技术领域
[0001] 本
发明涉及一种重组大肠杆菌发酵生产高圣草酚的方法，属于
生物工程技术领域。
背景技术
[0002] 高圣草酚(Homoeriodictyol)是一种黄
酮类物质，化学结构图如图1。高圣草酚和它的类似物主要是作为一种
风味改良剂，已经成功地商业化应用。从散塔草(Yerba Santa)中提取的高圣草酚，作为苦味掩盖剂在制药工业中已经应用多年了。
[0003] 目前高圣草酚和它的糖苷，它们的药理活性已经被证实，具有抗菌，抗炎，抗
氧化，抗癌，抗
真菌，抗骨质疏松等作用。高圣草酚还被证实可以促进
冠状动脉畅通，促进血小板聚集，具有广泛的应用前景。
[0004] 现有从桑寄生科懈寄生属的
种子植物中提取高圣草酚的方法，是将植物通过
水，
乙醇，甲醇或丙酮的提取，随后浓缩，萃取，
树脂吸附，柱层析等步骤，得到圣草酚和高圣草酚的混合物。该方法生产高圣草酚缺点明显，由于植物中高圣草酚含量太低，处理大量的植物需要消耗大量的有机
试剂和产生大量的污水，生产成本太高。而且该方法取提取得到的是圣草酚和高圣草酚的混合物，难以得到高纯度的高圣草酚。
[0005] 在生物合成高圣草酚方面，现有使用重组解脂耶氏
酵母Yarrowia lioplytica生物合成高圣草酚。该方法通过Yarrowia lioplytica表达名为ROMT-9的蛋白，将该蛋白提纯后，与圣草酚，甲基蛋
氨酸，甲醇一起生物反应，在最佳反应条件下，能够转化52.4％的浓度0.2g/L的圣草酚。该方法生成的高圣草酚产量太低，得到的也是圣草酚和高圣草酚的混合物，而且需要提取蛋白，转化条件苛刻，生产成本太高，难以实现大规模生产。
发明内容
[0006] 本发明首先提供了一种大肠杆菌(Escherichia coli)HER-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016646，保藏地址为中国武汉的武汉大学。
[0007] 本发明还提供了一种应用所述重组大肠杆菌发酵生产高圣草酚的方法，所述方法包括以下步骤：
[0008] (1)种子活化和制备；
[0009] (2)将步骤(1)得到的种子培养液，按1％～5％比例接种于发酵培养基，发酵初始条件为
温度35～37℃，通气量0.3～1.0vvm，罐压：0.01～0.05MPa，pH控制不低于7.0，DO与搅拌转速偶联，控制在30％以上水平，培养1h～4h；
[0010] (3)降低发酵温度到28℃～32℃，并加入诱导剂乳糖或IPTG进行诱导，其他发酵条件保持和步骤(2)一致，pH控制不超过7.8，诱导持续2h～6h；
[0011] (4)加圣草酚，转化生产高圣草酚；此阶段发酵温度28℃～32℃，
通风量：0.3vvm～0.5vvm，罐压：0.02～0.06MPa，pH控制在7.0到7.7之间，控制在溶氧在20％以上水平。
[0012] 在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基配方为：
葡萄糖4～100g/L，
磷酸氢二钠5～15g/L，磷酸二氢
钾1～5g/L，酵母抽提物1～10g/L，
硫酸铵0.5～5g/L，
氯化钠1～5g/L，七水
硫酸镁0～5g/L，氯化
钙0～1g/L，混合维生素溶液1～20ml/L，卡那霉素30mg/L，消泡剂0.01％，pH调节7.0左右。
[0013] 在本发明的一种实施方式中，步骤(4)圣草酚批次加入或者流加。批次加入每次加入0.2g/L～0.6g/L，每当圣草酚消耗到0.1g/L左右时，可继续加入圣草酚。使用流加方式时，圣草酚的加入速度约为0.01g/L/h～0.05g/L/h，根据发酵时期的不同，调整圣草酚的流
加速度，前中期流加速度在0.03g/L～0.05g/L，后期则降低至0.01g/L～0.03g/L。
[0014] 在本发明的一种实施方式中，步骤(4)还补加葡萄糖，葡萄糖可以批次加入或者流加，批次每次加入2g/L～6g/L，加入时机依据pH的变化情况；当pH高于7.8时，批次加入葡萄糖，利用葡萄糖的代谢控制pH不超过7.7。葡萄糖流加的速度可根据pH的变化调整，当pH持续上升时，则提高葡萄糖的流速，当pH持续下降时，则需要降低葡萄糖的流速。
[0015] 在本发明的一种实施方式中，步骤(4)通过4M NaOH和葡萄糖的添加，控制pH在7.3～7.7之间
波动；当pH低于7.3时，补加4M NaOH控制pH不低于7.3；当pH升高至7.7时，补加2g/L的葡萄糖，使得pH下降。
[0016] 在本发明的一种实施方式中，乳糖配制成30％(W/V)水溶液，在115℃中灭菌20分钟。IPTG配制成1mol/L的水溶液，通过0.22um孔径的
膜过滤灭菌。
[0017] 所述混合维生素溶液组成为：B6100mg，B125mg，叶酸20mg，核黄素20mg，硫胺素20mg，烟酸20mg，泛酸50mg，去离子水定容至1L。
[0018] 在本发明的一种实施方式中，种子活化和制备包括：挑取单菌落到液体LB种子培养基中，在37℃，摇床转数200rpm/min条件下，培养12h～20h，得到一级种子液；将一级种子液按照2％～6％接种量转接到二级种子培养基中，在37℃，摇床转数200rpm/min条件下，培养6h～12h，得到二级种子液。
[0019] 所述一级种子培养基配方为：蛋白胨1～10g/L，酵母抽提物1～10g/L，氯化钠0～10g/L，混合维生素溶液1～10ml/L，卡那霉素50mg/L，pH调节7.0左右。
[0020] 所述二级种子培养基配方为：葡萄糖1～10g/L，磷酸氢二钠5～15g/L，磷酸二氢钾1～5g/L，酵母抽提物1～5g/L，硫酸铵0.5～5g/L，氯化钠1～5g/L，七水硫酸镁0～3g/L，
氯化钙0～0.5g/L，混合维生素溶液1～10ml/L，卡那霉素50mg/L，pH调节7.0左右。
[0021] 本发明采用重组大肠杆菌发酵生产高圣草酚，发酵液中85％以上的圣草酚会转变为高圣草酚，高圣草酚产量达到1.45g/L，而且生产工艺简单易行，容易实现大规模生产。
[0023] 一株大肠杆菌(Escherichia coli)HER-161114，于2016年11月17日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2016646，保藏地址为中国武汉的武汉大学。
附图说明
[0024] 图1高圣草酚化学结构
[0025] 图2
实施例2中5L发酵过程中产物HER生成和底物ED消耗曲线
[0026] 图3实施例3中5L发酵过程中产物HER生成和底物ED消耗曲线
[0027] 图4实施例4中500L发酵过程中菌体生成、产物生成和底物消耗曲线[0028] 图5实施例4中500L发酵过程pH、DO和搅拌转数变化
具体实施方式
[0029] 分析方法：
[0030] (1)采用高效液相色谱法分析发酵液中的圣草酚、高圣草酚、葡萄糖、乳糖等底物、代谢产物和糖类物质。其中，圣草酚、高圣草酚等的测定采用岛津SPD-M20A
二极管阵列检测器，Phenomenex luna 5u C18色谱柱(150mm×4.6mm，5μ)；流动相15％～70％乙腈：85％～30％0.15％(w/v)乙
酸溶液梯度洗脱；流速0.8ml/min；柱温35℃；进样量5μL。糖类采用岛津ELSD-LT
蒸发光检测器；蒸发温度50℃，载气压
力280kpa；Phenomenex luna 5u NH2色谱柱(250mm×4.6mm，5μ)，柱温35℃；流动相80％乙腈，流速1.0ml/min；进样量5μL。
[0031] (2)采用可见光分光光度计测定发酵液菌体生长情况。发酵液取样后，稀释2～30倍，在600nm下测定吸光值。
[0032] 实施例1
[0033] 培养基：
[0034] 1.种子培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，七水硫酸镁0.5g/L，混合维生素溶液10ml/L，
自来水配制，卡那霉素50mg/L，pH调节7.2，培养基121℃灭菌20min，维生素
混合液和卡那霉素通过0.22μm滤膜过滤后加入。
[0035] 2.发酵培养基：葡萄糖4g/L，乳糖10g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氢二钠3g/L，磷酸二氢钠1.2g/L，硫酸铵0.5g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.05g/L，混合维生素溶液15ml/L，卡那霉素30mg/L，自来水配制，pH调节7.2，培养基121℃灭菌20min，其中葡萄糖、乳糖在115℃条件下单独灭菌20min，葡萄糖是接种前加入，乳糖作为补料糖后续加入，维生素混合液和卡那霉素通过0.22μm滤膜过滤后加入。
[0036] 培养方法：
[0037] 1.种子培养：取甘油管保存菌株，接种于装有20ml种子培养基的125ml三
角瓶中，37℃、200rpm摇床培养8h。
[0038] 2.发酵培养：取培养好的种子液按4％接种量接种到250ml三角瓶中。250ml三角瓶装的发酵终体积为50ml。整个发酵过程分为三阶段。
[0039] (1)接种后250ml三角瓶置于摇床中，培养条件为37℃，200rpm，培养约2h～3h，取样测定发酵液中菌体OD600达到0.8左右，进入第二阶段。
[0040] (2)培养温度降低至30℃，并加入1％乳糖，继续培养3h后进入第三个阶段。
[0041] (3)开始加入圣草酚。一次性加入终浓度1g/L的圣草酚，圣草酚溶液的浓度为40％(W/V)。保持摇床30℃，200rpm条件继续培养至48h结束，测定发酵液中高圣草酚含量为0.5g/L，圣草酚
质量转化率为约40％～50％。
[0042] 实施例2
[0043] 培养基：
[0044] 1.平板培养基：蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，氯化钠10g/L，琼脂20g/L，卡那霉素50mg/L。其中卡那霉素通过0.22μm滤膜过滤后加入。
[0045] 2.一级种子培养基：和实施例1中种子培养基一致。
[0046] 3.二级种子培养：葡萄糖4g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氢二钠3g/L，磷酸二氢钠1.2g/L，硫酸铵0.5g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.05g/L，混合维生素溶液15ml/L，卡那霉素50mg/L，自来水配制，pH调节7.2，培养基121℃灭菌20min，其中葡萄糖、乳糖在115℃条件下单独灭菌20min，葡萄糖是接种前加入，维生素混合液和卡那霉素通过
0.22μm滤膜过滤后加入。
[0047] 4.发酵培养基：葡萄糖4g/L，乳糖15g/L，酵母抽提物5g/L，磷酸氢二钠7g/L，磷酸二氢钠3g/L，硫酸铵2g/L，氯化钠0.5g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钙0.05g/L，混合维生素溶液20ml/L，卡那霉素30mg/L，消泡剂0.01％，自来水配制，pH调节7.2，培养基121℃灭菌20min，其中葡萄糖、乳糖在115℃条件下单独灭菌20min，葡萄糖是接种前加入，乳糖作为补料糖后续加入，维生素混合液和卡那霉素通过0.22μm滤膜过滤后加入。
[0048] 培养方法：
[0049] 1.一级种子培养：取保存菌株在平板培养基上分离划线，置于37℃
培养箱中过夜培养。挑取平板上单菌落到一级种子培养基中，一级种子培养基在125ml三角瓶中装液量20ml。37℃、200rpm摇床培养16h，作为一级种子液。
[0050] 2.二级种子培养：取一级种子液按按4％接种量接种到装有100ml二级种子培养基的500ml三角瓶中，37℃,200rp摇床培养8h，作为5L
发酵罐发酵的种子液。
[0051] 3.发酵培养：取二级种子液按按4％接种量接种到5L发酵罐中，5L发酵罐初始装液量2.7L，最终发酵体积约3L。整个发酵过程分为三个阶段：
[0052] (1)发酵罐初始37℃，搅拌转数300rpm，通风比0.8vvm，pH通过4M NaOH控制在7.0，在此条件下培养1.5h左右，相应的OD600达到0.8左右，将发酵温度降低至30℃，进入下一阶段。
[0053] (2)加入15g/L的乳糖，进入诱导阶段。此阶段发酵条件调整为：搅拌转数提高至350rpm～400rpm，通风比保持0.8vvm，pH通过4M NaOH控制不低于7.0，高于7.0不控制。在此条件下培养3h，进入下一阶段。
[0054] (3)加入圣草酚，进入转化阶段。此阶段发酵条件调整为：搅拌转述保持350rpm，通风比降低至0.5vvm，pH通过4MNaOH控制不低于7.5，高于7.5不控制。圣草酚分别在发酵4.5h，16h和28h各加入0.5g/L，发酵64h，高圣草酚产量为0.96g/L，产物对圣草酚的质量转化率约为64％。
[0055] 本实施例中高圣草酚和圣草酚的生成和消耗变化曲线如图2。
[0056] 实施例3
[0057] 培养基：
[0058] 本实施例中一级种子和二级种子培养基和实施例2中一样。发酵培养基葡萄糖初始浓度继续维持4g/L，在阶段3中额外补加8g/L。4g/L其他成份和实施例2中一样。
[0059] 培养方法：
[0060] 本实施例中培养方法中阶段1和阶段2和实施例2一致。阶段3中，圣草酚的添加改为在发酵4.5h，16h，28h和40h各添加0.4g/L，在圣草酚加入的同时，加入2g/L的葡萄糖。相当于在第三阶段，一共加入终浓度1.6g/L的圣草酚和8g/L的葡萄糖，发酵72h，高圣草酚的产量为1.17g/L，产物对圣草酚的质量转化率约为73.1％。
[0061] 与实施例2相比，实施例3在转化阶段增加了葡萄糖补加工艺，这种调整提高了高圣草酚产量约21.8％。
[0062] 本实施例中高圣草酚和圣草酚的生成和消耗变化曲线如图3。
[0063] 实施例4
[0064] 培养基：
[0065] 本实施例中一级种子和二级种子培养基和实施例2中一样。发酵培养基和实施例3中一样。
[0066] 培养方法：
[0067] 1.一级种子培养：取保存菌株在平板培养基上分离划线，置于37℃培养箱中过夜培养。挑取平板上单菌落到一级种子培养基中，一级种子培养基在250ml三角瓶中装液量50ml。37℃、200rpm摇床培养16h，作为一级种子液。一级种子一共有4个250ml三角瓶，向二级种子培养基移种前合并一样。
[0068] 2.二级种子培养：取合并的一级种子液按按2％接种量接种到装有1000ml二级种子培养基的5000ml三角瓶中，二级种子一共有5个5000ml三角瓶，置于37℃，200rpm摇床中培养8h，作为500L发酵罐发酵的种子液。
[0069] 3.发酵培养：取二级种子液5000ml移入到500L发酵罐中，500L发酵罐初始装液量180L，灭菌后发酵初始体积约220L。整个发酵过程分为三个阶段：
[0070] (1)发酵罐初始37℃，搅拌转数控制在120rpm～250rpm，并与溶氧联动，控制溶氧水平在30％左右。通风比0.5vvm，pH通过4M NaOH控制在7.0，在此条件下培养2h左右，相应的OD600达到1.0左右，将发酵温度降低至30℃，进入下一阶段。
[0071] (2)加入15g/L的乳糖，进入诱导阶段。此阶段发酵条件调整为：搅拌转数继续控制在120rpm～250rpm，并与溶氧联动，控制溶氧水平在30％左右。通风比0.5vvm，pH通过4M NaOH控制不低于7.0，高于7.0不控制。在此条件下培养3h，进入下一阶段。
[0072] (3)加入圣草酚，进入转化阶段。此阶段发酵条件调整为：搅拌转数控制在120rpm～200rpm，并与溶氧联动，控制溶氧水平在20％左右，通风比降低至0.3vvm。pH参数控
制模式调整为，通过4M NaOH和葡萄糖的添加，控制pH在7.3～7.7之间波动。当pH低于7.3时，补加4M NaOH控制pH不低于7.3；当pH升高至7.7时，补加2g/L的葡萄糖，使得pH下降。如图4所示，本实施例中pH通过4M NaOH和葡萄糖的补加控制在7.3～7.7之间波动，葡萄糖一共补入约8g/L，4MNaOH一共补入约5L。
[0073] 圣草酚分别在发酵5h，16h，24h和32h各加入终浓度约0.4g/L的圣草酚，发酵50.5h结束，发酵终体积约为230L，补入圣草酚约383g，约为1.65g/L。发酵50.5h生成高圣草酚浓度约1.45g/L，对圣草酚的质量转化率约为87.9％。
[0074] 实施例4相比于实施例3，pH控制模式不同，实施例4的这种pH控制方式，高盛草酚的产量相比于实施例3提高了约23.9％。
[0075] 本实施例中高圣草酚和圣草酚的生成和消耗变化曲线如图4，发酵过程中参数变化如图5。
[0076] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以
权利要求书所界定的为准。
