HbA1c脱氢酶
阅读：1013发布：2021-01-08
专利汇可以提供HbA1c脱氢酶专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种不易受 氧 气浓度影响且直接作用于血红蛋白A1c的HbA1c脱氢酶，以及使用该HbA1c脱氢酶的HbA1c测定方法和测定 试剂 盒 。即，通过在选自由直接作用于血红蛋白A1c且来源于锥毛壳(Coniochaeta)属等的阿 马 多里酶的280位、269位、54位、241位或267位所对应 位置 上取代1个或更多个 氨 基酸残基而得到的具有脱氢酶活性且直接作用于HbA1c的HbA1c脱氢酶，以及使用该HbA1c脱氢酶的HbA1c测定方法、测定试剂盒和 传感器 。本发明的HbA1c脱氢酶直接作用于血红蛋白A1c， 氧化酶 活性降低和/或脱氢酶活性提高，不仅无需血红蛋白A1c的蛋白酶处理，还可以在HbA1c测定中利用 电子 媒介体，以降低氧气浓度的影响，能够高灵敏度地测定HbA1c。，下面是HbA1c脱氢酶专利的具体信息内容。
1.一种样品中血红蛋白A1c的测定方法，包括：使直接作用于血红蛋白A1c的HbA1c脱氢
酶作用于样品，测定由该作用产生的非过氧化氢的还原型电子媒介体或非消耗氧的氧化型
电子媒介体。
2.根据权利要求1所述的测定方法，其中，测定是使用HbA1c脱氢酶、含有HbA1c脱氢酶
的酶电极或具有该酶电极作为工作电极的酶传感器，以及非氧电子媒介体的电化学测定，
或者是使用HbA1c脱氢酶、显色底物和非氧电子媒介体的吸光度测定。
3.一种直接作用于HbA1c的HbA1c脱氢酶，其与修饰前直接作用于血红蛋白A1c的阿马
多里酶相比，氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)降低，所述HbA1c脱氢酶为如下的HbA1c脱氢酶：
(i)在将阿马多里酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列进行比对时，
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中选自由280位、269位、54位、241位和267位构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸被取代，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的
HbA1c脱氢酶；
(ii)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位、269位、54位、
241位和267位所对应位置以外的位置的1个或更多个氨基酸由被取代、缺失或添加的氨基
酸序列组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；
(iii)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:3-14中任一氨基酸序列有70％以上的序列一致性，并且，SEQ ID NO:1的同源性区域中的氨基酸序列与该阿马多里酶的对应同源性区域中的氨基酸序列有90％以上的序列一
致性，其中，SEQ ID NO:1的同源性区域由SEQ ID NO:1的第10位～32位、36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～
162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～
241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～
308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～
383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；
(iv)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ
ID NO:3-14中任一氨基酸序列有80％以上的序列一致性，直接作用于血红蛋白A1c且具有
脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；或者
(v)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，SEQ ID NO:1的保守区域中的氨基酸序列与来源于该阿
马多里酶的天然阿马多里酶的对应保守区域中的氨基酸序列有90％以上的序列一致性，其
中，SEQ ID NO:1的保守区域由SEQ ID NO:1的第11、12、13、15、17、18、20、22、23、24、25、27、
29、31、36、37、41、46、47、50、51、52、54、56、57、58、75、79、82、84、85、93、95、149、158、159、
162、165、166、177、180、202、208、218、220、221、222、224、228、233、239、243、246、250、255、
258、260、266、267、270、272、277、278、280、281、282、284、285、286、318、321、326、329、334、
339、346、347、348、351、352、354、358、359、362、363、370、373、376、382、385、386、389、406、
407、409、418、425、427位组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶。
4.根据权利要求3所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为选自由谷氨酰
胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺构成的组的极性氨基酸；选自由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸构成的组的带电氨基酸；或者选自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组的氨基酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为选自由天冬酰
胺、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸或缬氨酸构成的组的氨基酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为选自由谷氨酰
胺、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸或组氨酸构成的组的氨基酸；或者
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸。
5.根据权利要求4所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、丝氨
酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺或丙氨
酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、谷氨
酸或赖氨酸；或者
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸。
6.根据权利要求5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、丝氨
酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸或酪氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺或丙氨
酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、谷氨
酸或赖氨酸；或者
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸或酪氨酸。
7.根据权利要求5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺或丝
氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸或酪氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺；或者
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨
酸或酪氨酸。
8.根据权利要求5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺或组
氨酸；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮
氨酸；或者
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮
氨酸。
9.根据权利要求5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮
氨酸；或者
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮
氨酸。
10.根据权利要求3～9中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，其中，所述HbA1c脱氢酶的脱氢
酶活性与修饰前的阿马多里酶(100％)相比，降低至小于60％，或者氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)与修饰前的阿马多里酶(100％)相比，降低至小于40％。
11.根据权利要求3～10中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，其中，所述阿马多里酶来源于
锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、节菱孢
(Arthrinium)属、弯孢(Curvularia)属、新赤壳(Neocosmospora)属、隐球菌
(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、裸孢壳
(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)
属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属或节杆菌(Arthrobacter)属。
12.根据权利要求3～11中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，其具有SEQ ID NO:1、SEQ ID
NO:3-14或SEQ ID NO:16-26中任意一个所示的氨基酸序列，并具有权利要求3～9中任意一
项规定的氨基酸取代。
13.根据权利要求3～12中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，在将HbA1c脱氢酶的氨基酸序
列与SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列进行比对时，所述HbA1c脱氢酶在SEQ ID NO:1所示
的氨基酸序列中选自由如下构成的组的位置所对应位置上进一步有1个以上的氨基酸取代
或缺失，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性：
(A)对62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、356位、64位和/或99位的取代；
(B)对262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位和/或81位的取代；以及
(C)羧基末端的435位、436位和437位缺失3个氨基酸残基。
14.根据权利要求13所述的HbA1c脱氢酶，在将HbA1c脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID
NO:1中记载的氨基酸序列进行比对时，所述HbA1c脱氢酶在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列
中选自由如下构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸进一步被取代为选自由如下
构成的组的氨基酸或缺失，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性：
(A)62位精氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；
63位亮氨酸所对应位置的氨基酸被取代为组氨酸或丙氨酸；
102位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸；
106位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸；
110位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸被取代为亮氨酸或酪氨酸；
113位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸；
355位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丝氨酸；
419位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸；
68位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺；
356位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为苏氨酸；
64位精氨酸所对应位置的氨基酸被取代为甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苏氨酸、
缬氨酸或异亮氨酸；
99位组氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丝氨酸；
(B)262位天冬酰胺所对应位置的氨基酸被取代为组氨酸；
257位缬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
249位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
253位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
337位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
340位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为脯氨酸；
232位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
129位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
132位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
133位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸；
44位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为脯氨酸；
256位甘氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
231位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
81位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；以及
(C)435位脯氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸所对应位置的羧基末端缺失3个氨基酸。
15.一种HbA1c测定试剂盒，其包含权利要求3～14中任意一项所述的HbA1c脱氢酶。
16.一种酶电极，其包含权利要求3～14中任意一项所述的HbA1c脱氢酶。
17.一种酶传感器，其具有权利要求16所述的酶电极作为工作电极。
18.根据权利要求1或2所述的测定方法，其中，HbA1c脱氢酶是权利要求3～14中任意一
项所述的HbA1c脱氢酶。
HbA1c脱氢酶
技术领域
[0001] 本发明涉及一种作用于HbA1c，且脱氢酶活性提高的阿马多里酶(amadoriase)、氧化酶活性降低的阿马多里酶、脱氢酶活性提高且氧化酶活性降低的阿马多里酶、其基因和
重组DNA以及该阿马多里酶的制备方法。此外本发明涉及作用于可有效用于作为糖尿病的
诊断用酶、传感器、以及糖尿病标记物的测定试剂盒的HbA1c的脱氢酶。
重组DNA以及该阿马多里酶的制备方法。此外本发明涉及作用于可有效用于作为糖尿病的
诊断用酶、传感器、以及糖尿病标记物的测定试剂盒的HbA1c的脱氢酶。
背景技术
[0002] 糖化蛋白是葡萄糖等醛糖(潜在地具有醛基的单糖及其衍生物)的醛基与蛋白质的氨基以非酶的方式形成共价键并通过阿马多里重排而产生的。作为蛋白质的氨基，可举
出氨基末端的α氨基、蛋白质中赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为在生物体内产生的糖化蛋白，已知有血液中的血红蛋白被糖化的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化的糖化白蛋白等。
出氨基末端的α氨基、蛋白质中赖氨酸残基侧链的ε氨基。作为在生物体内产生的糖化蛋白，已知有血液中的血红蛋白被糖化的糖化血红蛋白、白蛋白被糖化的糖化白蛋白等。
[0003] 这些生物体内产生的糖化蛋白中，作为在糖尿病的临床诊断领域用于糖尿病患者的诊断及症状管理的重要的血糖控制标记物，糖化血红蛋白(HbA1c)越来越受到关注。血液中的HbA1c浓度可反映过去一定期间的平均血糖值，其测定值在糖尿病症状的诊断及管理
中已成为重要的指标。
中已成为重要的指标。
[0004] 作为快速简便的测定该HbA1c的方法，提出有使用阿马多里酶的酶方法，即用蛋白酶等分解HbA1c，对从其β链氨基末端游离的α-果糖基缬氨酰基组氨酸(下面表示为“αFVH”)或者α-果糖基缬氨酸(下面表示为“αFV”)进行定量的方法(例如，参照专利文献1～7)。
[0005] 另外，作为使用阿马多里酶的HbA1c测定方法，有如下方法：使用Glu-C蛋白酶消化HbA1c，在使由糖化的β链氨基末端含缬氨酸的6个氨基酸组成的α-果糖基六肽(α-果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸，以下记作αF6P)游离时，对游离的αF6P进行定量(例如参考专利文献16、17、18、19)。该方法是按照IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine，国际临床化学和实验室
医学联合会)规定的HbA1c测定法(参考非专利文献10)，通过酶的HbA1c的测定方法。
医学联合会)规定的HbA1c测定法(参考非专利文献10)，通过酶的HbA1c的测定方法。
[0006] 但是，蛋白酶或肽酶也可以作用于阿马多里酶、过氧化物酶和其他蛋白质试剂。因此，本发明人开发了一种无需蛋白酶而可直接作用于HbA1c的阿马多里酶(专利文献20)。另外还有类似的报告例(专利文献21)。这些阿马多里酶在氧化糖化底物时，将电子传递给氧分子。
[0008] 阿马多里酶发现于细菌、酵母、真菌中，作为特别是对HbA1c测定有用的具有对αFVH和/或αFV的酶活性的阿马多里酶，例如，报告有来源于锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、节菱孢(Arthrinium)属、弯孢
(Curvularia)属、新赤壳(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌
(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、裸孢壳(Emericella)属、细基格孢
(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌((Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳
(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌
(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母
(Pichia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌
(Arthrobacter)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属的阿马多里酶(例如，参照专利文献1、6～15、非专利文献1～11)。予以说明，上述报告例中，阿马多里酶因文献不同而有被记载为酮胺氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等的情况。
(Curvularia)属、新赤壳(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌
(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、裸孢壳(Emericella)属、细基格孢
(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌((Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳
(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌
(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母
(Pichia)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌
(Arthrobacter)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属的阿马多里酶(例如，参照专利文献1、6～15、非专利文献1～11)。予以说明，上述报告例中，阿马多里酶因文献不同而有被记载为酮胺氧化酶或果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等的情况。
[0009] 阿马多里酶可以通过与过氧化物酶共轭，利用显色底物而用于测定样品中的糖化底物。现有的阿马多里酶在氧化糖化底物时，能够将电子传递给氧分子。该活性称为氧化酶活性。另一方面，现有的阿马多里酶在氧化糖化底物时，也能够向不同于氧分子的电子受体(电子媒介体)传递电子。该活性称为脱氢酶活性。如果降低酶的氧化酶活性并增加脱氢酶
活性，则在氧化糖化底物时，可以优先将电子传递给电子受体(电子媒介体)。因此，可以不受样品中氧的影响而测定来源于糖化底物的电子。
活性，则在氧化糖化底物时，可以优先将电子传递给电子受体(电子媒介体)。因此，可以不受样品中氧的影响而测定来源于糖化底物的电子。
[0010] 公知文献中可见到公开了关于阿马多里酶的脱氢酶活性提高：例如，通过将来源于颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基氨基酸氧化酶的56位天冬酰胺取代为丙
氨酸，显示出相对于脱氢酶活性中αFV的Vmax/Km提高2.3倍(参照专利文献16)。但是，公开的突变体相对于氧化酶活性中αFV的Vmax/Km与野生型相比提高1.2倍，因此认为依然受到了氧的影响。另外，公开的突变体虽然将αFV作为底物，但并不会直接作用于HbA1c本身。
氨酸，显示出相对于脱氢酶活性中αFV的Vmax/Km提高2.3倍(参照专利文献16)。但是，公开的突变体相对于氧化酶活性中αFV的Vmax/Km与野生型相比提高1.2倍，因此认为依然受到了氧的影响。另外，公开的突变体虽然将αFV作为底物，但并不会直接作用于HbA1c本身。
[0012] 现有技术文献
[0013] 专利文献
[0014] 专利文献1：国际公开第2004/104203号
[0015] 专利文献2：国际公开第2005/49857号
[0016] 专利文献3：日本特开2001-95598号公报
[0017] 专利文献4：日本特公平05-33997号公报
[0018] 专利文献5：日本特开平11-127895号公报
[0019] 专利文献6：国际公开第97/13872号
[0020] 专利文献7：日本特开2011-229526号公报
[0021] 专利文献8：日本特开2003-235585号公报
[0022] 专利文献9：日本特开2004-275013号公报
[0023] 专利文献10：日本特开2004-275063号公报
[0024] 专利文献11：日本特开2010-35469号公报
[0025] 专利文献12：日本特开2010-57474号公报
[0026] 专利文献13：国际公开第2010/41715号
[0027] 专利文献14：国际公开第2010/41419号
[0028] 专利文献15：国际公开第2011/15325号
[0029] 专利文献16：国际公开第2011/015325号
[0030] 专利文献17：国际公开第2008/108385号
[0031] 专利文献18：国际公开第2015/005258号
[0032] 专利文献19：国际公开第2013/162035号
[0033] 专利文献20：国际公开第2015/060429号
[0034] 专利文献21：国际公开第2015/005257号
[0035] 专利文献22：国际公开第2013/100006号
[0036] 非专利文献
[0037] 非专利文献1：Biochem.Biophys.Res.Commun.311,104-11,2003
[0038] 非专利文献2：Biotechnol.Bioeng.106,358-66,2010
[0039] 非专利文献3：J.Biosci.Bioeng.102,241-3,2006
[0040] 非专利文献4：Eur.J.Biochem.242,499-505,1996
[0041] 非专利文献5：Arch.Microbiol.178,344-50,2002
[0042] 非专利文献6：Mar.Biotechnol.6,625-32,2004
[0043] 非专利文献7：Biosci.Biotechnol.Biochem.59,487-91,1995
[0044] 非专利文献8：Appl.Microbiol.Biotechnol.74,813-819,2007
[0045] 非专利文献9：Biosci.Biotechnol.Biochem.66,1256-61,2002
[0046] 非专利文献10：Biosci.Biotechnol.Biochem.66,2323-29,2002
[0047] 非专利文献11：Biotechnol.Letters 27,27-32,2005
发明内容
[0048] 发明所要解决的问题
[0049] 本发明的目的在于提供直接作用于HbA1c、氧化酶活性降低、脱氢酶活性增强的阿马多里酶。此外本发明的目的还在于提供直接作用于HbA1c，且活性几乎不受溶解氧水平影响的阿马多里酶。
[0050] 解决问题的技术方案
[0051] 目前的现状是几乎没有公开的用于酶的氧化酶活性降低及赋予脱氢酶活性的信息，在这样的情况中，本发明人进行了反复专心研究，结果发现了对于来源于锥毛壳属的阿马多里酶，通过导入特定的氨基酸残基的取代，能够解决上述问题，从而完成了本发明。
[0052] 即，本发明包含如下内容。
[0054] [2]根据1所述的测定方法，其中，测定是使用HbA1c脱氢酶、含有HbA1c脱氢酶的酶电极或具有该酶电极作为工作电极的酶传感器，以及非氧电子媒介体的电化学测定，或者是使用HbA1c脱氢酶、显色底物和非氧电子媒介体的吸光度测定。
[0055] [3]一种直接作用于HbA1c的HbA1c脱氢酶，其与修饰前直接作用于血红蛋白A1c的(亲本)阿马多里酶相比，氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)降低，所述HbA1c脱氢酶为
如下的HbA1c脱氢酶：
如下的HbA1c脱氢酶：
[0056] (i)在将阿马多里酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列进行比对时，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中选自由280位、269位、54位、241位和267位构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸被取代，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的
HbA1c脱氢酶；
HbA1c脱氢酶；
[0057] (ii)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位、269位、54位、241位和267位所对应位置以外的位置的1个或更多个氨基酸由被取代、缺失或添加的氨基酸序列组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；
[0058] (iii)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14中任一氨基酸序列有70％以上的序列一致性，并且，SEQ ID NO:1的同源性区域中的氨基酸序列与该阿马多里酶的对应同源性区域中的氨基酸序列有90％以上的
序列一致性，其中，SEQ ID NO:1的同源性区域由SEQ ID NO:1的第10位～32位、36～41位、
49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、
156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、
236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、
306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、
370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；
序列一致性，其中，SEQ ID NO:1的同源性区域由SEQ ID NO:1的第10位～32位、36～41位、
49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、
156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、
236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、
306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、
370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位的氨基酸序列组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；
[0059] (iv)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，该阿马多里酶的全长氨基酸序列与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14中任一氨基酸序列有80％以上的序列一致性，直接作用于血红蛋白A1c且
具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；或者
具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶；或者
[0060] (v)所述(i)的HbA1c脱氢酶中，SEQ ID NO:1的保守区域中的氨基酸序列与来源于该阿马多里酶的天然阿马多里酶的对应保守区域中的氨基酸序列有90％以上的序列一致
性，其中，SEQ ID NO:1的保守区域由SEQ ID NO:1的第11、12、13、15、17、18、20、22、23、24、
25、27、29、31、36、37、41、46、47、50、51、52、54、56、57、58、75、79、82、84、85、93、95、149、158、
159、162、165、166、177、180、202、208、218、220、221、222、224、228、233、239、243、246、250、
255、258、260、266、267、270、272、277、278、280、281、282、284、285、286、318、321、326、329、
334、339、346、347、348、351、352、354、358、359、362、363、370、373、376、382、385、386、389、
406、407、409、418、425、427位组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶。
性，其中，SEQ ID NO:1的保守区域由SEQ ID NO:1的第11、12、13、15、17、18、20、22、23、24、
25、27、29、31、36、37、41、46、47、50、51、52、54、56、57、58、75、79、82、84、85、93、95、149、158、
159、162、165、166、177、180、202、208、218、220、221、222、224、228、233、239、243、246、250、
255、258、260、266、267、270、272、277、278、280、281、282、284、285、286、318、321、326、329、
334、339、346、347、348、351、352、354、358、359、362、363、370、373、376、382、385、386、389、
406、407、409、418、425、427位组成，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性的HbA1c脱氢酶。
[0061] [4]根据3所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
[0062] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为选自由谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺构成的组的极性氨基酸；选自由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸构成的组的带电氨基酸；或者选自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组的氨基酸；
[0063] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸；
[0064] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为选自由天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸或缬氨酸构成的组的氨基酸；
[0065] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为选自由谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、精氨酸、天冬氨酸或组氨酸构成的组的氨基酸；或者[0066] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、
亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸。
亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸、色氨酸、缬氨酸或丙氨酸。
[0067] [5]根据4所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
[0068] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；
[0069] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸；
[0070] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺或丙氨酸；
[0071] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸；或者
[0072] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸、酪氨酸、异亮氨酸或色氨酸。
[0073] [6]根据5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
[0074] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸或甲硫氨酸；
[0075] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
[0076] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中54位所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺或丙氨酸；
[0077] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺、谷氨酸或赖氨酸；或者
[0078] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸。
[0079] [7]根据5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
[0080] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺或丝氨酸；
[0081] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸；
[0082] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中241位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺；或者
[0083] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸、亮氨酸或酪氨酸。
[0084] [8]根据5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
[0085] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺或组氨酸；
[0086] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸；或者
[0087] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸。
[0088] [9]根据5所述的HbA1c脱氢酶，其为如下的HbA1c脱氢酶：
[0089] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中280位所对应位置的氨基酸被取代为谷氨酰胺；
[0090] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中269位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸；或者
[0091] SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中267位所对应位置的氨基酸被取代为甲硫氨酸或亮氨酸。
[0092] [10]根据3～9中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，其中，所述HbA1c脱氢酶的脱氢酶活性与修饰前的阿马多里酶(100％)相比，降低至小于60％，或者氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)与修饰前的阿马多里酶(100％)相比，降低至小于40％。
[0093] [11]根据3～10中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，其中，所述阿马多里酶来源于锥毛壳(Coniochaeta)属、正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、节菱孢
(Arthrinium)属、弯孢(Curvularia)属、新赤壳(Neocosmospora)属、隐球菌
(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、裸孢壳
(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)
属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属或节杆菌(Arthrobacter)属。
(Arthrinium)属、弯孢(Curvularia)属、新赤壳(Neocosmospora)属、隐球菌
(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉(Aspergillus)属、裸孢壳
(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)
属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属、棒状杆菌(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属或节杆菌(Arthrobacter)属。
[0094] [12]根据3～11中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，其具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26中任意一个所示的氨基酸序列，并具有3～9中任意一项规定的氨
基酸取代。
基酸取代。
[0095] [13]根据3～12中任意一项所述的HbA1c脱氢酶，在将HbA1c脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列进行比对时，所述HbA1c脱氢酶在SEQ ID NO:1所示的
氨基酸序列中选自由如下构成的组的位置所对应位置上进一步有1个以上的氨基酸取代或
缺失，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性：
氨基酸序列中选自由如下构成的组的位置所对应位置上进一步有1个以上的氨基酸取代或
缺失，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性：
[0096] (A)对62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、356位、64位和/或99位的取代；
[0097] (B)对262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位和/或81位的取代；以及
[0098] (C)羧基末端的435位、436位和437位缺失3个氨基酸残基。
[0099] [14]根据13所述的HbA1c脱氢酶，在将HbA1c脱氢酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列进行比对时，所述HbA1c脱氢酶在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中选
自由如下构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸进一步被取代为选自由如下构成
的组的氨基酸或缺失，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性：
自由如下构成的组的位置所对应位置的1个以上的氨基酸进一步被取代为选自由如下构成
的组的氨基酸或缺失，直接作用于血红蛋白A1c且具有脱氢酶活性：
[0100] (A)62位精氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、天冬酰胺或天冬氨酸；
[0101] 63位亮氨酸所对应位置的氨基酸被取代为组氨酸或丙氨酸；
[0102] 102位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸；
[0103] 106位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸；
[0104] 110位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸被取代为亮氨酸或酪氨酸；
[0105] 113位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸或精氨酸；
[0106] 355位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丝氨酸；
[0107] 419位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸；
[0108] 68位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为天冬酰胺；
[0109] 356位丙氨酸所对应位置的氨基酸被取代为苏氨酸；
[0110] 64位精氨酸所对应位置的氨基酸被取代为甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；
[0111] 99位组氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丝氨酸；
[0112] (B)262位天冬酰胺所对应位置的氨基酸被取代为组氨酸；
[0113] 257位缬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸；
[0114] 249位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0115] 253位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0116] 337位谷氨酰胺所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0117] 340位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为脯氨酸；
[0118] 232位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0119] 129位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0120] 132位天冬氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0121] 133位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸；
[0122] 44位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为脯氨酸；
[0123] 256位甘氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0124] 231位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；
[0125] 81位谷氨酸所对应位置的氨基酸被取代为赖氨酸、精氨酸；以及(C)435位脯氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸所对应位置的羧基末端缺失3个氨基酸。
[0126] [15]一种HbA1c测定试剂盒，其包含3～14中任意一项所述的HbA1c脱氢酶。
[0127] [16]一种酶电极，其包含3～14中任意一项所述的HbA1c脱氢酶。
[0128] [17]一种酶传感器，其具有如16所述的酶电极作为工作电极。
[0129] [18]根据1或2所述的测定方法，其中，HbA1c脱氢酶是3～14中任意一项所述的HbA1c脱氢酶。
[0131] 发明效果
[0132] 根据本发明，能够提供一种无需用蛋白酶处理等就可测定HbA1c，不易受氧气的影响，还可以作为高灵敏度测定的糖尿病诊断用酶，此外在糖尿病标记物测定用传感器中使
用的优异的阿马多里酶，以及提供编码该酶的基因等。如果使用该阿马多里酶，则无需用蛋白酶处理等，在氧气存在下也能够更准确地进行糖化血红蛋白的测定。
附图说明
用的优异的阿马多里酶，以及提供编码该酶的基因等。如果使用该阿马多里酶，则无需用蛋白酶处理等，在氧气存在下也能够更准确地进行糖化血红蛋白的测定。
附图说明
[0133] 图1-1是示例各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的一致性和相似氨基酸的图。比对了Co、Et、Py、Ar、Cc、Nv、Cn、Pn、An、En、Ul和Pj。
[0134] 图1-2是图1-1的续图。
[0135] 图1-3是图1-2的续图。
[0136] 图1-4是图1-3的续图。
[0137] 图1-5是图1-4的续图。
[0138] 图2-1是示例各种公知的阿马多里酶的氨基酸序列的一致性和相似氨基酸的图。除了图1所示的阿马多里酶以外，还比对了Ao2、Af2、At、Fo、Ao1、Af1、Pi、Dh。
[0139] 图2-2是图2-1的续图。
[0140] 图2-3是图2-2的续图。
[0141] 图2-4是图2-3的续图。
[0142] 图2-5是图2-4的续图。
[0143] 图2-6是图2-5的续图。
[0144] 图2-7是图2-6的续图。
[0145] 图2-8是图2-7的续图。
[0146] 图2-9是图2-8的续图。
[0147] 图2-10是图2-9的续图。
[0148] 图3表示阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性。图3是用于说明酶促反应的示意图，但并不限定酶的底物特异性等特性。
[0149] 图4表示使用A1cDH的HbA1c测定结果。
[0150] 图5表示绘制的各种HbA1c浓度的电流响应值结果。
具体实施方式
[0151] 下面详细地说明本发明。
[0152] 本发明的阿马多里酶可以将糖化蛋白、糖化肽作为底物。
[0153] (糖化蛋白、血红蛋白A1c)
[0154] 本发明的糖化蛋白是指非酶糖化的蛋白质。糖化蛋白在生物体内、外均存在，作为在生物体内存在的例子，有血液中的糖化血红蛋白、糖化白蛋白等，在糖化血红蛋白中将血红蛋白的β链氨基末端的缬氨酸被糖化的糖化血红蛋白特别地称为血红蛋白A1c(HbA1c)。作为在生物体外存在的例子，有蛋白质、肽与糖共存的液状调味料等饮料食品或输注液体
等。
等。
[0155] (糖化肽、果糖基肽)
[0156] 本发明的糖化肽是指来源于糖化蛋白的非酶糖化的肽，包括肽被直接非酶糖化而成的肽、通过蛋白酶等分解糖化蛋白而结果产生的肽、构成糖化蛋白的(多)肽被糖化而成
的肽。有时也将糖化肽称为果糖基肽。糖化蛋白中，作为受到糖化的肽侧的氨基，可举出氨基末端的α-氨基、肽内部的赖氨酸残基侧链的ε-氨基等，本发明的糖化肽更具体地是指α-糖化肽(α-果糖基肽)。α-糖化肽是从N末端的α-氨基酸被糖化的糖化蛋白通过某种手段，例如蛋白酶的限定分解等使其游离而形成的。例如，对象物的糖化蛋白为血红蛋白A1c
(HbA1c)时，该α-糖化肽是指从N末端被糖化的HbA1c的β链切出的糖化的肽。由146个残基的氨基酸构成的HbA1c的β链也属于α-糖化肽(αF146P)。
的肽。有时也将糖化肽称为果糖基肽。糖化蛋白中，作为受到糖化的肽侧的氨基，可举出氨基末端的α-氨基、肽内部的赖氨酸残基侧链的ε-氨基等，本发明的糖化肽更具体地是指α-糖化肽(α-果糖基肽)。α-糖化肽是从N末端的α-氨基酸被糖化的糖化蛋白通过某种手段，例如蛋白酶的限定分解等使其游离而形成的。例如，对象物的糖化蛋白为血红蛋白A1c
(HbA1c)时，该α-糖化肽是指从N末端被糖化的HbA1c的β链切出的糖化的肽。由146个残基的氨基酸构成的HbA1c的β链也属于α-糖化肽(αF146P)。
[0157] 一实施方式中本发明的阿马多里酶进行作用的测定物质(底物)为HbA1c、更具体地为HbA1c的β链。另一实施方式中本发明的阿马多里酶进行作用的测定物质为从HbA1c的β链切出的α-糖化肽，例如为αFV～αF128P、αFV～αF64P、αFV～αF32P、αFV～αF16P；例如为αF6P(α-果糖基缬氨酰基组氨酰基亮氨酰基苏氨酰基脯氨酰基谷氨酸)。另一实施方式中本
发明的阿马多里酶进行作用的测定物质为αFVH(α-果糖基缬氨酰基组氨酸)或αFV(α-果糖基缬氨酸)。
发明的阿马多里酶进行作用的测定物质为αFVH(α-果糖基缬氨酰基组氨酸)或αFV(α-果糖基缬氨酸)。
[0158] (阿马多里酶)
[0159] 阿马多里酶也称为酮胺氧化酶、果糖基氨基酸氧化酶、果糖基肽氧化酶、果糖基胺氧化酶等，是在氧存在下，催化亚氨基二乙酸或其衍生物(阿马多里化合物)氧化而生成乙醛酸或α-酮醛、氨基酸或肽以及过氧化氢的反应的酶。阿马多里酶广泛分布于自然界，可以通过探索起源于微生物、动物或植物的酶来获得。微生物中，例如，可以从丝状菌、酵母或细菌等中获得。
[0160] (HbA1c氧化酶)
[0161] 各种阿马多里酶中识别HbA1c本身作为底物，具有直接氧化HbA1c的活性的氧化酶，在本说明书中称作HbA1c氧化酶，有时将其记作A1cOX。直接作用于HbA1c的阿马多里酶例如可以根据国际公开第2015/060429号的记载来获得。另外，也可以根据国际公开第
2015/005257号的记载来获得。通过参照将其全部内容并入本说明书中。HbA1c氧化酶可以
具有这种公知文献记载的一个或更多个氨基酸取代。另外，还可以向公知的HbA1c氧化酶中导入改变底物特异性的突变等。
2015/005257号的记载来获得。通过参照将其全部内容并入本说明书中。HbA1c氧化酶可以
具有这种公知文献记载的一个或更多个氨基酸取代。另外，还可以向公知的HbA1c氧化酶中导入改变底物特异性的突变等。
[0162] 作为直接作用于HbA1c的阿马多里酶可以具有的氨基酸取代的示例，可举出SEQ ID NO:1的氨基酸序列中如下位置所对应位置的氨基酸取代。
[0163] (a)62位(精氨酸)
[0164] (b)63位(亮氨酸)
[0165] (c)102位(谷氨酸)
[0166] (d)106位(天冬氨酸)
[0167] (e)110位(谷氨酸)
[0168] (f)113位(丙氨酸)
[0169] (g)355位(丙氨酸)
[0170] (h)419位(丙氨酸)
[0171] (i)68位(天冬氨酸)
[0172] (j)356位(丙氨酸)
[0173] (k)64位(精氨酸)
[0174] (l)99位(组氨酸)
[0175] 这种情况下，优选(a)SEQ ID NO:1的62位所对应位置的氨基酸可以被取代为天冬酰胺、丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸或脯氨酸。优选(b)SEQ ID NO:1的63位所对应位置的氨基酸可以被取代为组氨酸、丙氨酸或甘氨酸。优选(c)SEQ ID NO:1的102位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸。优选(d)SEQ ID NO:1的106位所对应位置的氨基酸可以被取代为丙氨酸、赖氨酸或精氨酸。优选(e)SEQ ID NO:1的110位所对应位置的氨基酸可以被取代为亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸或组氨酸。优选(f)SEQ ID NO:1的113位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸或精氨酸。优选(g)SEQ ID NO:1的355位所对应位置的氨基酸可以被取代为丝氨
酸。根据情况(h)SEQ ID NO:1的419位所对应位置的氨基酸也可以被取代为赖氨酸。根据情况(i)SEQ ID NO:1的68位所对应位置的氨基酸也可以被取代为天冬酰胺。根据情况(j)SEQ ID NO:1的356位所对应位置的氨基酸也可以被取代为苏氨酸。根据情况(k)SEQ ID NO:1的
64位所对应位置的氨基酸可以被取代为甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。根据情况(l)SEQ ID NO:1的99位所对应位置的氨基酸可以被取代为丝氨酸。
酸。根据情况(h)SEQ ID NO:1的419位所对应位置的氨基酸也可以被取代为赖氨酸。根据情况(i)SEQ ID NO:1的68位所对应位置的氨基酸也可以被取代为天冬酰胺。根据情况(j)SEQ ID NO:1的356位所对应位置的氨基酸也可以被取代为苏氨酸。根据情况(k)SEQ ID NO:1的
64位所对应位置的氨基酸可以被取代为甘氨酸、丝氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、苏氨酸、缬氨酸或异亮氨酸。根据情况(l)SEQ ID NO:1的99位所对应位置的氨基酸可以被取代为丝氨酸。
[0176] 在特定的实施方式中，HbA1c氧化酶可以具有不同于上述突变的突变，或者除了上述突变以外，还可以在以下位置或其所对应位置具有一个以上的氨基酸取代：
[0177] (l)SEQ ID NO:1的67位；
[0178] (m)SEQ ID NO:1的72位；
[0179] (n)SEQ ID NO:1的76位；
[0180] (o)SEQ ID NO:1的96位；
[0181] (p)SEQ ID NO:1的109位；
[0182] (q)SEQ ID NO:1的116位。
[0183] 根据情况(l)SEQ ID NO:1的67位所对应位置的氨基酸可以是组氨酸。根据情况(m)SEQ ID NO:1的72位所对应位置的氨基酸可以是丝氨酸。根据情况(n)SEQ ID NO:1的76
位所对应位置的氨基酸可以是丙氨酸或苯丙氨酸。根据情况(o)SEQ ID NO:1的96位所对应
位置的氨基酸可以是谷氨酸。根据情况(p)SEQ ID NO:1的109位所对应位置的氨基酸可以
是精氨酸或赖氨酸。根据情况(q)SEQ ID NO:1的116位所对应位置的氨基酸可以是精氨酸。
位所对应位置的氨基酸可以是丙氨酸或苯丙氨酸。根据情况(o)SEQ ID NO:1的96位所对应
位置的氨基酸可以是谷氨酸。根据情况(p)SEQ ID NO:1的109位所对应位置的氨基酸可以
是精氨酸或赖氨酸。根据情况(q)SEQ ID NO:1的116位所对应位置的氨基酸可以是精氨酸。
[0184] 这些位置(62位/63位/102位/106位/110位/113位/355位/419位/68位/356位/64位/99位，以及67位/72位/76位/96位/109位/116位)的突变是改变阿马多里酶的底物特异
性的突变示例。但这只是示例，改变底物特异性的突变并不限于此。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶具有一个或多个改变底物特异性的突变。
性的突变示例。但这只是示例，改变底物特异性的突变并不限于此。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶具有一个或多个改变底物特异性的突变。
[0185] (本发明的HbA1c脱氢酶)
[0186] 一实施方式中，本发明提供HbA1c脱氢酶。HbA1c脱氢酶可以通过向阿马多里酶中导入本发明的突变来制作。一实施方式中，HbA1c脱氢酶可以根据HbA1c氧化酶(A1cOX)来获得。作为HbA1c氧化酶，可举出但不限于上述这些，只要是识别HbA1c作为底物并直接氧化
HbA1c的，就没有限制。在其他实施方式中，可以向阿马多里酶中导入本发明的突变，制作脱氢酶活性提高的阿马多里酶，然后向其中导入改变底物特异性的突变，制作直接作用于
HbA1c的HbA1c脱氢酶。
HbA1c的，就没有限制。在其他实施方式中，可以向阿马多里酶中导入本发明的突变，制作脱氢酶活性提高的阿马多里酶，然后向其中导入改变底物特异性的突变，制作直接作用于
HbA1c的HbA1c脱氢酶。
[0187] 本说明书中，HbA1c脱氢酶是指与导入本发明的突变之前的(亲本)阿马多里酶相比，导入突变后的阿马多里酶的脱氢酶活性提高，氧化酶活性降低，脱氢酶活性提高且氧化酶活性降低，或者氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)降低，且作用于HbA1c的阿马多里
酶。这并不排除本发明的HbA1c脱氢酶具有氧化酶活性。另外，本发明的HbA1c脱氢酶中不包括完全不识别HbA1c作为底物即完全不作用于HbA1c的阿马多里酶。
酶。这并不排除本发明的HbA1c脱氢酶具有氧化酶活性。另外，本发明的HbA1c脱氢酶中不包括完全不识别HbA1c作为底物即完全不作用于HbA1c的阿马多里酶。
[0188] 一实施方式中，本发明的HbA1c脱氢酶是根据来源于锥毛壳属的阿马多里酶(SEQ ID NO:1)制作的HbA1c脱氢酶。一实施方式中，本发明的HbA1c脱氢酶是根据来源于土正青
霉(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶(SEQ ID NO:3)、来源于棘壳孢属
(Pyrenochaeta sp.)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:4)、来源于节菱孢属(Arthrinium sp.)的
酮胺氧化酶(SEQ ID NO:5)、来源于棒状弯孢(Curvularia clavata)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:6)、来源于侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:7)、来
源于新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:8)、来源
于颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:9)、来源于构巢曲
霉(Aspergillus nidulans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:10)、来源于构巢裸孢壳
(Emericella nidulans)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:11)、来源于细基格孢属
(Ulocladium sp.)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:12)和来源于微紫青霉
(Penicillium janthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:13)、来源于米曲霉
(Aspergillus oryzae)的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉(Asperillus
fumigatus)的阿马多里酶Af2(SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的阿
马多里酶At(SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的阿马多里酶Fo
(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马多里酶Ao1(SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属(Pichia sp.)的阿马多里酶Pi(SEQ ID NO:
25)、来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的阿马多里酶Dh (SEQ ID NO:26)
或它们的同等物制作的HbA1c脱氢酶。
霉(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶(SEQ ID NO:3)、来源于棘壳孢属
(Pyrenochaeta sp.)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:4)、来源于节菱孢属(Arthrinium sp.)的
酮胺氧化酶(SEQ ID NO:5)、来源于棒状弯孢(Curvularia clavata)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:6)、来源于侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:7)、来
源于新型隐球菌(Cryptococcus neoformans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:8)、来源
于颖枯壳针孢(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:9)、来源于构巢曲
霉(Aspergillus nidulans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:10)、来源于构巢裸孢壳
(Emericella nidulans)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:11)、来源于细基格孢属
(Ulocladium sp.)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:12)和来源于微紫青霉
(Penicillium janthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:13)、来源于米曲霉
(Aspergillus oryzae)的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉(Asperillus
fumigatus)的阿马多里酶Af2(SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的阿
马多里酶At(SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的阿马多里酶Fo
(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马多里酶Ao1(SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属(Pichia sp.)的阿马多里酶Pi(SEQ ID NO:
25)、来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的阿马多里酶Dh (SEQ ID NO:26)
或它们的同等物制作的HbA1c脱氢酶。
[0189] 作为这种HbA1c脱氢酶的示例，可举出与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26中任意一个具有高序列一致性(例如，30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、
50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、
83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上)的氨基酸序列的阿马多里酶，以及在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-
26中任意一个的氨基酸序列中，有1个或数个的氨基酸被缺失、取代、添加和/或插入而成的氨基酸序列的阿马多里酶。
50％以上、55％以上、60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、
83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上)的氨基酸序列的阿马多里酶，以及在SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-
26中任意一个的氨基酸序列中，有1个或数个的氨基酸被缺失、取代、添加和/或插入而成的氨基酸序列的阿马多里酶。
[0190] 予以说明，本发明的HbA1c脱氢酶可以根据来源于例如正青霉(Eupenicillium)属、棘壳孢(Pyrenochaeta)属、节菱孢(Arthrinium)属、弯孢(Curvularia)属、新赤壳
(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉
(Aspergillus)属、裸孢壳(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳
(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌
(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌
(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、棒状杆菌
(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属等的生物种的阿马多里酶制作而成。这些中优选作用于HbA1c，且具有脱氢酶活性，氨基酸序列如上所述与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26具
有高序列一致性的HbA1c脱氢酶。
(Neocosmospora)属、隐球菌(Cryptococcus)属、暗球腔菌(Phaeosphaeria)属、曲霉
(Aspergillus)属、裸孢壳(Emericella)属、细基格孢(Ulocladium)属、青霉(Penicillium)属、镰刀菌(Fusarium)属、Achaetomiella属、无毛毛壳(Achaetomium)属、梭孢壳
(Thielavia)属、毛壳(Chaetomium)属、五谷麻孢壳(Gelasinospora)属、小囊菌
(Microascus)属、小球腔菌(Leptosphaeria)属、蛇孢腔菌(Ophiobolus)属、格孢腔菌
(Pleospora)属、闭毛孢壳(Coniochaetidium)属、毕赤酵母(Pichia)属、棒状杆菌
(Corynebacterium)属、土壤杆菌(Agrobacterium)属、节杆菌(Arthrobacter)属、德巴利酵母(Debaryomyces)属等的生物种的阿马多里酶制作而成。这些中优选作用于HbA1c，且具有脱氢酶活性，氨基酸序列如上所述与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26具
有高序列一致性的HbA1c脱氢酶。
[0191] HbA1c脱氢酶可以通过在HbA1c氧化酶的氨基酸序列中将至少1个氨基酸残基进行取代或添加或缺失而得到。
[0192] (带来脱氢酶活性提高/氧化酶活性降低的取代)
[0193] 作为带来脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸取代，可举出与SEQ ID NO:1的氨基酸序列中如下位置所对应位置的氨基酸取代。有时会将它们称为本发明的提高
脱氢酶活性的突变、本发明的降低氧化酶活性的突变、本发明的提高脱氢酶活性和/或降低氧化酶活性的突变，或者单独称为本发明的突变或本发明的取代。
脱氢酶活性的突变、本发明的降低氧化酶活性的突变、本发明的提高脱氢酶活性和/或降低氧化酶活性的突变，或者单独称为本发明的突变或本发明的取代。
[0194] (1)280位所对应位置的取代，例如被取代为选自由谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺构成的组的极性氨基酸；选自由天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸构成的组的带电氨基酸；或者选自由甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸构成的组的氨基酸。
[0195] (2)267位所对应位置的取代，例如被取代为选自由酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或丙氨酸构成的组的疏水性氨基酸残基。
[0196] (3)269位所对应位置的取代，例如被取代为选自由酪氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、半胱氨酸或丙氨酸构成的组的疏水性氨基酸残基。
[0197] (4)54位所对应位置的取代，例如被取代为天冬酰胺、丙氨酸、谷氨酰胺、组氨酸、甘氨酸或缬氨酸。
[0198] (5)241位所对应位置的取代，例如被取代为谷氨酰胺、赖氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、精氨酸或组氨酸。
[0199] 本说明书为了方便，有时将谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和天冬酰胺称为极性氨基酸。此外有时将天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸称为带电氨基酸。此外，有时将丙氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸称为疏水性氨基酸。此外有时将甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、脯氨酸称为体积大的氨基酸。
[0200] 本发明的HbA1c脱氢酶可以是有至少1个上述氨基酸取代，也可以是有多个氨基酸取代。例如，有1、2、3、4或5个上述氨基酸取代。
[0201] 其中，优选具有如下氨基酸位置所对应的氨基酸取代的脱氢酶活性提高且氧化酶活性降低的突变体。
[0202] (1)280位所对应位置的取代，例如被取代为谷氨酰胺、丝氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸或天冬酰胺。
[0203] (2)267位所对应位置的取代，例如被取代为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
[0204] (3)269位所对应位置的取代，例如被取代为酪氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸。
[0205] (4)54位所对应位置的取代，例如被取代为天冬酰胺、丙氨酸。
[0206] (5)241位所对应位置的取代，例如被取代为谷氨酰胺、赖氨酸或谷氨酸。
[0207] 本发明的HbA1c脱氢酶可在SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的位置所对应的位置，具有带来上述的脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸取代。而且，本发明的HbA1c脱氢酶可以进一步在这些取代氨基酸以外的位置将1个或数个(例如1～30个、1～20
个、1～15个、例如1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1～3个、特别优选为1个)氨基酸进行缺失、插入、添加和/或取代。本发明进一步包含如下的阿马多里酶突变体，该阿马多里酶突变体具有带来上述的脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸取代、提高底物特
异性等脱氢酶活性提高以外性质的氨基酸取代，关于除了所述取代的氨基酸以外的氨基酸
部分的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26的氨基酸序列相
比，有30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、55％以上、60％以上、
65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、
86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的氨基酸序列一致性，直接作用于HbA1c，改变脱氢酶活性。
个、1～15个、例如1～10个、优选为1～5个、进一步优选为1～3个、特别优选为1个)氨基酸进行缺失、插入、添加和/或取代。本发明进一步包含如下的阿马多里酶突变体，该阿马多里酶突变体具有带来上述的脱氢酶活性提高和/或氧化酶活性降低的氨基酸取代、提高底物特
异性等脱氢酶活性提高以外性质的氨基酸取代，关于除了所述取代的氨基酸以外的氨基酸
部分的氨基酸序列，与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26的氨基酸序列相
比，有30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、55％以上、60％以上、
65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、
86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的氨基酸序列一致性，直接作用于HbA1c，改变脱氢酶活性。
[0208] 予以说明，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的阿马多里酶是在国际公开第2007/125779号中由保有称为pKK223-3-CFP-T7重组质粒(保藏编号：FERM BP-10593)的大
肠杆菌生产的来源于锥毛壳属的阿马多里酶(CFP-T7)，为申请人之前发现的热稳定性优异
的修饰型阿马多里酶。该CFP-T7为相对于来源于天然型锥毛壳属的阿马多里酶，在272位、
302位和388位依次导入人工突变而获得的三重突变体。
肠杆菌生产的来源于锥毛壳属的阿马多里酶(CFP-T7)，为申请人之前发现的热稳定性优异
的修饰型阿马多里酶。该CFP-T7为相对于来源于天然型锥毛壳属的阿马多里酶，在272位、
302位和388位依次导入人工突变而获得的三重突变体。
[0209] 另外，国际公开第2015/060429号公开的CFP-T7-H35是向CFP-T7导入R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S的氨基酸取代而成的。CFP-T7-H37(SEQ ID NO:14)是向CFP-T7-H35导入突变D68N/A356T而成的。
[0210] 上述的氨基酸取代中，氨基酸位置表示SEQ ID NO:1所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置，在来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的位置所对应位置的氨基酸被取代。关于“对应位置”的含义在后记述。
[0211] (进一步取代)
[0212] (关于使阿马多里酶的表面活性剂耐受性提高的氨基酸取代)
[0213] 本发明人报告过通过取代阿马多里酶的氨基酸残基能够使其表面活性剂耐受性提高。例如参照国际公开第2015/020200号说明书。通过参照将其全部内容并入本说明书
中。
中。
[0214] 作为使阿马多里酶的表面活性剂耐受性提高的氨基酸取代，可举出SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中如下位置所对应位置的氨基酸取代。
[0215] (i)262位；
[0216] (ii)257位；
[0217] (iii)249位；
[0218] (iv)253位；
[0219] (v)337位；
[0220] (vi)340位；
[0221] (vii)232位；
[0222] (viii)129位；
[0223] (ix)132位；
[0224] (x)133位；
[0225] (xi)44位；
[0226] (xii)256位；
[0227] (xiii)231位；以及
[0228] (xiv)81位。
[0229] 根据情况262位所对应位置的氨基酸可以被取代为组氨酸。根据情况257位所对应位置的氨基酸可以被取代为半胱氨酸、丝氨酸、苏氨酸。根据情况249位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况253位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨
酸、精氨酸。根据情况337位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况
340位所对应位置的氨基酸可以被取代为脯氨酸。根据情况232位所对应位置的氨基酸可以
被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况129位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况132位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况133位所对应位置的氨基酸可以被取代为丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸。根据情况44位所对应位置的氨基酸可以被取代为脯氨酸。根据情况256位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨
酸、精氨酸。根据情况231位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况81位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
酸、精氨酸。根据情况337位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况
340位所对应位置的氨基酸可以被取代为脯氨酸。根据情况232位所对应位置的氨基酸可以
被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况129位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况132位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况133位所对应位置的氨基酸可以被取代为丙氨酸、甲硫氨酸、赖氨酸、精氨酸。根据情况44位所对应位置的氨基酸可以被取代为脯氨酸。根据情况256位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨
酸、精氨酸。根据情况231位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。根据情况81位所对应位置的氨基酸可以被取代为赖氨酸、精氨酸。
[0230] 本说明书中，这些位置(44位/133位/253位/257位/262位/337位/340位，以及249位/232位/129位/132位/256位/231位/81位)的突变有时称为使阿马多里酶的表面活性剂
耐受性提高的突变。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶还可以具有提高表面活性剂耐
受性的突变。
耐受性提高的突变。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶还可以具有提高表面活性剂耐
受性的突变。
[0231] (关于使阿马多里酶的热稳定性提高的氨基酸缺失)
[0232] 本发明人以前报告过通过从阿马多里酶的羧基末端缺失3个氨基酸残基，能够使其热稳定性提高(参照国际公开第2013/100006号说明书，并通过参照将其全部内容并入本
说明书中)。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶除了上述的取代以外可以进一步缺失从羧基末端起的3个氨基酸残基。本说明书中有时将从羧基末端起的3个氨基酸残基缺失称为
使热稳定性提高的缺失。
说明书中)。在一实施方式中，本发明的阿马多里酶除了上述的取代以外可以进一步缺失从羧基末端起的3个氨基酸残基。本说明书中有时将从羧基末端起的3个氨基酸残基缺失称为
使热稳定性提高的缺失。
[0233] (编码阿马多里酶的基因的获得)
[0234] 为了得到这些编码阿马多里酶的本发明基因(下面也仅称为“阿马多里酶基因”)，通常利用一般使用的基因克隆方法。例如，可以从具有阿马多里酶生产能力的微生物菌体及各种细胞，利用常规方法，例如Current Protocols in Molecular Biology(WILEY
Interscience,1989)记载的方法，提取染色体DNA或mRNA。还可以将mRNA作为模板来合成
cDNA。使用这样得到的染色体DNA或cDNA，能够制作染色体DNA或cDNA文库。
Interscience,1989)记载的方法，提取染色体DNA或mRNA。还可以将mRNA作为模板来合成
cDNA。使用这样得到的染色体DNA或cDNA，能够制作染色体DNA或cDNA文库。
[0235] 接着，根据上述阿马多里酶的氨基酸序列，合成适当的探针DNA，利用使用其从染色体DNA或cDNA文库中筛选阿马多里酶基因的方法；或者根据上述氨基酸序列，制作适当的引物DNA，利用5’RACE法及3’RACE法等适当的聚合酶链反应(PCR法)，扩增包含编码阿马多里酶的目的基因片段的DNA，连接这些DNA片段，能够得到包含目标阿马多里酶基因全长的
DNA。
DNA。
[0236] 作为这样得到的编码阿马多里酶的基因的优选一例，可举出来源于锥毛壳属的阿马多里酶基因(日本特开2003-235585号公报)的例子等。
[0237] 这些阿马多里酶基因从操作上优选按照常规方法连接到各种载体。例如，可举出将编码来源于锥毛壳属NISL 9330株的阿马多里酶基因的DNA插入到pKK223-3载体(GE
HEALTHCARE公司制)中而得到的重组质粒pKK223-3-CFP(日本特开2003-235585号公报)。
HEALTHCARE公司制)中而得到的重组质粒pKK223-3-CFP(日本特开2003-235585号公报)。
[0238] (载体)
[0239] 作为本发明中可使用的载体，并不限定为上述质粒，可以使用除上述以外的例如噬菌体、粘粒等本领域技术人员公知的任意载体。具体地优选例如pBluescriptII SK+
(STRATAGENE公司制)等。
(STRATAGENE公司制)等。
[0240] (阿马多里酶基因的突变处理)
[0241] 阿马多里酶基因的突变处理可以根据预期的突变形式，利用任何公知的方法来进行。即，可以广泛采用使阿马多里酶基因或者整合了该基因的重组DNA与作为突变原的药剂进行接触/作用的方法；紫外线照射法；基因工程手段；或者运用蛋白质工程手段的方法等。
[0243] 上述接触/作用的各条件可以采用与使用的药剂种类等相应的条件，只要是实际中在阿马多里酶基因中引起所期望的突变就没有特别限定。通常，优选在0.5～12M的上述
药剂浓度，在20～80℃的反应温度下接触/作用10分钟以上、优选为10～180分钟，由此能够引起所期望的突变。在进行紫外线照射时，也可以按照如上所述的常规方法进行(现代化
学，第24～30页，1989年6月号)。
药剂浓度，在20～80℃的反应温度下接触/作用10分钟以上、优选为10～180分钟，由此能够引起所期望的突变。在进行紫外线照射时，也可以按照如上所述的常规方法进行(现代化
学，第24～30页，1989年6月号)。
[0244] 作为运用蛋白质工程手段的方法，一般采用作为位点特异性突变(Site-Specific Mutagenesis)而已知的手段。例如可举出Kramer法(Nucleic Acids Res.,12,9441(1984):
Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids
Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679
(1986))、Kunkel法(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.,82,488(1985):Methods Enzymol.,154,
367(1987))等。作为改变DNA中的碱基序列的具体方法，例如可举出利用市售的试剂盒
(Transformer Mutagenesis Kit；Clonetech公司，EXOIII/Mung Bean Deletion Kit；
Stratagene公司制，Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit；Stratagene公司制
等)。
Methods Enzymol.,154,350(1987):Gene,37,73(1985))、Eckstein法(Nucleic Acids
Res.,13,8749(1985):Nucleic Acids Res.,13,8765(1985):Nucleic Acids Res,14,9679
(1986))、Kunkel法(Proc.Natl.Acid.Sci.U.S.A.,82,488(1985):Methods Enzymol.,154,
367(1987))等。作为改变DNA中的碱基序列的具体方法，例如可举出利用市售的试剂盒
(Transformer Mutagenesis Kit；Clonetech公司，EXOIII/Mung Bean Deletion Kit；
Stratagene公司制，Quick Change Site Directed Mutagenesis Kit；Stratagene公司制
等)。
[0245] 另外，也可以使用作为一般的PCR法(聚合酶链反应，Polymerase Chain Reaction)而已知的手段(Technique,1,11(1989))。予以说明，除了上述基因修饰法以外，也可以通过有机合成法或酶合成法来直接合成所期望的修饰阿马多里酶基因。
[0246] 对通过上述方法得到的阿马多里酶基因的DNA碱基序列进行确定或确认时，例如可以使用多毛细管DNA分析系统CEQ2000(Beckman Coulter公司制)或Applied Biosystems
3130xl基因分析仪(Thermo Fisher Scientific制)等来进行。
3130xl基因分析仪(Thermo Fisher Scientific制)等来进行。
[0247] (转化/转导)
[0248] 可通过常规方法将如上所述得到的阿马多里酶基因整合到噬菌体、粘粒、或者原核细胞或真核细胞的转化中使用的质粒等载体上，再通过常规方法对与各载体对应的宿主
进行转化或转导。例如，可以使用得到的重组DNA，对任意宿主进行转化或转导到这些宿主中而得到各菌株，例如属于埃希氏菌属的微生物，作为具体例为大肠杆菌K-12株、优选大肠杆菌JM109株、大肠杆菌DH5α株(均为宝生物工程株式会社制)及大肠杆菌B株，优选大肠杆菌BL21株(株式会社Nippon Gene制)等。
进行转化或转导。例如，可以使用得到的重组DNA，对任意宿主进行转化或转导到这些宿主中而得到各菌株，例如属于埃希氏菌属的微生物，作为具体例为大肠杆菌K-12株、优选大肠杆菌JM109株、大肠杆菌DH5α株(均为宝生物工程株式会社制)及大肠杆菌B株，优选大肠杆菌BL21株(株式会社Nippon Gene制)等。
[0249] (氨基酸序列的一致性或相似性)
[0250] 氨基酸序列的一致性或相似性可以通过GENETYX Ver.11(株式会社GENETYX制)的最大匹配及同源性检索等程序或DNASIS Pro(株式会社日立解决方案制)的最大匹配及多
序列比对等程序进行计算。为了计算氨基酸序列一致性，在比对2个以上的阿马多里酶时，可以研究该2个以上的阿马多里酶中相同的氨基酸位置。根据所述信息，能够确定氨基酸序列中的相同区域。
序列比对等程序进行计算。为了计算氨基酸序列一致性，在比对2个以上的阿马多里酶时，可以研究该2个以上的阿马多里酶中相同的氨基酸位置。根据所述信息，能够确定氨基酸序列中的相同区域。
[0251] 另外，也可以研究2个以上的阿马多里酶中相似的氨基酸位置。例如使用CLUSTALW能够比对多个氨基酸序列，此时，算法使用Blosum62，在比对多个氨基酸序列时，有时将判断为相似的氨基酸称为相似氨基酸。本发明的突变体中，氨基酸取代可以由这类相似氨基
酸间的取代而成。通过所述比对，对于多个氨基酸序列，可以研究氨基酸序列相同的区域和被相似氨基酸占据的位置。根据所述信息，能够确定氨基酸序列中的同源性区域及保守区
域。
酸间的取代而成。通过所述比对，对于多个氨基酸序列，可以研究氨基酸序列相同的区域和被相似氨基酸占据的位置。根据所述信息，能够确定氨基酸序列中的同源性区域及保守区
域。
[0252] 本说明书中“同源性区域”是指在比对2个以上的阿马多里酶时，某一基准的阿马多里酶与比对对象的阿马多里酶的对应位置中氨基酸为由相同或相似氨基酸组成的区域，
为由连续的3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上的氨基酸组成的区域。例如，图1中比对了全长氨基酸序列的序列一致性为74％以上的阿马多里酶。其中，以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第10位～32位为由相同或相似氨基酸组成，因此属于同源性区域。同样以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位能属于同源性区域。
为由连续的3个以上、4个以上、5个以上、6个以上、7个以上、8个以上、9个以上或10个以上的氨基酸组成的区域。例如，图1中比对了全长氨基酸序列的序列一致性为74％以上的阿马多里酶。其中，以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第10位～32位为由相同或相似氨基酸组成，因此属于同源性区域。同样以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，36～41位、49～52位、54～58位、63～65位、73～75位、84～86位、88～90位、120～122位、145～150位、156～162位、164～170位、180～182位、202～205位、207～211位、214～224位、227～230位、236～241位、243～248位、258～261位、266～268位、270～273位、275～287位、295～297位、306～308位、310～316位、324～329位、332～334位、341～344位、346～355位、357～363位、370～383位、385～387位、389～394位、405～410位和423～431位能属于同源性区域。
[0253] 优选的阿马多里酶的同源性区域是以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，由第11位～32位、36～41位、50～52位、54～58位、84～86位、88～90位、145～150位、
157～168位、202～205位、207～212位、215～225位、236～248位、258～261位、266～268位、
270～273位、275～287位、347～354位、357～363位、370～383位、385～387位、和405～410位的氨基酸序列组成的区域。
157～168位、202～205位、207～212位、215～225位、236～248位、258～261位、266～268位、
270～273位、275～287位、347～354位、357～363位、370～383位、385～387位、和405～410位的氨基酸序列组成的区域。
[0254] 进一步优选的阿马多里酶的同源性区域是以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，由第11～18位、20～32位、50～52位、54～58位、266～268位、270～273位、277～286位、和370～383位的氨基酸序列组成的区域。
[0255] 本发明的HbA1c脱氢酶在与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ ID NO:16-26所示的氨基酸序列的阿马多里酶进行比对时，为有30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、例如60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、
82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的全长氨基酸序列一致性，直接作用于HbA1c，并具有脱氢酶活性。进一步，本发明的HbA1c脱氢酶的同源性区域中的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中的同源性区域的氨基
酸序列有70％以上、75％以上、例如80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、
85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的序列一致性。
82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的全长氨基酸序列一致性，直接作用于HbA1c，并具有脱氢酶活性。进一步，本发明的HbA1c脱氢酶的同源性区域中的氨基酸序列与SEQ ID NO:1中的同源性区域的氨基
酸序列有70％以上、75％以上、例如80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、
85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的序列一致性。
[0256] 本说明书中“保守区域”是指在比对2个以上的阿马多里酶时，某一基准的阿马多里酶与比对对象的阿马多里酶的对应位置中氨基酸为由相同或相似氨基酸组成的区域。例
如，图2中比对了全长氨基酸序列的序列一致性为30％以上的阿马多里酶。其中，以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第11、12、13、15、17、18、20、22、23、24、25、27、29、
31、36、37、41、46、47、50、51、52、54、56、57、58、75、79、82、84、85、93、95、149、158、159、162、
165、166、177、180、202、208、218、220、221、222、224、228、233、239、243、246、250、255、258、
260、266、267、270、272、277、278、280、281、282、284、285、286、318、321、326、329、334、339、
346、347、348、351、352、354、358、359、362、363、370、373、376、382、385、386、389、406、407、
409、418、425、427位为由相同或相似氨基酸组成，因此属于保守区域。同样，以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第15、17、18、20、22、23、24、25、27、29、31、41、46、47、
51、52、54、56、57、79、82、93、149、158、159、162、177、180、202、208、221、222、233、243、250、
258、266、267、270、278、280、282、284、285、318、334、347、348、351、362、363、373、376、386、
407、409、418位为由相同氨基酸组成，因此属于保守区域。
如，图2中比对了全长氨基酸序列的序列一致性为30％以上的阿马多里酶。其中，以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第11、12、13、15、17、18、20、22、23、24、25、27、29、
31、36、37、41、46、47、50、51、52、54、56、57、58、75、79、82、84、85、93、95、149、158、159、162、
165、166、177、180、202、208、218、220、221、222、224、228、233、239、243、246、250、255、258、
260、266、267、270、272、277、278、280、281、282、284、285、286、318、321、326、329、334、339、
346、347、348、351、352、354、358、359、362、363、370、373、376、382、385、386、389、406、407、
409、418、425、427位为由相同或相似氨基酸组成，因此属于保守区域。同样，以SEQ ID NO:1表示的锥毛壳属阿马多里酶为基准，第15、17、18、20、22、23、24、25、27、29、31、41、46、47、
51、52、54、56、57、79、82、93、149、158、159、162、177、180、202、208、221、222、233、243、250、
258、266、267、270、278、280、282、284、285、318、334、347、348、351、362、363、373、376、386、
407、409、418位为由相同氨基酸组成，因此属于保守区域。
[0257] 其中，上述同源性区域和保守区域不过是对于天然阿马多里酶的氨基酸序列彼此比对的区域，关于根据向天然阿马多里酶中导入各种突变而成的修饰阿马多里酶，这些同
源性区域或保守区域中的各个对应氨基酸可以被取代，在修饰后也可以未必是相同或相似
氨基酸。
源性区域或保守区域中的各个对应氨基酸可以被取代，在修饰后也可以未必是相同或相似
氨基酸。
[0258] 例如，一实施方式中，可以基于天然阿马多里酶，导入突变而获得修饰阿马多里酶(例如HbA1c氧化酶)。然后，可以向修饰阿马多里酶中导入本发明的突变来作为HbA1c脱氢酶。此时，保守区域的序列一致性的比对不是通过SEQ ID NO:1的氨基酸序列和修饰阿马多里酶来进行，而是通过SEQ ID NO:1的氨基酸序列和修饰阿马多里酶的来源即天然阿马多
里酶的氨基酸序列来进行比对。
里酶的氨基酸序列来进行比对。
[0259] 因此，本发明的HbA1c脱氢酶的来源即天然阿马多里酶的保守区域的氨基酸序列与SEQ ID NO:1的保守区域的氨基酸序列的序列一致性，可以为70％以上、75％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、
89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上，例如在一实施方式中为100％。另外，本发明的HbA1c脱氢酶在与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ IDNO:16-26所示的氨基酸序列的阿马多里酶
进行比对时，为有30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、例如60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、
77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、
94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的全长氨基酸序列一致性，直接作用于HbA1c，并具有脱氢酶活性。
89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上，例如在一实施方式中为100％。另外，本发明的HbA1c脱氢酶在与由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3-14或SEQ IDNO:16-26所示的氨基酸序列的阿马多里酶
进行比对时，为有30％以上、35％以上、40％以上、45％以上、50％以上、55％以上、例如60％以上、65％以上、70％以上、71％以上、72％以上、73％以上、74％以上、75％以上、76％以上、
77％以上、78％以上、79％以上、80％以上、81％以上、82％以上、83％以上、84％以上、85％以上、86％以上、87％以上、88％以上、89％以上、90％以上、91％以上、92％以上、93％以上、
94％以上、95％以上、96％以上、97％以上、98％以上、例如99％以上的全长氨基酸序列一致性，直接作用于HbA1c，并具有脱氢酶活性。
[0260] (对应位置的确定)
[0261] 本说明书中，只要没有特别说明，某个位置所“对应的位置”则是指SEQ ID NO:1所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列中的特定位置所对应的来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基酸序列中的位置。本说明书中，有时会将对应位置称为相当位置。另外，有时会将特定位置所“对应位置的氨基酸”称为对应氨基酸。
[0262] 作为确定相对于某氨基酸序列中的特定位置在其他氨基酸序列中的“对应位置”的方法，例如可以通过利用Lipman-Pearson法等公知算法对氨基酸序列进行比对，对存在
于各阿马多里酶的氨基酸序列中的保守氨基酸残基赋予最大的一致性来进行。通过用这样
方法排列阿马多里酶的氨基酸序列，能够不管氨基酸序列中存在的插入、缺失，而确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列中的位置。认为相同位置在三维结构中存在于同位置，能
够推定具有与作为对象的阿马多里酶的特异性功能相关的相似效果。
于各阿马多里酶的氨基酸序列中的保守氨基酸残基赋予最大的一致性来进行。通过用这样
方法排列阿马多里酶的氨基酸序列，能够不管氨基酸序列中存在的插入、缺失，而确定相同氨基酸残基在各阿马多里酶序列中的位置。认为相同位置在三维结构中存在于同位置，能
够推定具有与作为对象的阿马多里酶的特异性功能相关的相似效果。
[0263] 图1和图2示例了来源于各种公知的生物种的阿马多里酶序列。SEQ ID NO:1表示的氨基酸序列如最上列所示。图1中所示的各种序列均与SEQ ID NO:1的序列有70％以上的
一致性并利用公知算法进行排列。图2中所示的各种序列均与SEQ ID NO:1的序列有30％以
上的一致性并利用公知算法进行排列。由图1和图2可知来源于锥毛壳(Coniochaeta)属的
阿马多里酶的氨基酸序列中的特定位置所对应的来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基
酸序列中的位置。另外，在能够可知对应位置的同时，还能够可知该对应位置中的对应氨基酸。图1中示出了来源于锥毛壳属的阿马多里酶(SEQ ID NO:1)、来源于土正青霉
(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶(SEQ ID NO:3)、来源于棘壳孢属(Pyrenochaeta sp.)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:4)、来源于节菱孢属(Arthrinium sp.)的酮胺氧化酶(SEQ
ID NO:5)、来源于棒状弯孢(Curvularia clavata)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:6)、来源于侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:7)、来源于新型隐球菌
(Cryptococcus neoformans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:8)、来源于颖枯壳针孢
(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:9)、来源于构巢曲霉
(Aspergillus nidulans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:10)、来源于构巢裸孢壳
(Emericella nidulans)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:11)、来源于细基格孢属
(Ulocladium sp.)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:12)和来源于微紫青霉
(Penicillium janthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列。图2
中，除了来源于锥毛壳属的阿马多里酶(SEQ ID NO:1)等图1记载的内容以外，还示出了来
源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的阿马多里酶Ao2(另称FaoAo2，SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉(Asperillus fumigatus)的阿马多里酶Af2(另称AmadoriaseII，SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的阿马多里酶At(另称FAOD-A，SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的阿马多里酶Fo(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马
多里酶Ao1(另称FaoAo 1，SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(另称
AmadoriaseI，SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属(Pichia sp.)的阿马多里酶Pi(SEQ ID
NO:25)、来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:
26)的氨基酸序列。
一致性并利用公知算法进行排列。图2中所示的各种序列均与SEQ ID NO:1的序列有30％以
上的一致性并利用公知算法进行排列。由图1和图2可知来源于锥毛壳(Coniochaeta)属的
阿马多里酶的氨基酸序列中的特定位置所对应的来源于其他生物种的阿马多里酶的氨基
酸序列中的位置。另外，在能够可知对应位置的同时，还能够可知该对应位置中的对应氨基酸。图1中示出了来源于锥毛壳属的阿马多里酶(SEQ ID NO:1)、来源于土正青霉
(Eupenicillium terrenum)的阿马多里酶(SEQ ID NO:3)、来源于棘壳孢属(Pyrenochaeta sp.)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:4)、来源于节菱孢属(Arthrinium sp.)的酮胺氧化酶(SEQ
ID NO:5)、来源于棒状弯孢(Curvularia clavata)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:6)、来源于侵管新赤壳(Neocosmospora vasinfecta)的酮胺氧化酶(SEQ ID NO:7)、来源于新型隐球菌
(Cryptococcus neoformans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:8)、来源于颖枯壳针孢
(Phaeosphaeria nodorum)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:9)、来源于构巢曲霉
(Aspergillus nidulans)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:10)、来源于构巢裸孢壳
(Emericella nidulans)的果糖基肽氧化酶(SEQ ID NO:11)、来源于细基格孢属
(Ulocladium sp.)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:12)和来源于微紫青霉
(Penicillium janthinellum)的果糖基氨基酸氧化酶(SEQ ID NO:13)的氨基酸序列。图2
中，除了来源于锥毛壳属的阿马多里酶(SEQ ID NO:1)等图1记载的内容以外，还示出了来
源于米曲霉(Aspergillus oryzae)的阿马多里酶Ao2(另称FaoAo2，SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉(Asperillus fumigatus)的阿马多里酶Af2(另称AmadoriaseII，SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉(Aspergillus terreus)的阿马多里酶At(另称FAOD-A，SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)的阿马多里酶Fo(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马
多里酶Ao1(另称FaoAo 1，SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(另称
AmadoriaseI，SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属(Pichia sp.)的阿马多里酶Pi(SEQ ID
NO:25)、来源于汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:
26)的氨基酸序列。
[0264] (特定位置所对应位置的氨基酸)
[0265] 本发明中，“SEQ ID NO:1的氨基酸序列的280位所对应位置的氨基酸”是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1中所示的来源于锥毛壳属的阿马多里酶的氨基酸序列进行比对时，SEQ ID NO:1的阿马多里酶的280位所对应位置的氨基酸。这可以通
过用上述确定“对应位置”的方法对氨基酸序列进行排列的图1或图2来确定。下文中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的267位、269位、54位和241位所对应位置的氨基酸序列也分别
相同。
过用上述确定“对应位置”的方法对氨基酸序列进行排列的图1或图2来确定。下文中的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的267位、269位、54位和241位所对应位置的氨基酸序列也分别
相同。
[0266] 即，“SEQ ID NO:1的氨基酸序列的280位所对应位置”的氨基酸，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为280位半胱氨酸；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为278位半胱氨酸；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为280位半胱氨酸；在来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶中为278位半胱氨酸；在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中为280位半胱氨酸；在来源于新
型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸；在来源于颖枯壳针孢的果糖基肽氧
化酶中为276位半胱氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸；
在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为280位半胱氨酸；在来源于细基格孢属的果糖
基氨基酸氧化酶中为278位半胱氨酸；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为280位
半胱氨酸。
型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸；在来源于颖枯壳针孢的果糖基肽氧
化酶中为276位半胱氨酸；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为280位半胱氨酸；
在来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶中为280位半胱氨酸；在来源于细基格孢属的果糖
基氨基酸氧化酶中为278位半胱氨酸；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为280位
半胱氨酸。
[0267] SEQ ID NO:1、3～13的各序列中的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的280位、267位、269位、54位和241位所对应的各个位置如下表所示。
[0268] [表1]
[0269]
[0270] 例如表中，SEQ ID NO:1的267位所对应位置的氨基酸，在来源于土正青霉的阿马多里酶(SEQ ID NO:3)中为267位的苯丙氨酸。关于其他位置，也同样可以从表中得知。
[0271] 进一步，来源于米曲霉的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af2(SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉的阿马多里酶At(SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌的阿马多里酶Fo(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马多里酶Ao1(SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属的阿马多里酶Pi(SEQ ID
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的280位、267位、269位、54位和241位所对应的各个位置如下表所示。
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的280位、267位、269位、54位和241位所对应的各个位置如下表所示。
[0272] [表2]
[0273]
[0274] 例如表中，SEQ ID NO:1的280位所对应位置的氨基酸，在来源于米曲霉的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)中为276位的半胱氨酸。
[0275] (底物特异性改变突变的对应位置)
[0276] 本说明书中，“SEQ ID NO:1的氨基酸序列的62位所对应位置”的氨基酸是指将确定的阿马多里酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行比对时，SEQ ID NO:1的
62位所对应位置的氨基酸。这可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1或图2来确
定。以下SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、
68位、356位、64位和99位，还有以下262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位和81位所对应位置的氨基酸也分别相同。
62位所对应位置的氨基酸。这可以通过用上述方法对氨基酸序列进行排列的图1或图2来确
定。以下SEQ IDNO:1所示的氨基酸序列的63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、
68位、356位、64位和99位，还有以下262位、257位、249位、253位、337位、340位、232位、129位、132位、133位、44位、256位、231位和81位所对应位置的氨基酸也分别相同。
[0277] SEQ ID NO:1、3～13的各序列中的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、356位、64位和99位所对应的各个位置如下表所示。
[0278] [表3]
[0279]
[0280] 进一步，来源于米曲霉的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af2(SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉的阿马多里酶At(SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌的阿马多里酶Fo(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马多里酶Ao1(SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属的阿马多里酶Pi(SEQ ID
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、356位、64位和99位所对应的各个位置如下表所示。表中，关于Dh，SEQ ID NO:1的68位所对应位置不存在。因此，关于Dh，不会选择SEQ ID NO:1的68位所对应位置作为取代氨基酸的位置。未定义对应位置的其他位置亦同。
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的62位、63位、102位、106位、110位、113位、355位、419位、68位、356位、64位和99位所对应的各个位置如下表所示。表中，关于Dh，SEQ ID NO:1的68位所对应位置不存在。因此，关于Dh，不会选择SEQ ID NO:1的68位所对应位置作为取代氨基酸的位置。未定义对应位置的其他位置亦同。
[0281] [表4]
[0282]
[0283] (表面活性剂耐受性提高突变的对应位置)
[0284] SEQ ID NO:1、3～13的各序列中的SEQ ID NO:1的氨基酸序列的44位、133位、253位、257位、262位、337位、340位、249位、232位、129位、132位、256位、231位和81位所对应的各个位置如下表所示。
[0285] [表5]
[0286]
[0287] 进一步，来源于米曲霉的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af2(SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉的阿马多里酶At(SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌的阿马多里酶Fo(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马多里酶Ao1(SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属的阿马多里酶Pi(SEQ ID
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的44位、133位、253位、257位、262位、337位、340位、249位、232位、129位、
132位、256位、231位和81位所对应的各个位置如下表所示。
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的SEQ ID
NO:1的氨基酸序列的44位、133位、253位、257位、262位、337位、340位、249位、232位、129位、
132位、256位、231位和81位所对应的各个位置如下表所示。
[0288] [表6]
[0289]
[0290] (热稳定性提高缺失的对应位置)
[0291] 本说明书中“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”是指将作为对象的阿马多里酶的氨基酸序列在与SEQ ID NO:1的氨基酸序列进行
比对时，从SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的3个
氨基酸残基的位置。来源于锥毛壳属的阿马多里酶中该位置的3个残基序列由435位脯氨
酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸组成，对应于这些位置的氨基酸序列也可以通过用上述方
法对氨基酸序列进行排列的图1或图2来确定。
比对时，从SEQ ID NO:1中记载的氨基酸序列的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的3个
氨基酸残基的位置。来源于锥毛壳属的阿马多里酶中该位置的3个残基序列由435位脯氨
酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸组成，对应于这些位置的氨基酸序列也可以通过用上述方
法对氨基酸序列进行排列的图1或图2来确定。
[0292] 予以说明，真核生物中，已知“过氧化物酶体靶向信号(Peroxisome Targeting Signal1，PTS1)序列”，其为用于将蛋白质向过氧化物酶体输送的信号序列，是由羧基末端的3个氨基酸组成的基序。作为常见的公知PTS1基序，有由(脯氨酸-丝氨酸-丙氨酸-半胱氨酸)-(赖氨酸-组氨酸-精氨酸-天冬酰胺)-(亮氨酸-甲硫氨酸)序列组成的基序(例如参照
FEBS J.,272,2362(2005)、Plant Cell Physiol.,38,759(1997)、Eur.J.Cell Biol.,71,
248(1996))。根据该发现，“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”的区域相当于阿马多里酶中所称的PTS1基序。因此，在某一方面，“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”也可以解释为“相当于
PTS1基序的位置”。
FEBS J.,272,2362(2005)、Plant Cell Physiol.,38,759(1997)、Eur.J.Cell Biol.,71,
248(1996))。根据该发现，“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”的区域相当于阿马多里酶中所称的PTS1基序。因此，在某一方面，“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”也可以解释为“相当于
PTS1基序的位置”。
[0293] 即，在来源于土正青霉的阿马多里酶中为羧基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、436位组氨酸和437位亮氨酸组成；在来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨
基酸由438位丙氨酸、439位赖氨酸和440位亮氨酸组成；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由450位组氨酸、451位赖氨酸和452位亮氨酸组成；在来源于棒状
弯孢的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由438位丝氨酸、439位赖氨酸和440位亮氨酸
组成；在来源于颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、
436位天冬酰胺和437位亮氨酸组成；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末
端的3个氨基酸由436位丙氨酸、437位赖氨酸和438位甲硫氨酸组成；在来源于构巢裸孢壳
的果糖基肽氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由436位丙氨酸、437位赖氨酸和438位甲硫氨
酸组成；在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由439位丙
氨酸、440位赖氨酸和441位亮氨酸组成；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为羧
基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸组成。
基酸由438位丙氨酸、439位赖氨酸和440位亮氨酸组成；在来源于节菱孢属的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由450位组氨酸、451位赖氨酸和452位亮氨酸组成；在来源于棒状
弯孢的酮胺氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由438位丝氨酸、439位赖氨酸和440位亮氨酸
组成；在来源于颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、
436位天冬酰胺和437位亮氨酸组成；在来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末
端的3个氨基酸由436位丙氨酸、437位赖氨酸和438位甲硫氨酸组成；在来源于构巢裸孢壳
的果糖基肽氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由436位丙氨酸、437位赖氨酸和438位甲硫氨
酸组成；在来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶中为羧基末端的3个氨基酸由439位丙
氨酸、440位赖氨酸和441位亮氨酸组成；在来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶中为羧
基末端的3个氨基酸由435位丙氨酸、436位赖氨酸和437位亮氨酸组成。
[0294] 予以说明，在一实施方式中，“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”，即“相当于PTS1基序的位置”与天然的相比，C末端侧的一个残基(亮氨酸-甲硫氨酸)可以缺失。例如，在来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶中，“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”，即“相当于PTS1基序的位
置”由440位的丝氨酸、441位的精氨酸组成。关于来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化
酶，则不存在从SEQ ID NO:1记载的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位
置。
置”由440位的丝氨酸、441位的精氨酸组成。关于来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化
酶，则不存在从SEQ ID NO:1记载的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位
置。
[0295] 进一步，来源于米曲霉的阿马多里酶Ao2(SEQ ID NO:19)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af2(SEQ ID NO:20)、来源于土曲霉的阿马多里酶At(SEQ ID NO:21)、来源于尖孢镰刀菌的阿马多里酶Fo(SEQ ID NO:22)、来源于米曲霉的阿马多里酶Ao1(SEQ ID NO:23)、来源于烟曲霉的阿马多里酶Af1(SEQ ID NO:24)、来源于毕赤酵母属的阿马多里酶Pi(SEQ ID
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”，即“相当于PTS1基序的位置”如下表所示。当Pi缺失424、425、426位时，也可以进一步缺失427位(羧基末端4个氨基酸缺失)。为了方便起见，这种关于Pi的羧基末端4个氨基酸缺失，也包含在从以SEQ ID NO:
1为基准的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基缺失之中。予以说明，以SEQ ID NO:1为基准时的对应位置为未被定义的位置，则不选为进行氨基酸缺失的位置。
NO:25)和来源于汉逊德巴利酵母的阿马多里酶Dh(SEQ ID NO:26)的各序列中的“从SEQ ID NO:1的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基所对应的位置”，即“相当于PTS1基序的位置”如下表所示。当Pi缺失424、425、426位时，也可以进一步缺失427位(羧基末端4个氨基酸缺失)。为了方便起见，这种关于Pi的羧基末端4个氨基酸缺失，也包含在从以SEQ ID NO:
1为基准的阿马多里酶的羧基末端起的3个氨基酸残基缺失之中。予以说明，以SEQ ID NO:1为基准时的对应位置为未被定义的位置，则不选为进行氨基酸缺失的位置。
[0296] [表7]
[0297]
[0298] (本发明阿马多里酶的生产)
[0299] 在使用具有如上所述得到的阿马多里酶生产能力的菌株进行生成该阿马多里酶时，可以利用通常的固体培养法培养该菌株，在可能的范围内优选采用液体培养法进行培
养。
养。
[0300] 另外，作为培养上述菌株的培养基，例如，可使用如下得到的培养基：在酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、肉提取物、玉米浆或大豆或者小麦麸的浸出液等一种以上的氮源中添加氯化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、氯化镁、氯化铁、硫酸铁或硫酸锰等一种以上的无机盐，根据需要进一步适当添加糖质原料、维生素等而成。
[0301] 予以说明，培养基的初始pH值优选调整为pH7～9。
[0302] 另外，培养可以采用任意的条件，例如，可以通过深层通气搅拌培养、振荡培养、静置培养等在20～42℃的培养温度、优选30℃左右的培养温度下实施4～24小时、进一步优选在30℃左右的培养温度下实施8～16小时。
[0303] 培养结束后，由该培养物采集阿马多里酶可以使用通常的酶采集手段而得到。例如，可以通过常规方法对菌体实施超声波破坏处理、研磨处理等、或者使用溶菌酶等裂解酶提取该酶、或者在甲苯等存在下振荡或者放置进行溶菌，使该酶向菌体外排出。然后，过滤该溶液并进行离心分离等除去固体部分，根据需要利用链霉素硫酸盐、鱼精蛋白硫酸盐或
硫酸锰等除去核酸后，向其中添加硫酸铵、乙醇、丙酮等并进行分离，采集沉淀物，从而得到阿马多里酶的粗酶。
硫酸锰等除去核酸后，向其中添加硫酸铵、乙醇、丙酮等并进行分离，采集沉淀物，从而得到阿马多里酶的粗酶。
[0304] 为了由上述阿马多里酶的粗酶进一步得到阿马多里酶纯化酶标准品，例如，可适当选择使用Sephadex、Superdex或Ultrogel等的凝胶过滤法；使用离子交换体的吸附溶出
法；使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法；使用羟基磷灰石的吸附溶出法；蔗糖密度梯度离心法等沉降法；亲和层析法；使用分子筛膜或者中空纤维膜等的分离法等，或将这些方法组合实施，从而能够得到经纯化的阿马多里酶酶标准品。由此，能够得到所期望的脱氢酶活性提高的阿马多里酶。
法；使用聚丙烯酰胺凝胶等的电泳法；使用羟基磷灰石的吸附溶出法；蔗糖密度梯度离心法等沉降法；亲和层析法；使用分子筛膜或者中空纤维膜等的分离法等，或将这些方法组合实施，从而能够得到经纯化的阿马多里酶酶标准品。由此，能够得到所期望的脱氢酶活性提高的阿马多里酶。
[0305] 本发明试剂盒所包含的阿马多里酶可以是来源于正青霉属、棘壳孢属、节菱孢属、弯孢属、新赤壳属、隐球菌属、暗球腔菌属、曲霉属、裸孢壳属、细基格孢属、青霉属、镰刀菌属、Achaetomiella属、无毛毛壳属、梭孢壳属、毛壳属、五谷麻孢壳属、小囊菌属、小球腔菌属、蛇孢腔菌属、格孢腔菌属、闭毛孢壳属、毕赤酵母菌属、棒状杆菌属、土壤杆菌属、节杆菌属等的天然的阿马多里酶或它们的突变体。这样的突变体在选自于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的280位半胱氨酸、267位苯丙氨酸、269位苯丙氨酸、54位天冬氨酸、241位酪氨酸的位置的氨基酸所对应位置上有1个或1个以上的氨基酸取代。本领域技术人员可以通过例
如后述的试验法等，容易地研究出某种阿马多里酶或其突变体是否能用于本发明的试剂
盒，即是否具有所期望的脱氢酶活性。
如后述的试验法等，容易地研究出某种阿马多里酶或其突变体是否能用于本发明的试剂
盒，即是否具有所期望的脱氢酶活性。
[0306] (本发明阿马多里酶中的脱氢酶活性的提高)
[0307] 本发明的阿马多里酶利用基因修饰等使其氨基酸序列产生突变，结果与修饰前的阿马多里酶相比，氧化酶活性降低，且/或脱氢酶活性提高。具体的特征在于与修饰前的阿马多里酶相比，“氧化酶活性”相对于“脱氢酶活性”的比率降低。氧化酶活性是指在氧化底-
物时，将电子传递给氧分子的活性。脱氢酶活性是指在氧化底物时，将氢(H)传递到电子受体的活性。
物时，将电子传递给氧分子的活性。脱氢酶活性是指在氧化底物时，将氢(H)传递到电子受体的活性。
[0308] 在使用传感器的糖化血红蛋白的测定中，为了降低氧的影响，希望氧化酶活性低。另一方面，从与底物的反应性角度出发，则优选脱氢酶的活性高。如果兼具考虑二者，在使用电子媒介体的糖化血红蛋白测定中，优选阿马多里酶的氧化酶活性(OX)与脱氢酶活性
(DH)之比OX/DH为低，此外，优选阿马多里酶的氧化酶活性(OX)低且脱氢酶活性(DH)高。所以本说明书中为了方便起见，有时使用脱氢酶活性相对于氧化酶活性的比率DH/OX或者氧
化酶活性相对于脱氢酶活性的比率OX/DH来表示阿马多里酶的特性。一实施方式中本发明
的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，脱氢酶活性增强。一实施方式中本发明的
修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，氧化酶活性降低。一实施方式中本发明的修
饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，脱氢酶活性与氧化酶活性之比OX/DH比低(DH/
OX比高)。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，不仅脱氢酶活性增强，而且氧化酶活性降低。具体地，本发明的修饰阿马多里酶中的表示脱氢酶活性相对于氧化酶活性的比率DH/OX，与修饰前(1.0倍)相比，优选增强1.3倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、例如450倍以上。此外，本发明的修饰阿马多里酶中的表示氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率OX/DH，与修饰前(100％)相比，优选降低至小于90％、小于80％、小于75％、小于50％、小于40％、小于31％、小于30％、小于20％、小于10％、小于
5％、小于4.5％、小于4％、小于3.6％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、例如小于
0.2％。
(DH)之比OX/DH为低，此外，优选阿马多里酶的氧化酶活性(OX)低且脱氢酶活性(DH)高。所以本说明书中为了方便起见，有时使用脱氢酶活性相对于氧化酶活性的比率DH/OX或者氧
化酶活性相对于脱氢酶活性的比率OX/DH来表示阿马多里酶的特性。一实施方式中本发明
的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，脱氢酶活性增强。一实施方式中本发明的
修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，氧化酶活性降低。一实施方式中本发明的修
饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，脱氢酶活性与氧化酶活性之比OX/DH比低(DH/
OX比高)。一实施方式中本发明的修饰阿马多里酶与修饰前的阿马多里酶相比，不仅脱氢酶活性增强，而且氧化酶活性降低。具体地，本发明的修饰阿马多里酶中的表示脱氢酶活性相对于氧化酶活性的比率DH/OX，与修饰前(1.0倍)相比，优选增强1.3倍以上、2倍以上、3倍以上、4倍以上、5倍以上、10倍以上、20倍以上、30倍以上、40倍以上、50倍以上、100倍以上、200倍以上、300倍以上、400倍以上、例如450倍以上。此外，本发明的修饰阿马多里酶中的表示氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率OX/DH，与修饰前(100％)相比，优选降低至小于90％、小于80％、小于75％、小于50％、小于40％、小于31％、小于30％、小于20％、小于10％、小于
5％、小于4.5％、小于4％、小于3.6％、小于3％、小于2％、小于1％、小于0.5％、例如小于
0.2％。
[0309] 氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率可以使用公知的阿马多里酶测定法在任意条件下进行测定，并与修饰前的阿马多里酶进行比较。例如，在pH7.0时，用添加1mM的某种糖化底物例如添加αFV而测定的脱氢酶活性除以添加1mM的该糖化底物例如添加αFV而测定的氧化酶活性而求出比率，由此计算出氧化酶活性相对于脱氢酶活性的比率，从而能够将
其在修饰前与修饰后的阿马多里酶中进行比较。底物可以为HbA1c或αF6P。
其在修饰前与修饰后的阿马多里酶中进行比较。底物可以为HbA1c或αF6P。
[0310] (高通量筛选)
[0311] 为了获得功能性阿马多里酶突变体，例如HbA1c脱氢酶，还可以将阿马多里酶用于高通量筛选。例如制作具有导入突变的阿马多里酶基因的转化或转导株的文库，可以将其
用于基于微量滴定板的高通量筛选、或者可以将其用于基于液滴型微流体的超高通量筛
选。作为例子，可举出构建编码突变的突变基因的组合文库，接着利用噬菌体展示技术(例如Chem.Rev.105(11)：4056-72,2005)、酵母展示技术(例如Comb Chem High Throughput
Screen.2008；11(2)：127-34)、细菌展示技术(例如Curr Opin Struct Biol 17：474-80,
2007)等，对突变阿马多里酶的大群落进行筛选的方法。此外参照Agresti et al,"
Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed
evolution"Proceedings of the National Academy of Sciences 107(9)：4004-4009
(Mar,2010)。关于可用于阿马多里酶突变筛选的超高通量筛选手段的该文献的记载通过参
照并入本说明书中。例如可通过错配PCR法来构建文库。此外也可以使用饱和诱变，以本说明书所记载的位置或其所对应位置为目标导入突变来构建文库。利用文库转化电转化感受
态EBY-100细胞等适当的细胞，可获得约107个突变体。可将用该文库转化的酵母细胞接着
用于细胞分选。也可以使用利用标准软光刻法制作的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体装置。
可使用流动聚焦装置形成单分散的液滴。将含有个别突变体而形成的液滴用于适当的分选
装置中。在分选细胞时可利用有无脱氢酶活性。突变导入和分选可以重复多次。
用于基于微量滴定板的高通量筛选、或者可以将其用于基于液滴型微流体的超高通量筛
选。作为例子，可举出构建编码突变的突变基因的组合文库，接着利用噬菌体展示技术(例如Chem.Rev.105(11)：4056-72,2005)、酵母展示技术(例如Comb Chem High Throughput
Screen.2008；11(2)：127-34)、细菌展示技术(例如Curr Opin Struct Biol 17：474-80,
2007)等，对突变阿马多里酶的大群落进行筛选的方法。此外参照Agresti et al,"
Ultrahigh-throughput screening in drop-based microfluidics for directed
evolution"Proceedings of the National Academy of Sciences 107(9)：4004-4009
(Mar,2010)。关于可用于阿马多里酶突变筛选的超高通量筛选手段的该文献的记载通过参
照并入本说明书中。例如可通过错配PCR法来构建文库。此外也可以使用饱和诱变，以本说明书所记载的位置或其所对应位置为目标导入突变来构建文库。利用文库转化电转化感受
态EBY-100细胞等适当的细胞，可获得约107个突变体。可将用该文库转化的酵母细胞接着
用于细胞分选。也可以使用利用标准软光刻法制作的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流体装置。
可使用流动聚焦装置形成单分散的液滴。将含有个别突变体而形成的液滴用于适当的分选
装置中。在分选细胞时可利用有无脱氢酶活性。突变导入和分选可以重复多次。
[0312] 予以说明，在制作本发明的HbA1c脱氢酶时，导入突变的顺序没有特别限制。首先，向初始阿马多里酶中导入本发明的脱氢酶活性提高突变，然后向得到的具有脱氢酶活性的阿马多里酶中导入改变底物特异性的突变等，并且/或者适当进行筛选，也可以将其作为作用于HbA1c的脱氢酶。
[0313] (阿马多里酶活性的测定方法)
[0314] 阿马多里酶的活性具有氧化酶活性与脱氢酶活性，这些活性可以通过各种方法进行测定。下面例示阿马多里酶活性的测定方法。
[0315] 为了评价酶的特性，也可以将HbA1c、αF6P、果糖基缬氨酸(FV)等糖化氨基酸，以及果糖基缬氨酰基组氨酸(FVH)等糖化肽作为底物。FV或FVH可以根据阪上等人的方法来合成、纯化(参照日本特开2001-95598号)。αF6P可以使用合成底物。
[0316] (将αF6P作为底物的氧化酶活性的测定方法)
[0317] 下面记载将αF6P用作底物的氧化酶活性测定。在一实施方式中，酶效价可以在以αF6P作为底物时，将每分钟生成1μmol过氧化氢的酶量定为1U。予以说明，这是为了便于评价酶特性和实施测定方法，并不意味着本发明的HbA1c脱氢酶仅以αF6P作为底物。脱氢酶活性测定法亦同。
[0318] 试剂的制备
[0319] (试剂1)：含有5U/ml的过氧化酶和0.49mM的4-氨基安替比林的0.1M磷酸缓冲液pH6.5
[0320] 将5kU的过氧化酶(龟甲万株式会社制)、100mg的4-氨基安替比林(和光纯药工业株式会社制)溶解于0.1M的磷酸钾缓冲液(pH6.5)中，定容至1000ml。
[0321] (试剂2)：15mM的TOOS溶液
[0322] 500mg的TOOS(N-乙基-N-(2-羟基-3-磺丙基)-m-甲基苯胺钠，同仁化学研究所制)溶解于离子交换水中，定容至100ml。
[0323] (试剂3)：底物溶液(30mM；终浓度1mM)
[0324] 将257.1mg的αF6P(肽研究所制)溶解于离子交换水中，定容至10ml。
[0325] 测定法
[0326] 混合675μl的试剂1、25μl的试剂2和25μl的酶液，在37℃下预加温5分钟。然后，加入25μl的试剂3并充分混合后，利用分光光度计(U-3010，株式会社日立高新技术制)观测在555nm处的吸光度的随时间变化，测定在555nm处的吸光度每分钟的变化量(ΔAs)。予以说
明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的试剂3以外，与上述同样地测定在555nm处的吸光度每分钟的变化量(ΔA0)。氧化酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的试剂3以外，与上述同样地测定在555nm处的吸光度每分钟的变化量(ΔA0)。氧化酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
[0327] 氧化酶活性(U/ml)＝{(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(39.2×0.5×0.025)
[0328] ΔAs：反应液每分钟的吸光度变化
[0329] ΔA0：对照液每分钟的吸光度变化
[0330] 39.2：反应生成的醌亚胺色素的毫摩尔吸光系数(mM-1·cm-1)
[0331] 0.5：每mol过氧化氢生成的醌亚胺色素的mol数
[0332] df：稀释系数。
[0333] (将αF6P作为底物的脱氢酶活性的测定方法)
[0334] 下面记载将αF6P用作底物的脱氢酶活性测定法。在一实施方式中，酶效价可以在以αF6P作为底物时，每分钟生成1μmol甲 染料的酶量定为1U。
[0335] 试剂的制备
[0336] (试剂4)：0.25M的磷酸缓冲液(pH6.5)
[0337] (试剂5)：10mM的WST-3溶液
[0338] 将690mg的WST-3(2-(4-碘苯基)-3-(2,4-二硝基苯基)-5-(2,4-二磺苯基)-2H-四唑鎓单钠盐，同仁化学研究所制)溶解于离子交换水中，定容至100ml。
[0339] (试剂6)：5.4mM的mPMS溶液
[0340] 将180mg的mPMS(1-甲氧基-5-甲基吩嗪甲基硫酸盐，同仁化学研究所制)溶解于离子交换水中，定容至100ml。
[0341] 测定法
[0342] 混合270μl的试剂4、150μl的试剂5、25μl的试剂6、255μl的离子交换水和25μl的酶液，在37℃下预加温5分钟。然后，加入25μl的试剂3并充分混合后，利用分光光度计(U-3010，株式会社日立高新技术制)测定在433nm处的吸光度。予以说明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的酶液以外，与上述同样地制备。脱氢酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
[0343] 脱氢酶活性(U/ml)＝{(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(31×0.025)
[0344] ΔAs：反应液每分钟的吸光度变化
[0345] ΔA0：对照液每分钟的吸光度变化
[0346] 31：反应生成的WST-3的甲 染料的毫摩尔吸光系数(mM-1·cm-1)
[0347] df：稀释系数。
[0348] (将HbA1c作为底物的脱氢酶活性测定方法)
[0349] 下面记载将HbA1c用作底物的脱氢酶活性测定法。在一实施方式中，酶效价可以在以HbA1c作为底物时，每分钟生成1μmol甲 染料的酶量定为1U。
[0350] 试剂的制备
[0351] (试剂7)：1.84mg/ml的HbA1c溶液
[0352] (试剂8)：10％的n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷
[0353] (试剂9)：185mM的磷酸缓冲液pH6.0
[0354] (试剂5)：10mM的WST-3溶液
[0355] 测定法
[0356] 首先，混合540μl的试剂7和60μl的试剂8，在98℃下加热5分钟，制备HbA1c样品预处理液。接着，向305μl的试剂9中混合125μl的试剂5、62.5μl的酶液和7.5μl的离子交换水，在37℃下预加温5分钟。然后，加入125μl的HbA1c样品预处理液并搅拌后，利用分光光度计测定在433nm处的吸光度。对照实验则是添加62.5μl不作用于HbA1c的阿马多里酶代替62.5μl的酶液来进行。脱氢酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
[0357] 脱氢酶活性(U/ml)＝{(ΔAs-ΔA0)×0.625×df}÷(31×0.0625)
[0358] ΔAs：反应液每分钟的吸光度变化
[0359] ΔA0：对照液每分钟的吸光度变化
[0360] 31：反应生成的WST-3的甲 染料的毫摩尔吸光系数(mM-1·cm-1)
[0361] df：稀释系数。
[0362] (测定试剂盒、传感器、测定方法)
[0363] 一实施方式中，本发明提供含有HbA1c脱氢酶的HbA1c测定试剂盒和HbA1c测定装置。该试剂盒或装置根据情况也可以含有电子媒介体。一实施方式中，本发明提供使用
HbA1c脱氢酶的HbA1c测定方法。
HbA1c脱氢酶的HbA1c测定方法。
[0364] 一实施方式中，本发明提供含有HbA1c脱氢酶的固定酶电极。一实施方式中，HbA1c脱氢酶可以涂布、吸附或固定化于酶电极上。另一实施方式中，电子媒介体也可以涂布、吸附或固定化于电极上。作为电极可以使用碳素电极、铂、金、银、镍、钯等金属电极等。碳素电极时，作为材料可举出热解石墨(PG)、玻璃碳(GC)、碳糊、塑性成型炭(PFC)等。测定体系可以是二电极系也可以是三电极系，例如可在工作电极上固定酶。作为参比电极，可举出标准氢电极、可逆氢电极、银-氯化银电极(Ag/AgCl)、钯-氢电极、饱和甘汞电极等，从稳定性及再现性的角度出发，优选使用Ag/AgCl。
[0365] 酶可通过交联、透析膜的包覆、包封到聚合物基质、使用光交联聚合物、使用导电性聚合物、使用氧化/还原聚合物等固定在电极上。此外也可以将酶与电子媒介体一起固定在聚合物中或者吸附固定在电极上，也可以组合这些手段。
[0366] 本发明的HbA1c脱氢酶通过使用恒电位仪、恒电流仪等，可以适用于各种电化学测定手段。作为电化学测定法，可举出电流测定法、电势测定法、电量测定法等各种手段。例如通过电流测定法对被还原的媒介体被外加电压氧化时产生的电流值进行测定，由此可以计
算样品中糖化底物的浓度。外加电压也根据媒介体及装置设定，例如可设为-1000～+
1000mV(相对于Ag/AgCl)等。
算样品中糖化底物的浓度。外加电压也根据媒介体及装置设定，例如可设为-1000～+
1000mV(相对于Ag/AgCl)等。
[0367] HbA1c浓度的测定，例如可如下所述进行。恒温皿中放入缓冲液，保持一定温度。作为媒介体，可使用铁氰化钾、吩嗪硫酸甲酯等。作为工作电极使用固定化本发明HbA1c脱氢酶的电极，并使用对电极(例如铂电极)和参比电极(例如Ag/AgCl电极)。向碳电极外加一定电压，电流稳定后，加入含有HbA1c的样品测定电流的增加。按照由标准浓度的HbA1c溶液制作的校准曲线，可以计算样品中的HbA1c浓度。
[0368] 进一步，为了降低测定所需的溶液量，也可使用印刷电极。此时，电极优选在绝缘基板上形成。具体地为理想地利用光刻技术、丝网印刷、凹版印刷、柔性版印刷等印刷技术在基板上形成电极。此外，作为绝缘基板的原材料，可举出硅、玻璃、陶瓷、聚氯乙烯、聚乙烯、聚丙烯、聚酯等，更优选对各种溶剂及化学品耐受性强的材料。
[0369] 一实施方式中，本发明提供包括该酶电极的传感器。
[0370] 另一实施方式中，可利用本发明的酶电极，通过测定由酶促反应产生的电流，从而确定样品中的阿马多里化合物的浓度。作为一例，将酶电极作为工作电极，将其与对电极和参比电极一起使用。对电极可为例如铂电极，参比电极可为例如Ag/AgCl电极。保持一定温度，将电极插入含有媒介体的缓冲液中。对工作电极外加电压，添加样品后，测定电流变化。
[0371] 本发明的测定方法、试剂盒、装置及用于传感器的媒介体(也称为人工电子媒介体、人工电子受体、电子媒介体)只要能够从本发明的HbA1c脱氢酶接受电子则无特别限制。
作为媒介体，可举出但不限于：醌类、吩嗪类、紫精类、细胞色素类、吩噁嗪类、吩噻嗪类、铁氰化物例如铁氰化钾、铁氧还蛋白类、二茂铁、锇配合物及其衍生物等；作为吩嗪化合物，例如可举出但不限于：PMS、甲氧基PMS。本说明书中，如无特别说明，术语“电子媒介体”不包括氧、过氧化氢。
作为媒介体，可举出但不限于：醌类、吩嗪类、紫精类、细胞色素类、吩噁嗪类、吩噻嗪类、铁氰化物例如铁氰化钾、铁氧还蛋白类、二茂铁、锇配合物及其衍生物等；作为吩嗪化合物，例如可举出但不限于：PMS、甲氧基PMS。本说明书中，如无特别说明，术语“电子媒介体”不包括氧、过氧化氢。
[0372] 一实施方式中，本发明的HbA1c脱氢酶与修饰前的酶相比，脱氢酶活性提高。一实施方式中，本发明的HbA1c脱氢酶与修饰前的酶相比，氧化酶活性降低。一实施方式中，本发明的HbA1c脱氢酶与修饰前的酶相比，氧化酶活性/脱氢酶活性比(OX/DH比)降低。另外，一实施方式中，本发明的HbA1c脱氢酶与修饰前的酶相比，脱氢酶活性提高，且氧化酶活性降低。这样的本发明的HbA1c脱氢酶的催化酶促反应不受、几乎不受或不易受氧的影响。本发明的HbA1c脱氢酶可以与现有的阿马多里酶用于相同的用途。此外，本发明的HbA1c脱氢酶
可以用于样品中的HbA1c等糖化底物浓度的测定，这能有助于例如糖尿病的诊断。此外，本发明的阿马多里酶可以作为酶电极进行使用。这可以用于各种电化学的测定。此外，本发明的HbA1c脱氢酶可以作为酶传感器进行使用。此外，本发明的HbA1c脱氢酶可以用在糖尿病
标记物的测定试剂盒中。一实施方式中，本发明提供样品中血红蛋白A1c的测定方法，包括：
使直接作用于血红蛋白A1c的HbA1c脱氢酶作用于样品，测定由该作用产生的非过氧化氢的
还原型电子媒介体或非消耗氧的氧化型电子媒介体。测定系统可以为溶液系统，也可以为
干燥系统。另外，测定可以是使用酶电极或酶传感器酶电极的电化学测定，或者也可以是使用显色底物的吸光度测定。但这是示例，本发明的HbA1c脱氢酶的用途并不限于这些。
可以用于样品中的HbA1c等糖化底物浓度的测定，这能有助于例如糖尿病的诊断。此外，本发明的阿马多里酶可以作为酶电极进行使用。这可以用于各种电化学的测定。此外，本发明的HbA1c脱氢酶可以作为酶传感器进行使用。此外，本发明的HbA1c脱氢酶可以用在糖尿病
标记物的测定试剂盒中。一实施方式中，本发明提供样品中血红蛋白A1c的测定方法，包括：
使直接作用于血红蛋白A1c的HbA1c脱氢酶作用于样品，测定由该作用产生的非过氧化氢的
还原型电子媒介体或非消耗氧的氧化型电子媒介体。测定系统可以为溶液系统，也可以为
干燥系统。另外，测定可以是使用酶电极或酶传感器酶电极的电化学测定，或者也可以是使用显色底物的吸光度测定。但这是示例，本发明的HbA1c脱氢酶的用途并不限于这些。
[0373] (实施例)
[0374] 下面通过实施例，对本发明进行更加具体的说明。但是，本发明的技术范围并不受这些实施例的任何限制。
[0375] [实施例1]
[0376] (关于脱氢酶活性提高型突变)
[0377] (1)重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H38DNA的制备
[0378] SEQ ID NO:14是将来源于锥毛壳属的果糖基肽氧化酶修饰成作用于果糖基六肽而成的酶(CFP-T7-H37)的氨基酸序列。将具有包含CFP-T7-H37基因(SEQ ID NO:15)的重组
质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-H37)株(参照国际公开第2015/060429号)接种于
LB-amp培养基[1％(W/V)BACTO胰蛋白胨、0.5％(W/V)蛋白胨、0.5％(W/V)NaCl、50μg/ml氨苄青霉素]2.5ml中，在37℃下振荡培养20小时，得到培养物。
质粒的大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-H37)株(参照国际公开第2015/060429号)接种于
LB-amp培养基[1％(W/V)BACTO胰蛋白胨、0.5％(W/V)蛋白胨、0.5％(W/V)NaCl、50μg/ml氨苄青霉素]2.5ml中，在37℃下振荡培养20小时，得到培养物。
[0379] 以7,000rpm对该培养物离心分离5分钟进行菌体收集而得到菌体。接着，使用QIAGEN tip-100(QIAGEN公司制)从该菌体提取重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H37并纯化，得
到2.5μg重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H37的DNA。
到2.5μg重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H37的DNA。
[0380] (2)重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H37DNA的位点特异性修饰操作
[0381] 以得到的重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H37DNA为模板，使用SEQ ID NO:27、28的合成寡核苷酸、KOD-Plus-(东洋纺株式会社制)，按照下面的条件进行PCR反应。
[0382] 即，加入10×KOD-Plus-缓冲液5μl、使dNTP各为2mM制备而成的dNTPs混合溶液5μl、25mM的MgSO4溶液2μl、50ng作为模板的pKK223-3-CFP-T7DNA、上述合成寡核苷酸各
15pmol、1U的KOD-Plus-，用灭菌水调整总体积为50μl。使用热循环仪(Eppendorf公司制)对制备的反应液在94℃下孵育2分钟，接着，重复进行30次“94℃，15秒”-“50℃，30秒”-“68℃，
6分钟”的循环。
15pmol、1U的KOD-Plus-，用灭菌水调整总体积为50μl。使用热循环仪(Eppendorf公司制)对制备的反应液在94℃下孵育2分钟，接着，重复进行30次“94℃，15秒”-“50℃，30秒”-“68℃，
6分钟”的循环。
[0383] 将一部分反应液用1.0％琼脂糖凝胶进行电泳，确认约6,000bp的DNA得到特异性的扩增。这样得到的DNA用限制性内切酶DpnI(NEW ENGLAND BIOLABS公司制)处理，切断残
存的模板DNA后，转化大肠杆菌JM109，涂布于LB-amp琼脂培养基上。将生长的菌落接种于
LB-amp培养基进行振荡培养，用与上述(1)同样的方法分离质粒DNA。使用多毛细管DNA分析系统Applied Biosystems 3130xl基因分析仪(Thermo Fisher Scientific公司制)确定该
质粒中编码阿马多里酶的DNA碱基序列，其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸的修饰型阿马多里酶(SEQ ID NO:16)的重组质粒
(pKK223-3-CFP-H38)。
存的模板DNA后，转化大肠杆菌JM109，涂布于LB-amp琼脂培养基上。将生长的菌落接种于
LB-amp培养基进行振荡培养，用与上述(1)同样的方法分离质粒DNA。使用多毛细管DNA分析系统Applied Biosystems 3130xl基因分析仪(Thermo Fisher Scientific公司制)确定该
质粒中编码阿马多里酶的DNA碱基序列，其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸的修饰型阿马多里酶(SEQ ID NO:16)的重组质粒
(pKK223-3-CFP-H38)。
[0384] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H38为模板，使用SEQ ID NO:29、30的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸且110位的亮氨酸被取代为酪氨酸的修饰型阿
马多里酶(SEQ ID NO:17)的重组质粒(pKK223-3-CFP-H39)。
马多里酶(SEQ ID NO:17)的重组质粒(pKK223-3-CFP-H39)。
[0385] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-T7-H39为模板，使用SEQ ID NO:31、32的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中
记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸、110位的亮氨酸被取代为酪氨酸且99位
的组氨酸被取代为丝氨酸的修饰型阿马多里酶(SEQ ID NO:18)的重组质粒(pKK223-3-
CFP-H40)。
记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸、110位的亮氨酸被取代为酪氨酸且99位
的组氨酸被取代为丝氨酸的修饰型阿马多里酶(SEQ ID NO:18)的重组质粒(pKK223-3-
CFP-H40)。
[0386] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H38为模板，使用SEQ ID NO:33、34的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸且269位的苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的修饰
型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H38-dh1)。
型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H38-dh1)。
[0387] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H38为模板，使用SEQ ID NO:35、33的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸且280位的269位的苯丙氨酸被取代为亮氨酸
的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H38-dh2)。
的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H38-dh2)。
[0388] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H38为模板，使用SEQ ID NO:36、37的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸且280位的半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的修饰
型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H38-dh3)。
型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H38-dh3)。
[0389] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H40为模板，使用SEQ ID NO:33、34的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸、110位的亮氨酸被取代为酪氨酸、99位的组氨酸被取代为丝氨酸且269位的苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒
(pKK223-3-CFP-H40-dh1)。
(pKK223-3-CFP-H40-dh1)。
[0390] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H40为模板，使用SEQ ID NO:35、33的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸、110位的亮氨酸被取代为酪氨酸、99位的组氨酸被取代为丝氨酸且269位的苯丙氨酸被取代为亮氨酸的修饰型阿马多里酶的重组质粒
(pKK223-3-CFP-H40-dh2)。
(pKK223-3-CFP-H40-dh2)。
[0391] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H40为模板，使用SEQ ID NO:36、37的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸、110位的亮氨酸被取代为酪氨酸、99位的组氨酸被取代为丝氨酸且280位的半胱氨酸被取代为谷氨酰胺的修饰型阿马多里酶的重组质粒
(pKK223-3-CFP-H40-dh3)。
(pKK223-3-CFP-H40-dh3)。
[0392] 接着，以重组质粒pKK223-3-CFP-H40-dh3为模板，使用SEQ ID NO:33、34的寡核苷酸和KOD-Plus-，在与上述同样的条件下进行PCR反应、转化大肠杆菌JM109和确定生长菌落所保有的质粒DNA中编码阿马多里酶的DNA的碱基序列。其结果，得到编码SEQ ID NO:14中记载的氨基酸序列的64位精氨酸被取代为甘氨酸、110位的亮氨酸被取代为酪氨酸、99位的组氨酸被取代为丝氨酸、269位的苯丙氨酸被取代为甲硫氨酸且280位的半胱氨酸被取代为
谷氨酰胺的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H40-dh4)。
谷氨酰胺的修饰型阿马多里酶的重组质粒(pKK223-3-CFP-H40-dh4)。
[0393] (3)各种修饰型阿马多里酶的生产
[0394] 将保有由上述操作步骤得到的上述重组质粒的各大肠杆菌JM109株在添加有0.1mM IPTG的LB-amp培养基4ml中在25℃下培养16小时。然后，用pH7.5的10mM磷酸缓冲液
悬浮各菌体，对菌体进行超声波粉碎，以15,000rpm离心分离10分钟，制备各粗酶液0.5ml。
悬浮各菌体，对菌体进行超声波粉碎，以15,000rpm离心分离10分钟，制备各粗酶液0.5ml。
[0395] (4)各种修饰型阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性评价
[0396] 将这样制备的各粗酶液作为样品，将αF6P作为底物，按照下述的氧化酶活性测定法和脱氢酶活性测定法，对各种修饰型阿马多里酶的氧化酶活性和脱氢酶活性进行评价。
[0397] (将αF6P作为底物的氧化酶活性的测定方法)
[0398] 试剂的制备
[0399] (试剂1)：含有5U/ml的过氧化酶(龟甲万株式会社制)和0.49mM的4-氨基安替比林(和光纯药工业株式会社制)的0.1M磷酸缓冲液pH6.5
[0400] (试剂2)：15mM的TOOS(同仁化学研究所制)溶液
[0401] (试剂3)：30mM的αF6P(肽研究所制)溶液(终浓度1mM)
[0402] 混合675μl的试剂1、25μl的试剂2和25μl的酶液，在37℃下预加温5分钟。然后，加入25μl的试剂3并充分混合后，利用分光光度计(U-3010，株式会社日立高新技术制)观测在555nm处的吸光度的随时间变化，测定在555nm处的吸光度每分钟的变化量(ΔAs)。予以说
明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的试剂3以外，与上述同样地测定在555nm处的吸光度每分钟的变化量(ΔA0)。在以终浓度1mM的αF6P作为底物时，每分钟生成1μmol过氧化氢的酶量(酶活性)定为1U。氧化酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的试剂3以外，与上述同样地测定在555nm处的吸光度每分钟的变化量(ΔA0)。在以终浓度1mM的αF6P作为底物时，每分钟生成1μmol过氧化氢的酶量(酶活性)定为1U。氧化酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
[0403] 氧化酶活性(U/ml)＝{(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(39.2×0.5×0.025)
[0404] ΔAs：反应液每分钟的吸光度变化
[0405] ΔA0：对照液每分钟的吸光度变化
[0406] 39.2：反应生成的醌亚胺色素的毫摩尔吸光系数(mM-1·cm-1)
[0407] 0.5：每mol过氧化氢生成的醌亚胺色素的mol数
[0408] df：稀释系数。
[0409] (将αF6P作为底物的脱氢酶活性的测定方法)
[0410] 试剂的制备
[0411] (试剂3)：30mM的αF6P(肽研究所制)溶液(终浓度1mM)
[0412] (试剂4)：0.25M的磷酸缓冲液(pH6.5)
[0413] (试剂5)：10mM的WST-3(同仁化学研究所制)溶液
[0414] (试剂6)：5.4mM的mPMS(同仁化学研究所制)溶液
[0415] 混合270μl的试剂4、150μl的试剂5、25μl的试剂6、255μl的离子交换水和25μl的酶液，在37℃下预加温5分钟。然后，加入25μl的试剂3并充分混合后，利用分光光度计(U-3010，株式会社日立高新技术制)测定在433nm处的吸光度。予以说明，对照液除了加入25μl的离子交换水代替25μl的酶液以外，与上述同样地制备。在以终浓度1mM的αF6P作为底物时，每分钟生成1μmol甲 染料的酶量定为1U。脱氢酶活性(U/ml)按照以下算式计算。
[0416] 脱氢酶活性(U/ml)＝{(ΔAs-ΔA0)×0.75×df}÷(31×0.025)
[0417] ΔAs：反应液每分钟的吸光度变化
[0418] ΔA0：对照液每分钟的吸光度变化
[0419] 31：反应生成的WST-3的甲 染料的毫摩尔吸光系数(mM-1·cm-1)
[0420] df：稀释系数。
[0421] 结果如表8、表9所示。表8中，CFP-H38表示来源于大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-H38)株的阿马多里酶。表9中，CFP-H40表示来源于大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-H40)株的阿马多里酶。予以说明，本实施例中将来源于大肠杆菌JM109(pKK223-3-CFP-T7-H37)株的
阿马多里酶的CFP-T7-H37作为突变原酶，因此表中记载的“氨基酸突变”的记载中CFP-T7-H37未包含已经导入的各种突变位点。表中，氧化酶活性(％)和脱氢酶活性(％)以原酶CFP-T7-H38或CFP-T7-H40的氧化酶活性(U/mL)为100时的百分率来表示。此外，表中的OX/DH
(％)表示为以原酶CFP-T7-H38或CFP-T7-H40的OX/DH比为100时的百分率。
阿马多里酶的CFP-T7-H37作为突变原酶，因此表中记载的“氨基酸突变”的记载中CFP-T7-H37未包含已经导入的各种突变位点。表中，氧化酶活性(％)和脱氢酶活性(％)以原酶CFP-T7-H38或CFP-T7-H40的氧化酶活性(U/mL)为100时的百分率来表示。此外，表中的OX/DH
(％)表示为以原酶CFP-T7-H38或CFP-T7-H40的OX/DH比为100时的百分率。
[0422] [表8]
[0423]
[0424] [表9]
[0425]
[0426] 如表8所示，以CFP-H38为基准，通过F269M、F269L、C280Q的各突变使得各自修饰酶的氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)降低。
[0427] 如表9所示，以CFP-H40为基准，通过F269M、F269L、C280Q的各突变使得各自修饰酶的氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)降低。另外，关于由CFP-H40制作的F269M/C280Q双重突变体，氧化酶活性与脱氢酶活性之比(OX/DH)进一步降低。
[0428] [实施例2]
[0429] (CFP-H38-dh3的生产和纯化)
[0430] 将大肠杆菌JM109(CFP-H38-dh3)株接种到添加有IPTG终浓度为0.1mM的LB-amp培养基200ml中，在25℃下培养16小时。用10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)洗涤得到的各培养菌
体后，将菌体悬浮于同样的缓冲液中并进行超声波粉碎处理，以20,000×g离心分离10分
钟，制备粗酶液40ml。
体后，将菌体悬浮于同样的缓冲液中并进行超声波粉碎处理，以20,000×g离心分离10分
钟，制备粗酶液40ml。
[0431] 用10mM的磷酸钾缓冲液(pH7.5)平衡填充有Q-sepharose FF(GEHealthcare公司制)的色谱柱后，将制备的含有CFP-H38-dh3的各粗酶液上样，使阿马多里酶与阴离子交换
树脂结合。随后，用含有30mM的NaCl浓度的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)输送20个柱体积量的溶液，使杂质蛋白质溶出后，用含有80mM NaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)使与树脂结合
的蛋白质溶出，回收显示阿马多里酶活性的组分。
树脂结合。随后，用含有30mM的NaCl浓度的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)输送20个柱体积量的溶液，使杂质蛋白质溶出后，用含有80mM NaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH7.5)使与树脂结合
的蛋白质溶出，回收显示阿马多里酶活性的组分。
[0432] 用Amicon Ultra Ultracel-30K(Millipore公司制)对得到的各显示阿马多里酶活性的组分进行浓缩，并用HiLoad 26/60Superdex200进行纯化。树脂的平衡、溶出使用含有150mM NaCl的10mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)。用SDS-PAGE对溶出的各组分的纯度进行评价，回收不含有杂质蛋白质的组分，作为CFP-H38-dh3的纯化标准品。
[0433] [实施例3]
[0434] (CFP-H38-dh3对于HbA1c的脱氢酶活性的评价)
[0435] 如下所述，利用分光光度计U-3010(株式会社日立高新技术制)评价CFP-H38-dh3对于HbA1c的脱氢酶活性。
[0436] (试剂7)：1.84mg/ml的HbA1c溶液(BBI solution制)
[0437] (试剂8)：10％的n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷(同仁化学研究所制)
[0438] (试剂9)：185mM的磷酸缓冲液pH6.0
[0439] (试剂5)：10mM的WST-3溶液
[0440] (试剂10)：8.8mg/ml(4.1U/ml)的CFP-H38-dh3溶液
[0441] (U表示将1mM的αF6P作为底物时的脱氢酶活性)
[0442] (试剂11)：8.8mg/ml的CFP-T7溶液
[0443] 首先，混合540μl的试剂7和60μl的试剂8，在98℃下加热5分钟，制备HbA1c样品预处理液。接着，向305μl的试剂9中混合125μl的试剂5、62.5μl的试剂10和7.5μl的离子交换水，在37℃下预加温5分钟。然后，加入125μl的HbA1c样品预处理液并搅拌后，利用分光光度计测定在433nm处的吸光度。对照实验则是添加62.5μl的试剂11以代替62.5μl的试剂10来进行。CFP-T7是对αF6P和HbA1c不显示反应性的阿马多里酶(参照国际公开第2015/060429号)。
[0444] 结果如图4所示。使用本发明的A1cDH，与对照相比，确认到明显的吸光度升高。即，确认到CFP-H38-dh3显示出对HbA1c的脱氢酶活性。
[0445] [实施例4]
[0446] (使用印刷电极的HbA1c定量)
[0447] 首先，使用实施例3中制备的HbA1c样品预处理液，制备含有20mM的磷酸缓冲液(pH6.5)、1M的KCl、0.65％的n-十二烷基-β-D-麦芽糖苷的HbA1c溶液。HbA1c浓度设为83、
166、249、332μg/ml这四个等级。在丝网印刷碳电极(DRP-110，DropSens制)上添加制备好的HbA1c溶液10μl和500mM的RuCl3(东京化成工业株式会社制)4μl并混合。通过连接线缆
(CAC，DropSens制)将丝网印刷碳电极与ALS电化学分析仪814D(BAS制)连接后，在电极上添加38.4mg/ml(17.8U/ml)的CFP-H38-dh3溶液6μl，外加+200mV(相对于Ag/AgCl)的电压进行反应，测定60秒后的电流值。绘制的各HbA1c浓度的电流响应值结果如图5所示。
166、249、332μg/ml这四个等级。在丝网印刷碳电极(DRP-110，DropSens制)上添加制备好的HbA1c溶液10μl和500mM的RuCl3(东京化成工业株式会社制)4μl并混合。通过连接线缆
(CAC，DropSens制)将丝网印刷碳电极与ALS电化学分析仪814D(BAS制)连接后，在电极上添加38.4mg/ml(17.8U/ml)的CFP-H38-dh3溶液6μl，外加+200mV(相对于Ag/AgCl)的电压进行反应，测定60秒后的电流值。绘制的各HbA1c浓度的电流响应值结果如图5所示。
[0448] 如图5所示，使用CFP-H38-dh3，可以精确地对HbA1c进行定量。
[0449] 将本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考而包括在本说明书中。
[0450] 序列说明
[0451] SEQ ID NO:1来源于锥毛壳属的阿马多里酶(CFP-T7)
[0452] SEQ ID NO:2CFP-T7基因序列
[0453] SEQ ID NO:3来源于土正青霉的阿马多里酶
[0454] SEQ ID NO:4来源于棘壳孢属的酮胺氧化酶
[0455] SEQ ID NO:5来源于节菱孢属的酮胺氧化酶
[0456] SEQ ID NO:6来源于棒状弯孢的酮胺氧化酶
[0457] SEQ ID NO:7来源于侵管新赤壳的酮胺氧化酶
[0458] SEQ ID NO:8来源于新型隐球菌的果糖基氨基酸氧化酶
[0459] SEQ ID NO:9来源于颖枯壳针孢的果糖基肽氧化酶
[0460] SEQ ID NO:10来源于构巢曲霉的果糖基氨基酸氧化酶
[0461] SEQ ID NO:11来源于构巢裸孢壳的果糖基肽氧化酶
[0462] SEQ ID NO:12来源于细基格孢属的果糖基氨基酸氧化酶
[0463] SEQ ID NO:13来源于微紫青霉的果糖基氨基酸氧化酶
[0464] SEQ ID NO:14CFP-T7-R62D/L63H/E102K/D106K/Q110L/A113K/A355S/D68N/A356T(CFP-T7-H37)的氨基酸序列
[0465] SEQ ID NO:15CFP-T7-H37碱基序列
[0466] SEQ ID NO:16CFP-T7-H38氨基酸序列(CFP-T7-H37-R64G)
[0467] SEQ ID NO:17CFP-T7-H39氨基酸序列(CFP-T7-H37-R64G/L110Y)
[0468] SEQ ID NO:18CFP-T7-H40氨基酸序列(CFP-T7-H37-R64G/L110Y/H99S)
[0469] SEQ ID NO:19Ao2(来源于米曲霉，另称FaoAo2)
[0470] SEQ ID NO:20Af2(来源于烟曲霉，另称AmadoriaseII)
[0471] SEQ ID NO:21At(来源于土曲霉，另称FAOD-A)
[0472] SEQ ID NO:22Fo(来源于尖孢镰刀菌)
[0473] SEQ ID NO:23Ao1(来源于米曲霉，另称FaoAo1)
[0474] SEQ ID NO:24Af1(来源于烟曲霉，另称AmadoriaseI)
[0475] SEQ ID NO:25Pi(来源于毕赤酵母属)
[0476] SEQ ID NO:26Dh(来源于汉逊德巴利酵母)
[0477] SEQ ID NO:27引物序列(导入R64G用)
[0478] SEQ ID NO:28引物序列(导入R64G用)
[0479] SEQ ID NO:29引物序列(导入L110Y用)
[0480] SEQ ID NO:30引物序列(导入L110Y用)
[0481] SEQ ID NO:31引物序列(导入H99S用)
[0482] SEQ ID NO:32引物序列(导入H99S用)
[0483] SEQ ID NO:33引物序列(导入F269M用)
[0484] SEQ ID NO:34引物序列(导入F269M用)
[0485] SEQ ID NO:35引物序列(导入F269L用)
[0486] SEQ ID NO:36引物序列(导入C280Q用)
[0487] SEQ ID NO:37引物序列(导入C280Q用)
[0488] 本说明书所引用的全部出版物、专利以及专利申请均通过直接引用而并入本说明书。
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