一种芽孢杆菌及其高密度培养方法
阅读：623发布：2021-06-11
专利汇可以提供一种芽孢杆菌及其高密度培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种芽孢杆菌及其高 密度 培养方法，该菌株为芽孢杆菌(Bacillus sp.)13002，保藏编号为CGMCC No.7431。培养方法为：(1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于 种子 培养基中，进行活化培养，得到种子培养液；(2)将种子培养液接种于 发酵 培养基中，进行发酵培养至16h～36h收集发酵培养液；(3)将发酵培养液离心后收集菌泥，用生理盐 水 清洗，加入菌种保护剂后，混合均匀后，进行干燥，得菌粉。本发明冻干后使其活菌总数达0.730×1011CFU/g以上，较好地克服了培养过程中产酸抑制菌体生长的问题，可较大程度地提高芽孢杆菌13002的生长率。，下面是一种芽孢杆菌及其高密度培养方法专利的具体信息内容。
1.一种芽孢杆菌的高密度培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将处于对数期生长的芽孢杆菌的菌悬液于种子培养基中，进行活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨0.2份～1.0份，酵母提取粉0.1份～0.5份，葡萄糖1.0份～2.0份，NaCl 0.5份～1.5份，用蒸馏水定容至100份，调节pH至
6.0～7.5，灭菌后冷却即可；
(2)以体积比2～10：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，当发酵至16h～
24h时，补充发酵培养基，进行发酵培养至16h～36h收集发酵培养液；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨0.5份～1.75份，酵母提取粉1.0份～2.75份，葡萄糖1.25份～
4.0份，NaCl 0.5份～1.5份，用蒸馏水或发酵培养基缓冲液定容至100份，调节pH至6.0～
7.5，灭菌后冷却即可；所述发酵培养基缓冲液为Na2HPO4-柠檬酸、Na2HPO4-NaH2PO4和KH2PO4-NaOH缓冲液中的一种或两种，并用其中的一种或两种以上来调节pH；
(3)将发酵培养液离心后收集菌泥，用生理盐水清洗后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比3～5：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后，进行干燥，得菌粉；
所述芽孢杆菌为芽孢杆菌(Bacillus sp.)13002，已于2013年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.7431。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基中细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的补料速率为0.5g/(L·h)～1.5g/(L·h)的恒定速率补料，以葡萄糖的浓度计。
4.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述种子培养基和发酵培养基的pH均为6.5；所述发酵是在发酵罐中自动发酵。
5.根据权利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养温度为35℃～55℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述种子培养液与发酵培养基的体积比为
6：100；发酵培养温度为45℃。
一种芽孢杆菌及其高密度培养方法
技术领域
背景技术
[0002] 凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)属能产生芽孢的、杆菌类乳酸菌。革兰氏阳性菌，代谢类型为兼性厌氧型，有氧条件较无氧条件能够产更多的生物量。菌体呈杆状，芽孢端生，无鞭毛。最适生长温度为40℃～50℃，最适生长pH值一般为6.6～7.0，发酵培养可产乳酸。同时，凝结芽孢杆菌是益生菌领域的潜力股，具备耐高温、耐胆盐、耐酸等抗逆性，对于部分抗生素和某些有害菌也有一定的抑制能力。近年来，凝结芽孢杆菌已然成为国内外研究的热点之一，研究的重点在于如何用低廉易获得的培养基获得高密度培养的凝结芽孢杆菌菌体。而国内对于凝结芽孢杆菌的研究才处于刚起步阶段。
[0003] 对于微生物发酵培养来说，高密度培养技术(HCDC，high cell density culture)指的是模拟人体生长环境，使细胞在特定细胞生物反应器中快速增长，从而充分提高菌体的发酵密度和生物量，或增加特定代谢产物的比生长率的一种培养技术。从广义上讲，凡是微生物培养至密度较高，活菌数达1011～1012CFU/g的均可成为高密度培养；实际上，由于菌种之间的特性差异，对于生长很慢的微生物，只要增长至较原来提高10倍甚至更高倍数的时候，便可以视作高密度培养。分批补料培养(fed-batch culture)指在培养的某些阶段，不定期地添加物料，使菌体及其代谢产物能够持续增长的培养技术；这是目前针对益生菌进行高密度培养最完善、最经常被使用的方式。
[0004] 申请号为201110169109.4的中国发明申请公开了“发酵乳酸菌的高密度培养方法”，是采用促进发酵乳杆菌增殖的专用培养基，并通过添加碱性物质以中和菌体代谢产生的酸，并适当补糖，克服发酵过程中碳源短缺和产酸抑制菌体生长的问题。但是对培养条件的优化较少；采用的糖反馈法属闭环控制，较为单一。
[0005] 申请号为201310742351.5的中国发明申请公开了“一种用于芽孢杆菌的高密度培养方法及培养基”，适用于地衣芽孢杆菌及枯草芽孢杆菌的高密度培养，得到的发酵液中芽孢形成率可在90％以上，芽孢密度最低在120亿/毫升以上。但是没有说明是否适用于凝结芽孢杆菌，也没有指出芽孢杆菌经高密度培养后达到的具体活菌数。
[0006] 申请号为201410516317.0的中国发明申请公开了“一种植物乳杆菌及其高密度培养方法”，是通过pH不再降低来判断是否到达发酵终点，同时指出该菌株具有良好的酸耐受性、胆盐耐受性及抑制常见肠道致病菌生长特性。但是没有采用分批补料培养法，仅靠自然发酵不足以使菌种高密度培养达到最优水平。
[0007] 上述现有技术指出高密度培养的限制因素和解决方法，主要包括：底物、产物或代谢副产物的负反馈作用；培养条件包括培养温度、pH值、溶氧量等的抑制作用。具体办法包括添加中和剂控制pH，添加碳源减少底物抑制等等，但仍存在适用范围受限、优化条件不足、方法选择单一等缺点。
发明内容
[0008] 本发明的目的是提供一种芽孢杆菌13002及其高密度培养方法。既符合该菌种的研究趋势，也为该菌种的深入研究及实际应用提供理论基础。
[0009] 本发明的目的通过如下技术方案实现：
[0010] 本发明芽孢杆菌13002，由荔枝汁中分离筛选得到，该芽孢杆菌菌株具有如下性质：
[0011] (1)形态特征：革兰氏阳性细菌，在一定条件下可产生芽孢，为兼性菌，菌体为杆状，单个排列，宽约0.5～1.0μm，长约3.0～5.0μm。
[0012] (2)生理特征：接触酶、过氧化氢酶、V-P实验、硫化氢都为阳性，能水解酪蛋白、明胶和淀粉，能利用柠檬酸盐、硝酸盐，不能利用丙酸盐，吲哚实验为阴性，最高生长温度为65℃；能利用葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、甘露糖、木糖、乳糖、半乳糖，不能利用鼠李糖。
[0014] 一种芽孢杆菌的高密度培养方法，包括如下步骤：
[0015] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨0.2份～1.0份，酵母提取粉0.1份～0.5份，葡萄糖1.0份～2.0份，NaCl 0.5份～1.5份，用蒸馏水定容至100份，调节pH至6.0～7.5，灭菌后冷却即可；
[0016] (2)以体积比2～10：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，进行发酵培养至16h～36h收集发酵培养液；
[0017] (3)将发酵培养液离心后收集菌泥，用生理盐水清洗后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比3～5：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后，进行干燥，得菌粉。
[0018] 所述菌种保护剂为10％海藻糖生理盐水溶液。
[0019] 所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨0.5份～1.75份，酵母提取粉1.0份～2.75份，葡萄糖1.25份～4.0份，NaCl 0.5份～1.5份，用蒸馏水或发酵培养基缓冲液定容至100份，调节pH至6.0～7.5，灭菌后冷却即可。
[0020] 所述发酵培养基中细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份。
[0021] 所述发酵培养基缓冲液为Na2HPO4-柠檬酸、Na2HPO4-NaH2PO4和KH2PO4-NaOH缓冲液中的一种或两种，并用其中的一种或两种以上来调节pH。
[0022] 当发酵至16h～24h时，补充发酵培养基，培养至24h～36h收集发酵培养液。
[0023] 所述发酵培养基的补料速率为0.5g/(L·h)～1.5g/(L·h)的恒定速率补料，以葡萄糖的浓度计。
[0024] 所述种子培养基和发酵培养基的pH均为6.5；所述发酵是在发酵罐中自动发酵。
[0025] 所述发酵培养温度为35℃～55℃。
[0026] 所述种子培养液与发酵培养基的体积比为6：100；发酵培养温度为45℃。
[0028] 本发明与现有技术相比，具有如下优点和有益效果：
[0029] (1)本发明芽孢杆菌13002高密度培养的培养基，其中，酵母提取粉来源于食用酵母，富含氨基酸、维生素等多种生长因子，细菌学蛋白胨总氮含量较高，两者协同作用使培养基能够发挥更好的效果。
[0030] (2)本发明利用缓冲体系来控制pH以促使芽孢杆菌13002进行高密度培养，在该条件下培养所得的活菌数高达2.138×109CFU/mL，提高至优化前的1.73倍，较好地解决了培养过程产酸抑制菌体生长的问题。
[0031] (3)本发明采用分批补料培养法，在发酵罐中自动发酵，于菌种生长对数末期，以0.5g/(L·h)的恒定速率添加发酵培养基，最终测得芽孢杆菌13002活菌总数是3.095×
9 11
10CFU/mL，冻干后活菌总数达0.730×10 CFU/g，既达到了高密度培养的目标，也较好地克服了培养过程中底物和产物抑制的问题。
9 11
10CFU/mL，冻干后活菌总数达0.730×10 CFU/g，既达到了高密度培养的目标，也较好地克服了培养过程中底物和产物抑制的问题。
[0032] (4)本发明公开的菌株是嗜热菌，在温度35℃～55℃中都能进行生长和发酵，在高温环境下进行发酵和生长，不容易污染杂菌。
[0033] (5)本发明公开的菌株经急性毒理实验证实是食用安全的，是一株潜在的益生菌，既可以用于菌粉，也可以用于高光学纯度的L-乳酸的发酵。
[0034] 所述芽孢杆菌(Bacillus sp.)13002，已于2013年4月8日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称：CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.7431。附图说明
[0035] 图1为实施例1中芽孢杆菌13002生长曲线；
[0036] 图2为实施例1中不同耐受温度对芽孢杆菌13002生长影响；
[0037] 图3为实施例1中不同耐胆盐时间对芽孢杆菌13002生长影响；
[0038] 图4为实施例1中不同耐酸时间对芽孢杆菌13002生长影响；
[0039] 图5为实施例1中摇瓶分批补料培养对芽孢杆菌13002生长影响；
[0040] 图6为实施例1中摇瓶和自动发酵罐分批补料培养对芽孢杆菌13002生长影响。
具体实施方式
[0041] 为更好理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步地详细说明，但是本发明要求保护的范围并不局限于实施例表示的范围。
[0042] 实施例1
[0043] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0044] (2)以体积比6：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45℃进行摇瓶培养，至24h培养结束，得发酵培养液；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉1.0份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0045] (3)将发酵培养液离心后收集菌泥，连续用生理盐水清洗2次后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比5：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后分装平铺在浅盘中，进行真空冷冻干燥或进行喷雾干燥或流化床干燥，得菌粉。
[0046] 所述保护剂配制方法为：按照质量比计算，海藻糖10.0份，用生理盐水溶解，并定容至100份，配制成10％(w/v)海藻糖溶液。
[0047] 芽孢杆菌13002生长曲线建立
[0048] 于45℃进行摇瓶培养时，每隔2h测定一次菌体浓度，至24h培养结束。
[0049] 以培养时间对芽孢杆菌13002菌体浓度作生长曲线，如图1所示。由图1可知，从0h到4h，菌体浓度上升缓慢，这一阶段的菌种处于调整期，是培养基接种之后的一个适应期，生长迟缓；从4h到16h，菌体浓度迅速上升，从0.2023g/L骤增到2.3331g/L，提高了10倍以上，该阶段菌种处于对数期，细胞高速生长繁殖；从16h开始，菌体浓度波动减缓至趋于平稳，至24h实验结束，该阶段菌种处于稳定期，细胞分裂速率明显降低，持续了较长一段时间。根据芽孢杆菌13002的生长曲线，此后采用16h～18h的种子培养液接入发酵培养基。
[0050] 芽孢杆菌13002益生特性研究
[0051] 1、芽孢杆菌13002对高温耐受性：
[0052] 分别取上述的45℃摇瓶培养24h后的发酵培养液1mL移入装有9mL生理盐水试管中，分别在45℃、60℃、70℃、80℃下水浴加热10min，得耐高温菌悬液，冷却后测定不同温度下处理后菌悬液的活菌总数，并以45℃测定值作为空白对照，计算菌种存活率。
[0053] 结果如图2所示，由图2可知，以45℃测得的芽孢杆菌13002的活菌总数作为参照，即为1.120×108CFU/mL，随着温度上升，菌种的活菌总数开始减少，存活率也呈现下降趋势。放置于温度为60℃作用10min，存活率高达92.9％，70℃时下降约7％，温度上升至80℃时，存活率也能达到72.3％。
[0054] 2、芽孢杆菌13002对胆盐耐受性：
[0055] 分别取上述的45℃摇瓶培养24h后的发酵培养液10mL移入装着90mL牛胆盐浓度为0.3％培养基的锥形瓶中，于45℃摇瓶培养0h、4h、8h、12h、24h后，测定不同耐受时间下菌悬液中的活菌总数，并以0h的值作为空白对照，计算菌种存活率。所述牛胆盐培养基配制方法为：牛胆盐0.3g，发酵培养基100mL，混合均匀灭菌后为0.3％的牛胆盐溶液。
[0056] 根据食糜消化规律，模拟动物肠道环境，选取胆盐浓度为0.3％(w/v)的培养基，研究一定时间下胆盐作用对芽孢杆菌13002生长的影响，如图3所示。由图3可知，以0h测得的芽孢杆菌13002的活菌总数作为参照，即为1.290×108CFU/mL，随着耐受时间的延长，从0h～12h，菌种的活菌总数不断减少，存活率也呈现下降趋势，但下降速率不断减缓。耐受时间4h，活菌总数依然在108CFU/mL以上，存活率达到83.7％，到12h时，降低到了69.8％。耐受时间到24h，活菌总数出现反弹，存活率不降反升，达到81.4％，这可能是因为胆盐已经无法抑制菌种生长，在培养基充足条件下，芽孢杆菌13002开始增殖。
[0057] 3、芽孢杆菌13002对酸耐受性：
[0058] 分别取上述的45℃摇瓶培养24h后的发酵培养液10mL移入装着90mL的pH2.0人工胃液的锥形瓶中，于45℃、180rpm下培养0h、1h、2h、3h、4h后，测定不同耐受时间下菌悬液中的活菌总数，并以0h测定值作为空白对照，计算菌种存活率；所述pH2.0人工胃液配制方法为：37％的盐酸(分子量36.5)0.0833mL，用蒸馏水定容至100mL，得HCl溶液的pH值为2.0，以1％(w/v)的比例加入胃蛋白酶，充分搅拌溶解后用0.45μm的微孔滤膜进行过滤除菌，备用。
[0059] 根据食糜消化规律，模拟胃环境，配制pH2.0的人工胃液，研究不同耐酸时间对芽孢杆菌13002生长的影响，如图4所示。由图4可知，以0h测得的菌种活菌总数作为参照，即为0.950×108CFU/mL，随着耐受时间的增加，菌种的活菌总数不断减少，存活率也呈现下降趋势。耐受时间2h，活菌总数为0.500×108CFU/mL，存活率为52.6％，到4h时，存活率依然达
40.0％。
40.0％。
[0060] 发酵培养基浓度水平对芽孢杆菌13002生长影响
[0061] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；
[0062] (2)以体积比6：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45℃摇瓶培养24h，得发酵培养液，对应的菌体浓度、活菌总数分别为2.516g/L、1.262×109CFU/mL；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.25份，酵母提取粉2.25份，葡萄糖1.75份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，调节pH至6.5，灭菌后冷却备用。
[0063] 结果如表1所示，经设置最陡爬坡实验，改变发酵培养基浓度，测定后比较得出菌体浓度及活菌总数最大的响应值，即按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.25份，酵母提取粉2.25份，葡萄糖1.75份，NaCl 1.0份，作为响应面设计因素的中心点。
[0064] 表1最陡爬坡实验
[0065]
[0066] 缓冲体系对芽孢杆菌13002生长影响
[0067] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；
[0068] (2)以体积比6：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45℃摇瓶培养24h，得发酵培养液，对应的菌体浓度、活菌总数及最大比生长率分别为3.558g/L、1.925×
109CFU/mL。所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，调节pH至6.5，灭菌后冷却备用。用Na2HPO4-柠檬酸、KH2PO4-NaOH缓冲体系培养得到的菌种最大菌体浓度分别为
2.613g/L、2.430g/L，远弱于于Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系的促生长效果；
109CFU/mL。所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，调节pH至6.5，灭菌后冷却备用。用Na2HPO4-柠檬酸、KH2PO4-NaOH缓冲体系培养得到的菌种最大菌体浓度分别为
2.613g/L、2.430g/L，远弱于于Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系的促生长效果；
[0069] 经研究不同缓冲体系对芽孢杆菌13002生长影响，优选Na2HPO4-NaH2PO4缓冲体系，用于芽孢杆菌13002的培养增殖。
[0070] 对芽孢杆菌13002分批补料培养
[0071] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；
[0072] (2)以体积比6：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45℃摇瓶培养，测定0h、4h对应的活菌总数；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0073] (3)发酵培养至16h，以0.5g/(L·h)(以葡萄糖的浓度计)的恒定补料速率向发酵培养基中添加发酵培养基，每4h添加一次，共补料3次，培养至28h结束，得发酵培养液，并测定16h、20h、24h、28h对应的活菌总数。
[0074] 以时间对芽孢杆菌13002的活菌总数作曲线，如图5所示。由图5可知，16h～28h内，9
随时间延长，摇瓶培养条件下活菌总数会随之增加，最大活菌总数达2.207×10CFU/mL。
随时间延长，摇瓶培养条件下活菌总数会随之增加，最大活菌总数达2.207×10CFU/mL。
[0075] 实施例2
[0076] 芽孢杆菌13002菌粉制备
[0077] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0079] (3)在自动发酵罐中，以体积比6：100的比例，将种子培养液接入发酵培养基中，于45℃进行培养，测定0h、4h对应的活菌总数；所述发酵培养基配方为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.5份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0080] (4)发酵培养至16h，以0.5g/(L·h)(以葡萄糖的浓度计)的恒定补料速率向发酵培养基中添加发酵培养基，每4h添加一次，共补料3次，培养至28h结束，得发酵培养液，并测定16h、20h、24h、28h对应的活菌总数。
[0081] 以时间对芽孢杆菌13002的活菌总数作曲线，并与实施例5中摇瓶分批补料培养进行比较，如图6所示。由图6可知，16h～28h内，随时间延长，发酵罐培养条件活菌总数呈先上升后下降的趋势，但在同一时间点均明显高于摇瓶培养。发酵罐条件最大活菌总数达3.095×109CFU/mL，是摇瓶培养条件的1.35倍。
[0082] (5)取发酵培养液于8000rpm，离心15min，用生理盐水洗脱2次，舍掉上清液，收集菌泥；按保护剂与湿菌泥体积比3：1，添加保护剂，混合均匀为保护剂菌悬液；将保护剂菌悬液分装平铺在浅盘中，在-20℃条件下预冻至少5h，再于真空冷冻干燥机中干燥24h，得冻干菌粉；取少量冻干菌粉，复水后测定活菌总数；所述保护剂配制方法为：按照质量比计算，海藻糖10.0份，用生理盐水溶解，并定容至100份，配制成10％(w/v)海藻糖溶液备用。
[0083] 经自动发酵罐分批补料培养，真空冷冻干燥，测得芽孢杆菌13002冻干后活菌数达11
0.730×10 CFU/g，达到高密度培养目标。
0.730×10 CFU/g，达到高密度培养目标。
[0084] 实施例3
[0085] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0086] (2)以体积比2：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45℃进行摇瓶培养；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.5份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖1.5份，NaCl 0.5份，用Na2HPO4-柠檬酸缓冲液定容至100份，并调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0087] (3)发酵培养至16h，以0.5g/(L·h)(以葡萄糖的浓度计)的恒定补料速率向发酵培养基中添加发酵培养基，每4h添加一次，共补料3次，培养至28h结束，得发酵培养液；
[0088] (4)将发酵培养液离心后收集菌泥，连续用生理盐水清洗2次后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比3：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后分装平铺在浅盘中，进行真空冷冻11
干燥，得菌粉，测得芽孢杆菌13002冻干后活菌数达0.390×10 CFU/g。
干燥，得菌粉，测得芽孢杆菌13002冻干后活菌数达0.390×10 CFU/g。
[0089] 实施例4
[0090] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0091] (2)以体积比10：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于35℃进行摇瓶培养；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨0.5份，酵母提取粉1.0份，葡萄糖4.0份，NaCl 1.0份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，并调节pH至6.0，灭菌后冷却备用；
[0092] (3)发酵培养至16h，以1.5g/(L·h)(以葡萄糖的浓度计)的恒定补料速率向发酵培养基中添加发酵培养基，每4h添加一次，共补料3次，培养至28h结束，得发酵培养液；
[0093] (4)将发酵培养液离心后收集菌泥，连续用生理盐水清洗2次后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比5：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后分装平铺在浅盘中，进行真空冷冻干燥，得菌粉，测得芽孢杆菌13002冻干后活菌数达0.330×1011CFU/g。
[0094] 实施例5
[0095] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0096] (2)以体积比6：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于45℃进行摇瓶培养；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，并调节pH至7.5，灭菌后冷却备用；
[0097] (3)发酵培养至16h，以0.5g/(L·h)(以葡萄糖的浓度计)的恒定补料速率向发酵培养基中添加发酵培养基，每4h添加一次，共补料3次，培养至28h结束，得发酵培养液；
[0098] (4)将发酵培养液离心后收集菌泥，连续用生理盐水清洗2次后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比3：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后分装平铺在浅盘中，进行真空冷冻干燥，得菌粉，测得芽孢杆菌13002冻干后活菌数达0.590×1011CFU/g。
[0099] 实施例6
[0100] (1)将处于对数期生长的芽孢杆菌13002的菌悬液于种子培养基中，进行连续2～3次活化培养，得到种子培养液；所述种子培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉0.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.0份，用蒸馏水定容至100份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0101] (2)以体积比6：100的比例，将种子培养液接种于发酵培养基中，于55℃进行摇瓶培养；所述发酵培养基为：按照质量比计算，细菌学蛋白胨1.0份，酵母提取粉2.5份，葡萄糖2.0份，NaCl 1.5份，用Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液定容至100份，并调节pH至6.5，灭菌后冷却备用；
[0102] (3)发酵培养至16h，以0.5g/(L·h)(以葡萄糖的浓度计)的恒定补料速率向发酵培养基中添加发酵培养基，每4h添加一次，共补料3次，培养至28h结束，得发酵培养液；
[0103] (4)将发酵培养液离心后收集菌泥，连续用生理盐水清洗2次后收集菌泥，按保护剂与湿菌泥体积比3：1，加入菌种保护剂后，混合均匀后分装平铺在浅盘中，进行真空冷冻干燥，得菌粉，测得芽孢杆菌13002冻干后活菌数达0.650×1011CFU/g。
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