一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法
专利汇可以提供一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种 微 生物 混合 发酵 生产液体 纤维 素酶的方法，是以绿色木霉和黑曲霉为 纤维素 酶生产菌，接种孢子液或 种子 液液体培养基中，通过控制培养基组成、混菌培养过程两菌生长量及培养条件、培养方式，生产高活性纤维素酶，本发明提供的方法对提高纤维素酶活 力 、完善酶系组分及缩短发酵时间均有良好的效果，且简单易行、具有广阔的发展前景；而且，在开发利用秸秆等天然纤维素资源的同时，无环境污染，是促进秸秆 乙醇 产业化的有效手段。，下面是一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法专利的具体信息内容。
1.一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法，其特征在于步骤如下：
步骤1，选用绿色木霉及黑曲霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，分别得到绿色木霉及黑曲霉的二级液体种子；
步骤2，先将绿色木霉的二级液体种子用液体发酵培养基培养，按液体发酵培养基体积的8～10%接种绿色木霉的二级液体种子，28～32℃下通气培养48～72h后，再按液体发酵培养基体积的4～6%接种黑曲霉二级液体种子，28～30℃下通气培养72～96h，于接种黑曲霉后12～24h，开始连续加入补料培养基，控制还原糖含量在0.08～0.10%，直至发酵结束，将发酵液过滤即得本发明液态纤维素酶粗酶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，粗酶液可直接使用或经浓缩后使用。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述斜面试管培养方法为：
将马铃薯洗净去皮，称取200g，切成小块，置于1L水中，煮沸30分钟，8层纱布过滤，滤液中加入琼脂18克，不断搅拌至琼脂完全融化，停止加热；迅速加入20g葡萄糖，搅拌使其溶解，补足水分至1000mL，适量分装至试管或茄子瓶中，盖上棉塞，于121℃下高压蒸汽灭菌20分钟，分别划线接种绿色木霉及黑曲霉菌株，于28～30℃下培养5～7天。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1中所述摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，采用以下培养基：
麸皮2～4%，
（NH4）2SO4 0.4～0.6%，
KH2PO4 0.4～0.6%，
CaCl2 0.05～0.08%，
MgSO4·7H2O 0.08～0.10%，
其余为水；
培养方法为：培养液121℃, 灭菌3 0分钟，按4～6%接种量接种斜面试管培养得到的孢子悬液；28～30℃下，220rpm培养24～48h，得到绿色木霉及黑曲霉的二级液体种子。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述液体发酵培养基采用以下培养基：
微晶纤维素3～5%，
玉米芯2～4%，
玉米浆0.5～1.5%，
营养盐0.1～0.3%，
其余为水；
制成混合浆料，调节pH在4.5～5.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2中所述补料培养基采用以下培养基：
微晶纤维素1～2%，
玉米芯3～5%，
玉米浆1.5～2.0%，
营养盐0.1～0.3%，
其余为水；
制成混合浆料，调节pH在5.0～6.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述营养盐的配方组成为：
（NH4）2SO4 4.0g/L，KH2PO4 4.0 g/L，CaCl2 0.2g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，Fe SO40.4mg/L，Zn SO4·7H2O 2.0mg/L，Cocl2·6 H2O2.0mg/L。
8. 如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤如下：
二级液体种子制备：
⑴生产菌株 绿色木霉和黑曲霉；
⑵斜面菌种制备 制备PDA培养基，采用划线接种绿色木霉及黑曲霉菌株，在30℃下分别培养7和5天后形成大量孢子，作为种子液接种使用；
⑶二级液体菌种制备 以麸皮4%,（NH4）2SO4 0.4%，KH2PO4 0.6%，CaCl2 0.05%，MgSO4·7H2O 0.08%，其余为水的液体培养基，装瓶灭菌，按4～6%接种量接种孢子悬液，
30℃下，220rpm培养48h；
[4]液态发酵培养基制备
以微晶纤维素4.0%，玉米芯2.0%，0.8%玉米浆，80%水，0.2%营养盐，制成混合浆料，调节pH在4.5～5.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；
[5]补料培养基制备
微晶纤维素1.0%，玉米芯3.0%， 2.0%玉米浆，80%水，0.1%营养盐，制成混合浆料，调节pH在5.0～6.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟；
[6]液体纤维素酶的制备
先将绿色木霉的二级液体种子，按液体发酵培养基体积的10%接种于液体发酵培养基，30℃下通气培养48h后，再接种4%黑曲霉二级液体种子，30℃下继续通气培养96h；于接入黑曲霉种子后12h，开始用补料培养基补料；发酵液还原糖含量控制在0.10%左右，直至发酵结束，将发酵液过滤即得粗酶液。
一种微生物混合发酵生产液体纤维素酶的方法
技术领域
背景技术
发明内容
步骤1，选用绿色木霉及黑曲霉为生产菌株，分别经斜面试管培养、摇瓶扩大培养或种子罐扩大培养，分别得到绿色木霉及黑曲霉的二级液体种子；
步骤2，先将绿色木霉的二级液体种子用液体发酵培养基培养，按液体发酵培养基体积的8～10%接种绿色木霉的二级液体种子，28～32℃下通气培养48～72h后，再接种4～
6%黑曲霉二级液体种子，28～30℃下通气培养72～96h，于接种黑曲霉后12～24h，开始连续加入补料培养基，控制还原糖含量在0.08～0.10%，直至发酵结束，将发酵液过滤即得本发明液态纤维素酶粗酶液。
（NH4）2SO4 0.4～0.6%，
KH2PO4 0.4～0.6%，
CaCl2 0.05～0.08%，
MgSO4·7H2O 0.08～0.10%，
其余为水。
玉米芯2～4%，
玉米浆0.5～1.5%，
营养盐0.1～0.3%，
其余为水；
制成混合浆料，调节pH在4.5～5.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
玉米芯3～5%，
玉米浆1.5～2.0%，
营养盐0.1～0.3%，
其余为水；
制成混合浆料，调节pH在5.0～6.0之间，121℃高压蒸汽灭菌30分钟。
⑴生产菌株 绿色木霉（Trichoderma viride ）和黑曲霉（Aspergillus niger）。
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