经过修饰的T细胞及其制备和使用方法
阅读：15发布：2020-10-05
专利汇可以提供经过修饰的T细胞及其制备和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了经过修饰的原代人类T细胞和其群体，其包含如下基因组，其中CTLA4、PD1、TCRA、TCRB和/或B2M基因已经被编辑以从同种异体健康供体产生现成的通用CAR T细胞，所述现成的通用CAR T细胞可施用于任何患者同时减少或消除免疫排斥或移 植物 抗宿主 疾病 的 风 险，并且不易于经受T细胞抑制；和用于所述细胞的同种异体施用以减少当所述细胞被施用于需要所述细胞的受试者时所述细胞将触发宿主免疫反应的可能性的方法。，下面是经过修饰的T细胞及其制备和使用方法专利的具体信息内容。
1.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：
(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；
(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；
(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或
(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性；和
各细胞任选地包含：
(e)(i)至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位；或编码所述至少一种嵌合抗原受体的外源核酸，和/或
(e)(ii)至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。
2.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：
(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或
(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
3.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：
(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第一连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失；和/或
(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第二连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第二对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。
4.如权利要求3所述的细胞，其中所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
5.如权利要求2至4中任一项所述的细胞，其进一步包含：
(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或
(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。
6.如权利要求5所述的细胞，其中所述基因组DNA的第三连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第三对具有选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9545组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失，和/或
其中所述基因组DNA的第四连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第四对具有选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。
7.如权利要求6所述的细胞，其中所述第三对核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573，和/或其中所述第四对核糖核酸包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。
8.如权利要求2至7中任一项所述的细胞，其进一步包含：
(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。
9.如权利要求8所述的细胞，其中所述基因组DNA的第五连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第五对具有选自包含SEQ ID NO:766-
780和10574-13257的组的序列的核糖核酸接触而缺失。
10.如权利要求9所述的细胞，其中所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
11.如权利要求2至10中任一项所述的细胞，其进一步包含嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的外源核酸。
12.如权利要求11所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
13.如权利要求2至12中任一项所述的细胞，其进一步包含至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。
14.如权利要求1至13中任一项所述的细胞，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。
15.如权利要求1至14中任一项所述的细胞，其中所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
16.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：
(a)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；
(b)编辑所述细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；
(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或
(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性；和任选地包括
(e)(i)使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位，和/或
(e)(ii)使所述细胞表达至少一种蛋白质，所述蛋白质调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应，
其中(a)-(d)中的所述编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸，和在(a)中至少一个第一对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第一连接延伸段，
在(b)中至少一个第二对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第二连接延伸段，
在(c)(i)中至少一个第三对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第三连接延伸段，和/或
在(c)(ii)中至少一个第四对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第四连接延伸段，和
在(d)中至少一个第五对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第五连接延伸段。
17.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：
(a)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或
(b)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
18.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：
(a)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，并且减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或
(b)使原代人类T细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第二对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，并且减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
20.如权利要求17至19中任一项所述的方法，其进一步包括：
(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。
21.如权利要求20所述的方法，其中(c)(i)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第三对具有选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列的核糖核酸接触，和/或
其中(c)(ii)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第四对具有选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触。
22.如权利要求21所述的方法，其中所述第三对核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573，和/或其中所述第四对核糖核酸包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。
23.如权利要求17至22中任一项所述的方法，其进一步包括：(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。
24.如权利要求23所述的方法，其中(d)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和第五对具有选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列的核糖核酸接触。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
26.如权利要求17至25中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
27.如权利要求17至26中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞表达至少一种蛋白质，当所述细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质调节在所述相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。
28.如权利要求16至27中任一项所述的方法，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。
29.如权利要求16至28中任一项所述的方法，其中所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
30.一种组合物，其包含如权利要求1至15中任一项所述或根据如权利要求16至29中任一项所述的方法产生的细胞。
31.一种治疗有需要的患者的方法，所述方法包括：
(a)(i)将如权利要求1至15中任一项所述的经过修饰的T细胞施用于需要所述细胞的患者；
(a)(ii)将根据如权利要求16至29中任一项所述的方法产生的经过修饰的T细胞施用于需要所述细胞的患者；或
(a)(iii)将如权利要求30所述的组合物施用于需要所述细胞的患者。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述治疗包含过继性免疫疗法。
33.如权利要求30或31所述的方法，其进一步包括在所述施用步骤之前使所述经过修饰的T细胞扩增。
34.如权利要求30至33中任一项所述的方法，其中所述患者患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症。
35.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含：
(a)编码Cas蛋白的核酸序列；
(b)至少一种选自由以下组成的组的核糖核酸序列：
(i)SEQ ID NO:1-195和797-3637；
(ii)SEQ ID NO:196-531和4047-8945；
(iii)SEQ ID NO:532-609和9102-9750；
(iv)SEQ ID NO:610-765和9798-10532；
(v)SEQ ID NO:766-780和10574-13257；和
(vi)(i)-(v)的组合。
36.如权利要求35所述的组合物，其中(b)中的所述核糖核酸序列对选自由以下组成的组：
(i)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72；
(ii)SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421；
(iii)SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573；
(iv)SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662；
(v)SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778；和
(vi)(i)-(v)的组合。
37.如权利要求34或35所述的组合物，其进一步包含编码可检测的标记物的核酸序列。
38.如权利要求34至37中任一项所述的组合物，其中所述Cas蛋白包含Cas9蛋白或其功能部分。
39.如权利要求34至38中任一项所述的组合物，其进一步包含可操作性连接至所述嵌合核酸的启动子，所述启动子为了使在人类细胞中的表达增加而经过优化，其中所述启动子选自由巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子和泛素启动子组成的组。
40.如权利要求34至39中任一项所述的组合物，其中所述嵌合核酸包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、
5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
41.如权利要求34至40中任一项所述的组合物，其中所述编码Cas蛋白的核酸包含编码Cas9蛋白的信使RNA(mRNA)。
42.如权利要求41所述的组合物，其中所述mRNA包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
43.一种用于改变细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述CTLA4多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶CTLA4多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶CTLA4多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组。
45.如权利要求43或44所述的方法，其中所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72。
46.一种用于改变细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述PD1多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶PD1多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶PD1多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组。
48.如权利要求45或46所述的方法，其中所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
49.一种用于改变细胞中的标靶TCRA多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRA多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRA多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRA多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组。
51.如权利要求49或50所述的方法，其中所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573。
52.一种用于改变细胞中的标靶TCRB多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRB多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRB多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRB多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组。
54.如权利要求52或53所述的方法，其中所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。
55.一种经过修饰的原代人类T细胞，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：
(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:3638-
4046组成的组的序列的核糖核酸接触而被编辑以减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或
(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的第二核糖核酸接触而被编辑以减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
56.如权利要求55所述的细胞，其进一步包含：
(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑，和/或
(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。
57.如权利要求56所述的细胞，其中基因组DNA的第三连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的第三核糖核酸接触而被编辑，和/或
其中基因组DNA的第四连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的第四核糖核酸接触而被编辑。
58.如权利要求55至57中任一项所述的细胞，其进一步包含：
(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。
59.如权利要求58所述的细胞，其中基因组DNA的第五连接延伸段已经通过使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的第五核糖核酸接触而被编辑。
60.如权利要求55至59中任一项所述的细胞，其进一步包含嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的外源核酸。
61.如权利要求60所述的细胞，其中所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
62.如权利要求55至61中任一项所述的细胞，其进一步包含至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。
63.如权利要求55至62中任一项所述的细胞，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。
64.如权利要求55至63中任一项所述的细胞，其中所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
65.一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括：
(a)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列的第一核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；
和/或
(b)使原代人类T细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的第二核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
66.如权利要求65所述的方法，其进一步包括：
(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。
67.如权利要求66所述的方法，其中(c)(i)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的第三核糖核酸接触，和/或
其中(c)(ii)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的第四核糖核酸接触。
68.如权利要求65至67中任一项所述的方法，其进一步包括：(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。
69.如权利要求68所述的方法，其中(d)中的所述编辑包含使所述细胞与所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的所述核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的第五核糖核酸接触。
70.如权利要求65至69中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
71.如权利要求65至70中任一项所述的方法，其进一步包括使所述细胞表达至少一种蛋白质，当所述细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质调节在所述相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。
72.如权利要求65至71中任一项所述的方法，其中所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。
73.如权利要求65至72中任一项所述的方法，其中所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
74.一种组合物，其包含如权利要求55至64中任一项所述或根据如权利要求65至73中任一项所述的方法产生的细胞。
75.一种包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含：
(a)编码Cas蛋白的核酸序列；
(b)选自由以下组成的组的核糖核酸序列：
(i)SEQ ID NO:3638-4046；
(ii)SEQ ID NO:8946-9101；
(iii)SEQ ID NO:9751-9797；
(iv)SEQ ID NO:10533-10573；
(v)SEQ ID NO:13258-13719；和
(vi)(i)-(v)的组合。
76.如权利要求75所述的组合物，其进一步包含编码可检测的标记物的核酸序列。
77.如权利要求75至76中任一项所述的组合物，其中所述Cas蛋白包含Cpf1蛋白或其功能部分。
78.如权利要求75至77中任一项所述的组合物，其进一步包含可操作性连接至所述嵌合核酸的启动子，所述启动子为了使在人类细胞中的表达增加而经过优化，其中所述启动子选自由巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子和泛素启动子组成的组。
79.如权利要求75至78中任一项所述的组合物，其中所述嵌合核酸包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、
5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
80.如权利要求75至79中任一项所述的组合物，其中所述编码Cas蛋白的核酸包含编码Cpf1蛋白的信使RNA(mRNA)。
81.如权利要求80所述的组合物，其中所述mRNA包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
82.一种用于改变细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述CTLA4多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶CTLA4多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶CTLA4多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组。
83.一种用于改变细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述PD1多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶PD1多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶PD1多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:8946-
9101组成的组。
84.一种用于改变细胞中的标靶TCRA多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRA多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRA多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRA多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:
9751-9797组成的组。
85.一种用于改变细胞中的标靶TCRB多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRB多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRB多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRB多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:
10533-10573组成的组。
86.一种经过修饰的原代人类T细胞，其包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：
(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；
(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；
(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性，和/或
(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和
(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性；
各细胞任选地包含：
(e)(i)至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位；或编码所述至少一种嵌合抗原受体的外源核酸，和/或
(e)(ii)至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白的外源核酸。
经过修饰的T细胞及其制备和使用方法
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求2015年3月27日提交的美国临时申请号62/139,479的权益，所述美国临时申请的完整教义以引用的方式并入本文中。
[0003] 政府支持
[0004] 本发明在政府支持下以由美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授权的R01DK097768进行。美国政府享有本发明的权利。
[0005] 发明背景
[0006] 使用嵌合抗原受体(CAR)的T细胞疗法代表了癌症免疫疗法(例如，过继性免疫疗法)的重大突破并且作为尤其用于病毒和真菌感染的新治疗形式。数种障碍目前妨碍了CAR T疗法的安全翻译，如内源T细胞受体(TCR)的自身反应性风险、癌细胞或受感染细胞对T细胞的抑制和对自体T细胞移植物的依赖。
[0007] 发明概述
[0008] 需要经过修饰的T细胞和制备和使用所述T细胞的方法，所述T细胞克服了内源TCR的自身反应性、T细胞抑制，还使得能够将同种异体T细胞用于CAR T疗法。本发明针对解决这种需要并且具有其它所需特征的其它解决方法。本发明使用基因组编辑，如CRISPR和/或TALEN系统，来去除上述障碍。在CRISPR/Cas系统中，Cas蛋白可为例如Cas9或Cpf1。例如，为了克服自身反应性，本文中详述的工作设计并且测试了靶向TCRa和TCRb链的CRISPR/Cas指导RNA(gRNA)并且证明了Jurkat T细胞中和原代人类T细胞中的高中靶活性和TCR表面表达的损失。归因于基因组编辑(例如，使用CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1系统)的多重能力，TCRa和/或TCRb也可与其它分子(例如，B2M、CTLA4、PD-1)组合被靶向以克服T细胞抑制并且使得能够进行CAR T疗法。本发明的组合物和方法适用于临床翻译并且改进现有和新兴的基于T细胞的疗法(例如，过继性免疫疗法)。
[0009] 在一些实施方案中，本发明针对包含经过修饰的基因组的经过修饰的原代人类T细胞，所述细胞包含第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被切割、编辑，例如以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被切割或编辑，例如以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被切割或编辑，例如以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被切割或编辑，例如以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被切割或编辑，例如以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的B2M表达或活性和/或MHC I类分子表面表达和/或活性；并且各细胞任选地包含：(i)至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位，或编码所述至少一种嵌合抗原受体的外源核酸，和/或(ii)至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应，或编码所述蛋白的外源核酸。
[0010] 在一些实施方案中，本发明针对包含经过修饰的基因组的经过修饰的原代人类T细胞，所述细胞包含第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0011] 在一些实施方案中，本发明针对包含经过修饰的基因组的经过修饰的原代人类T细胞，所述细胞包含第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第一连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失；和/或第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的第二连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第二对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。
[0012] 在一些实施方案中，所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
[0013] 在某些实施方案中，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。
[0014] 在一些实施方案中，所述基因组DNA的第三连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第三对具有选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9545组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失，和/或其中所述基因组DNA的第四连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第四对具有选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。在某些方面，所述第三对核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573，和/或其中所述第四对核糖核酸包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。
[0015] 在某些实施方案中，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在某些方面，所述基因组DNA的第五连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第五对具有选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。在一些实施方案中，所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
[0016] 在一些实施方案中，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的外源核酸。例如，所述嵌合抗原受体可特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
[0017] 在某些实施方案中，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应，或编码所述蛋白的外源核酸。在一些方面，所述T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。在某些方面，所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
[0018] 还公开了用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括(a)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；(b)编辑所述细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性；(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性；和(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性；和任选地(e)(i)使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位，和/或(e)(ii)使所述细胞表达至少一种蛋白质，所述蛋白质调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应，其中(a)-(d)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸，和在(a)中至少一个第一对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第一连接延伸段，在(b)中至少一个第二对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第二连接延伸段，在(c)(i)中至少一个第三对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第三连接延伸段，和/或在(c)(ii)中至少一个第四对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第四连接延伸段，和在(d)中至少一个第五对指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的第五连接延伸段。
[0019] 本文还公开了用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括(a)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；
和/或(b)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
和/或(b)编辑原代人类T细胞中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0020] 本文还公开了用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括(a)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第一对具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，并且减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第二对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，并且减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0021] 在一些方面，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法进一步包括(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在某些方面，(c)(i)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第三对具有选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列的核糖核酸接触，和/或其中(c)(ii)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第四对具有选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触。
[0022] 在一些方面，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法进一步包括(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在某些方面，(d)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和第五对具有选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列的核糖核酸接触。
[0023] 在本文所公开的本发明的某些方面中，所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72，并且其中所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。在本文所公开的本发明的某些方面中，所述第三对核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573，和/或其中所述第四对核糖核酸包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。在本文所公开的本发明的某些方面中，所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
[0024] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法进一步包括使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
[0025] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法进一步包括使所述细胞表达至少一种蛋白质，当所述细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质调节在所述相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。
[0026] 在本文所公开的本发明的某些方面中，T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。在本文所公开的本发明的某些方面中，所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
[0027] 本文还公开了治疗有需要的患者的方法，所述方法包括(a)(i)将根据技术方案1至15中任一项的经过修饰的T细胞施用于需要所述细胞的患者；(a)(ii)将根据技术方案16至29中任一项的方法产生的经过修饰的T细胞施用于需要所述细胞的患者；或(a)(iii)将根据技术方案30的组合物施用于需要所述细胞的患者。例如，所述治疗可包含过继性免疫疗法。
[0028] 在一些实施方案中，所述用于治疗患者的方法进一步包括在所述施用步骤之前使所述经过修饰的T细胞扩增。在一些方面，所述患者患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症。
[0029] 本文还公开了包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含(a)编码Cas蛋白的核酸序列；和(b)至少一种选自由以下组成的组的核糖核酸序列：(i)SEQ ID NO:1-195和797-3637；(ii)SEQ ID NO:196-531和4047-8945；(iii)SEQ ID NO:532-609和9102-9750；(iv)SEQ ID NO:610-765和9798-10532；(v)SEQ ID NO:766-780和10574-13257；和(vi)(i)-(v)的组合。例如，(b)中的所述核糖核酸序列对选自由以下组成的组：(i)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72；(ii)SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421；(iii)SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573；
(iv)SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662；(v)SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778；和(vi)(i)-(v)的组合。
(iv)SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662；(v)SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778；和(vi)(i)-(v)的组合。
[0030] 在一些实施方案中，所述包含嵌合核酸的组合物进一步包含编码可检测的标记物的核酸序列。在一些实施方案中，所述包含嵌合核酸的组合物进一步包含可操作性连接至所述嵌合核酸的启动子，所述启动子为了使在人类细胞中的表达增加而经过优化，其中所述启动子选自由巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子和泛素启动子组成的组。
[0031] 在一些方面，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白或其功能部分。例如，所述编码Cas蛋白的核酸包含编码Cas9蛋白的信使RNA(mRNA)。在某些方面，所述mRNA包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。在本发明的某些方面，所述嵌合核酸包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
[0032] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述CTLA4多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶CTLA4多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶CTLA4多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组。在某些方面，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组。例如，所述两种核糖核酸可包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72。
[0033] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述PD1多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶PD1多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶PD1多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组。在某些方面，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组。例如，所述两种核糖核酸可包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
[0034] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶TCRA多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRA多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRA多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRA多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组。在某些方面，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组。例如，所述两种核糖核酸可包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573。
[0035] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶TCRB多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRB多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRB多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRB多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组。在某些方面，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组。例如，所述两种核糖核酸可包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。
[0036] 在一些实施方案中，本发明针对经过修饰的原代人类T细胞，各细胞包含经过修饰的基因组，所述细胞包含(a)第一基因组修饰，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列的核糖核酸接触而被编辑以减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)第二基因组修饰，其中染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的第二核糖核酸接触而被编辑以减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0037] 在一些实施方案中，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含(c)(i)第三基因组修饰，其中染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因已经被编辑，和/或(c)(ii)第四基因组修饰，其中染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因已经被编辑，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在一些方面，所述基因组DNA的第三连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的第三核糖核酸接触而被编辑，和/或其中所述基因组DNA的第四连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的第四核糖核酸接触而被编辑。
[0038] 在一些实施方案中，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含(d)第五基因组修饰，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经被编辑，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在某些方面，所述基因组DNA的第五连接延伸段已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的第五核糖核酸接触而被编辑。
[0039] 在一些方面，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的外源核酸。在某些方面，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
[0040] 在一些方面，所述经过修饰的原代人类T细胞进一步包含至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应，或编码所述蛋白的外源核酸。
[0041] 本文还公开了用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法，所述方法包括(a)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列的第一核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)使原代人类T细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的第二核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0042] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括(c)(i)编辑所述细胞中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因，和/或(c)(ii)编辑所述细胞中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在某些方面，(c)(i)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的第三核糖核酸接触，和/或其中(c)(ii)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的第四核糖核酸接触。
[0043] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括(d)编辑所述细胞中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在某些方面，(d)中的编辑包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的第五核糖核酸接触。
[0044] 在一些实施方案中，所述方法进一步包括使所述细胞表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
[0045] 在一些实施方案中，本文所公开的方法进一步包括使所述细胞表达至少一种蛋白质，当所述细胞接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质调节在所述相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。
[0046] 在本文所公开的本发明的某些实施方案中，T细胞选自由细胞毒性T细胞、辅助性T细胞、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞和其组合组成的组。在本文所公开的本发明的某些实施方案中，所述细胞是获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
[0047] 本文还公开了包含本文所公开的本发明的细胞或根据本文所公开的本发明的方法产生的细胞的组合物。
[0048] 本文还公开了包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含：(a)编码Cas蛋白的核酸序列；(b)选自由以下组成的组的核糖核酸序列：(i)SEQ ID NO:3638-4046；(ii)SEQ ID NO:8946-9101；(iii)SEQ ID NO:9751-9797；(iv)SEQ ID NO:10533-10573；(v)SEQ ID NO:13258-13719；和(vi)(i)-(v)的组合。
[0049] 在一些实施方案中，所述嵌合核酸进一步包含编码可检测的标记物的核酸序列。在本文所公开的本发明的一些方面，所述Cas蛋白包含Cpf1蛋白或其功能部分。例如，所述编码Cas蛋白的核酸可包含编码Cpf1蛋白的信使RNA(mRNA)。在某些方面，所述mRNA包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-
5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
[0050] 在一些实施方案中，所述嵌合核酸包含至少一种选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的经过修饰的核苷酸。
[0051] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述CTLA4多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶CTLA4多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶CTLA4多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组。
[0052] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述PD1多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶PD1多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶PD1多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组。
[0053] 还公开了用于改变细胞中的标靶TCRA多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRA多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRA多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRA多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组。
[0054] 本文还公开了用于改变细胞中的标靶TCRB多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRB多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRB多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRB多核苷酸序列被切割，并且其中所述核糖核酸选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组。
[0055] 本发明的以上所论述的和多种其它特征和伴随的优势将通过参考本发明的以下详述而变得更好理解。
[0057] 本发明的这些和其它特征将通过参考以下详述以及附图而更充分地加以理解。所述专利或申请文件含有至少一个以彩色制成的图。这一具有彩色图的专利或专利申请公布的拷贝将由事务所在必要费用的要求和支付后提供。
[0058] 图1是使用肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继性免疫疗法的示意图。T细胞是从肿瘤分离，离体扩增并且随后再输注至患者中以靶向肿瘤细胞。由于肿瘤环境不支持充足T细胞增殖，这种方法使得T细胞能够被活化并且离体增殖，随后再引入以在肿瘤上安装免疫攻击(Restifo等人,2012)。
[0059] 图2是三代CAR T细胞的示意图。以绿色示出决定抗原特异性的肿瘤相关抗原(TAA)结合域。所述细胞内域并入了TCR转导机构的不同方面：(CD3ζ链/ZAP70)、蓝色(CD28/PI3K)和黄色(4-1BB或OX40/TRAF)(改编自Casucci和Bondanza,2011)。
[0060] 图3是T细胞活化和抑制机制的示意图。虚线箭头指示了通过MHC-TCR和CD28-B7相互作用进行的T细胞活化。实心箭头表示通过CTLA4和PD1对T细胞介导的抑制作用。B7-1和B7-2分别为CD80和CD86(改编自Drake等人,C.G,2014)。
[0061] 图4示出了Cas蛋白的示例性氨基酸序列。黄色突出显示指示了Ruv-C样域。加下划线指示了HNH核酸酶域。
[0063] 图6示出了适用于使用Cas9靶向PD1基因的示例性gRNA序列。在实验性实施例中描述的gRNA以红色文字被鉴别。
[0064] 图7示出了适用于使用Cas9靶向TCRα基因座的示例性gRNA序列。在实验性实施例中描述的gRNA以红色文字被鉴别。
[0065] 图8示出了适用于使用Cas9靶向人类TCRβ基因座的示例性gRNA序列。在实验性实施例中描述的gRNA以红色文字被鉴别。
[0066] 图9示出了适用于使用Cas9靶向并且编辑人类B2M基因的示例性gRNA序列。
[0067] 图10证明了本发明的示例性TCR靶向策略。图10是描绘分别靶向TCRα和TCRβ链的第一编码外显子的CRISPR gRNA的位置的示意图。
[0068] 图11A和图11B证明了Jurkat T细胞中的T细胞受体的缺失。图11A描绘了使用抗CD3抗体的FACS分析的结果，所述分析披露了稳定地表达Cas9核酸酶的Jurkat T细胞中的成功TCR缺失。图11B示出了SURVEYORTM分析的结果，确认了在TCRa和TCRb基因座处的切割。
[0069] 图12A和图12B证明了原代人类CD3+T细胞中的TCR缺失。图12A示出了SURVEYORTM分析的结果，证明了在获自两种独立供体的CD3+T细胞中的TCRa和TCRb基因座处的CRISPR切割。图12B示出了通过FACS分析证明的TCR表面表达的损失。
[0070] 图13A、图13B和图13C证明了本发明的示例性PD-1基因座靶向策略。图13A是所述PD-1靶向策略的示意图。图13B证明了所述双重CRISPR策略通过靶向HEK293T细胞中的PD-1基因座的两种CRISPR引起切割。图13C是测序的示意图，所述测序确认了在靶向PD-1基因(PDCD1)的两种CRISPR的转染之后在PD-1基因座中的预测缺失，如参考SEQ ID NO:793和794所示。
[0071] 图14A和图14B证明了Jurkat T细胞中的PD-1表达的损失。图14A示出了FACS分析的结果，证明了在活化的Jurkat T细胞中的PD-1表达的损失。图14B示出了SURVEYORTM分析的结果，确认了在PD-1基因座处的切割。
[0072] 图15A、图15B和图15C证明了本发明的示例性CTLA4基因座靶向策略。图15A是所述CTLA4靶向策略的示意图。图15B证明了所述双重CRISPR策略通过靶向HEK293T细胞中的CTLA4基因座的两种CRISPR引起切割。图15C是测序的示意图，所述测序确认了在靶向CTLA4基因(CTLA4)的两种CRISPR的转染之后在CTLA4基因座中的预测缺失，如参考SEQ ID NO:795和796所示。
[0073] 图16A和图16B证明了在Jurkat T细胞中的CTLA-4基因座处的切割。图16A证明了所述双重CRISPR策略通过靶向Jurkat T细胞中的CTLA4基因座的两种CRISPR引起切割。图16B示出了SURVEYORTM分析的结果，证明了在Jurkat T细胞中通过两种CTLA4CRISPR成功切割。
[0074] 图17示出了适用于使用Cpf1靶向CTLA4基因的示例性gRNA序列。
[0075] 图18示出了适用于使用Cpf1靶向PD1基因的示例性gRNA序列。
[0076] 图19示出了适用于使用Cpf1靶向TCRα基因座的示例性gRNA序列。
[0077] 图20示出了适用于使用Cpf1靶向人类TCRβ基因座的示例性gRNA序列。
[0078] 图21示出了适用于使用Cpf1靶向并且编辑人类B2M基因的示例性gRNA序列。
[0079] 图22证明了在293T细胞中所选择的指导的B2M缺失效率。在所述Surveyor分析中的箭头示出了核酸酶切割键。
[0080] 图23证明了在293T细胞中当用AsCpf1和指导crB2M转染时B2M表面表达的比较。
[0081] 图24证明了在293T细胞中当用LbCpf1和指导crB2M转染时B2M表面表达的比较。
[0082] 图25描绘了Cpf1crRNA设计和克隆信息。
[0083] 图26A、图26B、图26C、图26D、图26E、图26F和图26G证明了使用TALEN产生并且表征B2M KO JEG3细胞。图26A描绘了B2M TALEN的设计和诱导的突变。图26B描绘了在转录物和蛋白质层面上对B2M的分析。图26C证明了在表面表达层面上对B2M的分析。图26D证明了ΔB2M克隆缺乏MHC-I表面表达。图26E证明了ΔB2M克隆缺乏HLA-G表面表达。图26F证明了ΔB2M克隆缺乏HLA-C表面表达。图26G证明了ΔB2M克隆缺乏HLA-E表面表达。
[0084] 所述专利或申请文件含有至少一个以彩色制成的图。这一具有彩色图的专利或专利申请公布的拷贝将由事务所在必要费用的要求和支付后提供。
[0085] 发明详述
[0086] T细胞疗法正在作为癌症免疫疗法的重大突破出现并且目前有数项临床试验使用经过修饰的T细胞，主要在B细胞恶性肿瘤的治疗中。T细胞可进行遗传学修饰以表达具有源于单克隆抗体的可变域的特异性的肿瘤特异性嵌合抗原受体(CAR)，因此以主要组织相容性复合体(MHC)非限制性方式使免疫反应性集中针对所述肿瘤。
[0087] 尽管有这些早期成功，现有CAR T疗法仍存在数种障碍。主要障碍是内源T细胞受体(TCR)的持续存在，所述受体当以高剂量施用于患者时防止CAR T细胞的同种异体移植，并且如果所述细胞与自身抗原具有交叉反应性，即使所述细胞被归还给同一患者，也可导致自身免疫攻击。T细胞疗法中的第二种障碍在于肿瘤和病毒具有演化的机制以通过开发T细胞活性的关键检查点调节剂来抑制T细胞。本发明利用如CRISPR/Cas或TALEN系统的遗传编辑系统的潜能来克服防止这种新的治疗选项安全翻译至诊所的上述障碍。具体说来，本文所述的工作证明了从同种异体健康供体产生现成的通用CAR T细胞的可行性，所述现成的通用CAR T细胞可施用于任何患者而无免疫排斥或移植物抗宿主疾病(GvHD)的风险并且不易于经受T细胞抑制。此外，本文所述的工作证明了开发有效地靶向内源TCR的CRISPR指导序列(gRNA)，以及T细胞活性的关键检查点调节剂是可行的。本文所述的工作提供了gRNA，所述gRNA经过设计和测试以：(1)通过靶向编码TCRα和β链的基因来防止自身反应性；(2)通过靶向TCR和B2M基因来破坏同种屏障；和/或(3)通过靶向检查点抑制剂PD-1和CTLA4来克服自身反应性。
[0088] 本发明涵盖以熟练技术人员可用的任何方式，例如使用TALEN或CRISPR/Cas系统来改变标靶多核苷酸序列。所述CRISPR/Cas系统可使用多种Cas蛋白(Haft等人PLoS Comput Biol.2005；1(6)e60)。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR I型系统。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR II型系统。在一些实施方案中，所述CRISPR/Cas系统为CRISPR V型系统。应理解，尽管本文中详细描述了使用CRISPR/Cas(例如，Cas9和Cpf1)和TALEN的方法的实例，但本发明不限于使用这些方法/系统。本文中可使用熟练技术人员已知的靶向多核苷酸序列以减少或消除标靶细胞中的表达的其它方法。
[0089] 根据本发明的方法，细胞中的一个或多个标靶多核苷酸序列发生改变，例如经过修饰或切割。本发明涵盖出于任何目的改变细胞中的标靶多核苷酸序列，但尤其使得编码产物的表达或活性被减少或被消除。在一些实施方案中，细胞中的标靶多核苷酸序列发生改变以产生突变细胞。如本文所用，“突变细胞”是指具有不同于其原始表型的所产生表型的细胞。在一些情况下，“突变细胞”展现突变表型，例如当使用本发明的CRISPR/Cas系统使正常起作用的基因发生改变时。在其它情况下，“突变细胞”展现野生型表型，例如当使用CRISPR/Cas系统来校正突变表型时。在一些实施方案中，细胞中的标靶多核苷酸序列发生改变以校正或修复基因突变(例如，以使所述细胞恢复正常表型)。在一些实施方案中，细胞中的标靶多核苷酸序列发生改变以诱导基因突变(例如，以破坏基因或基因组元件的功能)。
[0090] 在一些实施方案中，所述改变为插入缺失。如本文所用，“插入缺失”是指由插入、缺失或其组合引起的突变。如本领域技术人员应了解，除非基因组序列的编码区中的插入缺失的长度为3的倍数，否则所述插入缺失将引起移码突变。在一些实施方案中，所述改变为点突变。如本文所用，“点突变”是指置换一个核苷酸的取代。CRISPR/Cas系统可用于在标靶多核苷酸序列中诱导任何长度的插入缺失或点突变。
[0091] 在一些实施方案中，所述改变导致所述标靶多核苷酸序列或其一部分的基因剔除。例如，基因剔除细胞中的标靶多核苷酸序列可出于治疗和研究目的两者体外、体内或离体执行。基因剔除细胞中的标靶多核苷酸序列可适用于治疗或预防与所述标靶多核苷酸序列的表达有关的病症(例如，通过离体基因剔除细胞中的突变等位基因并且将包含所述基因剔除的突变等位基因的那些细胞引入至受试者中)。如本文所用，“基因剔除”包括以干扰所述标靶多核苷酸序列或其表达产物的功能的方式使所述标靶多核苷酸序列的全部或一部分缺失。
[0092] 在一些实施方案中，所述改变导致所述标靶多核苷酸序列的减少的表达。术语“降低(decrease)”、“减少(reduced)”、“减少(reduction)”和“降低(decrease)”均用于本文中，一般意指降低达统计学显著量。然而，为避免疑义，“降低(decreased)”、“减少(reduced)”、“减少(reduction)”、“降低(decrease)”包括如与参考水平相比降低达至少10％，例如，如与参考水平相比降低达至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约
50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或高达并且包括100％降低(即，如与参考样品相比不存在水平)，或在10-100％之间的任何降低。
50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或高达并且包括100％降低(即，如与参考样品相比不存在水平)，或在10-100％之间的任何降低。
[0093] 术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”均用于本文中，一般意指增加达统计学显著量；为避免任何疑义，术语“增加(increased)”、“增加(increase)”或“增强(enhance)”或“活化(activate)”意指如与参考水平相比增加至少10％，例如，如与参考水平相比增加至少约20％，或至少约30％，或至少约40％，或至少约50％，或至少约60％，或至少约70％，或至少约80％，或至少约90％或高达并且包括100％增加或在10-100％之间的任何增加，或如与参考水平相比至少约2倍，或至少约3倍，或至少约4倍，或至少约5倍或至少约10倍增加，或在2倍与10倍之间或更大的任何增加。
[0094] 术语“统计学显著”或“显著地”是指统计学显著性并且一般意指低于所述标记物的正常或较低浓度两个标准差(2SD)。所述术语是指存在差异的统计证据。其被定义为当零假设实际上真实时作出不接受所述零假设的决定的可能性。所述决定通常使用p值作出。
[0095] 在一些实施方案中，所述改变为纯合改变。在一些实施方案中，所述改变为杂合改变。
[0096] 在一些实施方案中，所述改变导致将所述标靶多核苷酸序列从不需要的序列校正为所需序列。CRISPR/Cas系统可用于校正标靶多核苷酸序列中的任何类型的突变或误差。例如，CRISPR/Cas系统可用于插入归因于缺失而在标靶多核苷酸序列中缺少的核苷酸序列。CRISPR/Cas系统也可用于从标靶多核苷酸序列缺失或切除归因于插入突变的核苷酸序列。在一些情况下，CRISPR/Cas系统可用于用正确核苷酸序列置换不正确核苷酸序列(例如，以恢复归因于功能缺失型突变(即，SNP)而受损的标靶多核苷酸序列的功能)。
[0097] CRISPR/Cas系统可以令人惊讶的高效率改变标靶多核苷酸。在某些实施方案中，改变的效率为至少约5％。在某些实施方案中，改变的效率为至少约10％。在某些实施方案中，改变的效率为约10％至约80％。在某些实施方案中，改变的效率为约30％至约80％。在某些实施方案中，改变的效率为约50％至约80％。在一些实施方案中，改变的效率大于或等于约80％。在一些实施方案中，改变的效率大于或等于约85％。在一些实施方案中，改变的效率大于或等于约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％。在一些实施方案中，改变的效率等于约100％。
[0098] CRISPR/Cas系统可用于改变细胞中的任何标靶多核苷酸序列。本领域技术人员将容易地理解，在任何特定细胞中欲改变的所需标靶多核苷酸序列可对应于任何基因组序列，就所述基因组序列来说，其表达与病症有关或以其它方式促进病原体进入所述细胞中。例如，细胞中欲改变的所需标靶多核苷酸序列可为对应于含有疾病相关的单个多核苷酸多态性(SNP)的基因组序列的多核苷酸序列。在所述实例中，CRISPR/Cas系统可通过用野生型等位基因置换细胞中的所述疾病相关的SNP而用于校正所述SNP。作为另一实例，负责病原体进入或增殖至细胞中的标靶基因的多核苷酸序列可为用于缺失或插入以破坏所述标靶基因的功能从而防止病原体进入细胞中或在细胞内部增殖的合适标靶。
[0099] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为基因组序列。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为人类基因组序列。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为哺乳动物基因组序列。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为脊椎动物基因组序列。
[0100] 细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)
[0101] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为CTLA4，或其同系物、直系同源物或变体(基因ID：1493，还称作CD；GSE；GRD4；ALPS5；CD152；CTLA-4；IDDM12；CELIAC3)。示例性CTLA4人类标靶多核苷酸序列在下表1中示出(NG_011502.1RefSeqGene；SEQ ID NO:782)。
[0102]
[0103]
[0104]
[0105] 所述CTLA4基因为免疫球蛋白超家族成员并且其多核苷酸序列编码将抑制信号传送至T细胞的蛋白质。所述蛋白质具有V域、跨膜域和细胞质尾。已经表征了由交替剪接变体编码的多种同种型。膜结合的同种型充当由二硫键统一的同型二聚体，而可溶性同种型充当单体。CTLA4基因突变据报道已经与胰岛素依赖性糖尿病、格雷夫斯病、桥本甲状腺炎、乳糜泻、全身性红斑狼疮、甲状腺相关眼眶病和其它自身免疫疾病有关。
[0106] 在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体2上的CTLA4基因已经使用基因编辑系统(例如，TALEN、CRISPR/Cas等)被编辑以减少或消除所述细胞或其群体中的CTLA4表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体2上的CTLA4基因已经被编辑以例如从SEQ ID NO:782缺失基因组DNA的连接延伸段，由此减少或消除所述细胞或其群体中的CTLA4表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。所述基因组DNA的连接延伸段可通过使原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的至少一对核糖核酸(即CRISPRCTLA4 gRNA对，例如，至少一个gRNA对、至少两个gRNA对、至少三个gRNA对、至少四个gRNA对、至少五个gRNA对等)接触而缺失。
[0107] 如本文所用，术语“接触”(例如，使多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和/或核糖核酸接触)意图包括体外一起孵育细胞中的Cas蛋白和/或核糖核酸(例如，在培养物中添加所述Cas蛋白或编码所述Cas蛋白的核酸)或离体接触细胞。使标靶多核苷酸序列与如本文所公开的Cas蛋白和/或核糖核酸接触的步骤可以任何合适方式进行。例如，所述细胞可在贴壁培养物中，或在悬浮培养物中加以处理。应理解，与如本文所公开的Cas蛋白和/或核糖核酸接触的细胞也可同时或依序与另一试剂(如生长因子或其它分化试剂或环境)接触以稳定化所述细胞，或使所述细胞进一步分化。
[0108] 本公开涵盖减少或消除任何细胞系或原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)、其群体中的CTLA4表达和/或活性以产生减少或消除T细胞抑制的细胞。用于基因组编辑的原代人类细胞可获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。细胞也可获自并非患有所述病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、疑似患有所述病症或处于发展所述病症的增加的风险中的正常健康受试者。
[0109] 本发明涵盖基因组编辑原代人类细胞以切割CTLA4基因序列，以及编辑所述细胞的基因组以改变一个或多个额外标靶多核苷酸序列(例如，PD1、TCRA、TCRB、B2M等)。应理解，使用本文所述的一种或多种gRNA或gRNA对来切割CTLA4基因序列可导致CTLA4基因组DNA序列(例如，SEQ ID NO:782)的部分或完全缺失。
[0110] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)基因组修饰(例如，第一基因组修饰)，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性。
[0111] 本领域技术人员应理解，CTLA4基因组DNA的第一连接延伸段的缺失同样地可使用靶向CTLA4基因中的外显子的任何CRISPRgRNA对来实现，在所述CRISPR gRNA对中第一CTLA4 gRNA靶向停留在第二外显子上游的第一外显子，所述第二外显子在所述第一外显子下游。同样地，任何外显子对均可使用这一策略被靶向以导致基因组DNA的第一连接延伸段的切割，结果是因此被修饰的细胞的DNA修复机制使第一外显子中的CTLA4 gRNA切割位点上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于所述CTLA4 gRNA切割位点下游的所述基因组DNA的5’端。这一策略的实施例使用包含SEQ ID NO:128(CR1)和SEQ ID NO:72(CR2)的第一对核糖核酸在图15A和图15B中示出。在所述实施例中，所述第一对CTLA4 gRNA被示出靶向CTLA4基因的外显子2和外显子3。当然，CTLA4基因中的任何两个相邻外显子均可能使用这一策略被靶向(例如，外显子1和外显子2、外显子3和4)。应进一步理解，所述含有CTLA4标靶基序的CTLA4外显子中的任何部分均可使用这一策略被靶向，只要所述第一对CTLA4 gRNA的各CTLA4 gRNA指向所述相邻CTLA4外显子中的每一者中的一个CTLA4标靶基序。换句话说，为了实现所述策略，熟练人员仅需要从SEQ ID NO:1-195和797-3637中选择靶向第一外显子中的基序的CTLA4 gRNA，并且接着从SEQ ID NO:1-195和797-3637选择靶向在所述第一外显子上游或下游的第二(例如，相邻)外显子中的基序的第二CTLA4 gRNA。以这种方式，所述第一对gRNA将指导所述细胞中的Cas蛋白分别至第一和第二外显子，并且切割那些外显子以及内含子(或其间任何其它序列)，由此允许细胞的DNA修复机制共价地接合两个切割位点处的基因组DNA以产生具有缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的CTLA4基因的经过修饰的细胞或其群体。除了靶向相邻外显子，或作为替代，还可选择第一对gRNA以靶向CTLA4基因中的任何两个外显子(例如，外显子1和3、外显子1和4、外显子2和4等)，以致在那些外显子中的切割位点之间的基因组DNA序列缺失，并且侧接那些切割位点的基因组DNA序列共价地接合以产生具有缺乏所述基因组DNA的第一连接延伸段的CTLA4基因的经过修饰的细胞或其群体。
[0112] 下表2示出了在示例性人类CTLA4基因中四个外显子中的每一者的基因组序列。熟练技术人员可容易地使用本文中概述的CTLA4靶向策略以多种方式进行所述策略而从SEQ ID NO:1-195和SEQ ID NO 797-3637选择CTLA4 gRNA对以靶向下表2中示出的包含SEQ ID NO:783-786的外显子。或者，熟练技术人员可容易地使用本文中概述的CTLA4靶向策略以多种方式进行所述策略而从SEQ ID NO:3638-4046选择至少一种CTLA4 gRNA以靶向下表2中示出的包含SEQ ID NO:783-786的外显子。使用这一策略缺失的所述上游外显子的至少所述部分和所述下游外显子的至少所述部分的大小取决于其中所述CTLA4 gRNA指引各个别外显子中的切割的位置。例如，使用这一策略将缺失在所述上游外显子中的切割位点下游的所述外显子的整个部分和在所述下游外显子中的切割位点上游的所述外显子的整个部分。因此，可使用这一策略通过选择靶向最接近所述上游外显子的5’端和最接近相邻下游外显子的3’端的基序的CTLA4 gRNA而缺失所靶向的外显子的较大部分。相反地，可通过选择靶向最远离所述上游外显子的5’端和最远离相邻下游外显子的3’端的基序的CTLA4 gRNA而缺失所靶向的外显子的较小部分。
[0113] 表2
[0114]
[0115]
[0116]
[0117] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)基因组修饰(例如，第一基因组修饰)，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第一连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第一连接延伸段)已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和一对(例如，第一对)具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触而缺失。在一些实施方案中，所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72。
[0118] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述CTLA4多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸杂交至所述(例如)CTLA4多核苷酸序列并且将Cas蛋白指向所述标靶CTLA4多核苷酸序列的标靶基序，其中所述标靶CTLA4多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO.1-195和797-3637组成的组。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组。在一些实施方案中，所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72。
[0119] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(a)基因组修饰(例如，第一基因组修饰)，其中染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列的至少一种核糖核酸接触而被编辑以减少或消除所述细胞中的CTLA4受体表面表达和/或活性。
[0120] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述CTLA4多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶CTLA4多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶CTLA4多核苷酸序列被切割，并且其中所述至少一种核糖核酸选自由SEQ ID NO.3638-4046组成的组。在某些方面，所述细胞中的标靶CTLA4多核苷酸序列的后续改变导致所述标靶CTLA4多核苷酸序列的第二次切割，由此编辑所述标靶CTLA4多核苷酸序列以缺失基因组DNA的第一连接延伸段。
[0121] 程序性细胞死亡1(PD1)
[0122] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为PD1，或其同系物、直系同源物或变体(基因ID：5133，还称作PD-1、CD279、SLEB2、hPD-1、hPD-I和hSLE1)。示例性PD1人类标靶多核苷酸序列在下表3中示出(NG_012110.1RefSeqGene；SEQ ID NO:787)。
[0123]
[0124]
[0125]
[0126] 所述PD1基因编码免疫球蛋白超家族细胞表面膜蛋白，所述膜蛋白在祖B细胞中表达并且相信牵涉于其分化中。当小鼠注射抗CD3抗体时，这种基因的表达在小鼠中的胸腺中被诱导，导致大量胸腺细胞的细胞凋亡。还相信这种基因的产物在T细胞功能中至关重要并且在自身免疫疾病的预防中发挥作用。
[0127] 在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体2上的PD1基因已经使用基因编辑系统(例如，TALEN、CRISPR/Cas等)被编辑以减少或消除所述细胞或其群体中的PD1表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体2上的PD1基因已经被编辑以例如从SEQ ID NO:787缺失基因组DNA的连接延伸段，由此减少或消除所述细胞或其群体中的PD1表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。所述基因组DNA的连接延伸段可通过使原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和至少一对核糖核酸(即CRISPR PD1 gRNA对，例如，至少一个gRNA对、至少两个gRNA对、至少三个gRNA对、至少四个gRNA对、至少五个gRNA对等)接触而缺失，所述至少一对核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组。
[0128] 本公开涵盖减少或消除任何细胞系或原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)、其群体中的PD1表达和/或活性以产生减少或消除T细胞抑制的细胞。用于基因组编辑的原代人类细胞可获自患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。细胞也可获自并非患有所述病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、疑似患有所述病症或处于发展所述病症的增加的风险中的正常健康受试者。
[0129] 本发明涵盖基因组编辑原代人类细胞以切割PD1基因序列，以及编辑所述细胞的基因组以改变一个或多个额外标靶多核苷酸序列(例如，CTLA4、TCRA、TCRB、B2M等)。应理解，使用本文所述的一种或多种gRNA或gRNA对来切割PD1基因序列可导致PD1基因组DNA序列(例如，SEQ ID NO:787)的部分或完全缺失。
[0130] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(b)基因组修饰(例如，第二基因组修饰)，其中染色体2上的PD1基因已经被编辑以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0131] 本领域技术人员应理解，PD1基因组DNA的第二连接延伸段的缺失同样地可使用靶向PD1基因中的外显子的任何CRISPR gRNA对来实现，在所述CRISPR gRNA对中第一PD1 gRNA靶向停留在第二外显子上游的第一外显子，所述第二外显子在所述第一外显子下游。同样地，任何外显子对均可使用这一策略被靶向以导致基因组DNA的第二连接延伸段的切割，结果是因此被修饰的细胞的DNA修复机制使第一外显子中的PD1 gRNA切割位点上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于所述PD1 gRNA切割位点下游的所述基因组DNA的5’端。
这一策略的实施例使用包含SEQ ID NO:462(CR1)和SEQ ID NO:421(CR2)的第一对核糖核酸在图13A和图13B中示出。在所述实施例中，所述第一对PD1 gRNA被示出靶向PD1基因的外显子2和外显子3。当然，PD1基因中的任何两个相邻外显子均可能使用这一策略被靶向(例如，外显子1和外显子2、外显子3和4、外显子4和5)。应进一步理解，所述含有CRISPR gRNA PD1标靶基序的PD1外显子中的任何部分均可使用这一策略被靶向，只要所述第一对PD1 gRNA的各PD1 gRNA指向所述相邻PD1外显子中的每一者中的一个CRISPR gRNA PD1标靶基序。换句话说，为了实现所述策略，熟练人员仅需要从SEQ ID NO:196-531和4047-8945中选择靶向第一外显子中的基序的PD1 gRNA，并且接着从SEQ ID NO:196-531和4047-8945选择靶向在所述第一外显子上游或下游的第二(例如，相邻)外显子中的基序的第二PD1 gRNA。
以这种方式，所述第一对gRNA将指导所述细胞中的Cas蛋白分别至第一和第二外显子，并且切割那些外显子以及内含子(或其间任何其它序列)，由此允许细胞的DNA修复机制共价地接合两个切割位点处的基因组DNA以产生具有缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的PD1基因的经过修饰的细胞或其群体。除了靶向相邻外显子，或作为替代，还可选择第一对gRNA以靶向PD1基因中的任何两个外显子(例如，外显子1和3、外显子1和4、外显子1和5、外显子2和4、外显子2和5等)，以致在那些外显子中的切割位点之间的基因组DNA序列缺失，并且侧接那些切割位点的基因组DNA序列共价地接合以产生具有缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的PD1基因的经过修饰的细胞或其群体。
这一策略的实施例使用包含SEQ ID NO:462(CR1)和SEQ ID NO:421(CR2)的第一对核糖核酸在图13A和图13B中示出。在所述实施例中，所述第一对PD1 gRNA被示出靶向PD1基因的外显子2和外显子3。当然，PD1基因中的任何两个相邻外显子均可能使用这一策略被靶向(例如，外显子1和外显子2、外显子3和4、外显子4和5)。应进一步理解，所述含有CRISPR gRNA PD1标靶基序的PD1外显子中的任何部分均可使用这一策略被靶向，只要所述第一对PD1 gRNA的各PD1 gRNA指向所述相邻PD1外显子中的每一者中的一个CRISPR gRNA PD1标靶基序。换句话说，为了实现所述策略，熟练人员仅需要从SEQ ID NO:196-531和4047-8945中选择靶向第一外显子中的基序的PD1 gRNA，并且接着从SEQ ID NO:196-531和4047-8945选择靶向在所述第一外显子上游或下游的第二(例如，相邻)外显子中的基序的第二PD1 gRNA。
以这种方式，所述第一对gRNA将指导所述细胞中的Cas蛋白分别至第一和第二外显子，并且切割那些外显子以及内含子(或其间任何其它序列)，由此允许细胞的DNA修复机制共价地接合两个切割位点处的基因组DNA以产生具有缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的PD1基因的经过修饰的细胞或其群体。除了靶向相邻外显子，或作为替代，还可选择第一对gRNA以靶向PD1基因中的任何两个外显子(例如，外显子1和3、外显子1和4、外显子1和5、外显子2和4、外显子2和5等)，以致在那些外显子中的切割位点之间的基因组DNA序列缺失，并且侧接那些切割位点的基因组DNA序列共价地接合以产生具有缺乏所述基因组DNA的第二连接延伸段的PD1基因的经过修饰的细胞或其群体。
[0132] 下表4示出了在示例性人类PD1基因中五个外显子中的每一者的基因组序列。熟练技术人员可容易地使用本文中概述的PD1靶向策略以多种方式进行所述策略而从SEQ ID NO:196-531和4047-8945选择PD1 gRNA对以靶向下表4中示出的包含SEQ ID NO:788-792的外显子。或者，熟练技术人员可容易地使用本文中概述的PD1靶向策略以多种方式进行所述策略而从SEQ ID NO:8946-9101选择至少一种PD1gRNA以靶向下表4中示出的包含SEQ ID NO:788-792的外显子。使用这一策略缺失的所述上游外显子的至少所述部分和所述下游外显子的至少所述部分的大小取决于其中所述PD1 gRNA指引各个别外显子中的切割的位置。例如，使用这一策略将缺失在所述上游外显子中的切割位点下游的所述外显子的整个部分和在所述下游外显子中的切割位点上游的所述外显子的整个部分。因此，可使用这一策略通过选择靶向最接近所述上游外显子的5’端和最接近相邻下游外显子的3’端的基序的PD1 gRNA而缺失所靶向的外显子的较大部分。相反地，可通过选择靶向最远离所述上游外显子的5’端和最远离相邻下游外显子的3’端的基序的PD1 gRNA而缺失所靶向的外显子的较小部分。
[0133] 表4
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(b)基因组修饰(例如，第二基因组修饰)，其中染色体2上的PD1基因已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第二连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性，其中所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第二连接延伸段)已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和一对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸(例如，第二对)接触而缺失。在一些实施方案中，所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
[0139] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述PD1多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶PD1多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶PD1多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO.196-531和4047-8945组成的组。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组。在一些实施方案中，所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
[0140] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(b)基因组修饰(例如，第二基因组修饰)，其中染色体2上的PD1基因已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的至少一种核糖核酸接触而被编辑以减少或消除所述细胞中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0141] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述PD1多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶PD1多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶PD1多核苷酸序列被切割，并且其中所述至少一种核糖核酸选自由SEQ ID NO.8946-9101组成的组。在某些方面，所述细胞中的标靶PD1多核苷酸序列的后续改变导致所述标靶PD1多核苷酸序列的第二次切割，由此编辑所述标靶PD1多核苷酸序列以缺失基因组DNA的第二连接延伸段。
[0142] T细胞受体α链(TCRA)和T细胞受体β链(TCRB)基因座
[0143] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列是T细胞受体α基因座(TCRA)，或其同系物、直系同源物或变体(基因ID：5133，还称作IMD7、TCRD、TRA@、TRAC，并且在本文中被称作TCRa、TCRA、TCRα等)。示例性TCRA人类标靶多核苷酸序列为NCBI参考序列：NC_000014.9。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸是T细胞受体α基因座(TCRB)，或其同系物、直系同源物或变体(基因ID：6957，还称作TCRB、TRB@，并且在本文中被称作TCRb、TCRB、TCRβ等)。T淋巴细胞的抗原识别经由类似于使用由B细胞产生的免疫球蛋白的机制的机制发生。存在两种主要的成熟T细胞亚型，即表达α和β链的那些，和表达γ和δ链的那些。与所分泌的Ig分子形成对比，T细胞受体链是膜结合的并且通过细胞-细胞接触起作用。T细胞受体α链编码基因在染色体14上分组。
[0144] 当编码N端抗原识别域的至少70个可变(V)基因之一重排至61个接合(J)基因区段之一以形成功能性V区外显子，而所述外显子被转录并且剪接至编码C端部分的恒定区基因(TRAC)区段时，形成T细胞受体α链。当编码N端抗原识别域的52个可变(V)基因之一重排至多样性(D)基因和接合(J)基因以形成功能性V区外显子，而所述外显子被转录并且剪接至编码C端部分的恒定(C)区基因区段时，形成T细胞受体β链。与所述α链基因座形成对比，所述β链基因座在所述V基因后具有两个独立的基因簇，各簇含有一个D基因、数个J基因和一个C基因。在其合成后，所述α和β链组合以产生α-βT细胞受体异型二聚体(Janeway等人,2005)。
[0145] 在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体14上的TCRα链基因座已经使用基因编辑系统(例如，TALEN、CRISPR/Cas等)被编辑以减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体14上的TCRα链基因座已经被编辑以缺失例如包含编码外显子的基因组DNA的连接延伸段，由此减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。所述基因组DNA的连接延伸段可通过使原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的至少一对核糖核酸(即CRISPR TCRA gRNA对，例如，至少一个gRNA对、至少两个gRNA对、至少三个gRNA对、至少四个gRNA对、至少五个gRNA对等)接触而缺失。
[0146] 在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体7上的TCRβ链基因座已经使用基因编辑系统(例如，TALEN、CRISPR/Cas等)被编辑以减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体7上的TCRβ链基因座已经被编辑以缺失例如包含编码外显子的基因组DNA的连接延伸段，由此减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表达(例如，细胞表面表达)和/或活性(例如，蛋白活性)。所述基因组DNA的连接延伸段可通过使原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的至少一对核糖核酸(即CRISPR TCRAgRNA对，例如，至少一个gRNA对、至少两个gRNA对、至少三个gRNA对、至少四个gRNA对、至少五个gRNA对等)接触而缺失。
[0147] 本公开涵盖减少或消除任何细胞系或原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)、其群体中的TCR表达和/或活性以产生减少或消除自身反应性的细胞。本公开进一步涵盖基因组编辑原代人类细胞以切割TCRα链基因座和/或TCRβ链基因座序列，以及编辑所述细胞的基因组以改变一个或多个额外标靶多核苷酸序列(例如，CTLA4、PD1和/或B2M)。应理解，使用本文所述的一种或多种gRNA或gRNA对和Cas蛋白切割TCRα链基因座序列和/或TCRβ链基因座序列可导致标靶TCRα链基因座和/或TCRβ链基因座DNA序列(例如编码外显子，例如第一编码外显子)的部分或完全缺失。
[0148] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(c)(i)基因组修饰(例如，第三基因组修饰)，其中染色体14上的TCRα链基因座已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第三连接延伸段)，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(c)(ii)基因组修饰(例如，第四基因组修饰)，其中染色体7上的TCRβ链基因座已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第四连接延伸段)，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，其中从染色体14上的TCRα链基因座缺失基因组DNA的连接延伸段和/或从染色体7上的TCRβ链基因座缺失基因组DNA的连接延伸段会减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表面表达和/或TCR活性。
[0149] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(c)(i)基因组修饰(例如，第三基因组修饰)，其中染色体14上的TCRα链基因座已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第三连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在一些实施方案中，所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第三连接延伸段)已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列的一对核糖核酸(例如，第三对)接触而缺失。在一些实施方案中，所述第三对核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573。
[0150] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(c)(ii)基因组修饰(例如，第四基因组修饰)，其中染色体7上的TCRβ链基因座已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第四连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在一些实施方案中，所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第四连接延伸段)已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列的一对核糖核酸(例如，第四对)接触而缺失。在一些实施方案中，所述第四对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
[0151] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶TRCA多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRA多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRA多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRA多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO.532-609和9102-9750组成的组。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组。在一些实施方案中，所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573。
[0152] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶TRCB多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRB多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRB多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRB多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO.610-765和9798-10321组成的组。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10321组成的组。在一些实施方案中，所述两种核糖核酸包含SEQ ID NO:
657和SEQ ID NO:662。
657和SEQ ID NO:662。
[0153] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(c)(i)基因组修饰(例如，第三基因组修饰)，其中染色体14上的TCRα链基因座已经被编辑以减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在一些实施方案中，所述第三基因组修饰通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的至少一种核糖核酸接触而发生。
[0154] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(c)(ii)基因组修饰(例如，第四基因组修饰)，其中染色体7上的TCRβ链基因座已经被编辑以减少或消除所述细胞中的TCR表面表达和/或活性。在一些实施方案中，所述第四基因组修饰通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的至少一种核糖核酸接触而发生。
[0155] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶TRCA多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRA多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRA多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRA多核苷酸序列被切割，并且其中所述至少一种核糖核酸选自由SEQ ID NO.9751-9797组成的组。在某些方面，所述细胞中的标靶TRCA多核苷酸序列的后续改变导致所述标靶TRCA多核苷酸序列的第二次切割，由此编辑所述标靶TRCA多核苷酸序列以缺失基因组DNA的第三连接延伸段。
[0156] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶TRCB多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述TCRB多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶TCRB多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶TCRB多核苷酸序列被切割，并且其中所述至少一种核糖核酸选自由SEQ ID NO.10533-10573组成的组。在某些方面，所述细胞中的标靶TRCB多核苷酸序列的后续改变导致所述标靶TRCB多核苷酸序列的第二次切割，由此编辑所述标靶TRCB多核苷酸序列以缺失基因组DNA的第四连接延伸段。
[0157] β-2-微球蛋白(B2M)
[0158] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为β-2-微球蛋白(B2M；基因ID：567)。所述B2M多核苷酸序列编码与在实质上所有成核细胞的表面上表达的主要组织相容性复合体(MHC)I类分子的重链相关的血清蛋白。B2M蛋白包含β折叠片结构，所述结构已经被发现在某些病理学条件下形成淀粉样原纤维。所述B2M基因具有4种外显子，所述外显子跨大约
8kb。B2M已经在正常个体的血清中观察到并且在具有肝豆状核变性、镉中毒和多种导致肾小管功能失调的病况的患者的尿液中以升高的量观察到。已知与B2M有关的其它病理病况包括而不限于已经在具有家族性分解亢进低蛋白血症的个体中报道的在B2M基因中的纯合突变(例如，ala11pro)、已经在具有家族性内脏淀粉样变性的个体中报道的在B2M基因中的杂合突变(例如，asp76asn)。
8kb。B2M已经在正常个体的血清中观察到并且在具有肝豆状核变性、镉中毒和多种导致肾小管功能失调的病况的患者的尿液中以升高的量观察到。已知与B2M有关的其它病理病况包括而不限于已经在具有家族性分解亢进低蛋白血症的个体中报道的在B2M基因中的纯合突变(例如，ala11pro)、已经在具有家族性内脏淀粉样变性的个体中报道的在B2M基因中的杂合突变(例如，asp76asn)。
[0159] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为B2M的变体。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为B2M的同系物。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列为B2M的直系同源物。
[0160] 在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)或其群体，其包含如下基因组，其中染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因已经使用基因编辑系统(例如，TALEN、CRISPR/Cas等)被编辑以减少或消除所述细胞或其群体中的MHC I类分子的表面表达。在一些方面，本公开提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，其包含如下基因组，其中染色体15上的B2M基因已经被编辑以缺失NCBI参考序列：NG_012920.1的基因组DNA的连接延伸段，由此减少或消除所述细胞或其群体中的MHC I类分子的表面表达。所述基因组DNA的连接延伸段可通过使所述细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13719组成的组的至少一种核糖核酸或至少一对核糖核酸接触而缺失。
[0161] 本公开涵盖消除任何细胞系或原代人类细胞群体(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)中的MHC I类分子表面表达以产生减少或消除当移植(例如，同种异体移植)时触发不想要的宿主免疫反应的可能性的细胞。B2M是MHC I类蛋白的附属链，它是MHC I类蛋白在细胞的表面上表达所必需的。相信缺乏表面MHC I类的经过工程改造的细胞(例如，突变细胞)可减少当所述经过工程改造的细胞施用于宿主时将由细胞毒性T细胞检测到所述细胞的可能性。因此，在一些实施方案中，所述细胞或细胞的群体中编码B2M的标靶多核苷酸序列的切割会减少当所得的一种或多种细胞被施用于受试者时所述细胞将触发宿主免疫反应的可能性。
[0162] 本发明涵盖基因组编辑原代人类细胞以切割B2M基因序列，以及编辑所述细胞的基因组以改变一个或多个额外标靶多核苷酸序列(例如，CTLA4、PD1、TCRA和/或TCRB)。应理解，使用本文所述的一种或多种gRNA或gRNA对和Cas蛋白来切割B2M基因组序列可导致所述标靶B2M基因组序列的部分或完全缺失。
[0163] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(d)基因组修饰(例如，第五基因组修饰)，其中染色体15上的B2M基因已经被编辑以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第五连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在一些实施方案中，所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第五连接延伸段)已经通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列的一对核糖核酸(例如，第五对)接触而缺失。在一些实施方案中，所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
[0164] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶B2M多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述B2M多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和一种至两种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶B2M多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶B2M多核苷酸序列被切割，并且其中所述一种至两种核糖核酸中的至少一者选自由SEQ ID NO.766-780和10574-13257组成的组。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均选自由SEQ ID NO:766-780和
10574-13257组成的组。在一些实施方案中，所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
10574-13257组成的组。在一些实施方案中，所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
[0165] 在一些方面，本发明提供经过修饰的原代人类T细胞或其群体，各细胞包含经过修饰的基因组，所述基因组包含：(d)基因组修饰(例如，第五基因组修饰)，其中染色体15上的B2M基因已经被编辑以减少或消除所述细胞中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在一些实施方案中，所述第五基因组修饰通过使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的至少一种核糖核酸接触而发生。
[0166] 在一些方面，本发明提供了一种用于改变细胞中的标靶B2M多核苷酸序列的方法，所述方法包括使所述B2M多核苷酸序列与成簇的规律间隔短回文重复序列相关(Cas)蛋白和至少一种核糖核酸接触，其中所述核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶B2M多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序，其中所述标靶B2M多核苷酸序列被切割，并且其中所述至少一种核糖核酸选自由SEQ ID NO.13258-13719组成的组。在某些方面，所述细胞中的标靶B2M多核苷酸序列的后续改变导致所述标靶B2M多核苷酸序列的第二次切割，由此编辑所述标靶B2M多核苷酸序列以缺失基因组DNA的第五连接延伸段。
[0167] 嵌合抗原受体
[0168] 本发明的多个方面涉及经过修饰以包括嵌合抗原受体的原代人类细胞。嵌合抗原受体(CAR)是经过设计以使免疫细胞靶向在细胞表面上表达的特异性分子标靶的分子。在其最基础形式中，其为被引入细胞中的受体，所述受体使在细胞外部表达的特异性域偶合于在细胞内部的信号传导途径，以致当所述特异性域与其标靶相互作用时，所述细胞被活化。CAR通常由T细胞受体(TCR)的变体制成，其中如scFv的特异性域或某一类型的受体融合至TCR的信号传导途径。这些构建体接着被引入至T细胞中，使所述T细胞在表达所述标靶抗原的细胞存在下被活化，导致由所述活化的T细胞以非MHC依赖性方式攻击被靶向的细胞(参见Chicaybam等人(2011)Int Rev Immunol 30:294-311)。目前，靶向多种肿瘤抗原的肿瘤特异性CAR正在临床中针对多种不同癌症的治疗进行测试。这些癌症和所靶向的其抗原的实例包括滤泡性淋巴瘤(CD20或GD2)、神经母细胞瘤(CD171)、非霍奇金淋巴瘤(CD20)、淋巴瘤(CD19)、胶质母细胞瘤(IL13Rα2)、慢性淋巴细胞白血病或CLL和急性淋巴细胞白血病或ALL(均为CD19)。也已经开发了病毒特异性CAR以攻击具有如HIV的病毒的细胞。例如，使用对Gp100具特异性的CAR来开始用于治疗HIV的临床试验(Chicaybam,同上)。
[0169] 如本文所用，“嵌合抗原受体”(CAR)是人工构建的杂合蛋白或多肽，其包含连接至负责淋巴细胞中的信号转导的免疫受体的特异性或识别(即，结合)域。所述结合域典型地源于Fab抗体片段，所述Fab抗体片段已经经由在所述特异性域内的抗体链之间引入柔性连接体而被塑造成单链scFv。其它可能的特异性域可包括激素或细胞因子分子的信号传导部分、受体的细胞外域和通过文库(例如，噬菌体)筛选分离的肽配体或肽(参见Ramos和Dotti,(2011)Expert Opin Bio Ther 11(7):855)。在所述CAR的信号传导和结合部分之间的柔性可为所需的特征以允许所述标靶与所述结合域之间的更佳相互作用，因此通常包括铰链区。可使用的结构的一个实例为来自如IgG分子的免疫球蛋白的CH2-CH3区。典型CAR的信号传导域包含TCR-CD3复合体的细胞内域，如ζ链。或者，可使用Fc受体的γ链。典型CAR的跨膜部分可包含如CD4、CD8或CD28的蛋白质的跨膜部分(Ramos和Dotti,同上)。一些CAR的特征包括其以非MHC限制性方式使T细胞特异性和反应性再针对所选标靶的能力。所述非MHC限制性标靶识别对表达CAR的T细胞给予了独立于抗原加工识别标靶的能力，因此避开了肿瘤逃逸的主要机制。
[0170] 图2中示出预期用于本发明的经过修饰的细胞、组合物、方法和试剂盒的至少三代不同的嵌合抗原受体。所谓的“第一代”CAR通常包含单一内部信号传导域，如CD3ζ链，并且被认为可能由于不完全活化而在临床中略微无效。为了增加具有这些CAR的T细胞的性能，已经产生了第二代CAR，其具有通过包括另一刺激域来证明T细胞额外活化信号的能力，所述另一刺激域通常源于如CD28、CD134/OX40、CD137/4-1BB、Lck、ICOS和DAP10的其它受体的细胞内域。另外，也已经开发了第三代CAR，其中所述CAR含有三个或更多个刺激域(Ramos和Dotti,同上)。在一些情况下，CAR可包含细胞外铰链域、跨膜域和任选地，包含CD8的细胞内铰链域和包含CD28、4-1BB和CD3ζ的细胞内T细胞受体信号传导域。CD28是T细胞共刺激中重要的T细胞标记物。CD8也是T细胞标记物。4-1BB将有效的共刺激信号传送至T细胞，从而促进T淋巴细胞的分化并且增强其长期存活。CD3ζ与TCR缔合以产生信号并且含有基于免疫受体酪氨酸的活化基序(ITAM)。在其它情况下，CAR可包含细胞外铰链域、跨膜域和包含CD28和CD3ζ的细胞内T细胞信号传导域。在其它情况下，CAR可包含细胞外铰链域和包含CD8的跨膜域和包含CD28和CD3ζ的细胞内T细胞受体信号传导域。
[0171] 在一些实施方案中，所述经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)进一步包含嵌合抗原受体或编码所述嵌合抗原受体的外源核酸。所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。多种癌症抗原在本领域中已知并且可由特异性CAR靶向。举非限制性实例，关于可由CAR靶向的肿瘤相关抗原参见表5(参见Ramos和Dotti,同上，和Orentas等人(2012),Front in Oncol 2:1)。
[0172]
[0173]
[0174]
[0175] 在一些实施方案中，所述CAR可对肿瘤抗原具有特异性，其中CAR特异性域为ScFv。在其它实施方案中，CAR可对肿瘤抗原具特异性，其中CAR特异性域包含配体或多肽。非限制性示例性CAR包括靶向CD33(参见Dutour等人,(2012)Adv Hematol 2012；2012:683065)、GD2(Louis等人(2011)Blood 118(23):650-6)、CD19(Savoldo等人,(2011)J Clin Invest
121(5):1822和Torikai等人(2012)Blood 119(24):5697)、IL-11Rα(Huang等人,(2012)Cancer Res 72(1):271-81)、CD20(Till等人(2012)Blood 119(17):3940-50)、NY-ESO-1(Schuberth等人,(2012)Gene Ther doi:10.1038/gt2012.48)、ErbB2(Zhao等人,(2009)J.Immunol 183(9):5563-74)、CD70(Shaffer等人(2011)Blood 116(16):4304-4314)、CD38(Bhattacharayya等人(2012)Blood Canc J 2(6)第e75页)、CD22(Haso等人(2012)Canc Res 72(8)S1,doi:1158/1158-7445AM2012-3504)、CD74(Stein等人(2004)Blood 104:
3705-3711)、CAIX(Lamers等人,(2011)Blood 117(1):72-82)、STEAP1(关于标靶的回顾，参见Kiessling等人(2012)Cancers 4:193-217)、VEGF-R2(美国专利公布号
US20120213783A1)、叶酸受体(PCT专利公布WO2012099973)和IL-13Rα(美国专利号7,514,
537)的那些。
121(5):1822和Torikai等人(2012)Blood 119(24):5697)、IL-11Rα(Huang等人,(2012)Cancer Res 72(1):271-81)、CD20(Till等人(2012)Blood 119(17):3940-50)、NY-ESO-1(Schuberth等人,(2012)Gene Ther doi:10.1038/gt2012.48)、ErbB2(Zhao等人,(2009)J.Immunol 183(9):5563-74)、CD70(Shaffer等人(2011)Blood 116(16):4304-4314)、CD38(Bhattacharayya等人(2012)Blood Canc J 2(6)第e75页)、CD22(Haso等人(2012)Canc Res 72(8)S1,doi:1158/1158-7445AM2012-3504)、CD74(Stein等人(2004)Blood 104:
3705-3711)、CAIX(Lamers等人,(2011)Blood 117(1):72-82)、STEAP1(关于标靶的回顾，参见Kiessling等人(2012)Cancers 4:193-217)、VEGF-R2(美国专利公布号
US20120213783A1)、叶酸受体(PCT专利公布WO2012099973)和IL-13Rα(美国专利号7,514,
537)的那些。
[0176] 经由经过修饰的细胞递送的外源分子
[0177] 本发明的多个方面涉及使用本发明的经过修饰的原代人类细胞或其群体(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)来递送外源分子至细胞、组织或器官以调节所述细胞、组织或器官中的所关注的生物活性/效应。例如，所述经过修饰的原代人类细胞或其群体可经过修饰以递送治疗产物(例如免疫调节细胞因子或其拮抗剂以介导自身免疫活性，例如针对抗发炎Th2型反应，例如在活性CNS病变中用组成性表达IL-4以使细胞靶向髓鞘蛋白并且抑制Th1诱导和巨噬细胞活化的病毒载体转导对肽MBP 87-99具特异性的T细胞杂交瘤，如Johnson和Tuohy“, Targeting Antigen-Specific T Cells for Gene Therapy of Autoimmune Disease,”Madame Curie Bioscience Database中进一步描述)或再生产物(例如，以修复受损组织，产生新的或人工组织，或两者，例如使用经过修饰的T细胞来递送神经生长因子(NGF)至中枢神经系统(CNS)、递送血小板源性生长因子-A(PDGF-A)以治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)等)至发炎和组织破坏的位点，调节细胞相互作用(例如细胞间功能的调节(如信号传导途径的调节)、细胞凋亡诱导、停止表位扩展、耐受性诱导、耐受性逆转和特异性程序化等)，或校正其本身的遗传缺陷以改善疾病(例如，自身免疫疾病)。
[0178] “外源”分子是正常未存在于细胞中，但可通过一种或多种基因、生物化学或其它方法被引入至细胞中的分子。“正常存在于细胞中”是关于细胞的特定发育阶段和环境条件来确定。因此，举例来说，仅在神经元的胚胎发育期间存在的分子关于成体神经元细胞是外源分子。外源分子可包含例如功能失常的内源分子的功能形式或正常功能的内源分子的功能失常形式。
[0179] 外源分子可尤其为小分子，如通过组合化学方法产生，或大分子，如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、以上分子的任何经过修饰的衍生物或包含以上分子中的一者或多者的任何复合体。核酸包括DNA和RNA，可为单链或双链的；可为线性、分支链或环状的；并且可具有任何长度。核酸包括能够形成双螺旋的那些，以及形成三螺旋的核酸。参见例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重塑因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、去甲基化酶、乙酰化酶、去乙酰化酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶和螺旋酶。
[0180] 外源分子可为与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白或核酸。在所述情况下，外源分子以高于细胞中的内源分子的浓度的浓度被引入至细胞中。在一些情况下，外源核酸可包含被引入至细胞中的感染病毒基因组、质粒或游离体，或正常未存在于细胞中的染色体。用于将外源分子引入至细胞中的方法为本领域技术人员已知的并且包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。
[0181] 在一些实施方案中，所述外源分子包含融合分子(例如，融合蛋白或核酸)。“融合”分子是如下分子，其中两个或更多个亚单位分子被连接，优选地共价。所述亚单位分子可为相同化学类型的分子，或可为不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的实例包括但不限于融合蛋白(例如，在CRISPR DNA结合域与切割域之间的融合物)；融合核酸(例如，编码上述融合蛋白的核酸)和在核酸与蛋白之间的融合物(例如，CRISPR/Cas核酸酶系统)。第二种类型的融合分子的实例包括但不限于在形成三螺旋的核酸与多肽之间的融合物，和在小沟结合物与核酸之间的融合物。
[0182] 细胞中融合分子的表达可由于递送所述融合分子至细胞，例如就融合蛋白来说通过递送融合蛋白至细胞或通过递送编码所述融合蛋白的多核苷酸至细胞而引起，其中所述多核苷酸被转录，并且转录物被翻译，以产生所述融合蛋白。反式剪接、多肽切割和多肽接合也可牵涉于细胞中蛋白质的表达。用于多核苷酸和/或多肽递送至细胞的方法在本公开中别处提供。
[0183] 出于本公开的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区(参见下文)，以及调节所述基因产物的产生的所有DNA区，无论所述调节序列是否与编码和/或被转录的序列相邻。因此，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列(如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点)、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质附着位点和基因座控制区。
[0184] “基因表达”是指基因中所含的信息转化为基因产物。基因产物可为基因(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)的直接转录产物或通过mRNA的翻译产生的蛋白。基因产物还包括通过如加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑的过程修饰的RNA，和通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化修饰的蛋白。
[0185] 基因表达的“调节”是指基因的表达水平的改变。表达的调节可包括但不限于基因活化和基因抑制。调节也可为完全的，即，其中基因表达完全地去活化或被活化至野生型水平或超出；或其可为部分的，其中基因表达部分地减少，或部分地被活化至野生型水平的一部分。“真核”细胞包括但不限于真菌细胞(如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人类细胞(例如，T细胞)。
[0186] 术语“可操作性连接(operative linkage)”和“可操作性连接(operatively linked)”(或“可操作性连接(operably linked)”)关于两种或更多种组分(如序列元件)的并置可互换使用，其中所述组分被布置，以致两种组分正常地起作用并且允许如下可能性，即所述组分中的至少一者可介导对其它组分中的至少一者发挥的作用。举例说明，如果如启动子的转录调节序列回应于一种或多种转录调节因子的存在或不存在控制编码序列的转录水平，那么所述转录调节序列可操作性连接至所述编码序列。转录调节序列一般地呈顺式与编码序列可操作性连接，但无需直接地与其相邻。例如，增强子是可操作性连接至编码序列(即使其未邻接)的转录调节序列。
[0187] 关于融合多肽，术语“可操作性连接”可指如下事实，即所述组分中的每一者均与另一组分连接执行相同功能，就如同其并未如此连接一般。例如，关于其中CasDNA结合域融合至切割域的融合多肽，如果在所述融合多肽中所述DNA结合域部分能够结合其标靶位点和/或其结合位点，而所述切割域能够切割在所述标靶位点附近的DNA，那么所述DNA结合域和所述切割域呈可操作性连接。同样，关于其中CasDNA结合域融合至活化或抑制域的融合多肽，如果在所述融合多肽中所述DNA结合域部分能够结合其标靶位点和/或其结合位点，而所述活化域能够上调基因表达或所述抑制域能够下调基因表达，那么所述DNA结合域和所述活化或抑制域呈可操作性连接。
[0188] 蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是如下蛋白质、多肽或核酸，其序列不与全长蛋白质、多肽或核酸同一，但保留与所述全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能。功能片段可具有与相应的原生分子相比更多、更少或相同数目的残基，和/或可含有一种或多种氨基酸或核苷酸取代。用于确定核酸的功能(例如，编码功能、杂交至另一核酸的能力)的方法为本领域中众所周知的。同样，用于确定蛋白质功能的方法也是众所周知的。例如，多肽的DNA结合功能可例如通过过滤器结合、电泳迁移率变动或免疫沉淀分析来确定。DNA切割可通过凝胶电泳进行分析。参见Ausubel等人,上文。蛋白质与另一蛋白质相互作用的能力可例如通过共免疫沉淀、双杂交分析或互补(基因和生物化学两者)来确定。参见例如Fields等人(1989)Nature 340:245-246；美国专利号5,585,245和PCT WO 98/44350。
[0189] “载体”能够转移基因序列至标靶细胞。典型地，“载体构建体”、“表达载体”和“基因转移载体”意指能够指导所关注的基因的表达并且可转移基因序列至标靶细胞的任何核酸构建体。因此，所述术语包括克隆和表达媒介物，以及整合载体。
[0190] “报告基因”或“报告序列”是指产生容易测量(优选地但未必在常规分析中)的蛋白质产物的任何序列。合适的报告基因包括但不限于编码介导抗生素抗性(例如，氨比西林抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码有色或荧光或发光蛋白(例如，绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)和介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)的序列。表位标签包括例如FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列的一个或多个拷贝。“表达标签”包括编码可操作性连接至所需的基因序列以便监测所关注的基因的表达的报告基因的序列。
[0191] 在一些实施方案中，所述经过修饰的原代人类细胞或其群体进一步包含至少一种外源蛋白，所述外源蛋白调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应；或编码所述蛋白质的外源核酸。
[0192] 用于产生经过修饰的细胞的方法
[0193] 本发明的多个方面涉及用于产生经过修饰的原代人类细胞(例如免疫细胞，例如T细胞、自然杀手细胞等)的方法。在一些实施方案中，一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法包括以下步骤：(a)编辑原代人类T细胞或其群体中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第一连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞或其群体中的CTLA4受体表面表达和/或活性。
[0194] 在一些实施方案中，一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法包括以下步骤：(b)编辑所述细胞或其群体中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第二连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞或其群体中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0195] 在一些实施方案中，一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法包括以下步骤：(c)(i)编辑所述细胞或其群体中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第三连接延伸段)，和/或(c)(ii)编辑所述细胞或其群体中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第四连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表面表达和/或活性。
[0196] 在一些实施方案中，一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法包括以下步骤：(d)编辑所述细胞或其群体中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的连接延伸段(例如，第五连接延伸段)，由此减少或消除所述细胞或其群体中的MHC I类分子表面表达和/或活性。
[0197] 在一些实施方案中，(a)-(d)中的编辑步骤包含使所述细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列，和在(a)中至少一对(例如，第一对)指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第一连接延伸段)，在(b)中至少一对(例如，第二对)指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第二连接延伸段)，在(c)(i)中至少一对(例如，第三对)指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第三连接延伸段)，和/或在(c)(ii)中至少一对(例如，第四对)指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第四连接延伸段)，和在(d)中至少一对(例如，第五对)指导RNA序列接触以从所述基因缺失所述基因组DNA的连接延伸段(例如，第五连接延伸段)。
[0198] 在一些实施方案中，一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法任选地包括以下步骤：(e)(i)使所述细胞或其群体表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位，和/或(e)(ii)使所述细胞或其群体表达至少一种蛋白质，所述蛋白质调节在相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。
[0199] 在一些方面，本发明提供了一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法，所述方法包括：(a)编辑原代人类T细胞或其群体中在染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，所述第一连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的5’端上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第一连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第一连接延伸段的经过修饰的CTLA4基因，由此减少或消除所述细胞或其群体中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)编辑原代人类T细胞或其群体中在染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，所述第二连接延伸段包含侧接相邻上游外显子的至少一部分和相邻下游外显子的至少一部分的内含子，并且在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段上游的所述基因组DNA的3’端共价地接合于在所述缺失的基因组DNA的第二连接延伸段的3’端下游的所述基因组DNA的5’端以产生染色体2上缺乏基因组DNA的第二连接延伸段的经过修饰的PD1基因，由此减少或消除所述细胞或其群体中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0200] 在一些方面，本发明提供了一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法，所述方法包括：(a)使原代人类T细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和第一对具有选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以缺失基因组DNA的第一连接延伸段，并且减少或消除所述细胞或其群体中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)使原代人类T细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和第二对具有选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列的核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以缺失基因组DNA的第二连接延伸段，并且减少或消除所述细胞或其群体中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0201] 在一些实施方案中，所述第一对核糖核酸包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72，并且所述第二对核糖核酸包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421。
[0202] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法进一步包括：(c)(i)编辑所述细胞或其群体中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因以缺失基因组DNA的第三连接延伸段，所述第三连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，和/或(c)(ii)编辑所述细胞或其群体中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因以缺失基因组DNA的第四连接延伸段，所述第四连接延伸段包含编码外显子的至少一部分，由此减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表面表达和/或活性。在一些实施方案中，(c)(i)中的编辑步骤包含使所述细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和第三对具有选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列的核糖核酸接触，和/或(c)(ii)中的编辑步骤包含使所述细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和第四对具有选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列的核糖核酸接触。在一些实施方案中，所述第三对核糖核酸包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573，和/或所述第四对核糖核酸包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662。
[0203] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法进一步包括：(d)编辑所述细胞或其群体中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因以缺失基因组DNA的第五连接延伸段，由此减少或消除所述细胞或其群体中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在一些实施方案中，(d)中的编辑步骤包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和第五对具有选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列的核糖核酸接触。在一些实施方案中，所述第五对核糖核酸包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778。
[0204] 在一些方面，本发明提供了一种用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法，所述方法包括：(a)使原代人类T细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列的第一核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(CTLA4)基因以减少或消除所述细胞或其群体中的CTLA4受体表面表达和/或活性；和/或(b)使原代人类T细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的第二核糖核酸接触，由此编辑染色体2上的程序性细胞死亡1(PD1)基因以减少或消除所述细胞或其群体中的PD1受体表面表达和/或活性。
[0205] 在某些方面，所述细胞中的标靶TRCB多核苷酸序列的后续改变导致所述标靶TRCB多核苷酸序列的第二次切割，由此编辑所述标靶TRCB多核苷酸序列以缺失基因组DNA的第四连接延伸段。
[0206] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法进一步包括：(c)(i)编辑所述细胞或其群体中在染色体14上的编码T细胞受体(TCR)α链基因座的基因，和/或(c)(ii)编辑所述细胞或其群体中在染色体7上的编码TCRβ链基因座的基因，由此减少或消除所述细胞或其群体中的TCR表面表达和/或活性。在一些实施方案中，(c)(i)中的编辑步骤包含使所述细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的第三核糖核酸接触，和/或(c)(ii)中的编辑步骤包含使所述细胞或其群体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的第四核糖核酸接触。
[0207] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法进一步包括：(d)编辑所述细胞或其群体中在染色体15上的β2-微球蛋白(B2M)基因，由此减少或消除所述细胞或其群体中的MHC I类分子表面表达和/或活性。在一些实施方案中，(d)中的编辑步骤包含使所述细胞与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的第五核糖核酸接触。
[0208] 在一些实施方案中，如本文所述的基因(例如，CTLA4、PD1、TCRA、TCRB和/或B2M)的编辑导致所述基因的多核苷酸序列的切割。在某些方面，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞的方法的后续应用引起了所述基因的多核苷酸序列的第二次切割，由此缺失基因组DNA的连接延伸段。
[0209] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法进一步包括：使所述细胞或其群体表达至少一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体特异性地结合于在受损细胞、发育不良细胞、受感染细胞、免疫原性细胞、发炎细胞、恶性细胞、化生细胞、突变细胞和其组合中的至少一者的表面上表达的所关注的抗原或表位。
[0210] 在一些实施方案中，所述用于产生经过修饰的原代人类T细胞或其群体的方法进一步包括：使所述细胞或其群体表达至少一种蛋白质，当所述细胞或其群体接近相邻细胞、组织或器官时，所述蛋白质调节在所述相邻细胞、组织或器官中的所关注的生物效应。
[0211] 应理解，本发明的CRISPR/Cas系统可以多种方式切割标靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列被切割，以致双链断裂发生。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列被切割，以致单链断裂发生。
[0212] 本发明的方法可用于改变细胞中的任何标靶多核苷酸序列，只要所述细胞中的标靶多核苷酸序列含有合适的标靶基序，所述标靶基序允许所述CRISPR/Cas系统的至少一种核糖核酸将Cas蛋白指向所述标靶基序并且杂交至所述标靶基序。本领域技术人员应理解，用于靶向特定多核苷酸的标靶基序取决于所用的CRISPR/Cas系统，和欲靶向的多核苷酸序列。
[0213] 在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23bp长。在一些实施方案中，所述标靶基序为至少20bp长。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NRG基序前面。在一些方面，所述NRG基序为NGG或NAG。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在由所述Cas蛋白识别的NGG基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在由所述Cas蛋白识别的NAG基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为由G开始的20个核苷酸的DNA序列并且就在由所述Cas蛋白识别的NGG基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为G(N)19NGG。在一些实施方案中，所述标靶基序为(N)20NGG。
[0214] 在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNGRRT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNGRRT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNNRRT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNNRRT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNAGAAW基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNAGAAW基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNNNGATT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNNNGATT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NAAAAC基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NAAAAC基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为具有5’富T区(例如，TTTN基序)的17至23个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序为具有5’富T区(例如，TTTN基序)的20个核苷酸的DNA序列。
[0215] 在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个个核苷酸的DNA序列并且就在由酿脓链球菌Cas9蛋白识别的NRG基序(例如，NGG或NAG)前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在由金黄色葡萄球菌Cas9蛋白识别的NNGRRT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在由金黄色葡萄球菌Cas9蛋白识别的NNNRRT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在由嗜热链球菌Cas9蛋白识别的NNAGAAW基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在由脑膜炎奈瑟氏菌Cas9蛋白识别的NNNNGATT基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在由齿密螺旋体Cas9蛋白识别的NAAAAC基序前面。在一些实施方案中，所述标靶基序为具有由氨基酸球菌属或毛螺菌科Cpf1蛋白识别的5’富T区(例如，TTTN基序)的17至23个核苷酸的DNA序列。
[0216] 可选择本发明的标靶基序以最小化本发明的CRISPR/Cas系统的脱靶效应。在一些实施方案中，选择所述标靶基序以致当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时，其含有至少两种错配。在一些实施方案中，选择所述标靶基序以致当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时，其含有至少一种错配。本领域技术人员应了解，可使用多种技术来选择用于最小化脱靶效应的合适标靶基序(例如，生物信息学分析)。
[0217] 在一些实施方案中，所述标靶基序包含CTLA基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含PD1基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含TCRA基因中的G(N)19NGG或(N)20NGGDNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含TCRB基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含B2M基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。
[0218] 在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:782中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:783中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:784中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:785中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:786中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:787中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:788中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:789中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:790中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:791中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含SEQ ID NO:792中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列。
[0219] 在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含选自由SEQ ID NO:1-195和797-4046组成的组的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含选自由SEQ ID NO:196-531和4047-9101组成的组的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9797组成的组的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10573组成的组的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含选自由SEQ ID NO:766-780和
10574-13719组成的组的DNA序列。
10574-13719组成的组的DNA序列。
[0220] 在一些实施方案中，所述标靶基序包含与CTLA基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含与PD1基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含与TCRA基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含与TCRB基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序包含与B2M基因中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。
[0221] 在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-2602组成的组的DNA序列中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8128组成的组的DNA序列中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含与选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9545组成的组的DNA序列中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含与选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10321组成的组的DNA序列中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。在一些实施方案中，所述标靶基序或所述标靶基序的至少一部分包含与选自由SEQ ID NO:766-780和10574-12300组成的组的DNA序列中的G(N)19NGG或(N)20NGG DNA序列相比包含至少两种核苷酸错配的DNA序列。
[0222] 在一些实施方案中，本发明的CRISPR/Cas系统使用同系物指导的修复来校正标靶多核苷酸序列。在一些实施方案中，在所述标靶多核苷酸序列的切割后，发生同系物指导的修复。在一些实施方案中，使用外源引入的DNA修复模板执行同系物指导的修复。所述外源引入的DNA修复模板可为单链或双链的。所述DNA修复模板可具有任何长度。本领域技术人员应理解，任何特定DNA修复模板的长度均将取决于欲校正的标靶多核苷酸序列。所述DNA修复模板可经过设计以修复或置换任何标靶多核苷酸序列，尤其是包含疾病相关多态性(例如，SNP)的标靶多核苷酸序列。例如，包含所述SNP的突变等位基因的同系物指导的修复可用CRISPR/Cas系统通过选择侧接所述突变等位基因的两个标靶基序，并且设计DNA修复模板以匹配野生型等位基因来实现。
[0223] 在一些实施方案中，本发明的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和至少一种至两种能够将Cas蛋白指向标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的核糖核酸(例如，gRNA)。在一些实施方案中，本发明的CRISPR/Cas系统包括Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸序列和至少一对能够将Cas蛋白指向标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的核糖核酸(例如，gRNA)。如本文所用，“蛋白质”和“多肽”可互换使用以指一系列通过肽键接合的氨基酸残基(即，氨基酸的聚合物)并且包括经过修饰的氨基酸(例如，磷酸化、糖化、糖基化等)和氨基酸类似物。示例性多肽或蛋白质包括基因产物、天然存在的蛋白质、同系物、旁系同源物、片段和以上各物的其它相等物、变体和类似物。
[0224] 在一些实施方案中，Cas蛋白包含一种或多种氨基酸取代或修饰。在一些实施方案中，所述一种或多种氨基酸取代包含保守氨基酸取代。在一些情况下，取代和/或修饰可防止或减少细胞中所述多肽的蛋白水解降解和/或延长其半衰期。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含肽键置换(例如，脲、硫脲、氨基甲酸酯、磺基脲等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含替代的氨基酸(例如，D-氨基酸、β-氨基酸、高半胱氨酸、磷酸丝氨酸等)。在一些实施方案中，Cas蛋白可包含修饰以包括部分(例如，PEG化、糖基化、脂质化、乙酰化、封端等)。
[0225] 在一些实施方案中，Cas蛋白包含核心Cas蛋白。示例性Cas核心蛋白包括但不限于Cas1、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8和Cas9。在一些实施方案中，Cas蛋白包含大肠杆菌亚型的Cas蛋白(还称作CASS2)。大肠杆菌亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cse1、Cse2、Cse3、Cse4和Cas5e。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Ypest亚型的Cas蛋白(还称作CASS3)。Ypest亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csy1、Csy2、Csy3和Csy4。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Nmeni亚型的Cas蛋白(还称作CASS4)。Nmeni亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csn1和Csn2。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Dvulg亚型的Cas蛋白(还称作CASS1)。Dvulg亚型的示例性Cas蛋白包括Csd1、Csd2和Cas5d。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Tneap亚型的Cas蛋白(还称作CASS7)。Tneap亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Cst1、Cst2、Cas5t。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Hmari亚型的Cas蛋白。Hmari亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csh1、Csh2和Cas5h。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Apern亚型的Cas蛋白(还称作CASS5)。Apern亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csa1、Csa2、Csa3、Csa4、Csa5和Cas5a。在一些实施方案中，Cas蛋白包含Mtube亚型的Cas蛋白(还称作CASS6)。Mtube亚型的示例性Cas蛋白包括但不限于Csm1、Csm2、Csm3、Csm4和Csm5。在一些实施方案中，Cas蛋白包含RAMP模块Cas蛋白。示例性RAMP模块Cas蛋白包括但不限于Cmr1、Cmr2、Cmr3、Cmr4、Cmr5和Cmr6。
[0226] 在一些实施方案中，所述Cas蛋白为酿脓链球菌Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为金黄色葡萄球菌Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为嗜热链球菌Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为脑膜炎奈瑟氏菌Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为齿密螺旋体Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为来自任何细菌物种的Cas9蛋白或其功能部分。Cas9蛋白是II型CRISPR系统的成员，所述系统典型地包括反式编码的小RNA(tracrRNA)、内源核糖核酸酶3(rnc)和Cas蛋白。Cas 9蛋白(还称作CRISPR相关核酸内切酶Cas9/Csn1)是包含1368个氨基酸的多肽。Cas9蛋白的示例性氨基酸序列(SEQ ID NO:781)在图4中示出。Cas 9含有2个核酸内切酶域，包括切割与crRNA非互补的标靶DNA的RuvC样域(残基7-22、759-766和982-989)，和切割与crRNA互补的标靶DNA的HNH核酸酶域(残基810-872)。在图4中，所述RuvC样域以黄色突出显示并且所述HNH核酸酶域加下划线。
[0227] 在一些实施方案中，所述Cas蛋白为Cpf1蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白为来自任何细菌物种的Cpf1或其功能部分。在一些方面，Cpf1为新凶手弗朗西丝菌U112蛋白或其功能部分。在一些方面，Cpf1为氨基酸球菌属BV3L6蛋白或其功能部分。在一些方面，Cpf1为毛螺菌科细菌ND2006蛋白或其功能部分。Cpf1蛋白为V型CRISPR系统的成员。Cpf1蛋白为包含约1300个氨基酸的多肽。Cpf1含有RuvC样核酸内切酶域。Cpf1使用单一核糖核酸酶域切割呈交错模式的标靶DNA。所述交错DNA双链断裂产生4或5-nt 5’悬垂物。
[0228] 如本文所用，“功能部分”是指肽中保留其与至少一种核糖核酸(例如，指导RNA(gRNA))复合并且切割标靶多核苷酸序列的能力的部分。在一些实施方案中，所述功能部分包含选自由DNA结合域、至少一个RNA结合域、螺旋酶域和核酸内切酶域组成的组的可操作性连接的Cas9蛋白功能域的组合。在一些实施方案中，所述功能部分包含选自由DNA结合域、至少一个RNA结合域、螺旋酶域和核酸内切酶域组成的组的可操作性连接的Cpf1蛋白功能域的组合。在一些实施方案中，所述功能域形成复合体。在一些实施方案中，所述Cas9蛋白的功能部分包含RuvC样域的功能部分。在一些实施方案中，所述Cas9蛋白的功能部分包含HNH核酸酶域的功能部分。在一些实施方案中，所述Cpf1蛋白的功能部分包含RuvC样域的功能部分。
[0229] 应理解，本发明涵盖使标靶多核苷酸序列与Cas蛋白(例如，Cas9)接触的多种方式。在一些实施方案中，外源Cas蛋白可以多肽形式被引入至细胞中。在某些实施方案中，Cas蛋白可缀合于或融合至细胞穿透多肽或细胞穿透肽。如本文所用，“细胞穿透多肽”和“细胞穿透肽”分别是指促进分子吸收至细胞中的多肽或肽。所述细胞穿透多肽可含有可检测的标记。
[0230] 在某些实施方案中，Cas蛋白可缀合于或融合至带电蛋白质(例如，其携带正电荷、负电荷或总体中性电荷)。所述连接可为共价的。在一些实施方案中，Cas蛋白可融合至超正电荷GFP以显著地增加所述Cas蛋白穿透细胞的能力(Cronican等人ACS Chem Biol.2010；5(8):747-52)。在某些实施方案中，Cas蛋白可融合至蛋白质转导域(PTD)以促进其进入细胞中。示例性PTD包括Tat、寡聚精氨酸和穿膜肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至PTD的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至tat域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至寡聚精氨酸域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至穿膜肽域的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cas9蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cas9多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至细胞穿透肽的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至PTD的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至tat域的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至寡聚精氨酸域的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至穿膜肽域的Cpf1多肽。在一些实施方案中，Cpf1蛋白包含融合至超正电荷GFP的Cpf1多肽。
[0231] 在一些实施方案中，Cas蛋白可以编码所述Cas蛋白(例如，Cas9或Cpf1)的核酸形式被引入至含有所述标靶多核苷酸序列的细胞中。将所述核酸引入至细胞中的过程可通过任何合适的技术实现。合适的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体转导或感染。在一些实施方案中，所述核酸包含DNA。在一些实施方案中，所述核酸包含如本文所述的经过修饰的DNA。在一些实施方案中，所述核酸包含mRNA。在一些实施方案中，所述核酸包含如本文所述的经过修饰的mRNA(例如，合成、经过修饰的mRNA)。
[0232] 在一些实施方案中，编码Cas蛋白的核酸和编码所述至少一种至两种核糖核酸的核酸经由病毒转导(例如，慢病毒转导)被引入至细胞中。
[0233] 在一些实施方案中，所述Cas蛋白与一种至两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，所述Cas蛋白与两种核糖核酸复合。在一些实施方案中，所述Cas蛋白与一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，所述Cas蛋白由如本文所述的经过修饰的核酸(例如，合成、经过修饰的mRNA)编码。
[0234] 本发明方法涵盖能够将Cas蛋白指向标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的任何核糖核酸的使用。在一些实施方案中，所述核糖核酸中的至少一者包含tracrRNA。在一些实施方案中，所述核糖核酸中的至少一者包含CRISPR RNA(crRNA)。在一些实施方案中，单一核糖核酸包含将Cas蛋白指向细胞中的标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的指导RNA。在一些实施方案中，所述核糖核酸中的至少一者包含将Cas蛋白指向细胞中的标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的指导RNA。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的两者包含将Cas蛋白指向细胞中的标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的指导RNA。可选择本发明的核糖核酸以杂交至多种不同的标靶基序，视所用的特定CRISPR/Cas系统和所述标靶多核苷酸的序列而定，如本领域技术人员应理解。也可选择所述一种至两种核糖核酸以最小化与除所述标靶多核苷酸序列以外的核酸序列的杂交。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸杂交至当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时含有至少两种错配的标靶基序。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸杂交至当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时含有至少一种错配的标靶基序。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸经过设计以杂交至紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的标靶基序。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均经过设计以杂交至紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的标靶基序，所述标靶基序侧接位于所述标靶基序之间的突变等位基因。
[0235] 在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列。
[0236] 在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列。
[0237] 在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。
[0238] 在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:
9751-9797组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。
9751-9797组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，至少一种核糖核酸包含与选自由核糖核酸序列SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。
[0239] 在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均包含将Cas蛋白指向细胞中的标靶多核苷酸序列的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的指导RNA。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与标靶多核苷酸序列的同一链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与标靶多核苷酸序列的相对链上的序列互补和/或杂交。在一些实施方案中，所述一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与标靶多核苷酸序列的相对链上的序列不互补和/或不杂交。在一些实施方案中，所述一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与标靶多核苷酸序列的重叠标靶基序互补和/或杂交。在一些实施方案中，所述一种或两种核糖核酸(例如，指导RNA)与标靶多核苷酸序列的偏移标靶基序互补和/或杂交。
[0240] 本发明还涵盖多重基因组编辑。本领域技术人员应理解，关于单一基因的基因组编辑的以上描述同样可适用于下文所述的多重基因组编辑实施方案。
[0241] 如本文所用，术语“施用(administering)”、“引入(introducing)”和“移植(transplanting)”在通过导致所引入的细胞至少部分定位于所需位点处的方法或途径将细胞放置于受试者中的背景下可互换使用，例如本文所述的包含根据本发明方法改变的标靶多核苷酸序列的细胞。所述细胞可直接地植入所需位点处，或替代地通过任何适当途径施用，所述途径导致递送至受试者中的所需位置处，其中所植入的细胞或所述细胞的组分的至少一部分保持活力。在施用于受试者之后所述细胞的活力时期可短至数小时(例如二十四小时)，至数天，至长达数年。在一些情况下，所述细胞也可施用于除所需位点以外的位置处，如肝脏中或皮下，例如在胶囊中以使所植入的细胞维持于植入位置处并且避免所植入的细胞的迁移。
[0242] 关于离体方法，细胞可包括自体同源细胞，即从需要改变一种或多种细胞中的标靶多核苷酸序列的受试者取得的所述一种或多种细胞(即，供体和接受者为同一个体)。自体同源细胞具有避免所述细胞的任何基于免疫学的排斥的优势。或者，所述细胞可为异源的，例如从供体取得。所述第二受试者可为相同或不同物种。典型地，当所述细胞来自供体时，其将来自与接受者充分免疫学可相容的供体(即，将不经受移植排斥)，以减少或去除对于免疫抑制的需要。在一些实施方案中，所述细胞从异种来源(即，已经遗传工程改造以与接受者充分免疫学可相容的非人类哺乳动物)，或接受者的物种取得。用于确定免疫学相容性的方法为本领域中已知的，并且包括组织分型以分析针对HLA和ABO决定子的供体-接受者相容性。参见例如Transplantation Immunology,Bach和Auchincloss编(Wiley,John&Sons,Incorporated 1994)。
[0243] 任何合适的细胞培养基均可用于本发明的离体方法。
[0244] 术语“受试者”和“个体”在本文中可互换使用，并且是指动物(例如，人类)，从其可获得细胞和/或向其提供用如本文所述的细胞进行的治疗(包括预防性治疗)。关于那些对如人类受试者的特定动物具特异性的感染、病况或疾病状态的治疗，术语受试者是指所述特定动物。如本文中可互换使用的“非人类动物”和“非人类哺乳动物”包括哺乳动物，如大鼠、小鼠、兔、绵羊、猫、狗、牛、猪和非人类灵长类动物。术语“受试者”还涵盖任何脊椎动物，包括但不限于哺乳动物、爬行动物、两栖动物和鱼。然而，有利的是，所述受试者为哺乳动物，如人类或其它哺乳动物(如饲养哺乳动物(例如狗、猫、马等)或生产哺乳动物(例如牛、绵羊、猪等))。
[0245] 在一些实施方案中，所述改变导致所述标靶多核苷酸序列的减少的表达。在一些实施方案中，所述改变导致所述标靶多核苷酸序列的基因剔除。在一些实施方案中，所述改变导致将所述标靶多核苷酸序列从不需要的序列校正为所需序列。在一些实施方案中，各改变为纯合改变。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率为约5％至约80％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率为约10％至约80％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率为约30％至约80％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率为约50％至约80％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率大于或等于约80％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率大于或等于约85％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率大于或等于约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在一些实施方案中，在各基因座处的改变的效率为约100％。
[0246] 在一些实施方案中，各标靶多核苷酸序列被切割，以致双链断裂发生。在一些实施方案中，各标靶多核苷酸序列被切割，以致单链断裂发生。
[0247] 在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列包含CTLA4的多个不同部分。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列包含PD1的多个不同部分。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列包含TCRA的多个不同部分。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列包含TCRB的多个不同部分。在一些实施方案中，所述标靶多核苷酸序列包含B2M的多个不同部分。
[0248] 在一些实施方案中，各标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，各标靶基序为具有5’富T区的20个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，各标靶基序为由G开始的20个核苷酸的DNA序列并且就在由所述Cas蛋白识别的NGG基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在由所述Cas蛋白识别的NGG基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为G(N)19NGG。在一些实施方案中，各标靶基序为(N)20NGG。在一些实施方案中，选择各标靶基序以致当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时，其含有至少两种错配。在一些实施方案中，选择各标靶基序以致当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时，其含有至少两种错配。
[0249] 在一些实施方案中，各标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNGRRT基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNGRRT基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNNRRT基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNNRRT基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNAGAAW基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNAGAAW基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NNNNGATT基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NNNNGATT基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为17至23个核苷酸的DNA序列并且就在NAAAAC基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为20个核苷酸的DNA序列并且就在NAAAAC基序前面。在一些实施方案中，各标靶基序为具有5’富T区(例如，TTTN基序)的17至23个核苷酸的DNA序列。在一些实施方案中，各标靶基序为具有5’富T区(例如，TTTN基序)的20个核苷酸的DNA序列。
[0250] 在一些实施方案中，在所述标靶多核苷酸序列的切割后，发生同系物指导的修复。在一些实施方案中，使用外源引入的DNA修复模板执行同系物指导的修复。在一些实施方案中，外源引入的DNA修复模板为单链的。在一些实施方案中，外源引入的DNA修复模板为双链的。
[0251] 在一些实施方案中，所述Cas蛋白(例如，Cas9或Cpf1)与至少一种核糖核酸复合。在一些实施方案中，所述Cas蛋白(例如，Cas9)与多种核糖核酸复合。在一些实施方案中，选择所述多种核糖核酸以最小化与除所述标靶多核苷酸序列以外的核酸序列(例如，单一标靶多核苷酸序列的多种改变)的杂交。在一些实施方案中，选择所述多种核糖核酸以最小化与除所述标靶多核苷酸序列以外的核酸序列(例如，多种标靶多核苷酸序列的一种或多种改变)的杂交。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的每一者均杂交至当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时含有至少两种错配的标靶基序。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的每一者均杂交至当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时含有至少一种错配的标靶基序。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的每一者均经过设计以杂交至紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的标靶基序。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的每一者均经过设计以杂交至紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的标靶基序，所述标靶基序侧接位于所述标靶基序之间的突变等位基因。
[0252] 在一些实施方案中，所述Cas蛋白(例如，Cpf1)与单一核糖核酸复合。在一些实施方案中，选择所述核糖核酸以最小化与除所述标靶多核苷酸序列以外的核酸序列(例如，单一标靶多核苷酸序列的多种改变)的杂交。在一些实施方案中，选择所述核糖核酸以最小化与除所述标靶多核苷酸序列以外的核酸序列(例如，多种标靶多核苷酸序列的一种或多种改变)的杂交。在一些实施方案中，所述核糖核酸杂交至当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时含有至少两种错配的标靶基序。在一些实施方案中，所述核糖核酸杂交至当与细胞中的所有其它基因组核苷酸序列比较时含有至少一种错配的标靶基序。在一些实施方案中，所述核糖核酸经过设计以杂交至紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的标靶基序。在一些实施方案中，所述核糖核酸经过设计以杂交至紧邻由所述Cas蛋白识别的脱氧核糖核酸基序的标靶基序，所述标靶基序侧接位于所述标靶基序之间的突变等位基因。
[0253] 应理解，所述编码Cas蛋白的核酸或所述核糖核酸(例如，SEQ IDNO:1-780和797-13719)中的任一者均可由质粒表达。在一些实施方案中，所述Cas蛋白或所述核糖核酸中的任一者均使用针对干细胞(例如，人类干细胞和/或祖细胞)中的增加的表达进行优化的启动子来表达。在一些实施方案中，所述启动子选自由巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子和泛素启动子组成的组。
[0254] 在一些实施方案中，本发明方法进一步包括选择表达所述Cas蛋白的细胞。本发明涵盖用于选择细胞的任何合适方法。在一些实施方案中，选择细胞包含FACS。在一些实施方案中，使用FACS来选择共表达Cas和选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的组的荧光蛋白的细胞。
[0255] 治疗方法
[0256] 本发明涵盖治疗和/或预防多种与标靶多核苷酸序列的表达有关的病症。
[0257] 本发明还涵盖使用本发明的经过修饰的原代人类细胞、包含那些细胞的组合物和本发明组合物(例如，嵌合核酸)的多种治疗方法。如应用于分离的细胞的术语“治疗(treat)”、“治疗(treating)”、“治疗(treatment)”等包括使所述细胞经受任何种类的过程或条件或对所述细胞执行任何种类的操纵或程序。如应用于受试者，所述术语是指向个体施用细胞或细胞的群体，其中标靶多核苷酸序列(例如，CTLA4、PD1、TCRA、TCRB、B2M等)已经根据本文所述的方法离体改变。所述个体通常患病或受伤，或相对于所述群体的平均成员处于增加的患病风险中并且需要所述注意、照顾或管理。
[0258] 如本文所用，术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指向受试者施用有效量的具有根据本文所述的方法离体改变的标靶多核苷酸序列的细胞，使得所述受试者具有所述疾病的至少一种症状的减少或所述疾病的改进，例如有益或所需的临床结果。出于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻、疾病程度的削弱、疾病的稳定化(即，不恶化)状态、疾病进展的延迟或减慢、疾病状态的改善或缓和和康复(部分或全部)，无论可检测抑或不可检测。治疗(Treating)可指如与未接受治疗时的预期存活相比延长存活。因此，本领域技术人员认识到治疗可改进疾病病况，但可能并非所述疾病的完全治愈。如本文所用，术语“治疗(treatment)”包括预防。或者，如果疾病的进展减少或停止，那么治疗是“有效的”。“治疗(Treatment)”也可意指如与未接受治疗时的预期存活相比延长存活。需要治疗的那些包括已经被诊断患有与多核苷酸序列的表达有关的病症的那些，以及有可能因为遗传易感性或其它因素而发展所述病症的那些。
[0259] 疾病或病状的“治疗(treatment)”、“预防(prevention)”或“改善(amelioration)”意指延迟或预防所述疾病或病症的发作，逆转、减轻、改善、抑制、减慢或停止进展，与所述疾病或病症有关的病况的进展或严重程度的加重或退化。在一个实施方案中，疾病或病症的症状减轻达至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％或至少
50％。
50％。
[0260] 应理解，本文所述的方法和组合物可用于治疗或预防与细胞中的标靶多核苷酸序列的增加的表达以及标靶多核苷酸序列的降低的表达有关的病症。标靶多核苷酸序列的增加和降低的表达包括其中所述标靶多核苷酸序列的表达水平分别地增加或降低的情况，以及其中所述标靶多核苷酸序列的表达产物的功能和/或活性水平与正常表达和/或活性水平相比分别地增加或降低的情况。本领域技术人员应理解，治疗或预防与标靶多核苷酸序列的增加的表达有关的病症可通过确定在使细胞与本文所述的组合物接触之后在相关细胞中所述标靶多核苷酸序列(或其表达产物)的水平和/或活性是否降低来分析。熟练技术人员还应理解，治疗或预防与标靶多核苷酸序列的降低的表达有关的病症可通过确定在使细胞与本文所述的组合物接触之后在相关细胞中所述标靶多核苷酸序列(或其表达产物)的水平和/或活性是否增加来分析。
[0261] 在一些实施方案中，所述病症是癌症。如本文所用的术语“癌症”是定义为细胞的过度增生，所述细胞的独特特性(正常控制的损失)导致未调节的生长、分化的缺乏、局部组织侵入和转移。关于本发明方法，所述癌症可为任何癌症，包括急性淋巴细胞癌、急性骨髓性白血病、腺泡状横纹肌肉瘤、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳癌、肛门、肛管或肛门直肠癌、眼癌、肝内胆管癌、关节癌、颈部、胆囊或胸膜癌、鼻、鼻腔或中耳癌、口腔癌、外阴癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓癌、结肠癌、食道癌、子宫颈癌、纤维肉瘤、胃肠类癌瘤、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、肾癌、喉癌、白血病、液体肿瘤、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、肥大细胞瘤、黑素瘤、多发性骨髓瘤、鼻咽癌、非霍奇金淋巴瘤、卵巢癌、胰腺癌、腹膜、网膜和肠系膜癌、咽癌、前列腺癌、直肠癌、肾癌、皮肤癌、小肠癌、软组织癌、实体肿瘤、胃癌、睾丸癌、甲状腺癌、输尿管癌和膀胱癌。如本文所用，术语“肿瘤”是指恶性类型(除非另外特定地指示并且不包括良性类型组织)的细胞或组织的异常生长。
[0262] 在一些实施方案中，所述病症为遗传病症。在一些实施方案中，所述病症为单基因病症。在一些实施方案中，所述病症为多基因病症。在一些实施方案中，所述病症为与一种或多种SNP有关的病症。与一种或多种SNP有关的示例性病症包括美国专利号7,627,436中描述的复杂疾病、如PCT国际申请公布号WO/2009/112882中所述的阿尔兹海默氏病、如美国专利申请公布号2011/0039918中所述的发炎疾病、如美国专利申请公布号2012/0309642中所述的多囊卵巢综合征、如美国专利号7,732,139中所述的心血管疾病、如美国专利申请公布号2012/0136039中所述的亨廷顿氏病、如欧洲专利申请公布号EP2535424中所述的血栓栓塞性疾病、如PCT国际申请公布号WO/2012/001613中所述的神经血管疾病、如美国专利申请公布号2010/0292211中所述的精神病、如美国专利申请公布号2011/0319288中所述的多发性硬化、如PCT国际申请公布号WO/2006/023719A2中所述的精神分裂症、分裂情感性障碍和双相障碍、如美国专利申请公布号U.S.2011/0104674中所述的双相障碍和其它小病、如PCT国际申请公布号WO/2006/104370A1中所述的结肠直肠癌、如美国专利申请公布号U.S.2006/0204969中所述的与邻近AKT1基因座的SNP有关的病症、如PCT国际申请公布号WO/2003/012143A1中所述的进食障碍、如美国专利申请公布号U.S.2007/0269827中所述的自身免疫疾病、如美国专利号7,790,370中所述的在具有克罗恩氏病的患者中的纤维狭窄性疾病和如美国专利号8,187,811中所述的帕金森氏病，所述文献中的每一者均以引用的方式整体并入本文中。可根据本发明方法治疗或预防的与一种或多种SNP有关的其它病症对于熟练技术人员来说将为显而易知的。
[0263] 在一些实施方案中，所述病症为慢性传染病。“慢性传染病”是由传染剂引起的疾病，其中所述感染已经持续。所述疾病可包括感染(A、B或C)、疱疹病毒(例如，VZV、HSV-1、HSV-6、HSV-II、CMV和EBV)和HIV/AIDS。非病毒性实例可包括慢性真菌疾病，如曲霉病、念珠菌病、球孢子菌病和与隐球菌有关的疾病和组织胞浆菌病。慢性细菌传染剂的非限制性实例可为肺炎衣原体、单核球增多性李斯特菌和结核分枝杆菌。在一些实施方案中，所述病症为人类免疫缺乏病毒(HIV)感染。在一些实施方案中，所述病症为获得性免疫缺乏综合征(AIDS)。
[0264] 在一些实施方案中，所述病症为自身免疫病症。术语“自身免疫疾病”是指其中受试者针对其本身的组织发起破坏性免疫反应的任何疾病或病症。自身免疫病症可影响受试者(例如，人类)中的几乎每一个器官系统，包括但不限于神经、胃肠和内分泌系统，以及皮肤和其它结缔组织、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫疾病的实例包括但不限于桥本氏甲状腺炎、全身性红斑狼疮、斯耶格伦氏综合征、格雷夫斯氏病、硬皮病、类风湿性关节炎、多发性硬化、重症肌无力和糖尿病。
[0265] 在一些实施方案中，所述病症为移植物抗宿主疾病(GVHD)。
[0266] 本发明方法能够改变多种不同细胞中的标靶多核苷酸序列(例如，改变免疫检查点调节基因(例如CTL4、PD1等)以减少或消除T细胞抑制，改变编码TCRα和β链的基因以减少或消除T细胞自身反应性，和/或改变B2M以消除MHC I类表面表达，和任选地改变与病症有关的一种或多种额外标靶多核苷酸序列，在所述病症中改变所述标靶多核苷酸序列将为有益的，和/或任选地使所述细胞表达调节至少一种生物过程的蛋白质)。在一些实施方案中，本发明方法用于离体改变细胞中的标靶多核苷酸序列以用于后续引入至受试者中。
[0267] 在一些实施方案中，所述细胞或其群体为原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞或其群体为原代T细胞(例如，人类)。所述T细胞可为任何T细胞，包括而不限于细胞毒性T细胞(例如，CD8+细胞)、辅助性T细胞(例如，CD4+细胞)、记忆T细胞、调节T细胞、组织浸润淋巴细胞(例如，肿瘤浸润淋巴细胞，例如TIL、CD3+细胞)和其组合。
[0268] 在一些实施方案中，所述细胞为外周血细胞。在一些实施方案中，所述细胞为干细胞或多能细胞。在一些实施方案中，所述细胞为造血干细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD34+细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD34+动员的外周血细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD34+脐血细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD34+骨髓细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD34+CD38-谱系-CD90+CD45RA-细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD4+细胞。在一些实施方案中，所述细胞为CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞为肝细胞。在一些实施方案中，所述细胞为人类多能细胞。在一些实施方案中，所述细胞为原代人类细胞。在一些实施方案中，所述细胞为原代CD34+细胞。在一些实施方案中，所述细胞为原代CD34+造血祖细胞(HPC)。在一些实施方案中，所述细胞为原代CD4+细胞。在一些实施方案中，所述细胞为原代CD4+ T细胞。在一些实施方案中，所述细胞为自体同源原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞为自体同源原代体细胞。在一些实施方案中，所述细胞为同种异体原代细胞。在一些实施方案中，所述细胞为同种异体原代体细胞。在一些实施方案中，所述细胞为成核细胞。在一些实施方案中，所述细胞为非转化细胞。在一些实施方案中，所述细胞为人类绒膜癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞为JEG-3细胞。在一些实施方案中，所述细胞为单核细胞。在一些实施方案中，所述细胞为Thp-1细胞。在一些实施方案中，所述细胞并非癌细胞。在一些实施方案中，所述细胞并非肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述细胞并非转化细胞。
[0269] 所述细胞或其群体可获自任何受试者，例如患有选自由自身免疫病症、癌症、慢性传染病和移植物抗宿主疾病(GVHD)组成的组的病症、正在治疗所述病症、被诊断患有所述病症、处于发展所述病症的风险中或疑似患有所述病症的受试者。
[0270] 本发明还提供包含本发明的Cas蛋白或其功能部分的组合物、编码所述Cas蛋白或其功能部分的核酸和将Cas蛋白指向细胞中的标靶多核苷酸的标靶基序并且杂交至所述标靶基序的核糖核酸序列。
[0271] 在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的至少一种核糖核酸序列的组合物。在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列、选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的一对核糖核酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和
797-3637组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
797-3637组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:1-195和797-3637组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0272] 在一些实施方案中，所述核糖核酸序列对包含SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72或由SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72组成。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与SEQ ID NO:128和72具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0273] 在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的至少一种核糖核酸序列的组合物。在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列、选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的一对核糖核酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:
196-531和4047-8945组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
196-531和4047-8945组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:196-531和4047-8945组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0274] 在一些实施方案中，所述核糖核酸序列对包含SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421或由SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421组成。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0275] 在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的至少一种核糖核酸序列的组合物。在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列、选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的一对核糖核酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID 532-609和9102-9750组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:532-609和9102-9750组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:532-609和9102-
9750组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
9750组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0276] 在一些实施方案中，所述核糖核酸序列对包含SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573或由SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573组成。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0277] 在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的至少一种核糖核酸序列的组合物。在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列、选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的一对核糖核酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:610-765和9798-10532组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:
610-765和9798-10532组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
610-765和9798-10532组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0278] 在一些实施方案中，所述核糖核酸序列对包含SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662或由SEQ ID NO:657和SEQ ID NO:662组成。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0279] 在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列和选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的至少一种核糖核酸序列的组合物。在一些方面，本文公开了包含编码Cas 9蛋白的核酸序列、选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的一对核糖核酸序列的组合物。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第一核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述第二核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:766-780和10574-13257组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与选自由SEQ ID NO:
766-780和10574-13257组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
766-780和10574-13257组成的组的序列具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0280] 在一些实施方案中，所述核糖核酸序列对包含SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778或由SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778组成。在一些实施方案中，所述核糖核酸对包含与SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778具有至少一种核苷酸错配或至少两种核苷酸错配的序列。
[0281] 在一些方面，本文公开了包含编码Cpf1蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列的核糖核酸的组合物。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:3638-4046组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。
[0282] 在一些方面，本文公开了包含编码Cpf1蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列的核糖核酸的组合物。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:8946-9101组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。
[0283] 在一些方面，本文公开了包含编码Cpf1蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列的核糖核酸的组合物。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:9751-9797组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID 9751-9797组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。
[0284] 在一些方面，本文公开了包含编码Cpf1蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列的核糖核酸的组合物。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:10533-10573组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。
[0285] 在一些方面，本文公开了包含编码Cpf1蛋白的核酸序列和具有选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列的核糖核酸的组合物。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列具有单一核苷酸错配的序列。在一些实施方案中，所述核糖核酸包含与选自由SEQ ID NO:13258-13719组成的组的序列具有两种核苷酸错配的序列。
[0286] 在一些方面，本发明提供了包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含：(a)编码Cas蛋白的核酸序列；和(b)至少一种选自由以下组成的组的核糖核酸序列：(i)SEQ ID NO:1-195和797-3637；(ii)SEQ ID NO:196-531和4047-8945；(iii)SEQ ID NO:532-609和
9102-9750；(iv)SEQ ID NO:610-765和9798-10532；和(v)SEQ ID NO:766-780和10574-
13257；和(i)-(v)的组合。
9102-9750；(iv)SEQ ID NO:610-765和9798-10532；和(v)SEQ ID NO:766-780和10574-
13257；和(i)-(v)的组合。
[0287] 在一些实施方案中，(b)中的所述至少一种核糖核酸序列选自由以下组成的组：(i)SEQ ID NO:128和SEQ ID NO:72；(ii)SEQ ID NO:462和SEQ ID NO:421；(iii)SEQ ID NO:550和SEQ ID NO:573；(iv)SEQID NO:657和SEQ ID NO:662；和(v)SEQ ID NO:773和SEQ ID NO:778；和(i)-(v)的组合。
[0288] 在一些方面，本发明提供了包含嵌合核酸的组合物，所述嵌合核酸包含：(a)编码Cas蛋白的核酸序列；和(b)选自由以下组成的组的核糖核酸序列：(i)SEQ ID NO:3638-4046；(ii)SEQ ID NO:8946-9101；(iii)SEQ ID NO:9751-9797；(iv)SEQ ID NO:10533-
10573；和(v)SEQ ID NO:13258-13719；和(i)-(v)的组合。
10573；和(v)SEQ ID NO:13258-13719；和(i)-(v)的组合。
[0289] 在一些实施方案中，所述组合物进一步包含编码可检测的标记物的核酸序列。
[0290] 在一些实施方案中，所述组合物包括至少一种用于改变标靶多核苷酸序列的额外核糖核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括至少两种用于改变标靶多核苷酸序列的额外核糖核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括至少三种用于改变标靶多核苷酸序列的额外核糖核酸序列。在一些实施方案中，所述组合物包括至少四种用于改变标靶多核苷酸序列的额外核糖核酸序列。
[0291] 在一些实施方案中，所述组合物中的核糖核酸中的至少一者是如本文所述的经过修饰的核糖核酸(例如合成、经过修饰的核糖核酸，例如包含选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的一种至两种经过修饰的核苷酸，或本文所述的任何其它经过修饰的核苷酸或修饰)。
[0292] 在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cas蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cas9蛋白或其功能部分的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cpf1蛋白或其功能部分的核酸序列。
[0293] 在一些实施方案中，所述组合物中的核糖核酸中的至少一者是如本文所述的经过修饰的核糖核酸(例如合成、经过修饰的核糖核酸，例如包含选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的一种至两种经过修饰的核苷酸，或本文所述的任何其它经过修饰的核苷酸或修饰)。在一些实施方案中，所述组合物中的一对核糖核酸是如本文所述的经过修饰的核糖核酸(例如合成、经过修饰的核糖核酸，例如包含选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的一种至两种经过修饰的核苷酸，或本文所述的任何其它经过修饰的核苷酸或修饰)。
[0294] 在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cas蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cas9蛋白或其功能部分的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cas蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cas9蛋白或其功能部分的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含编码Cpf1蛋白或其功能部分的核酸序列。
[0295] 在一些实施方案中，所述编码所述Cas蛋白(例如，Cas9或Cpf1)的核酸包含如本文所述的经过修饰的核糖核酸(例如本文所述的合成、经过修饰的mRNA，例如包含选自由假尿苷、5-甲基胞嘧啶、2-硫代-尿苷、5-甲基尿苷-5’-三磷酸、4-硫代尿苷-5’-三磷酸、5,6-二氢尿苷-5’-三磷酸和5-氮杂尿苷-5’-三磷酸组成的组的至少一种经过修饰的核苷酸，或本文所述的任何其它经过修饰的核苷酸或修饰)。
[0296] 在一些实施方案中，本发明组合物包含编码选自由绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白组成的组的荧光蛋白的核酸序列。在一些实施方案中，本发明组合物包含可操作性连接至所述嵌合核酸的启动子。在一些实施方案中，所述启动子针对人类细胞中的增加的表达进行优化。在一些实施方案中，所述启动子针对人类干细胞中的增加的表达进行优化。在一些实施方案中，所述启动子针对原代人类细胞中的增加的表达进行优化。在一些实施方案中，所述启动子是选自由巨细胞病毒(CMV)早期增强子元件和鸡β-肌动蛋白启动子、鸡β-肌动蛋白启动子、延伸因子-1α启动子和泛素启动子组成的组。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cas9蛋白或其功能部分。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含Cpf1蛋白或其功能部分。
[0298] 施用细胞
[0299] 在一些方面，本发明提供了一种将细胞施用于需要所述细胞的受试者的方法，所述方法包括：(a)使细胞或细胞的群体离体与Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸和将Cas蛋白指向所述细胞或其群体中的选自由编码CTLA4、PD1、TCRA、TCRB、B2M和其组合的标靶多核苷酸序列组成的组的至少一种标靶多核苷酸序列并且杂交至所述至少一种标靶多核苷酸序列的至少一种核酸核酸接触，其中所述至少一种标靶多核苷酸序列被切割；和(b)将从(a)得到的细胞施用于需要所述细胞的受试者。
[0300] 在一些方面，本发明提供了一种将细胞施用于需要所述细胞的受试者的方法，所述方法包括：(a)使细胞或细胞的群体离体与(i)Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸，和(ii)将Cas蛋白指向所述细胞或细胞的群体中的选自由编码CTLA4、PD1、TCRA、TCRB、B2M和其组合的标靶多核苷酸序列组成的组的至少一种标靶多核苷酸序列并且杂交至所述至少一种标靶多核苷酸序列的至少一对核酸核酸接触，其中所述标靶多核苷酸序列被切割；和(b)将从(a)得到的一种或多种细胞施用于需要所述细胞的受试者。
[0301] 在一些方面，本发明提供了一种将细胞施用于需要所述细胞的受试者的方法，所述方法包括：(a)使细胞或细胞的群体离体与(i)Cas蛋白或编码Cas蛋白的核酸，和(ii)将Cas蛋白指向所述细胞或细胞的群体中的选自由编码CTLA4、PD1、TCRA、TCRB、B2M和其组合的标靶多核苷酸序列组成的组的标靶多核苷酸序列并且杂交至所述标靶多核苷酸序列的一种核酸核酸接触，其中所述标靶多核苷酸序列被切割；和(b)将从(a)得到的一种或多种细胞施用于需要所述细胞的受试者。
[0302] 预期施用细胞的方法可适于其中可需要施用所述细胞的任何目的(例如，用于将细胞同种异体施用于需要所述细胞的受试者)。在一些实施方案中，需要细胞施用的受试者患有病症。例如，所述受试者可患有其中所述特定细胞在功能或数目方面降低的病症，并且可需要施用从其中所述特定细胞适当地发挥功能的健康或正常个体获得的功能细胞并且可需要施用适当数目的那些健康细胞至所述个体以恢复由那些细胞提供的功能(例如，在细胞数目或功能方面已经降低的产激素细胞，在细胞数目或功能方面已经降低的免疫细胞等)。在所述情况下，所述健康细胞可经过工程改造以降低所述健康细胞的宿主排斥的可能性。在一些实施方案中，所述病症包含遗传病症。在一些实施方案中，所述病症包含感染。在一些实施方案中，所述病症包含HIV或AIDs。在一些实施方案中，所述病症包含癌症。在一些实施方案中，所述病症包含自身免疫疾病。
[0303] 细胞的群体可在施用所述细胞以选择其中已经编辑其基因组的细胞之前进行分选(例如，使用FACS)。分选的细胞可接着扩增至用于所述特定病症的移植所需的细胞的量，就所述病症来说第二受试者需要所述细胞。在一些实施方案中，所述方法可包括在施用步骤之前使经过基因组修饰的细胞与Cas蛋白和靶向与所述病症有关的一种或多种额外标靶多核苷酸的一种或多种指导RNA序列接触，就所述病症来说第二受试者(即，接受者)需要所述细胞。例如在HIV的情况下，经过基因组修饰的细胞可与Cas蛋白和靶向CCR5和/或CXCR4基因的一种或多种指导RNA序列接触，由此编辑经过基因组修饰的细胞的基因组以消除或减少CCR5和/或CXCR4的表面表达。所述细胞对于施用于第二受试者(例如，患有HIV或AIDS)来说将为有益的，因为其将由于缺乏MHC I类分子表面表达而消除或减少不想要的宿主免疫反应的可能性，并且由于缺乏CCR5和/或CXCR4表面表达而几乎不展现对HIV感染的易感性。
[0304] 如本文所用，“核酸”以其最广泛含义包括包含经由磷酸二酯键连接的核苷酸的聚合物的任何化合物和/或物质。示例性核酸包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)、苏糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA)或其杂合物。其还可包括RNAi诱导剂、RNAi剂、siRNA、shRNA、miRNA、反义RNA、核酶、催化性DNA、tRNA、诱导三螺旋形成的RNA、适体、载体等。在一些实施方案中，所述编码所述Cas蛋白的核酸为mRNA。在一些实施方案中，所述Cas蛋白由经过修饰的核酸(例如，本文所述的合成、经过修饰的mRNA)编码。
[0305] 本发明涵盖熟练技术人员可用的任何核酸修饰的使用。本发明核酸可包括多种修饰。在一些实施方案中，所述核酸包含选自由吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代-假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟基甲基胞苷、1-甲基-假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮杂-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮杂-假异胞苷、泽布拉林、5-氮杂-泽布拉林、5-甲基-泽布拉林、5-氮杂-2-硫代-泽布拉林、2-硫代-泽布拉林、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、
4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮杂-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷、7-脱氮杂-鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、
6-硫代-7-脱氮杂-鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷和其组合组成的组的一种或多种修饰。
4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮杂-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮杂-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲基硫代-N6-(顺-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰基氨甲酰基腺苷、N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、2-甲基硫代-N6-苏氨酰基氨甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲基硫代-腺嘌呤和2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、丫苷、怀丁苷、7-脱氮杂-鸟苷、7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、
6-硫代-7-脱氮杂-鸟苷、6-硫代-7-脱氮杂-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷和其组合组成的组的一种或多种修饰。
[0306] 用于制造或合成本发明的经过修饰的RNA的经过修饰的核苷和核苷酸的制备可涉及多种化学基团的保护和脱保护。对于保护和脱保护的需要和适当保护基的选择可由本领域技术人员容易地确定。
[0307] 保护基的化学性质可发现于例如Greene等人,Protective Groups in Organic Synthesis,第2版,Wiley&Sons,1991中，其以引用的方式整体并入本文中。
[0308] 经过修饰的核苷和核苷酸可根据Ogata等人Journal of Organic Chemistry 74:2585-2588,2009；Purmal等人Nucleic Acids Research 22(1):72-78,1994；Fukuhara等人Biochemistry 1(4):563-568,1962；和Xu等人Tetrahedron 48(9):1729-1740,1992中所述的合成方法来制备，所述文献中的每一者均以引用的方式整体并入。
[0309] 经过修饰的核酸(例如，核糖核酸)无需沿着所述分子的整个长度均匀地进行修饰。不同核苷酸修饰和/或骨架结构可存在于所述核酸中的多个位置处。本领域技术人员应理解，核苷酸类似物或其它修饰可位于核酸中的任何位置处，以致所述核酸的功能并未大体上降低。修饰也可为5′或3′端修饰。所述核酸可含有最少一个并且最多100％的经过修饰的核苷酸，或任何介于中间的百分率，如至少50％的经过修饰的核苷酸、至少80％的经过修饰的核苷酸或至少90％的经过修饰的核苷酸。
[0310] 在一些实施方案中，至少一种核糖核酸为经过修饰的核糖核酸。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的至少一者为经过修饰的核糖核酸。在一些实施方案中，所述一种至两种核糖核酸中的每一者均为经过修饰的核糖核酸。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的至少一者为经过修饰的核糖核酸。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的多者为经过修饰的。在一些实施方案中，所述多种核糖核酸中的每一者均为经过修饰的。本领域技术人员应理解，所述经过修饰的核糖核酸可包括本文所述的核酸修饰中的一者或多者。
[0311] 在一些方面，本文提供了编码多肽的合成、经过修饰的RNA分子，其中所述合成、经过修饰的RNA分子包含一种或多种修饰，以致将所述合成、经过修饰的RNA分子引入细胞中会导致相对于与不包含所述一种或多种修饰的编码多肽的合成RNA分子接触的细胞减少的先天免疫反应。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含编码Cas蛋白的合成、经过修饰的RNA分子。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含编码Cas9蛋白的合成、经过修饰的RNA分子。在一些实施方案中，所述Cas蛋白包含编码Cpf1蛋白的合成、经过修饰的RNA分子。
[0312] 本文所述的合成、经过修饰的RNA包括修饰以防止由核酸内切酶和核酸外切酶引起的快速降解并且避免或减少所述细胞对所述RNA的先天免疫或干扰素反应。修饰包括但不限于例如(a)末端修饰，例如5′端修饰(磷酸化、脱磷酸化、缀合、倒置的键等)、3′端修饰(缀合、DNA核苷酸、倒置的键等)，(b)碱基修饰，例如用经过修饰的碱基、稳定化碱基、去稳定化碱基或与搭配物的扩展谱系碱基配对的碱基或缀合的碱基置换，(c)糖修饰(例如，至少2′位置或4′位置)或糖的置换，以及(d)核苷间键修饰，包括磷酸二酯键的修饰或置换。就所述修饰干扰反应(即，相对于所述修饰的缺乏导致翻译的50％或更高减少，例如在兔网状细胞体外翻译分析中)来说，所述修饰不适用于本文所述的方法和组合物。适用于本文所述的方法的合成、经过修饰的RNA组合物的具体实例包括但不限于含有经过修饰的或非天然核苷间键的RNA分子。具有经过修饰的核苷间键的合成、经过修饰的RNA尤其包括在所述核苷间键中不具有磷原子的那些。在其它实施方案中，所述合成、经过修饰的RNA在其核苷间键中具有磷原子。
[0313] 经过修饰的核苷间键的非限制性实例包括硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其它烷基膦酸酯(包括3′-亚烷基膦酸酯和手性膦酸酯)、亚膦酸酯、氨基磷酸酯(包括3′-氨基氨基磷酸酯和氨基烷基氨基磷酸酯、硫逐氨基磷酸酯)、硫逐烷基膦酸酯、硫逐烷基磷酸三酯和具有正常3′-5′键的硼烷膦酸酯、这些物质的2′-5′连接的类似物，和具有倒转极性的那些，其中相邻的核苷单元对是3′-5′至5′-3′或2′-5′至5′-2′连接的。还包括多种盐、混合盐和游离酸形式。
[0314] 教导以上含磷键的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,195；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,
302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,
476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,
361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,
277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,
167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE39464，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,
476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,316；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,
361；5,625,050；6,028,188；6,124,445；6,160,109；6,169,170；6,172,209；6,239,265；6,
277,603；6,326,199；6,346,614；6,444,423；6,531,590；6,534,639；6,608,035；6,683,
167；6,858,715；6,867,294；6,878,805；7,015,315；7,041,816；7,273,933；7,321,029；和美国专利RE39464，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0315] 其中不包括磷原子的经过修饰的核苷间键具有由短链烷基或环烷基核苷间键、混合杂原子和烷基或环烷基核苷间键或一种或多种短链杂原子或杂环核苷间键形成的核苷间键。这些包括具有吗啉基键(部分地由核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲酰基和硫代甲酰基骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；含烯烃骨架；氨基磺酸酯骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N、O、S和CH2组分部分的那些。
[0316] 教导经过修饰的寡核苷的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,64,562；5,264,564；
5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,
086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,
677,437；和5,677,439，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,
086；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,
677,437；和5,677,439，其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0317] 本文所述的合成、经过修饰的RNA的一些实施方案包括具有硫代磷酸酯核苷间键的核酸和具有杂原子核苷间键，和尤其上文提及的美国专利号5,489,677的—CH2-NH—CH2-、—CH2-N(CH3)-O—CH2-[被称作亚甲基(甲基亚氨基)或MMI]、—CH2-O—N(CH3)-CH2-、—CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-和—N(CH3)-CH2-CH2-[其中原生磷酸二酯核苷间键被表示为—O—P—O—CH2-]，和上文提及的美国专利号5,602,240的酰胺骨架的寡核苷，所述美国专利中的两者均以引用的方式整体并入本文中。在一些实施方案中，本文所提供的核酸序列具有上文提及的美国专利号5,034,506(以引用的方式整体并入本文中)的吗啉基骨架结构。
[0318] 本文所述的合成、经过修饰的RNA还可含有一个或多个取代的糖部分。本文提供的核酸可在2′位置处包括以下之一：H(脱氧核糖)；OH(核糖)；F；O—、S—或N-烷基；O—、S—或N-烯基；O—、S-或N-炔基；或O-烷基-O-烷基，其中所述烷基、烯基和炔基可为取代或未取代的C1至C10烷基或C2至C10烯基和炔基。示例性修饰包括O[(CH2)nO]mCH3、O(CH2).nOCH3、O(CH2)nNH2、O(CH2)nCH3、O(CH2)nONH2和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1至约10。在一些实施方案中，合成、经过修饰的RNA在2′位置处包括以下之一：C1至C10低碳烷基、取代的低碳烷基、烷芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳烷基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、杂环烷基、杂环烷芳基、氨基烷基氨基、聚烷基氨基、取代的硅烷基、报告基团、嵌入剂、用于改进RNA的药物动力学特性的基团或用于改进合成、经过修饰的RNA的药效学特性的基团和具有相似特性的其它取代基。在一些实施方案中，所述修饰包括2′甲氧基乙氧基(2′-O—CH2CH2OCH3，还称作2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等人,Helv.Chim.Acta,1995,78:486-504)，即烷氧基-烷氧基。另一示例性修饰为2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即O(CH2)2ON(CH3)2基团(还称作2′-DMAOE)，和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(本领域中还称作2′-O-二甲基氨基乙氧基乙基或2′-DMAEOE)，即2′-O—CH2-O—CH2-N(CH2)2。
[0319] 其它修饰包括2′-甲氧基(2′-OCH3)、2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。相似修饰也可在核酸序列上的其它位置处进行，尤其在3′端核苷酸上或在2′-5′连接的核苷酸中的糖的3′位置和5′端核苷酸的5′位置。合成、经过修饰的RNA也可具有代替呋喃戊糖基糖的糖模拟物，如环丁基部分。教导所述经过修饰的糖结构的制备的代表性美国专利包括但不限于美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,
909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中某些由本申请共同拥有，并且其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920，其中某些由本申请共同拥有，并且其中每一者均以引用的方式整体并入本文中。
[0320] 作为非限制性实例，本文所述的合成、经过修饰的RNA可包括至少一个经过修饰的核苷，包括2′-O-甲基修饰的核苷、包含5′硫代磷酸酯基的核苷、2′-氨基修饰的核苷、2′-烷基修饰的核苷、吗啉基核苷、包含氨基磷酸酯或非天然碱基的核苷或其任何组合。
[0321] 在本文所述的这一方面和所有其它所述方面的一些实施方案中，所述至少一个经过修饰的核苷选自由5-甲基胞苷(5mC)、N6-甲基腺苷(m6A)、3,2′-O-二甲基尿苷(m4U)、2-硫代尿苷(s2U)、2′氟尿苷、假尿苷、2′-O-甲基尿苷(Um)、2′脱氧尿苷(2′dU)、4-硫代尿苷(s4U)、5-甲基尿苷(m5U)、2′-O-甲基腺苷(m6A)、N6,2′-O-二甲基腺苷(m6Am)、N6,N6,2′-O-三甲基腺苷(m62Am)、2′-O-甲基胞苷(Cm)、7-甲基鸟苷(m7G)、2′-O-甲基鸟苷(Gm)、N2,7-二甲基鸟苷(m2,7G)、N2,N2,7-三甲基鸟苷(m2,2,7G)和肌酐(I)组成的组。
[0322] 或者，合成、经过修饰的RNA可包含至少两个经过修饰的核苷、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少15个、至少20个或更多个，直至所述核苷酸的整个长度。至少，包含至少一个经过修饰的核苷的合成、经过修饰的RNA分子包含具有如本文所述的修饰的单一核苷。给定的合成、经过修饰的RNA中的所有位置不必要均匀地进行修饰，并且事实上以上提及的修饰中的超过一者可并入单一合成、经过修饰的RNA中或甚至合成、经过修饰的RNA中的单一核苷处。然而，优选但并非绝对地有必要修饰分子中的给定核苷的每一处存在(例如，各胞嘧啶为经过修饰的胞嘧啶，例如5mC)。然而，还预期在给定的合成、经过修饰的RNA分子中的同一核苷的不同存在可以不同方式进行修饰(例如，一些胞嘧啶为被修饰为5mC，其它被修饰为2′-O-甲基胞苷或其它胞嘧啶类似物)。对于合成、经过修饰的RNA中的多个经过修饰的核苷中的每一者来说，所述修饰无需相同。此外，在本文所述的方面的一些实施方案中，合成、经过修饰的RNA包含至少两个不同的经过修饰的核苷。在本文所述的方面的一些所述优选实施方案中，所述至少两个不同的经过修饰的核苷为5-甲基胞苷和假尿苷。合成、经过修饰的RNA也可含有经过修饰和未修饰的核苷的混合物。
[0323] 如本文所用，“未修饰的”或“天然”核苷或核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。在一些实施方案中，合成、经过修饰的RNA包含至少一种核苷(“碱基”)修饰或取代。经过修饰的核苷包括其它合成和天然核碱基，如肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、纳布拉林(nubularine)、异鸟苷、杀结核菌素、2-(卤基)腺嘌呤、2-(烷基)腺嘌呤、2-(丙基)腺嘌呤、2(氨基)腺嘌呤、2-(氨基烷基)腺嘌呤、2(氨基丙基)腺嘌呤、2(甲硫基)N6(异戊烯基)腺嘌呤、6(烷基)腺嘌呤、6(甲基)腺嘌呤、7(脱氮杂)腺嘌呤、8(烯基)腺嘌呤、8-(烷基)腺嘌呤、8(炔基)腺嘌呤、8(氨基)腺嘌呤、8-(卤基)腺嘌呤、8-(羟基)腺嘌呤、8(硫代烷基)腺嘌呤、8-(硫醇)腺嘌呤、N6-(异戊基)腺嘌呤、N6(甲基)腺嘌呤、N6,N6(二甲基)腺嘌呤、2-(烷基)鸟嘌呤、2(丙基)鸟嘌呤、6-(烷基)鸟嘌呤、6(甲基)鸟嘌呤、7(烷基)鸟嘌呤、7(甲基)鸟嘌呤、7(脱氮杂)鸟嘌呤、8(烷基)鸟嘌呤、8-(烯基)鸟嘌呤、8(炔基)鸟嘌呤、8-(氨基)鸟嘌呤、8(卤基)鸟嘌呤、8-(羟基)鸟嘌呤、8(硫代烷基)鸟嘌呤、8-(硫醇)鸟嘌呤、N(甲基)鸟嘌呤、2-(硫代)胞嘧啶、3(脱氮杂)5(氮杂)胞嘧啶、3-(烷基)胞嘧啶、3(甲基)胞嘧啶、5-(烷基)胞嘧啶、5-(炔基)胞嘧啶、5(卤基)胞嘧啶、5(甲基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(丙炔基)胞嘧啶、5(三氟甲基)胞嘧啶、6-(偶氮)胞嘧啶、N4(乙酰基)胞嘧啶、3(3氨基-3羧基丙基)尿嘧啶、2-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2(硫代)尿嘧啶、4-(硫代)尿嘧啶、5(甲基)4(硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-4(硫代)尿嘧啶、5(甲基)2,4(二硫代)尿嘧啶、5(甲基氨基甲基)-2,4(二硫代)尿嘧啶、5(2-氨基丙基)尿嘧啶、5-(烷基)尿嘧啶、5-(炔基)尿嘧啶、5-(烯丙基氨基)尿嘧啶、5(氨基烯丙基)尿嘧啶、5(氨基烷基)尿嘧啶、5(胍烷基)尿嘧啶、5(1,3-二唑-1-烷基)尿嘧啶、5-(氰基烷基)尿嘧啶、5-(二烷基氨基烷基)尿嘧啶、5(二甲基氨基烷基)尿嘧啶、5-(卤基)尿嘧啶、
5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5氧基乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、
1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-
3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-
1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-
2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、纳布拉林、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-脱氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2,
6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、取代的1,
2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。经过修饰的核苷还包括包含缀合的部分(例如，配体)的天然碱基。如上文所论述，含有所述经过修饰的核苷的RNA必须可在宿主细胞中翻译(即，不防止由所述经过修饰的RNA编码的多肽的翻译)。例如，含有s2U和m6A的转录物在兔网状细胞裂解物中不良地翻译，而假尿苷、m5U和m5C可与有效翻译相容。另外，本领域中已知适用于增加转录物的核酸酶抗性的2′-氟修饰的碱基导致非常低效的翻译。翻译可由本领域技术人员使用例如兔网状细胞裂解物翻译分析来分析。
5-(甲氧基)尿嘧啶、尿嘧啶-5氧基乙酸、5(甲氧基羰基甲基)-2-(硫代)尿嘧啶、5(甲氧基羰基-甲基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(丙炔基)尿嘧啶、5(三氟甲基)尿嘧啶、6(偶氮)尿嘧啶、二氢尿嘧啶、N3(甲基)尿嘧啶、5-尿嘧啶(即，假尿嘧啶)、2(硫代)假尿嘧啶、4(硫代)假尿嘧啶、2,4-(二硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)假尿嘧啶、5-(甲基)假尿嘧啶、5-(烷基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2-(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-4(硫代)假尿嘧啶、5-(烷基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶、5-(甲基)-2,4(二硫代)假尿嘧啶、1取代的假尿嘧啶、1取代的2(硫代)-假尿嘧啶、1取代的4(硫代)假尿嘧啶、1取代的2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基-羰基乙烯基)-2(硫代)-假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-4(硫代)假尿嘧啶、1(氨基烷基氨基羰基乙烯基)-2,4-(二硫代)假尿嘧啶、1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、
1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-取代的1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-取代的1-(氮杂)-2-(硫代)-
3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(氨基烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-
1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噁嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1,3-(二氮杂)-2-(氧代)-吩噻嗪-1-基、7-(胍烷基羟基)-1-(氮杂)-2-(硫代)-3-(氮杂)-吩噻嗪-1-基、1,3,5-(三氮杂)-
2,6-(二氧杂)-萘、肌苷、黄嘌呤、次黄嘌呤、纳布拉林、杀结核菌素、异鸟苷、肌苷基、2-氮杂-肌苷基、7-脱氮杂-肌苷基、硝基咪唑基、硝基吡唑基、硝基苯并咪唑基、硝基吲唑基、氨基吲哚基、吡咯并嘧啶基、3-(甲基)异喹诺酮基、5-(甲基)异喹诺酮基、3-(甲基)-7-(丙炔基)异喹诺酮基、7-(氮杂)吲哚基、6-(甲基)-7-(氮杂)吲哚基、咪唑并吡啶基、9-(甲基)-咪唑并吡啶基、吡咯并吡嗪基、异喹诺酮基、7-(丙炔基)异喹诺酮基、丙炔基-7-(氮杂)吲哚基、2,4,5-(三甲基)苯基、4-(甲基)吲哚基、4,6-(二甲基)吲哚基、苯基、萘基、蒽基、菲基、芘基、芪基、并四苯基、并五苯基、二氟甲苯基、4-(氟)-6-(甲基)苯并咪唑、4-(甲基)苯并咪唑、6-(偶氮)胸腺嘧啶、2-吡啶酮、5硝基吲哚、3硝基吡咯、6-(氮杂)嘧啶、2(氨基)嘌呤、2,
6-(二氨基)嘌呤、5取代的嘧啶、N2-取代的嘌呤、N6-取代的嘌呤、06-取代的嘌呤、取代的1,
2,4-三唑、吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻位取代的6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、对(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、邻(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、双-邻(氨基烷基羟基)-6-苯基-吡咯并-嘧啶-2-酮-3-基、吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-7-氨基-吡啶并嘧啶-3-基、2-氧代-吡啶并嘧啶-3-基或其任何O-烷基化或N-烷基化衍生物。经过修饰的核苷还包括包含缀合的部分(例如，配体)的天然碱基。如上文所论述，含有所述经过修饰的核苷的RNA必须可在宿主细胞中翻译(即，不防止由所述经过修饰的RNA编码的多肽的翻译)。例如，含有s2U和m6A的转录物在兔网状细胞裂解物中不良地翻译，而假尿苷、m5U和m5C可与有效翻译相容。另外，本领域中已知适用于增加转录物的核酸酶抗性的2′-氟修饰的碱基导致非常低效的翻译。翻译可由本领域技术人员使用例如兔网状细胞裂解物翻译分析来分析。
[0324] 其它经过修饰的核碱基包括美国专利号3,687,808中公布的那些、Modified Nucleosides in Biochemistry,Biotechnology and Medicine,Herdewijn,P.编Wiley-VCH,2008中公布的那些；2009年3月26日提交的国际申请号PCT/US09/038,425中公布的那些；The Concise Encyclopedia Of Polymer Science And Engineering,第858-859页,Kroschwitz,J.L编John Wiley&Sons,1990中公布的那些，和由Englisch等人,Angewandte Chemie,国际版,1991,30,613公布的那些。
[0325] 教导以上提及的经过修饰的核碱基以及其它经过修饰的核碱基中的某些的制备的代表性美国专利包括但不限于以上指出的美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,30；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,457,191；
5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,
091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,
380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088(其中每一者均以引用的方式整体并入本文中)，和美国专利号5,750,692(也以引用的方式整体并入本文中)。
5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121,5,596,
091；5,614,617；5,681,941；6,015,886；6,147,200；6,166,197；6,222,025；6,235,887；6,
380,368；6,528,640；6,639,062；6,617,438；7,045,610；7,427,672；和7,495,088(其中每一者均以引用的方式整体并入本文中)，和美国专利号5,750,692(也以引用的方式整体并入本文中)。
[0326] 用于本文所述的合成、经过修饰的RNA的另一修饰涉及将一种或多种增强所述RNA的活性、细胞分布或细胞摄取的配体、部分或缀合物化学连接至所述RNA。本文所述的合成、经过修饰的RNA可进一步包含5′帽。在本文所述的方面的一些实施方案中，所述合成、经过修饰的RNA包含5′帽，所述5′帽包含使用5′-5′三磷酸键连接至RNA分子的5′端的经过修饰的鸟嘌呤核苷酸。如本文所用，还预期术语“5′帽”涵盖其它5′帽类似物，包括例如5′二鸟苷帽、具有亚甲基-双(膦酸酯)部分的四磷酸酯帽类似物(参见例如Rydzik,A M等人,(2009)Org Biomol Chem 7(22):4763-76)、具有硫代磷酸酯修饰的二核苷酸帽类似物(参见例如Kowalska,J.等人,(2008)RNA 14(6):1119-1131)、具有用于非桥接氧的硫取代的帽类似物(参见例如Grudzien-Nogalska,E.等人,(2007)RNA 13(10):1745-1755)、N7-苯甲基化二核苷四磷酸酯类似物(参见例如Grudzien,E.等人,(2004)RNA 10(9):1479-1487)或抗反向帽类似物(参见例如Jemielity,J.等人,(2003)RNA 9(9):1108-1122和Stepinski,J.等人,(2001)RNA 7(10):1486-1495)。在一个所述实施方案中，所述5′帽类似物为5′二鸟苷帽。在一些实施方案中，所述合成、经过修饰的RNA不包含5′三磷酸。
[0327] 所述5′帽对于mRNA的识别和附接至核糖体以开始翻译至关重要。所述5′帽还保护所述合成、经过修饰的RNA免于5′核酸外切酶介导的降解。合成、经过修饰的RNA包含5′帽并不是绝对需求，并且因此在其它实施方案中，所述合成、经过修饰的RNA缺乏5′帽。然而，归因于包含5′帽的合成、经过修饰的RNA的较长半衰期和增加的翻译效率，包含5′帽的合成、经过修饰的RNA在本文中是优选的。
[0328] 本文所述的合成、经过修饰的RNA可进一步包含5′和/或3′非翻译区(UTR)。非翻译区是所述RNA中在起始密码子(5′)之前并且在终止密码子(3′)之后的区域，并且因此未由翻译机构翻译。用一个或多个非翻译区修饰RNA分子可改进mRNA的稳定性，因为所述非翻译区可干扰RNA降解中所涉及的核糖核酸酶和其它蛋白。另外，用5′和/或3′非翻译区修饰RNA可通过结合会改变核糖体与mRNA的结合的蛋白质而增强翻译效率。用3′UTR修饰RNA可用于维持所述RNA的细胞质定位，从而允许在细胞的细胞质中发生翻译。在一个实施方案中，本文所述的合成、经过修饰的RNA不包含5′或3′UTR。在另一实施方案中，所述合成、经过修饰的RNA包含5′或3′UTR。在另一实施方案中，本文所述的合成、经过修饰的RNA包含5′和3′UTR。在一个实施方案中，所述5′和/或3′UTR选自已知在细胞中具有高稳定性的mRNA(例如，鼠类α-球蛋白3′UTR)。在一些实施方案中，所述5′UTR、所述3′UTR或两者包含一个或多个经过修饰的核苷。
[0329] 在一些实施方案中，本文所述的合成、经过修饰的RNA进一步包含Kozak序列。“Kozak序列”是指真核mRNA上具有共有(gcc)gccRccAUGG的序列，其中R为起始密码子(AUG)上游三个碱基处的嘌呤(腺嘌呤或鸟嘌呤)，在所述起始密码子之后为另一‘G’。所述Kozak共有序列由所述核糖体识别以开始多肽的翻译。典型地，开始发生在所述翻译机构所遇到的第一个AUG密码子处，所述密码子接近转录物的5′端。然而，在一些情况下，这一AUG密码子可在称作漏扫描的过程中被避开。在所述AUG密码子附近存在Kozak序列将强化所述密码子作为翻译的开始位点，以致发生正确多肽的翻译。此外，将Kozak序列添加至合成、经过修饰的RNA中将促进更有效翻译，即使关于所述起始密码子存在确定性。因此，在一些实施方案中，本文所述的合成、经过修饰的RNA进一步在所需位点处包含Kozak共有序列以开始翻译来产生正确长度的多肽。在一些所述实施方案中，所述Kozak序列包含一个或多个经过修饰的核苷。
[0330] 在一些实施方案中，本文所述的合成、经过修饰的RNA进一步包含“聚(A)尾”，所述聚(A)尾是指腺嘌呤核苷酸的3′均聚物尾，其长度可改变(例如，至少5个腺嘌呤核苷酸)并且可长达数百个腺嘌呤核苷酸)。3′聚(A)尾的纳入可保护所述合成、经过修饰的RNA免于在细胞中降解，并且还促进核外定位以增强翻译效率。在一些实施方案中，所述聚(A)尾包含1个与500个之间的腺嘌呤核苷酸；在其它实施方案中，所述聚(A)尾包含至少5个、至少10个、至少20个、至少30个、至少40个、至少50个、至少60个、至少70个、至少80个、至少90个、至少100个、至少110个、至少120个、至少130个、至少140个、至少150个、至少160个、至少170个、至少180个、至少190个、至少200个、至少225个、至少250个、至少275个、至少300个、至少325个、至少350个、至少375个、至少400个、至少425个、至少450个、至少475个、至少500个腺嘌呤核苷酸或更多个。在一个实施方案中，所述聚(A)尾包含1个与150个之间的腺嘌呤核苷酸。在另一实施方案中，所述聚(A)尾包含90个与120个之间的腺嘌呤核苷酸。在一些所述实施方案中，所述聚(A)尾包含一个或多个经过修饰的核苷。
[0331] 预期对本文所述的合成、经过修饰的RNA的一种或多种修饰允许所述合成、经过修饰的RNA在细胞中的更大稳定性。就所述修饰允许翻译并且减少或不恶化细胞对具有所述修饰的合成、经过修饰的RNA的天生免疫或干扰素反应来说，特定地预期所述修饰用于本文中。一般说来，合成、经过修饰的RNA的稳定性越大，可从所述合成、经过修饰的RNA产生更多蛋白质。典型地，哺乳动物mRNA中富AU区的存在倾向于使转录物不稳定，因为细胞蛋白被募集至富AU区以刺激所述转录物的聚(A)尾的去除。合成、经过修饰的RNA的聚(A)尾的损失可导致增加的RNA降解。因此，在一个实施方案中，如本文所述的合成、经过修饰的RNA不包含富AU区。具体说来，优选的是所述3′UTR大体上缺乏AUUUA序列元件。
[0332] 在一个实施方案中，配体改变了其中并入所述配体的合成、经过修饰的RNA的细胞摄取、细胞内靶向或半衰期。在一些实施方案中，配体提供了如例如与缺乏所述配体的组合物相比增强的对于所选标靶(例如，分子、细胞或细胞类型、细胞内隔室(例如，线粒体、细胞质、过氧化物酶体、溶酶体))的亲和力。优选的配体不会干扰从所述合成、经过修饰的RNA表达多肽。
[0333] 所述配体可为可例如通过破坏细胞的细胞骨架，例如通过破坏细胞的微管、微丝和/或中间丝而增加所述合成、经过修饰的RNA或其组合物摄取至细胞中的物质，例如药物。所述药物可为例如紫杉醇、长春新碱、长春花碱、细胞松弛素、诺考达唑、亚普拉坎诺里德(japlakinolide)、拉春库林A、鬼笔环肽、司万霍利德(swinholide)A、茚达诺辛或肌基质蛋白。
[0334] 另一方面，所述配体是由宿主细胞吸收的部分，例如维生素。示例性维生素包括维生素A、E和K。其它示例性维生素包括B族维生素，例如叶酸、B12、核黄素、生物素、吡哆醛或例如由癌细胞吸收的其它维生素或养分。还包括HSA和低密度脂蛋白(LDL)。
[0335] 另一方面，所述配体是细胞渗透剂，优选地螺旋细胞-渗透剂。优选地，所述试剂为两性分子。示例性试剂为肽，如tat或触足肽。如果所述试剂是肽，那么其可经过修饰，包括肽基模拟物、反演体、非肽或假-肽键，和D-氨基酸的使用。所述螺旋剂优选地为α-螺旋剂，其优选地具有亲脂相和疏脂相。
[0336] “细胞渗透肽”能够渗透细胞，例如微生物细胞(如细菌或真菌细胞)，或哺乳动物细胞(如人类细胞)。微生物细胞渗透肽可为例如α-螺旋线性肽(例如，LL-37或Ceropin P1)、含二硫键的肽(例如，α-防御素、β-防御素或杀细菌素)或仅含有一个或两个优势氨基酸的肽(例如，PR-39或吲哚力西丁)。例如，细胞渗透肽可为双向两性分子肽(如MPG)，其源于HIV-1 gp41的融合肽域和SV40大T抗原的NLS(Simeoni等人,Nucl.Acids Res.31:2717-2724,2003)。
[0337] 本文所述的合成、经过修饰的RNA可通过本领域中充分确立的方法，如“Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,”Beaucage,S.L.等人(编),John Wiley&Sons,Inc.,New York,N.Y.,USA(其由此以引用的方式整体并入本文中)中所述的那些来合成和/或修饰。转录方法在本文中进一步描述于实施例中。在本文所述的方面的一个实施方案中，使用“夹板介导的接合”来合成用于合成、经过修饰的RNA的模板，所述“夹板介导的接合”允许通过长的寡核苷酸和/或dsDNA PCR产物的控制串联来快速合成DNA构建体并且无需在接合区引入限制位点。其可在T7模板产生期间用于将通用非翻译区(UTR)添加至基因的编码序列中。夹板介导的接合也可用于将核定位序列添加至开放阅读框中，并且制成具有从野生型开放阅读框开始的点突变的显性负性构建体。简单地说，使单链和/或变性dsDNA组分退火至使所需末端接合的夹板寡核苷酸，所述末端通过热稳定性DNA连接酶接合并且所需构建体通过PCR扩增。接着使用RNA聚合酶从所述模板体外合成合成、经过修饰的RNA。在合成、经过修饰的RNA的合成完成之后，在用于本文所述的方法之前从转录反应去除所述DNA模板。
[0338] 在这些方面的一些实施方案中，所述合成、经过修饰的RNA用碱性磷酸酶进一步处理。
[0339] ***
[0340] 本领域技术人员容易理解，本发明充分适于进行所述目标且获得所提及的目的和优势，以及其中固有的那些。本文中的描述和实施例的细节代表某些实施方案，是示例性的，并且不意图作为对本发明范围的限制。本领域技术人员将想到其中修改和其它用途。这些修改涵盖于本发明的精神内。本领域技术人员应显而易知，可对本文所公开的发明进行不同取代和修改而不偏离本发明的范围和精神。
[0341] 除非清楚地相反指示，否则如本文中在本说明书和权利要求书中所用的冠词“一(a)”和“一(an)”应理解为包括多个提及物。除非相反指示或在其它方面从本文显而易见，否则在一组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或描述是在所述组成员中的一者、超过一者或全部存在于、用于给定的产物或过程中或以其它方式与给定的产物或过程相关时被视为满足条件的。本发明包括如下实施方案，其中确切地所述组中的一个成员存在于、用于给定的产物或过程中或以其它方式与给定的产物或过程相关。本发明还包括如下实施方案，其中所述组成员中的超过一者或全部存在于、用于给定的产物或过程中或以其它方式与给定的产物或过程相关。此外，应理解本发明提供所有变化、组合和排列，其中除非另外指示或除非本领域技术人员将显而易知将出现抵触或矛盾，否则所列出的权利要求中的一者或多者的一种或多种限制、要素、条款、说明项等被引入至依赖于同一基础权利要求的另一权利要求(或相关的任何其它权利要求)中。预期本文所述的所有实施方案在适当时适用于本发明的所有不同方面。还预期所述实施方案或方面中的任一者均可在适当时自由地与一个或多个其它所述实施方案或方面组合。在要素以列表形式，例如以马库什组或相似形式提供时，应理解还公开了所述要素的各子组，并且任何要素均可从所述组中去除。应理解一般说来，在本发明或本发明的多个方面被提及包含特定要素、特征等时，本发明的某些实施方案或本发明的多个方面由所述要素、特征等组成，或基本上由所述要素、特征等组成。为简单起见，那些实施方案在本文中并非在每一种情况下均以这么多的措辞具体陈述。还应理解，本发明的任何实施方案或方面均可明确地从权利要求书中排除，无论所述具体排除是否在本说明书中加以陈述。例如，可排除任何一种或多种活性剂、添加剂、成分、任选的试剂、生物类型、病症、受试者或其组合。
[0342] 在权利要求书或描述涉及所述组合物时，除非另外指示或除非本领域技术人员将显而易知将出现抵触或矛盾，否则应理解根据本文所公开的方法中的任一者制造和使用所述组合物的方法，和出于本文所公开的目的中的任一者使用所述组合物的方法是本发明的多个方面。在权利要求书或描述涉及方法时，例如，除非另外指示或除非本领域技术人员将显而易知将出现抵触或矛盾，否则应理解制造适用于执行所述方法的组合物的方法，和根据所述方法产生的产物是本发明的多个方面。
[0343] 在本文中给出范围时，本发明包括其中包括终点的实施方案、其中排除两个终点的实施方案和其中包括一个终点并且排除另一终点的实施方案。应假设，除非另外指示，否则两个终点均包括在内。此外，还应理解除非另外指示或在其它方面从本文和本领域技术人员的理解显而易知，否则以范围表述的值可在本发明的不同实施方案中假设所陈述的范围内的任何具体值或子范围，除非本文另外清楚地指示，否则达到所述范围的下限的单位的十分之一。还应理解，在本文中陈述一系列数值时，本发明包括如下实施方案，其相似地涉及任何介于中间的值或由所述系列中的任何两个值界定的范围，并且最低值可被视为最小值并且最大值可被视为最高值。如本文所用的数值包括以百分率表述的值。关于其中数值之前加上“约”或“大约”的本发明的任何实施方案，本发明包括其中陈述所述精确值的实施方案。关于其中数值之前不加“约”或“大约”的本发明的任何实施方案，本发明包括其中所述值之前加上“约”或“大约”的实施方案。
[0344] 如本文所用，“A和/或B”(其中A和B是不同权利要求项)一般意指A、B中的至少一者或A和B两者。例如，一个与另一序列互补和/或杂交的序列包括(i)一个与所述另一序列互补的序列，即使所述一个序列可能未必在所有条件下均与所述另一序列杂交，(ii)一个与所述另一序列杂交的序列，即使所述一个序列并未完全地与所述另一序列互补，和(iii)与所述另一序列互补并且杂交的序列。
[0345] 除非另外规定或在其它方面从本文显而易知(除了所述数字将不允许超过可能的值的100％的情况)，否则“大约”或“约”一般包括如下数字，其属于在任一方向中(大于或小于所述数字)1％的范围或在一些实施方案中属于数字的5％的范围或在一些实施方案中属于数字的10％的范围。应理解，除非清楚地相反指示，否则在本文所要求的包括超过一种动作的任何方法中，所述方法的动作的顺序不必限于其中所述方法的动作被陈述的顺序，但本发明包括其中如此限制所述顺序的实施方案。还应理解，除非相反指示或从本文显而易知，否则本文所述的任何产物或组合物均可被视为“分离的”。
[0346] 如本文所用，术语“包含(comprising)”或“包含(comprises)”是关于组合物、方法和其相应组分使用，所述组合物、方法和其相应组分是本发明所必需的，但允许未规定要素的纳入(无论是否必需)。如本文所用，术语“基本上由……组成(consisting essentially of)”是指给定的实施方案所需要的那些要素。所述术语允许不会本质上影响本发明的所述实施方案的基础和新颖或功能特征的额外要素的存在。
[0347] 术语“由……组成(consisting of)”是指如本文所述的组合物、方法和其相应组分，其排除了本发明的所述实施方案中未陈述的任何要素。
[0348] ***实施例
[0349] 实施例1：鉴别有效地从原代人类T细胞去除内源TCR以防止CART细胞的自身反应性的CRISPR指导核糖核酸(gRNA)。
[0350] 自身反应性的防止具有最高优先权以改进现有的基于T细胞的疗法。本发明旨在开发具有高中靶和无/低脱靶活性的gRNA，其允许原代人类T细胞中的内源T细胞受体(TCR)的有效并且安全缺失。本发明人设计了多种针对分别位于染色体14和7上的TCRα和β链基因TM座(TRA和TRB)的gRNA(图10)。各gRNA首先使用SURVEYOR 分析(数据未示)针对在HEK293T细胞中指导位点特异性突变的能力进行测试。随后通过流式细胞术(FACS)和SURVEYORTM分析来评估具有最高中靶效率的候选gRNA在Jurkat T细胞中的功能性TCR消除(图11A和图
11B)。通过慢病毒转导或短暂地通过核转染递送指导。我们通过在原代人类T细胞中的FACSTM
分析观察到TCR表达的损失(图12A)并且使用SURVEYOR 分析确认了从两个独立供体获得的T细胞中的CRISPR切割(图12B)。
11B)。通过慢病毒转导或短暂地通过核转染递送指导。我们通过在原代人类T细胞中的FACSTM
分析观察到TCR表达的损失(图12A)并且使用SURVEYOR 分析确认了从两个独立供体获得的T细胞中的CRISPR切割(图12B)。
[0351] 实施例2：用于CAR-T疗法的同种异体T细胞。
[0352] 基于T细胞的疗法目前限于从同一患者获得的自体同源细胞的输注。通过产生普遍适用的细胞产物将T细胞起源延伸至同种异体来源不仅将极大地减少成本，而且为用于这一新颖并且有前景类别的疗法的更广泛范围的患者开了大门。
[0353] MHC I类表面表达的完全损失可使用靶向编码附属链β2微球蛋白(B2M)的基因的CRISPR gRNA来实现。本发明人最近已经鉴别出具有极高的中靶效率的靶向B2M的g RNA，其可已经适用于基因疗法(Mandal等人,“Efficient Ablation of Genes in Human Hematopoietic Stem and Effector Cells using CRISPR/Cas9”Cell Stem Cell,15:5,643-652(2014)；Meissner等人“, Genome editing for human gene therapy,”Methods in enzymology,546,273-295(2014)；美国申请号62/076,424和PCT申请PCT/US2015/059621，其教导以引用的方式并入本文中)。由于所述CRISPR/Cas9系统允许多重，B2M gRNA可成功地与针对TCRa和TCRb链的gRNA一起用于原代T细胞并且随后用于人类化小鼠中的过继性转移模型中，例如以使得能够将同种异体T细胞用于CAR-T疗法。
[0354] 另外，本发明人最近使用TALEN产生并且表征了B2M基因剔除JEG3细胞。这些结果证明了使用TALEN基因组编辑系统进行的B2M的基因组缺失导致B2M和所有MHC I类分子的表面表达的完全消除(图26A-26G)。
[0355] 实施例3：通过靶向T细胞活化的检查点调节剂PD-1和CTLA4来防止T细胞抑制。
[0356] 为了克服例如由癌细胞或肿瘤环境造成的T细胞抑制，本发明人开发了靶向T细胞活性的关键检查点调节剂的gRNA。采用了如关于TCRα和β链所述的相似方法：多种针对编码PD-1(PDCD1)和CTLA4(CTLA4)的基因(均位于人类染色体2上)的gRNA首先针对其在HEK293T细胞中的中靶切割效率进行测试(分别地，图13和图15)。在两个基因座处使用基于PCR的策略，随后测序(图13C和图15C)，以及通过SURVEYORTM分析(图14B和图16B)确认了切割。在活化的Jurkat T细胞中通过FACS分析确认了PD-1表达的减少(图14A)。
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