(Tefinostat)(CHR-2845)，CHR-3996，4SC-202，CG200745，ACY-
1215，ACY-241和/或其任意组合。在某些方面中，HDACi是恩替诺特(吡啶-3-基甲基N-[[4-[(2-氨基苯基)氨基甲酰基]苯基]甲基]氨基甲酸酯)。

[0182] 在某些方面中，本文所提供的方法包括给予抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物以及抑制DNMT1、DNMT-3a、DNMT-3b和/或其任意组合的DNMTi。例如，在某些方面中，DNMTi可以包含一种或多种化学部分或化学部分的组合，所述化学部分例如但不限于：氮杂胞苷，地西他滨，4-脱氧尿苷(zebularine)，SGI-110，表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate)，MG98，RG108，普鲁卡因胺，肼苯哒嗪，和/或其任意组合。在某些方面中，DNMTi可以是氮杂胞苷。

[0183] 根据本文所提供的方法，抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)和表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi或其任意组合)可以分开地或同时地给予。任意一种物质可以在另一种物质之前给予或者可以同时给予各种物质，例如，在单一制剂中。此外，给药的途径、物质的配方和/或给药的方案可以是相同的或不同的。

[0184] 据本文所提供的方法，向患有癌症的患者给予特异性结合SEMA4D的抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)和表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi或其任意组合)。患者的癌症可以是新诊断出的，或在某些方面中，给药可以遵循更传统的癌症治疗。在某些方面中，给予本文所提供的联合疗法可以用作具有发展某种癌症的高易感性对象中的预防措施，或用以预防以前治疗的癌症的复发。对象的癌症可以是，例如，实体瘤，血液恶性病，其任何转移，或其任意组合。

[0185] 在某些方面中，对象的癌症是实体瘤或其转移。实体瘤可以是，例如，肉瘤，癌症，黑色素瘤，其任何转移，或其任意组合。可以根据本文所提供的方法治疗的实体瘤的实例包括但不限于，鳞状细胞癌，腺癌，基底细胞癌，肾细胞癌，乳腺导管癌，软组织肉瘤，骨肉瘤，黑素瘤，小细胞肺癌，非小细胞肺癌，肺腺癌，腹膜癌，肝细胞癌，胃肠癌，胃癌，胰腺癌，神经内分泌癌，胶质母细胞瘤，宫颈癌，卵巢癌，肝癌，膀胱癌，脑癌，肝细胞瘤，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，子宫内膜癌或子宫癌，食道癌，唾液腺癌，肾癌，肝癌，前列腺癌，外阴癌，甲状腺癌，头颈癌，其任何转移，或其任意组合。

[0186] 在某些方面中，癌症是血液恶性病或其转移。可以根据本文所提供的方法治疗的血液恶性病的实例包括但不限于，白血病，淋巴瘤，骨髓瘤，急性髓性白血病，慢性髓性白血病，急性淋巴细胞白血病，慢性淋巴细胞白血病，毛细胞白血病，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，多发性骨髓瘤，其任何转移，或其任意组合。

[0187] 在某些方面中，本文所提供的癌症治疗方法可以进一步包括给予其他癌症疗法。其他癌症疗法可以发生在给予本文所述的联合疗法同时，本文所提供的联合疗法之前，或本文所提供的联合疗法之后。在某些方面中，其他疗法可以包括但不限于，手术，化疗，放疗，给予癌症疫苗，给予免疫刺激剂，过继性T细胞或抗体疗法，给予免疫检查点阻断抑制剂，给予调节性T细胞(Treg)调节剂及其组合。

[0188] 表观遗传调节剂，例如，HDACi、DNMTi和/或其任何组合与抗-SEMA4D结合分子，例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物的联合给予能够用于治疗各种恶性或非恶性肿瘤。述及“抗肿瘤活性”意指恶性细胞增殖或累积速率的降低，并因此使存在的肿瘤或在治疗过程中产生的肿瘤的增长率下降，和/或破坏存在的瘤性(肿瘤)细胞或新形成的瘤性细胞，并因此在治疗期间降低肿瘤的总尺寸。“抗肿瘤活性”还可以包括促进免疫浸润进入肿瘤，转向功能性、肿瘤特异性、分泌IFNγ的CD8+细胞毒性T细胞，增加T效应细胞与T调节细胞的比例，增加T细胞活性，浸润和活化交叉呈递肿瘤抗原并局部激活肿瘤特异性T细胞的抗原呈递细胞，减少肿瘤相关血管生成，抑制肿瘤进展和增强存活。例如，采用表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)和抗-SEMA4D抗体的疗法能引起生理响应，例如，抑制、延迟或减少肿瘤或恶性细胞生长和转移，这将有益于与人体中表达SEMA4D细胞相关的癌症治疗。

[0189] 在某些方面中，采用表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)和抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其片段)的联合疗法可以用作药物，特别是用于癌症的治疗和预防或用于癌前病症或病变。在某些方面中，采用表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)和抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其片段)的联合疗法可以用于治疗SEMA4D过表达癌症或与SEMA4D过表达细胞相关的癌症。

[0190] 根据本文所提供的治疗方法，给予表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)和抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)(如本文他处限定)可以用于促进患有癌症或倾向于患上癌症的对象的积极治疗响应。“积极治疗响应”相对于癌症旨在包括与“抗肿瘤活性”相关的疾病的改善，述及“抗肿瘤活性”意指恶性细胞增殖或累积速率的降低，并因此使存在的肿瘤或在治疗过程中产生的肿瘤的增长率下降，和/或破坏存在的瘤性(肿瘤)细胞或新形成的瘤性细胞，因而在治疗期间降低肿瘤的总尺寸。这类积极治疗响应并不限于给药途径。本文所提供的方法可基于在患有癌症患者中抑制、延迟或减少肿瘤生长、恶性细胞生长和转移。因此，作为一个非限制性的实例，疾病的改善可以肿瘤大小的降低或肿瘤的消失为特征。如本文它出所述，在给予提供的联合治疗后实现的治疗响应可大于单独给予表观遗传调节剂或抗-SEMA4D结合分子后实现的相应治疗响应。在某些方面，实现的治疗响应大于给予两种物质后预期的累加响应。换而言之，实现的治疗响应是协同的。在某些方面中，协同响应可以导致更有效的治疗，更快的治疗，或可允许在联合疗法中采用降低剂量药剂的治疗。

[0191] 药物组合物和给药方法

[0192] 本公开提供了组合物，例如，药物组合物，其包含有效量的抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)和有效量的表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)。该组合物可以进一步包含一种或多种药学上可接受的运载体或赋形剂，和/或一种或多种其他治疗剂，其实例在本文它出公开。本文提供了用于这类药物组合物的合适的抗-SEMA4D结合分子和表观遗传调节剂。

[0193] 在某些方面，药物组合物包含含有VH和VL的有效量的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段，其中所述VH和VL包括MAb VX15/2503和MAb 67中包含的CDR氨基酸序列，即含有氨基酸序列SEQ ID NO:2的HCDR1，含有氨基酸序列SEQ ID NO:3的HCDR2，含有氨基酸序列SEQ ID NO:4的HCDR3，含有氨基酸序列SEQ ID NO:6的LCDR1，含有氨基酸序列SEQ ID NO:7的LCDR2，和含有氨基酸序列SEQ ID NO:8的LCDR3。在某些方面，药物组合物包含有效量的抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段，其包括MAb VX15/2503的VH和VL氨基酸序列，即包含氨基酸序列SEQ ID NO:1的VH和包含氨基酸序列SEQ ID NO:5的VL。

[0194] 在某些方面，药物组合物包含有效量的HDACi恩替诺特。在某些方面，药物组合物包含有效量的DNMTi氮杂胞苷。

[0195] 本文提供的示例性药物组合物包含有效量的MAb VX15/2503和有效量的恩替诺特。本文提供的另一示例性药物组合物包含有效量的MAb VX15/2503和有效量的氮杂胞苷。
在某些方面中，提供的药物组合物中包含的“有效量”的特定物质可以不同于，例如，低于，以单独疗法形式起效的物质的量。在某些方面中，本文所提供药物组合物的治疗功效大于当其中包含的物质单独给予时的累加效应。

[0196] 表观遗传调节剂联合抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物组合的给药途径可以是，例如，口服、胃肠外、吸入或局部。本文所用的术语胃肠外包括例如，静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、直肠或阴道给药。两种物质的给药模式可以是相同的或不同的。虽然所有这些给药形式均明确认为在本文所提供的方法的范围内，但给药形式的非限制性实例是注射液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注。合适的注射用药物组合物可包含缓冲剂(如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(如聚山梨酯)，以及任选的稳定剂(如人白蛋白)等。然而，在与本文所教授内容相符的其它方法中，表观遗传调节剂和/或抗-SEMA4D结合分子，如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物可直接递送到不良细胞群的位点，从而提高患病组织与治疗剂的接触。

[0197] 制备和给予有需要的对象本文所提供的联合疗法的方法为本领域技术人员所熟知并由其容易地被确定，所述联合疗法包含表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)联合抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)。

[0198] 如本文所讨论，可以对于体内治疗癌症而言药学上有效量给予与抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)联合的表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其任何组合)。在这方面，应理解，将配制本发明公开的表观遗传调节剂和结合分子以利于给药并提高活性物质的稳定性。在某些实施方式中，本文所提供的方法的药物组合物包含药学上可接受的无毒无菌运载体，如生理盐水、无毒缓冲液、防腐剂等。处于即时应用的目的，表观遗传调节剂和结合分子的药学上有效量是足以影响患有癌症对照中癌细胞的至少一种表观遗传修饰活性的量，例如，降低组蛋白脱乙酰酶活性或DNA甲基转移酶活性，和实现与靶标的有效结合和实现益处，例如，抗增殖作用，抑制、延迟或减少肿瘤和恶性细胞生长和转移，预防进一步肿瘤发展，减少肿瘤尺寸，减少肿瘤血管，以及减少癌细胞数量，和/或减少可以观察到与该疾病相关的一种或多种症状。

[0199] 用于本文所提供方法的药物组合物可以包含药学上可接受的运载体，例如，离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂，血清蛋白质如人血清白蛋白，缓冲物质如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的部分甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素基物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯-段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。

[0200] 胃肠外给药制剂可以包括无菌的水性或非水性溶液、悬液和乳液。非水性溶剂的非限制性示例是丙二醇，聚乙二醇，植物油如橄榄油，和可注射的有机酯如油酸乙酯。水性运载体包括例如，水、醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。药学上可接受的运载体包括但不限于：0.01-0.1M，例如，0.05M的磷酸盐缓冲液或0.8％盐水。其它常见的胃肠外载剂包括磷酸钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸林格溶液或固定油。静脉内载剂包括液体和营养补充剂、电解质补充剂，例如基于林格右旋糖的那些物质等。也可存在防腐剂和其它添加剂，例如，抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。

[0201] 适于注射应用的药物组合物的非限制实例包括无菌水溶液(水溶性时)或分散液，以及用于临时制备无菌注射液或分散液的无菌粉末。在这种情况下，该组合物必须无菌，并应该是达到存在易注射性(easy syringability)程度的流体。组合物通常配制成在制造和储存条件下稳定，并且应该在保存过程中能够抵抗微生物如细菌和真菌的污染作用。运载体可以是包含如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)及其合适混合物的溶剂或分散介质。可维持合适的流动性，例如通过使用诸如卵磷脂的涂料、分散液情况下通过保持所需粒度以及通过使用表面活性剂。适用于本文所述治疗方法的制剂可参见《雷明顿药物科学》(Remington's Pharmaceutical Sciences)(马克出版公司(Mack Publishing Co.))第16版(1980)。

[0202] 也可通过各种抗菌剂和抗真菌剂(如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等)实现防止微生物的作用。例如，组合物中可包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨糖醇和/或氯化钠。可在组合物中包含延迟吸收的物质(如单硬脂酸铝和明胶)以延长可注射组合物的吸收。

[0203] 制备无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物(例如，表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)联合抗-SEMA4D抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物，本身或与其它活性剂联合)掺入含有本文所列一种成分或多种成分组合的合适溶剂，然后按需进行过滤除菌。通常，将活性活化物掺入含有碱性分散介质和上述其它所需成分的无菌载剂中制备分散液。在制备无菌注射液的无菌粉末时，制备方法的两个非限制性实例是真空干燥和冷冻干燥，其由之前无菌过滤的溶液得到活性组分和任何其它所需组分的粉末。注射制剂在无菌条件下按照本领域已知方法加工，装入容器(如安瓿、袋、瓶、注射器或小管)中，并密封。此外，可以试剂盒的形式包装并销售制剂。这类制品可具有标签或药品说明书，表明相关组合物可用于治疗患有或倾向于患有癌症的对象。

[0204] 胃肠外制剂可以是单次推注剂量，输注或负荷推注剂量，随后是维持剂量。可在具体固定或可变的间隔处给予这些组合物，例如，每天一次或者按需摂基础。

[0205] 使用的某些药物组合物可以可接受的剂型口服给予，包括例如，胶囊、片剂、水性悬液或溶液。也可通过鼻气溶胶或吸入来给予某些药物组合物。这类组合物可采用苯甲醇或其他合适的防腐剂，吸收促经济以增强生物可及性，和/或其他常规增溶剂或分散剂制备成盐水溶液。

[0206] 待与运载体材料组合产生单剂型的表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi或其组合)和抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)的量可以根据待治疗的对象以及具体的给药模式而变化。可以单剂型、多剂型或在确立的时间段内的输注中给予组合物。也可调整给药方案，以提供最优所需响应(例如，治疗或预防性响应)。

[0207] 在本发明范围内，表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi或其组合)联合抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可按照上述治疗方法以足以产生疗效的量给予人或其它动物。表观遗传调节剂联合抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)可以常规剂型给予所述人或其它动物，该剂型根据已知技术将抗体和表观遗传调节剂与常规的药学上可接受运载体或稀释剂混合来制备。本领域技术人员应认识到，药学上可接受运载体或稀释剂的形式和特点由混合的活性成分含量、给药途径和其它熟知变量决定。本领域技术人员将进一步认识到的是，可以使用包含表观遗传调节剂和结合分子的混合物。

[0208] 述及“有效量”意指表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)的量以及抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的量，所述量在其给予时对于患有待治疗疾病患者的治疗带来积极治疗响应，例如，抗增殖作用，防止进一步肿瘤发展，减少肿瘤尺寸，减少肿瘤血管，减少癌细胞数量，抑制、延迟或减少癌症患者中肿瘤和/或恶性细胞生长和/或转移，和/或减少可以观察到与该疾病相关的一种或多种症状。

[0209] 本文所述组合物治疗有效剂量，例如，用于抗增殖作用，防止进一步肿瘤发展，减少肿瘤尺寸，减少肿瘤血管，减少癌细胞数量，抑制、延迟或减少癌症患者中肿瘤和/或恶性细胞生长和/或转移，和/或减少可以观察到与该疾病相关的一种或多种症状的治疗有效剂量根据许多不同的因素可以各不相同，所述因素包括给药的方式，靶位点，患者的生理状态，患者是人类还是其他动物，给予的其他药物，以及治疗是预防性的还是治疗性的。在某些实施方式中，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，包括转基因动物。可使用本领域技术人员已知的常规方法对治疗剂量进行滴定以优化安全性和功效。

[0210] 鉴于本文所公开内容，本领域普通技术人员无需过多实验即可确定表观遗传调节剂，例如，HDACi、DNMTi和/或其他组合联合抗-SEMA4D结合分子待给予的量。影响给药模式和表观遗传调节剂和结合分子相应量的因素影响包括但不限于，经历治疗个体的疾病严重性、病史、年龄、身高、体重、健康和身体状况。类似地，待给予的表观遗传调节剂和结合分子的量将取决于给药模式，以及对象将经历该药剂的单一剂量还是多重剂量。

[0211] 还提供了表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)联合抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的用途，并且在一些方面中，还包括采用至少一种其他疗法的预处理。“预治疗”或“预处理”是指对象在接受包含表观遗传调节剂联合抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药物之前已经接受了一种或多种其他疗法(例如，已经用至少一种其他癌症疗法进行治疗)。“预治疗”或“预处理”包括在用包含表观遗传调节剂，例如，HDACi如恩替诺特和/或DNMTi如氮杂胞苷以及抗-SEMA4D结合分子如本文公开的单克隆抗体VX15/2503或其抗原结合片段、变体或衍生物的药物治疗开始之前2年内、18个月内、1年内、6个月内、2个月内、6周内、1个月内、4周内、3周内、2周内、1周内、6天内、5天内、4天内、3天内、2天内、或者甚至1天内已经用至少一种其他疗法进行治疗的对象。对象不必对采用先前的一种或多种疗法进行的预治疗有响应。因此，接受包含表观遗传调节剂联合抗-SEMA4D结合分子(例如抗体或其抗原结合片段、变体或衍生物)的药物的对象对采用先前疗法的预治疗，或对先前疗法中的一种或多种(其中预治疗包括多种疗法)可能已有响应或可能未能响应。

[0212] 本文所提供的方法还提供表观遗传调节剂(例如，HDACi、DNMTi和/或其组合)联合抗-SEMA4D结合分子(例如，抗体或其片段、变体或衍生物)在制备用于治疗患有癌症的对象的药物中的用途，其中，所述药物用于还在用至少一种其他疗法进行治疗的对象。本文所公开的可用的疗法包括但不限于，手术，放疗，癌症疫苗，给予免疫刺激剂，过继性T细胞或抗体疗法，给予免疫检查点阻断抑制剂，给予调节性T细胞(Treg)调节剂及其组合。

[0213] 除非另有说明，本发明将采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们均在本领域技术范围内。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等编(1989)Molecular Cloning A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(第2版；冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press))；Sambrook等编(1992)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)，(纽约州的冷泉港实验室出版社(Cold Springs Harbor Laboratory，NY))；D.N.Glover编，(1985)DNA Cloning(《DNA克隆》)，第I和II卷；Gait编(1984)Oligonucleotide Synthesis《( 寡核苷酸合成》)；Mullis等，美国专利号4,683,195；
Hames和Higgins编(1984)Nucleic Acid Hybridization(《核酸杂交》)；Hames和Higgins编(1984)Transcription And Translation(《转录和翻译》)；Freshney(1987)Culture Of Animal Cells(《动物细胞培养》)(ARL公司(Alan R.Liss，Inc.))；Immobilized Cells And Enzymes(《固定的细胞和酶》)(IRL出版社)(1986)；Perbal(1984)A Practical Guide To Molecular Cloning(《分子克隆实践指南》)；论文，Methods In Enzymology(《酶学方法》)(学术出版社公司(Academic Press，Inc.)，纽约州)；Miller和Calos编(1987)Gene
Transfer Vectors For Mammalian Cells(《哺乳动物细胞的转基因载体》)(冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory))；Wu等编，Methods In Enzymology(《酶学方法》)，第154和155卷；Mayer和Walker编(1987)Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology(《细胞和分子生物学中的免疫化学方法》)(学术出版社(Academic Press)，伦敦)；Weir和Blackwell编(1986)Handbook Of Experimental Immunology(《实验免疫学手册》)，第I-IV卷；Manipulating the Mouse Embryo(《小鼠胚胎操作》)，纽约州冷泉港的冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)，(1986)；和Ausubel等(1989)Current Protocols in Molecular Biology(《新编分子生物学实验指南》)(马里兰州巴尔的摩的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons，
Baltimore，Md.))。

[0214] 抗体工程的一般原理可参见Borrebaeck编(1995)Antibody Engineering(《抗体工程》)(第2版；牛津大学出版社(Oxford Univ.Press))。蛋白质工程的一般原理可参见Rickwood等编(1995)Protein Engineering，A Practical Approach《( 蛋白质工程，实践方法》)，(英国牛津的牛津大学出版社的IRL出版公司(IRL Press at Oxford Univ.Press，Oxford，Eng.))。抗体和抗体-半抗原结合的一般原理可参见：Nisonoff(1984)Molecular Immunology(《分子免疫学》)(第2版；马萨诸塞州桑德兰的辛奥尔联合公司(Sinauer Associates，Sunderland，Mass.))；和Steward(1984)Antibodies,Their Structure and Function(《抗体的结构和功能》)(Chapman和Hall，纽约州纽约市)。此外，本领域已知且没有具体描述的免疫学标准方法可按照下述文献所述进行：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，纽约州的约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)；
Stites等编(1994)Basic and Clinical Immunology(《基础和临床免疫学》)(第8版；
Appleton和Lange，康涅狄格州的诺沃克(Norwalk，Conn.))和Mishell和Shiigi(编)(1980)Selected Methods in Cellular Immunology(《细胞免疫学的选用方法》)(W.H.弗里曼公司(W.H.Freeman and Co)，纽约州)。

[0215] 列出免疫学通用原理的标准参考文献包括：Current Protocols in Immunology(《新编免疫学实验指南》)，约翰韦利父子公司(John Wiley&Sons)，纽约州；Klein(1982)J.，Immunology:The Science of Self-Nonself Discrimination(《免疫学：自身-非自身区别的科学》)(约翰韦利父子公司，纽约州)；Kennett等编(1980)Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses(《单克隆抗体，杂交瘤：生物学分析的新领域》)(普莱努公司(Plenum Press)，纽约州)；Campbell(1984)"Monoclonal Antibody Technology"in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology"(《生化和分子生物学实验室技术》中的“单克隆抗体技术”)，Burden等编(的埃尔斯威尔公司(Elsevere)，阿姆斯特丹)；Goldsby等编(2000)Kuby Immunnology(《库比免疫学》)(第4版；W.H.弗里曼公司(W.H.Freemand&Co.))；Roitt等(2001)Immunology(《免疫学》)(第6版；伦敦：摩兹比公司(Mosby))；Abbas等(2005)Cellular and Molecular Immunology(《细胞和分子免疫学》)(第5版；埃尔斯威尔健康科学分公司(Elsevier Health Sciences Division))；Kontermann和Dubel(2001)Antibody Engineering(《抗体工程》)(施普林格公司(Springer Verlan))；Sambrook和Russell(2001)Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》)(冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press))；Lewin(2003)Gene VIII(《基因VIII》)(普伦蒂斯霍尔出版社(Prentice Hall)2003)；Harlow和Lane(1988)Antibodies:A Laboratory Manual(《抗体：实验室手册》)(冷泉港出版社)；Dieffenbach和Dveksler(2003)PCR Primer(《PCR引物》)(冷泉港出版社)。

[0216] 将上文中引用的所有参考文献以及其中引用的所有参考文献通过引用全文纳入本文。

[0217] 通过说明的方式，而非限制性方式提供以下实施例。

[0218] 实施例

[0219] 实施例1：给予恩替诺特(ENT)和抗-SEMA4D抗体增加存活，显著延迟肿瘤生长，并增加百分比完全肿瘤消退

[0220] ENT和抗-SEMA4D MAb的联合给药对存活、肿瘤生长和肿瘤消退的作用在肿瘤小鼠模型中测试。将Colon26细胞(500,000个细胞)经皮下植入Balb/c小鼠。采用以下物质处理小鼠：1)对照Ig(10mg/kg，腹膜内(ip)，每周x 5，在第2天开始)(n＝20)；2)对照Ig(10mg/kg，腹膜内，每周x 5，在第2天开始)+ENT(20mg/kg，3x/每周x 2周，当平均肿瘤体积为约300mm3时起始)(n＝21)；3)抗-SEMA4D/MAb 67(10mg/kg，腹膜内，每周x 5周，在第2天开始)(n＝24)；或4)抗-SEMA4D/MAb 67(10mg/kg，腹膜内，每周x 5周，在第2天开始)和ENT(20mg/kg，3x/每周x 2周，当平均肿瘤体积为约300mm3时起始)(n＝26)(实验设计述于图1)。对照和实验组中的肿瘤体积在治疗时相似。进行Kaplan-Meier存活曲线分析以评估存活功能，测量肿瘤体积的变化以确定肿瘤生长速率，而完全肿瘤消退的频率通过确定无肿瘤的小鼠
3
的百分比确定。百分比完全消退(％CR)还通过在消退之前超过至少100mm的肿瘤来分层。
统计学显著性这样确定，Mantel Cox对数秩检验用于存活，双因素ANOVA用于肿瘤体积，而费舍尔精确检验用于CR。Prism报告结果，P>0.05时为不显著(ns)，0.013
≤0.0001时为(“****”)最显著。将并未发展出肿瘤或在到达700mm 肿瘤体积之前发展出肿瘤溃疡的小鼠排除出分析。

[0221] 对于联合给予ENT和抗-SEMA4D/MAb 67的组观察到肿瘤生长延迟方面的协同作用(782％最大肿生长延迟(TGD))，相较于单独给予其他物质的组：对于SEMA4D/MAb 67为107％TGD，和对于ENT为214％TGD(图2A)。ENT和抗-SEMA4D/MAb 67处理的小鼠相较于用ENT或抗-SEMA4D/MAb 67处理的小鼠还显示显著改善的存活(p<0.05)(图2B)。此外，ENT和抗-SEMA4D/MAb67的联合治疗相对于单一物质显著地增加了完全肿瘤消退的频率(62％***)，特别是在消退前超过100mm3的肿瘤中(图2C和2D)。这些结果证明，采用ENT和抗-SEMA4D MAb的治疗改善了存活，降低了肿瘤生长，并导致较大的已建立肿瘤的消退。

[0222] 实施例2：给予ENT和抗-SEMA4D抗体增加存活，降低肿瘤生长，并增加完全消退的频率

[0223] 将Colon26细胞(500,000个细胞)经皮下植入Balb/c小鼠。采用以下物质处理小鼠：1)对照Ig(10mg/kg，每周x 5周，在第2天开始(n＝12))；2)对照Ig(10mg/kg，每周x 5周，在第2天开始)和ENT(20mg/kg,3x/周x 2周，当平均肿瘤体积为约250mm3时起始)(n＝9)；3)抗-SEMA4D/MAb 67(10mg/kg，腹膜内，每周x 5周，在第2天开始)(n＝8)；或4)抗-SEMA4D/MAb 67(10mg/kg，每周x 5周，在第2天开始)和ENT(20mg/kg,3x/周x 2周，当平均肿瘤体积为约250mm3时起始)(n＝13)。对照和实验组中的肿瘤体积在治疗时相似。显示各组的平均肿瘤体积、Kaplan-Meier存活曲线和完全肿瘤消退的频率。统计学显著性分别使用双因素ANOVA、Mantel Cox对数秩检验和费舍尔精确检验确定。Prism报告结果，P>0.05时为不显著(ns)，0.01

[0224] 接受ENT和抗-SEMA4D/MAb 67的小鼠展现出最大的705％TGD，而用抗-SEMA4D/MAb67处理的小鼠显示肿瘤生长的119％延迟(图3A)。ENT和抗-SEMA4D/MAb 67的联合治疗相较于对照Ig和ENT处理组(25％*)还增加了完全肿瘤消退的频率(62％**)(图3B-3D)。此外，接受ENT和抗-SEMA4D/MAb 67的小鼠相较于采用对照Ig(P<0.001)或对照Ig和ENT(p<
0.01)处理的小鼠显示显著改善的存活(图3E)。这些结果证明，采用ENT和抗-SEMA4D MAb的联合治疗导致增强的存活，降低的肿瘤生长，和肿瘤的消退。

[0225] 实施例3：给予氮杂胞苷(AZA)和抗-SEMA4D抗体增加存活，显著延迟肿瘤生长，并增加完全肿瘤消退

[0226] AZA和抗-SEMA4D MAb的联合给药对存活、肿瘤生长和肿瘤消退的作用在肿瘤小鼠模型中测试。将Colon26细胞(500,000个细胞)经皮下植入Balb/c小鼠。采用以下物质处理小鼠：组1：对照Ig(10mg/kg，腹膜内，每周x 4，在第2天开始(n＝12))；组2：抗-SEMA4D/MAb 67(10mg/kg，腹膜内，每周x 4，在第2天开始(N＝8))；组3：对照Ig(10mg/kg，腹膜内，每周x
4，在第2天开始+AZA(0.8mg/kg,3x/周X 4剂量，在第22-24天开始，当平均肿瘤体积为约
3
200mm时(n＝10))；和组4：抗-SEMA4D/MAb 67(10mg/kg，腹膜内，每周x 4，在第2天开始+AZA(0.8mg/kg,3x/周X 4剂量，在第22-24天开始，当平均肿瘤体积为约200mm3时(n＝9))。
实验设计示于图4。监测小鼠60天或直至肿瘤体积达到约1,500mm3。

[0227] 对照和实验组中的肿瘤体积在治疗时相似。进行Kaplan-Meier存活曲线分析以评估存活功能，测量肿瘤体积的变化以确定肿瘤生长速率，而完全肿瘤消退的频率通过确定无肿瘤的小鼠的百分比确定。统计学显著性这样确定，Mantel Cox对数秩检验用于存活，双因素ANOVA用于肿瘤体积，而费舍尔精确检验用于完全肿瘤消退。Prism报告结果，P>0.05时为不显著(ns)，0.01

[0228] 接受AZA和抗-SEMA4D/MAb 67的小鼠显示最大的705％TGD，而用抗-SEMA4D/MAb67处理的小鼠显示肿瘤生长的119％延迟(图5A)。AZA和抗-SEMA4D/MAb 67处理的小鼠相较于对照小鼠显示显著改善的存活(p<0.001)，并且相较于单物质抗-SEMA4D/MAb 67处理的小鼠显示几乎显著改善的存活(p＝0.0697)(图5B)。此外，AZA和抗-SEMA4D/MAb 67的联合治疗相较于对照Ig(17％)显著增加完全肿瘤消退的频率至78％(p<0.01)(图5C)。这些结果证明，采用AZA和抗-SEMA4D MAb的治疗改善了存活，降低了肿瘤生长，并导致较大的已建立肿瘤的消退。

[0229] 本公开的广度和范围不应受限于上述任何示例性实施方式，而应仅根据所附权利要求书及其等同内容来定义。

[0230] 表4：序列

[0231]

标题	发布/更新时间	阅读量
重定向T细胞以治疗HIV感染的方法	2020-05-20	157
新型高亲和性肿瘤杀伤细胞(T-AK细胞)制剂	2020-05-21	221
一种CD40联合PD-L及细胞因子扩增PBMC的方法	2020-05-21	926
用于过继细胞治疗的工程改造的细胞	2020-05-11	445
用于过继细胞疗法的肿瘤浸润淋巴细胞	2020-05-20	709
作为早期治疗选择的过继细胞疗法	2020-05-11	743
分离、培养和遗传工程改造用于过继治疗的免疫细胞群的方法	2020-05-13	857
个性化癌症疫苗和过继免疫细胞治疗	2020-05-12	81
使用精氨酸耗竭剂的组合癌症免疫疗法	2020-05-18	964
过继细胞转移与溶瘤病毒组合疗法	2020-05-17	45

用脑信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症

用脑信号蛋白-4D抗体联合表观遗传调节剂治疗癌症

背景技术

具体实施方式

该功能需要专业版企业版VIP权限，您可以：