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用于超灵敏的核酸检测的电 传感器

阅读：746发布：2022-04-10

专利汇可以提供用于超灵敏的核酸检测的电传感器专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种用于检测核酸分子的传感器，其包括具有两个电极的电极结构和在电极表面固定的核酸探针。本发明还涉及成套装置和使用该传感器或传感器阵列的方法。本发明又涉及一种该传感器和传感器阵列的制造方法。，下面是用于超灵敏的核酸检测的电传感器专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于检测核酸分子的传感器，其包括：
电极结构，其包括第一电极、第二电极以及重叠区，其中，在所述重叠区内：所述第二电极的一部分与所述第一电极的一部分重叠，以使所述第二电极的顶面水平高于所述第一电极的顶面水平，并且在所述第一电极和所述第二电极之间设置有绝缘层，所述绝缘层与所述第一电极和所述第二电极接触；
第一核酸探针，其固定于所述第一电极的表面；和
第二核酸探针，其固定于所述第二电极的表面。
2.如权利要求1所述的传感器，其中，在所述重叠区内，所述第二电极和所述绝缘层的侧面相对于所述第二电极的顶面成约90°±30°的角度。
3.如权利要求1或2所述的传感器，其中，所述第一电极和所述第二电极由选自下述组的材料制成，所述组包括贵金属、掺杂硅、掺杂多晶硅、锗硅、钛(Ti)、钽(Ta)、钨(W)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、金属合金和导电聚合物。
4.如权利要求3所述的传感器，其中，所述贵金属为金。
5.如权利要求3所述的传感器，其中，所述金属合金选自于氮化钛(TiN)、氮化钽(TaN)和金属硅化物。
6.如权利要求3～5中任一项所述的传感器，其中，所述第一电极和所述第二电极由相同材料或不同材料制成。
7.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述电极结构布置在基板上。
8.如权利要求7所述的传感器，其中，所述基板为金属氧化物层。
9.如权利要求8所述的传感器，其中，所述基板为二氧化硅层。
10.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述绝缘层的表面粗糙度小于
0.5nm。
11.如权利要求7～10中任一项所述的传感器，其中，所述基板的厚度介于约
20nm±0.7nm～约200nm±0.7nm之间。
12.如权利要求7～11中任一项所述的传感器，其中，所述基板进一步布置在半导体层上。
13.如权利要求12所述的传感器，其中，所述半导体层的半导体为硅。
14.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述绝缘层是由相对介电常数(κ)至少为10的材料制成。
15.如权利要求1～13中任一项所述的传感器，其中，所述绝缘层由SiO2、Ta2O5、Al2O3、ZrO2和HfO2制成。
16.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述第一电极和所述第二电极的宽度彼此无关地选定在约0.1μm～约100μm之间。
17.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述第一电极和所述第二电极的厚度彼此无关地选定在约50nm～约500nm之间。
18.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，当将SiO2用作绝缘层时，则所述绝缘层的厚度介于约10nm～约20nm之间。
19.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，当所述绝缘层为相对介电常数(κ)至少为10的材料时，则所述绝缘层的厚度介于约1nm～约5nm之间。
20.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，在所述绝缘层和所述第一电极之间和/或所述绝缘层和所述第二电极之间设置有粘合层。
21.如权利要求20所述的传感器，其中，所述粘合层由金属制成。
22.如权利要求21所述的传感器，其中，所述粘合层的所述金属为Cr或Ti。
23.如权利要求20～22中任一项所述的传感器，其中，所述粘合层的厚度介于约
2nm～约30nm之间。
24.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针的长度为至少10个核苷酸、或至少40个核苷酸或至少60个核苷酸。
25.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针包括相同的核苷酸序列。
26.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述第一核酸探针和所述第二核酸探针包括不同的核苷酸序列。
27.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述核酸为DNA、RNA或它们的衍生物。
28.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，所述第一核酸探针和/或所述第二核酸探针通过化学接头固定于各自的电极的表面。
29.如前述权利要求中任一项所述的传感器，其中，多个传感器布置于传感器阵列中。
30.一种核酸检测成套装置，其包括：
如前述权利要求中任一项所述的传感器；
包含金属前驱体的溶液；和
适用于对所述金属前驱体进行化学还原的溶液。
31.一种制造如权利要求1～29中任一项所述的传感器的方法，其中，该方法包括：
提供如权利要求1所述的包括第一电极和第二电极的电极结构；和
在所述第一电极和所述第二电极的表面固定第一核酸探针。
32.如权利要求31所述的方法，其中，当固定于所述第一电极或所述第二电极的核酸探针不同于固定于各自的另一个电极的核酸探针时，则在固定第一核酸探针之后，所述方法还包括下述步骤：
通过所述第一电极或所述第二电极的电位扫描，将所述第一核酸探针从所述第一电极或所述第二电极的表面剥离；和
在所述第一核酸未被剥离掉的电极的表面固定第二核酸探针。
33.如权利要求32或33所述的方法，其中，所述阶梯式电极结构通过下述步骤制造：
在基板上形成第一电极；
形成覆盖所述基板和所述第一电极的绝缘层；
形成覆盖所述基板的涂有所述绝缘层的一部分的第二电极，其中所述第二电极形成为与所述第一电极的涂有所述绝缘层的一部分重叠；
去除所述绝缘层的未被所述第二电极覆盖的部分。
34.如权利要求33所述的方法，其中，利用等离子体增强化学气相沉积法(PECVD)制备所述绝缘层。
35.如权利要求34所述的方法，其中，将四乙氧基硅烷(TEOS)用作制备所述绝缘层的PECVD方法中的硅源。
36.如权利要求34所述的方法，其中，将氧气用作制备所述绝缘层的PECVD方法中的前驱体气体。
37.如权利要求34所述的方法，其中，在制备所述绝缘层时，用于所述绝缘层的沉积时间为约40秒～2分钟或为45秒。
38.如权利要求34所述的方法，其中，在制备所述绝缘层时，在PECVD方法中使用的腔内压强为约800mTorr(106.66Pa)～1000mTorr(133.32Pa)或为约850mTorr(113.32Pa)。
39.如权利要求36所述的方法，其中，在制备所述绝缘层时，作为所述前驱体气体的氧气的流量介于约1800sccm～约2200sccm之间或约为2000sscm。
40.如权利要求35所述的方法，其中，在制备所述绝缘层时，所述TEOS的流量介于约
0.4l/min～约0.6l/min或为约0.5l/min。
41.如权利要求32-40中任一项所述的方法，其中，以约0.1～约1V之间的电压进行所述电位扫描。
42.如权利要求32-40中任一项所述的方法，其中，所述电位扫描的扫描速率为约
150～250mV/s或为约200mV/s。
43.一种用于检测靶核酸的方法，其包括：
提供如权利要求1～29中任一项所述的传感器，其中所述传感器包括两个电极，而且将核酸序列固定在与靶核酸序列互补的电极的表面；
利用疑似包含所述靶核酸的样本液体孵育所述传感器；
使所述传感器的核酸分子金属化；和
进行电导测量以判断所述靶核酸是否存在。
44.如权利要求43所述的方法，其中，所述金属化步骤包括：
利用含有金属前驱体的溶液孵育所述传感器；
利用适用于对所述金属前驱体进行化学还原的溶液孵育所述传感器。

说明书全文

用于超灵敏的核酸检测的电传感器

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请要求2009年3月11日提交的新加坡专利申请第200901668-4号的优先权，为了所有目的，将其全部内容通过引用并入此处。

技术领域

[0003] 本发明涉及电化学领域。更为具体地，本发明涉及利用电化学设备和方法对核酸的检测。

背景技术

[0004] 随着例如DNA和RNA等核酸的出现，近10年见证了微阵列在基因表达谱和单核苷酸多态性(SNP)检测中所经历的变更。例如结合了聚合酶链反应(PCR)的微阵列技术，由于其巨大的并行性和高的输出量，已经成为当前的技术水平。尽管分子生物和医药的发展表现出相当的前景，但基于荧光的微阵列技术在光学检测中存在一些固有的缺点，这包括需要昂贵而庞大的光学扫描仪、由于荧光染料的光致退色导致的潜在图像恶化和由于标记荧光染料之间的光谱串扰而导致的模糊的读出。核酸微阵列的电模拟可为核酸的快速定量化提供一个可行的选择，这对于临床以及防护应用场合尤其是期望的。

[0005] 在过去几年内，研究者已经提出了具有直接电转换的几个作标记和无标记的感测技术。直接电转换相对其它方法具有几个优点。最好的前景之一是使用标准的CMOS技术可以使传感器单元与关联的信号处理电路进行片上集成的可行性。参考文献，相比于电阻或电容器件，利用各种微米和纳米制备技术已经对场效应器件进行了更为广泛的研究。在前一类器件中，经过在栅介质上的与生物有关的相互作用，一旦引入带电分子(例如核酸)，通过表面电势的变化来调节电特性。场效应感测避免了电流通过DNA传导，该导电可能产生不想要的电化学变化。然而，限制场效应传感器用于DNA检测的最关键参数为(i)很小的信号背景比和(ii)狭窄的检测窗口。另外，信号的可靠性经常出现问题，这是因为直流读出电子电路在栅极输入处经常出现长期的漂移。

[0006] 最近，Shiigi，H.、Tokonami，S.等人(2005，J.Am.Chem.Soc，vol.127，pp.3280)构建了金纳米颗粒(GNP)的膜，使用癸二硫醇作为铂微电极之间的隔离物。在他们的方法中，在用于桥接相邻GNP的受体-靶分子复合物的形成之前和之后，作者监测了电荷载流子的隧道效应。由于电荷载流子通过DNA分子的流动相当有限，因此在杂交时基线电流的变化小于1％，使得该方法倾向于产生错误的信号。在另一方法中，Roy，S.、Vedala，H.等人(2008，Nano Lett.，vol.8，ρp.26)开发了一种夹于一对碳纳米管电极之间的单链DNA(ss-DNA)，从而用探针探查ss-DNA的自有电荷导电性以及其杂交后的双键结构。由于在碳纳米管电极和捕获探针之间存在非常短的化学接头，信噪比被提高到25％。虽然对电荷流机制的基本认识感兴趣，但来自这样的单个纳米管单DNA系统的信号的可靠性可能不够高，从而不足以在生物医药界被接受。

[0007] 而且，经济有效地制备高度一致的具有高扩展潜力的纳米结构对于很多技术应用非常重要，然而其仍为技术挑战。很多自底向上(bottom-up)的方法遇到了某些限制，例如器件之间的一致性，这反映出器件在制备过程中的差异，还遇到低产量以及低可扩展性。另一方面，广泛应用的制备窄纳米间隙的自顶向下(top-down)的方法，例如机械裂结法、电子束刻蚀法、电迁移、蘸水笔刻蚀、透射电子显微镜辅助纳米溅射以及电镀，都必须解决例如高成本、低产量等问题，目的是离常规制备方法更近一步。

[0008] 因此，本发明的一个目标是提供新颖的、适于克服至少一部分上述缺点的设备和方法。

发明内容

[0009] 在第一方面，本发明涉及一种用于检测核酸分子的传感器。该传感器包括或由下列部件组成：

[0010] 电极结构，其包括第一电极、第二电极以及重叠区，其中，在所述重叠区内：所述第二电极的一部分与所述第一电极的一部分重叠，以使所述第二电极的顶面水平高于所述第一电极的顶面水平，在所述第一电极和所述第二电极之间设有绝缘层，该绝缘层与所述第一电极和所述第二电极接触；

[0011] 第一核酸探针，其固定于所述第一电极的表面；和

[0012] 第二核酸探针，其固定于所述第二电极的表面。

[0013] 在另一方面，本发明涉及一种核酸检测成套装置，该成套装置包括或由下列部件组成：如本文所述的传感器；含有金属前驱体的溶液；和适用于对所述金属前驱体进行化学还原的溶液。

[0014] 在又一方面，本发明涉及一种制造本发明的传感器的方法。该方法包括或由下列步骤组成：提供本文所述的电极结构；在第一电极和第二电极的表面固定第一核酸探针；通过第一电极或第二电极的电位扫描，将第一核酸探针从所述第一电极或所述第二电极的表面剥离；以及在所述第一核酸探针未被剥离掉的电极的表面固定第二核酸探针。

[0015] 在又一方面，本发明涉及一种用于检测靶核酸的方法。该方法包括或由下列步骤组成：提供如权利要求1～29中任一项所述的传感器，其中所述传感器包括两个电极，而且将核酸序列固定在与靶核酸序列互补的电极的表面；在第一步利用疑似包含靶核酸的样本液体孵育所述传感器；使所述传感器的核酸分子金属化；以及进行电导测量以判断所述靶核酸是否存在。附图说明

[0016] 结合非限制性的示例和附图并参照具体说明，将更好地理解本发明，在附图中：

[0017] 图1图1B表示阶梯式电极结构，其中顶电极(1)部分地与底电极(2)重叠从而形成阶梯式结构。该阶梯式结构的较高的台阶是由在重叠区4(条纹区域)与底电极(2)重叠的顶电极(1)的顶面形成。该阶梯式结构的较低的台阶由底电极(2)的顶面形成。在图1(B)所示的实施例中，台阶之间的边缘由三个侧壁(1′，1″，1″′)形成，这三个侧壁构成顶电极(1)和布置于底电极和顶电极之间的绝缘层(3)的一部分。在图2(G)中，台阶的侧壁以附图标记200来表示。图1(A)表示其中顶电极与底电极完全重叠的阶梯式电极结构。该阶梯式电极结构的边缘是由顶电极和布置于底电极和顶电极之间的绝缘层的两个侧壁(1′，1″)形成。图1(C)表示能用于传感器阵列中的阶梯式电极结构。顶电极压在底电极上，从而在顶电极和底电极重叠的区域中形成台阶。与在图1(A)中一样，图1(C)所示的阶梯式电极结构的边缘也是由顶电极和布置于底电极和顶电极之间的绝缘层的两个侧壁形成。图1D～1F表示其中第一核酸探针和第二核酸探针分别固定于第一电极和第二电极的电极结构。出于示例性的目的，仅表示了在电极表面固定一个核酸探针，但实际上，在电极表面上固定有多个核酸探针。可直接地或通过接头(在图1D～图1F中位于核酸探针和电极表面之间的圆形端)将核酸探针固定至电极表面。

[0018] 图2和图3图示用于制造根据本发明的实施例的传感器的方法。将硅片基板120的上层110 氧化(SiO2层110)。在第一步骤(图3A)中，基板层120的上层110涂有光刻胶层100。在图3B和2(步骤1)中，表示了在第二步骤中如何使光刻胶层图形化和显影以限定出第一电极的空间。在第三步骤(图3C)中，沉积用于形成第一电极的材料130。也可首先沉积粘合层，之后沉积用于形成第一电极的材料。在第四步骤(图3D)中，去除光刻胶层100和覆盖光刻胶层的所有电极材料以形成第一电极130(图2，步骤2)。在第五步骤中，在之前所形成的层的上方沉积绝缘层140以覆盖第一电极130和基板层110(图3E和图2中步骤3)。在进一步的步骤中，通过涂敷另一光刻胶层160而使用于第二电极的空间图形化(图2中步骤4)。在沉积用于形成第二电极150的材料和任意可选的粘合层之后，去除光刻胶层160，从而得到在图2的步骤5中(也参见图3F)图示的器件。在最后的步骤中，去除绝缘层140的未被用于形成第二电极150的材料覆盖的部分，剩下图2中步骤6以及图3G图示的电极结构。该方法得到一种阶梯式电极结构，其具有形成于第一电极130的顶面与第二电极150的顶面之间的台阶的侧壁200。侧壁200是由第二电极150和绝缘层110形成。

[0019] 图4图示在整个硅片120的上方所沉积的二氧化硅薄膜的椭圆偏振研究的结果。

[0020] 图5表示二氧化硅基板层和金电极层的AFM图像。(金层的RMS粗糙度小于1.5nm)。该图像表示包括由铬制成的粘合层的第一电极，其中粘合层与基板SiO2层和第一电极的金层直接接触。

[0021] 图6表示在1.2×1.2cm2的硅芯片上制备的5×5阵列的阶梯式微传感器的光学图像。一个欧元分币的直径为16.25mm。

[0022] 图7表示绝缘体(SiO2)/底电极(Au)界面的原子力显微镜(AFM)图像。

[0023] 图8(A)表示传感器器件的示意图示。(A)5-20nm厚的绝缘层140夹于一对Au微电极130、150之间。通过改变绝缘层的厚度可容易地调节绝缘层140的宽度(纳隙)。(B)感测过程：(I)跨越形成于顶电极150与底电极130之间的台阶的两个不同的核酸捕获探针(在图8(B)中的波浪线)的固定化；(II)与靶DNA的杂交(在上核酸探针和下核酸探针之间连接的波浪线)；(III)沿桥接分子的骨架形成银线，从而导致在电极对之间导电路径的形成。

[0024] 图9表示典型的传感器阵列芯片(尺寸：10mm×10mm)的立体显微图像。

[0025] 图10表示在由绝缘层隔开的两个电极上对两个不同捕获探针的固定化：(A)清洗后的传感器的光学图像(两个电极线，即水平线＝底电极，垂直线＝顶电极，显示相同颜色)；(B)在CP1的固定化以及与其标记有Cy3染料的互补靶DNA杂交之后的器件的荧光图像(顶电极和底电极为红色)；(C)CP1从底电极的电化学剥离，随后与带有Cy3标记的DNA杂交(仅顶电极显示为红色，底电极不显示任何颜色)；(D)在CP2的固定化以及与各自的标记有Cy3和FAM染料的互补DNAs’杂交(顶电极显示为红色，底电极显示为绿色)之后的荧光图像。

[0026] 图11(A，上)表示以背景(对照物)为参照的1.0fM靶DNA的代表性的i-V曲线，(B，中)为校准曲线，(C，下)为在1.0pM处错配识别测试的i-V曲线。为清楚起见，将单碱基错配后的靶的i-V曲线放大10倍。误差条表示每组5个测量值的数据的变化。

[0027] 图12表示在1.0fM～100pM范围内变化的各种浓度下的PKB2基因的i-V曲线。

[0028] 图13表示SEM图像：(A)经银处理后的二氧化硅；(B)在台阶交叉处(即顶电极和底电极之间的台阶)的空白传感器芯片；(C)涂有捕获探针的对照传感器芯片；(D)经银处理后的1.0pM的PKB2杂交后的传感器芯片。

[0029] 图14表示用于RNA检测的感测器件的示意图。

[0030] 图15表示以背景(对照物)为参照的100ng总RNA的代表性的i-V曲线。

[0031] 图16图示(1)10ng的总RNA和(2-4)以5.0fM的增量添加的链RNA的电响应。

[0032] 图17表示电导相对于GAPDH浓度的校准曲线。误差条表示每组5个测量值的数据的变化。

具体实施方式

[0033] 在第一方面，本发明涉及用于检测核酸分子的传感器。该传感器包括或由下列部件组成：电极结构，其包括第一电极、第二电极和重叠区，其中，在重叠区内第二电极的一部分与第一电极的一部分重叠，使得第二电极的顶面水平高于第一电极的顶面水平从而形成阶梯式结构，在第一电极和第二电极之间设有绝缘层，该绝缘层与第一电极和第二电极接触。该传感器还包括固定于第一电极的表面的第一核酸探针和固定于第二电极的表面的第二核酸探针。

[0034] 该传感器的设计考虑了通过使用标准的硅微细加工技术以经济有效的方式而进行批量生产的可行性。该感测机构的基础是当靶核酸(例如DNA或RNA)的两个末端与两个不同的表面束缚的捕获探针杂交时，将在第一电极的顶面和第二电极的顶面之间形成的边缘桥接起来，之后是简单的金属化步骤。例如，在仅有1.0fM的靶DNA的情况下，以干净的背景(小于1.0pS)为参照，获得约两个数量级的电导提升。同样，在一个实施例中，从4
1.0fM～1.0pM获得了电导与核酸浓度之间的线性关系，即每单位浓度伴随着2.1×10％突出的信号强度的变化。电导率的这种变化非常大，以致于可明确地对核酸浓度进行定量检测，且可以不需要如在当前DNA试验中使用的靶扩增。而且，在使用中，由于其独特的垂直排列的纳米结构和两个探针的构造，该传感器表现出优异的单碱基错配识别。

[0035] 针对RNA检测，在仅有0.3fM的mRNA的情况下，观察到不同的电导变化。例如，在一个实施例中，从0.50fM～10pM获得了电导和mRNA浓度之间的线性关系，每个单位浓度伴随着2个数量级以上的突出的信号强度的变化。电导的这种变化非常大，以致于可明确且定量地确定mRNA的表达水平，且对于DNA可以不需要在当前mRNA表达分析试验中使用的靶扩增。例如，在仅有10ng的总RNA中可成功地区分基因表达的低至50％的差异。

[0036] 本发明的传感器中的电极的阶梯式结构可以进行改变，以在电极之间产生具有约50nm～约535nm之间的高度的边缘的台阶，其中边缘形成于在重叠区中第二电极(例如参见图2中的150)的顶面与第一电极(例如参见图2中的130)的顶面之间。例如图3(G)所示，电极之间的台阶200的边缘的厚度由第二电极150的厚度和绝缘层140的厚度来确定。

[0037] 在一个实施例中，第二电极和绝缘层的侧面(例如参见图1(B)中1′、1″和1″′)相对于第二电极的顶面成约80°～90°之间的角，或者在一个实施例中，成90°±30°的角或90°±20°的角。这样在重叠区中，第二电极和第一电极之间形成了陡峭的边缘。这允许例如将核酸紧靠边缘的底部固定，于是，即使是与固定于第二电极的顶面和底电极的顶面的紧靠台阶的核酸探针相结合的较短的靶核酸，也能为桥形成提供良好的条件。该阶梯式传感器结构允许检测长度为至少40个核苷酸的靶核酸。可被检测的靶核酸的长度主要地也依赖于在重叠区中由绝缘层彼此隔开的第二电极和第一电极的顶面之间的距离。台阶越高，靶核酸就需要越长，以将间隙桥接并与固定于电极的顶面的核酸探针结合(例如参见图8(B))。还应注意，固定于第二电极的核酸探针可以固定在由第二电极形成的侧壁(例如参见图1A和1B中1′、1″或1″′)的一部分处。因此，正在桥接的靶核酸分子将经过的在第二和第一电极之间的有效最小间距为绝缘层的厚度，或者在包括粘合层的情况下，所述有效最小间距为绝缘层和粘合层的厚度。

[0038] 在传感器阵列的情况下(参见图1C)，或为如图1(A)所示的单个传感器结构的情况下，第二电极可与第一电极完全地重叠。与第一电极完全地重叠的意思是第二电极的重叠区与第一电极的整个宽度重叠，而不是与第一电极的整个长度重叠。如图1(C)和图6所示，在传感器阵列中，第二电极可在多个第一电极的上方延伸。例如图1(B)和图3(G)所示，第二电极的重叠区也可仅以一定比例与第一电极重叠。第二电极的重叠区可与第一电极的至少约5％、或与第一电极的约10％～约95％、第一电极的约97％、第一电极的约99％或第一电极的约50％重叠。例如图1(B)所示，在第二电极的重叠区仅以一定比例与第一电极重叠的情况下，形成了又一边缘(1”’)，从而增加了用于核酸探针的结合的可能的地点，并可能由此提高传感器的灵敏度。

[0039] 第一电极和第二电极的厚度可相同或不同。在一个实施例中，第一电极和第二电极的厚度可彼此无关地介于约50nm～约500nm之间。在一个实施例中，每个电极的厚度可彼此无关地介于约50nm～约300nm之间、或约50nm～约200nm之间。在一个示例中，电极的厚度为75nm、或100nm、或150nm、或200nm、或250nm。每个电极的宽度可彼此相同或不同。第一电极和第二电极的宽度可独立地从约0.1μm～约100μm之间的范围内选择。

[0040] 用于将第一电极和第二电极隔开的绝缘层(图1中的3)具有致密且均匀的结构。该绝缘层的厚度可介于约1nm～约50nm之间、或1nm～20nm之间、或5nm～15nm之间。绝缘层的厚度也可随着其所用的材料而变化。例如，在一个实施例中，当将SiO2用作绝缘层的材料时，则绝缘层的厚度可为20nm、或介于约10nm～20nm之间。在另一示例中，当使用相对介电常数(κ)至少为10的材料时，则绝缘层的厚度可为约2nm、或介于约1nm～约5nm之间。本发明的传感器的独特设计和形态导致了绝缘层的漏电流在1V 偏压下低于1pS，在某些情况下，仅介于约0.2～约0.8pS之间。

[0041] 绝缘层为非常均匀的层，这意味着绝缘层的表面粗糙度低于0.5nm。表面粗糙度超过0.5nm时，在第一电极和第二电极之间的漏电流将升高，其可能不利于设备的性能且负面地影响传感器器件的灵敏度。

[0042] 在另一实施例中，可将粘合层布置于绝缘层和第一电极之间、或绝缘层和第二电极之间或绝缘层和两个电极(第一电极和第二电极)之间。由于不同材料之间的晶格失配和热膨胀系数的不同，不同材料的两层不总是互相粘合。因此，需要粘合层在两个活性材料层之间起到缓冲层的作用。有时，在界面或合金(化合物)形成处存在原子(分子)扩散，从而使各自的界面更加稳定。如果没有粘合层，则诸如Au或Pt等的薄膜电极层可能从涂有绝缘层的基板上剥离，所述基板例如为涂有SiO2的硅或玻璃基板等。粘合层的厚度可介于约2nm～约30nm之间、或约5nm～25nm之间、或约2nm～15nm之间的范围内。在一个实施例中，粘合层的厚度为约2nm～约5nm之间。

[0043] 本文提到的电极结构可布置在基板上。该基板的厚度可介于约20nm～约200nm之间。在一个实施例中，基板的厚度介于约20nm±0.7nm～约200nm±0.7nm之间。该基板可布置在例如由半导体材料制成的又一基板层上。该半导体材料可以是比如硅、锗、砷化镓或碳化硅。其它材料包括砷、硒和碲的混合物。在一个实施例中，该半导体材料为硅。例如，图3(G)图示了其中将基板层110沉积在又一基板层120上的实施例。第一电极130和绝缘层140布置在基板层110上。

[0044] 基板层110可由与绝缘层140相同或不同的材料制成。例如，在一个实施例中，基板层110由诸如SiO2的金属氧化物制成。不过，也可以使用SiO2之外的其它基板材料。例如，可使用能够耐至少300℃(在此温度下随后例如通过PECVD沉积绝缘层)而没有任何脱气、变形或熔解的绝缘材料。在一个实施例中，用作基板层的材料也应该能够耐有机溶剂。一种这样的例子为氮化硅(Si3N4)。

[0045] 在某个实施例中，使用了如又一基板层120的又一基板层。具有绝缘基板层110的目的是为了防止在同一面上的相邻金属电极之间的电串扰。这意味着，如果将除诸如Si等半导体材料之外的另一材料(例如玻璃、石英或任意所述绝缘基板(如陶瓷)等)用作又一基板材料120，则不需要基板层110。因此，基板层110或120可包括但不限于如硅、玻璃、石英、Si3N4或陶瓷等的半导体材料。

[0046] 绝缘层可由具有高的相对介电常数(κ)的材料或SiO2制成。相对介电常数(κ)的其它术语为介电常数、或相对静态介电常数、或静态介电常数。相对介电常数为材料的介电常数与在真空中的介电常数(将其定义为1)之比。相对介电常数(κ)为材料贮存来自外加电磁场的电荷并随后将能量传送出去的能力的量度。在一个实施例中，绝缘层可由相对介电常数(κ)至少为10的材料制成。相对介电常数(κ)至少为10的材料的例子包括但不限于Ta2O5、Al2O3、ZrO2和HfO2。

[0047] 如果存在，则粘合层由金属制成。适合的金属的例子包括但不限于Cr、Zr、Si、Al+TiN、IrO2或Ti。例如，对于Au电极，经常将材料Ti或Cr用作粘合层的材料。对于贵金属电极，一般可将Si、Al、Al加TiN或IrO2用作粘合层的材料。例如，对于Pt电极，可将Ti或Zr用作粘合层的材料。第一电极和第二电极可由相同或不同的材料制成。电极由下述的材料制成，但不限于这些材料，这些材料包括：贵金属、掺杂硅、掺杂多晶硅、锗硅、钛(Ti)、钽(Ta)、钨(W)、铝(Al)、铬(Cr)、铜(Cu)、金属合金或导电聚合物。这里可使用的贵金属包括金、铂、铟、钯、锇、银、铑和钌。金属合金的例子包括但不限于氮化钛(TiN)、氮化钽(TaN)、Mg2Ni、CaNi5、Co3Sn2、NdFeB和金属硅化物。

[0048] 固定于第一电极的表面的核酸探针可与固定于第二电极的表面的核酸探针为相同的核酸探针、或为不同于固定于第二电极的表面的核酸探针。

[0049] 在其一般意义上，这里使用的术语“核酸”指代任何可能结构的核酸，例如单链、双链或它们的组合等。核酸例如包括DNA分子、RNA分子、使用核苷酸类似物或使用核酸化学产生的DNA或RNA的类似物、锁核酸分子(LNA)、PNA分子和tecto-RNA分子(例如Liu，B.，et al.，J.Am.Chem.Soc.(2004)126，4076-4077)。LNA分子具有被修饰的带有位于C4’和O2’之间的亚甲基桥的RNA骨架，亚甲基桥锁定了呋喃糖环的N构型，为各个分子提供了更高的双链稳定性和核酸酶耐受性。与PNA分子不同，LNA分子具有带电骨架。DNA或RNA可以是来自于基因组的或合成的，且可以是单链或双链。所述核酸例如可以为mRNA、cRNA、合成的RNA、基因组DNA、cDNA、合成的DNA、DNA和RNA的共聚物、寡核苷酸、长度为约21～23个核苷酸之间的小RNA，等等。而且各个核酸还可包含非天然的核苷酸类似物。

[0050] 很多核苷酸类似物为人所知并可在这里出现和/或使用。核苷酸类似物是包含例如在碱基、糖、或磷酸根部分处的修饰的核苷酸。作为示例，已知用2′F、2′O-Me或2′H残基取代siRNA的2′-OH残基能改善各个RNA的体内稳定性。在碱基部分的修饰包括对下述碱基的天然修饰和合成修饰：A、C、G和T/U；不同的嘌呤碱基或嘧啶碱基(如尿嘧啶-5-基、次黄嘌呤-9-基和2-氨基腺嘌呤-9-基等)；以及非嘌呤或非嘧啶的核苷酸碱基。其它的核苷酸类似物作为通用的碱基。通用的碱基包括3-硝基吡咯和5-硝基吲哚。通用的碱基能够与任何其它的碱基形成碱基对。碱基修饰通常可与例如2′-O-甲氧基乙基等的糖修饰结合，以实现独特的性能(如增加的双链稳定性)。

[0051] 在第一电极和第二电极的表面固定的核酸探针是与想要结合的靶核酸互补的单链核酸。通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对和双链核酸的形成而发生靶核酸的结合。核酸探针的核酸可以是本文提及的任何核酸。在一个实施例中，核酸探针由DNA或RNA制成。DNA和RNA两者都由重复的核苷酸单元构成。每个核苷酸由糖、磷酸根和核酸碱基组成。在DNA中的糖为脱氧核糖。在RNA中的糖为核糖，核糖与脱氧核糖相同但多一个OH(称作羟基的氧氢原子结合)。DNA和RNA之间主要的区别是DNA包含胸腺嘧啶核酸碱基但不包含尿嘧啶核酸碱基，而RNA包含尿嘧啶核酸碱基但不包含胸腺嘧啶核酸碱基。其它三种杂环胺(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶)在DNA和RNA中都存在。

[0052] 本文使用的核酸探针的长度可介于约5个～约50个核苷酸之间、或约10个～50个核苷酸之间或约15个～30个核苷酸之间。在一个实施例中，核酸探针的长度为至少10个、或40个或60个核苷酸。第一核酸探针和第二核酸探针的长度可相同或不同。

[0053] 利用本领域已知的方法将核酸探针固定在第一电极和第二电极的表面。核酸通常通过接头分子而固定于电极的表面。巯基经常用于在金属的表面上固定核酸。

[0054] 例如，在一个实施例中，利用固相DNA合成技术，通过制备末端巯基化的寡核苷酸而将短寡核苷酸固定在金表面上(例如在Kelley，S.O.，Barton，J.K.，et al.，1998，Langmuir，vol.14，pp.6781中所描述的)。Hanna等人使用5-[(4-叠氮基苯甲酰甲基)硫基]-UTP、5-APAS-UTP和5-APAS-CTP将RNA与金属表面交联。这些经修饰的核苷酸包含叠氮基，叠氮基用于对所述交联进行激活，且能够通过体外转录反应而被引入RNA分子中(Hanna，M.M.，Dissinger，S.，et al.，1989，Biochemistry，vol.28，pp.5814；Hanna，M.M.，Zhang，Y.，et al.，1993，Nucleic Acids Res.，vol.21，pp.2073)。WO 03038108公开了一种用于对已有的核酸链的嘌呤碱基或嘧啶碱基进行修饰从而引入用于固化至金属表面的-12 -11 2巯基的方法。在电极表面的核酸探针的密度可介于约1×10 ～5×10 mol/cm 之间的范围内。

[0055] 在另一方面，本发明涉及一种用于检测靶核酸的方法。该方法包括下列步骤或由下列步骤组成：提供本文所述的传感器，其中所述传感器包括两个电极，并且将核酸序列固定在与靶核酸序列互补的电极的表面上；使用疑似包含靶核酸的样本液体孵育传感器；使传感器的核酸分子金属化；进行电导测量以确定靶核酸是否存在。

[0056] 在所述方法中，诸如NaCl等的盐浓度可介于约0.01～1.0mM之间的范围内。在一个实施例中，温度可介于约10℃～约90℃之间的范围内。pH可介于约3～9之间的范围内。于是，利用本文描述的传感器可在不同条件的宽范围内实施上述方法。实施上面的用于检测靶核酸序列的方法，也不必要对疑似包含靶核酸序列的样本进行预处理。

[0057] 首先，使传感器(例如参见图8(B)I)与疑似包含靶核酸的溶液接触。如果该溶液包含靶核酸，则靶核酸与固定于第一电极和第二电极的表面的核酸探针发生互补性的结合(例如参见图8(B)II)。

[0058] 在将传感器与例如包含待检测的靶核酸的溶液接触之后，该方法可进一步包括几个清洗步骤。该清洗步骤可去除妨碍后续的电测量和/或金属在结合后的靶核酸链上进行沉积的任何物质。也可使经过靶核酸的杂交后的传感器经受严格的清洗，以从传感器去除所有非特定吸收或部分杂交的核酸链。为实现严格的清洗，使用不同盐浓度的溶液。例如，盐溶液浓度越低，且严格的清洗和温度的持续时间越长，严格度就越高，就可去除越多的核酸。该清洗可在25℃～75℃温度之间、以每次约2～5分钟的两～三个步骤完成。所述方法在本领域已为人所知，且本领域的技术人员知道如何将严格的清洗适用于各个靶核酸检测。

[0059] 在靶核酸与核酸探针杂交之后以及在可选的清洗步骤之后，杂交后的核酸要经过金属化步骤。用于金属化核酸的方法在本领域已众所周知(例如参见Braun，E.，Eichen，Y.，et al.，1998，Nature，vol.391，pp.775)。金属化包括如贵金属离子(参见上述的贵金属)等的导电金属离子在核酸复合物上的沉积，核酸复合物形成于靶核酸和固定于电极的表面的核酸探针之间。沉积之后，金属化后的核酸链形成了比所述核酸导电更有效率的纳米线(参见图8(B)III)。

[0060] 因此，为增加核酸的电性能，沿核酸分子矢量地沉积导电金属离子。化学沉积过程+ +基于如银离子等的金属离子通过离子交换(例如Ag/Na 离子交换)以及银和核酸碱基之间的复合物的形成来实现沿核酸的选择性定位。在使用银离子的实施例中，以银离子交换后的核酸然后被还原以形成纳米大小的与核酸骨架结合的金属化银聚集体。这些贵金属聚集体随后在低光条件下利用化学还原溶液和贵金属离子进一步如在标准的摄影过程中那样而“显影”。该化学还原溶液可为酸性溶液，例如是含有对苯二酚的溶液。

[0061] 因此，在一个实施例中，该金属化步骤包括将传感器与含有金属前驱体的溶液接触的步骤；然后将该传感器与含有适用于对贵金属前驱体进行化学还原的还原剂的溶液接触。

[0062] 如贵金属前驱体等的合适的金属前驱体的例子包括但不限于AgNO3、+
[Ag(NH3)2](aq)、HAuCl4·3H2O、H2PtCl6·6H2O、PdCl2、K2PdCl4、RuCl3、H2PdCl6·6H2O，或如果利用不同金属离子的混合物对核酸进行金属化时它们的混合物。

[0063] 适用于化学上还原贵金属前驱体的还原剂包括但不限于对苯二酚、抗坏血酸(AA)、硼烷(如二甲硫醚硼烷、癸硼烷、儿茶酚硼烷或硼烷-四氢呋喃络合物等)；一氢化铜、柠檬酸、二异丁基氢化铝(DIBAL-H)、1，4-二氢-2，6-二甲基-3，5-吡啶二羧酸二乙酯、乙醇、乙二醇(EG)、甲醛、甲酸、肼、氢气、氢化锂铝(LiAlH4)、3-巯基丙酸(3-MPA)、甲醇、硼氢化镍、硅烷(如苯基硅烷、三(三甲基硅基)硅烷(TTMSS)、三氯硅烷、三乙基硅烷(TES)、聚甲基氢硅氧烷(PMHS)或聚甲基氢硅氧烷)；异丙醇(2-丙醇)、双(2-甲氧基乙氧基)氢化铝钠(红铝)、羟甲基亚磺酸钠(雕白粉)、硼氢化钠(NaBH4)、氰基硼氢钠、连二亚硫酸钠(Na2S2O4)、三乙酰氧基硼氢化钠、四甲基二硅氧烷(TMDSO，TMDS)、氢化三丁基锡(三丁基锡烷)、三苯基膦或亚磷酸三苯酯。在一个实施例中，使用在NH3溶液中的对苯二酚。

[0064] 在又一方面中，本发明涉及一种核酸检测成套装置。该成套装置包括或由下列物品组成：本文所述的传感器、含有如贵金属等的导电金属的金属前驱体的溶液以及适用于使该金属前驱体进行化学还原的溶液。

[0065] 所述核酸检测成套装置可用于例如表征病原体的核酸、在表达谱期间测量mRNA水平或在现场即时检测(point-of-care)的应用，如检测传染病、癌症诊断和治疗，等等。能将传感器布置在传感器阵列中，这又可以实现多个靶核酸的并行检测。这里所述的传感器或传感器阵列也可集成在用于检测一系列靶核酸的读出单元中。利用该传感器和该成套装置，可检测全长基因。该传感器足够灵敏，从而其也可获得在本申请的实验部分所描述的核酸序列中单碱基错配的差异。

[0066] 在另一方面中，本发明涉及一种制造本发明的传感器的方法。该方法包括提供如本文所述的电极结构。之后在第一电极和第二电极的表面固定第一核酸探针。在两个电极上固定两个不同的核酸探针的情况下，那么通过第一电极或第二电极的电位扫描(potential cycling)而将固定于第一电极和第二电极的表面的第一核酸探针剥掉。之后将不同于第一核酸探针的第二核酸探针固定在电极的尚未剥掉第一核酸探针的表面。

[0067] 该方法的电极结构可利用如反应离子刻蚀(RIE)和光刻蚀剥离(photolithography-liftoff)工艺等的标准的刻蚀方法来制造。RIE工艺导致了阶梯式电极结构的侧壁的更好轮廓。

[0068] 因此，在一个实施例中，传感器的制造方法包括在基板上形成第一电极。之后，形成用于覆盖基板和第一电极的绝缘层。然后形成用于覆盖基板的涂有绝缘层的一部分的第二电极。第二电极形成为与涂有绝缘层的第一电极的一部分重叠从而形成重叠区。去除绝缘层的未被第二电极覆盖的部分，从而形成如图1所示的阶梯式电极结构。

[0069] 参照图2和图3描述其中重叠区仅与第一电极的部分重叠的电极结构的制造例子。图3(A)表示厚度约为500μm的硅片被设置为基板层120。使硅片基板120的上层110氧化。利用旋涂法在上层110涂上光刻胶。如图2(1)和图3(A)所示，形成了厚度为约
0.5μm～约2μm的光刻胶层100。图3(B)表示借助掩模通过曝光于UV灯而使光刻胶层
100图形化，并使其显影以形成凹处。图2(2)和图3(C)表示在铬(Cr)层(未图示)上沉积高纯度的金层(50nm～300nm)130，其中铬(Cr)层沉积于光刻胶层100的剩余的部分上以及凹处中。图3(D)表示通过使光刻胶层100经丙酮的作用而去除光刻胶层100，同时去除在光刻胶层上沉积的金层130的各个部分。形成了第一电极130。图2(3)和图3(E)表示利用等离子体增强化学气相沉积法(PECVD)或溅射法在上层110和第一电极130上沉积绝缘层140(5nm～200nm)。

[0070] 图2(4)表示在绝缘层140上沉积光刻胶层160(未图示)且进行图形化，以形成用于第二电极150的沉积的凹处。图2(5)和图3(F)表示沉积第二电极150以及去除光刻胶层160，以得到图形化后的第二电极150。图2(6)和图3(G)表示通过反应离子刻蚀(RIE)去除绝缘层140的未被第二电极150覆盖的部分。形成了阶梯式电极结构的侧壁200。侧壁200构成了在图3所示的具体例子中覆盖第一电极的几乎90％的重叠区的部分。

[0071] 如上所述，可利用溅射法或等离子体增强化学气相沉积法(PECVD)来制备绝缘层。PECVD利用电能产生辉光放电(等离子体)，其中能量被转移到气体混合物中(前驱体气体)。这将气体混合物转变成活性基、离子、中性原子和分子以及其它高度受激粒子。这些原子和分子碎片与位于腔室中的基板相互作用，且根据这些相互作用的特征，在基板处发生刻蚀或沉积处理。由于通过以气相形式的碰撞而出现以气相形式的活性或高能粒子的形成，因此基板可保持在低温下。由PECVD形成的薄层具有高粘着性、低针孔密度、好的阶梯覆盖性以及均匀性等特征。

[0072] 在一个实施例中，将四乙氧基硅烷(TEOS)用作PECVD方法中制备绝缘层的硅源。将氧气用作PECVD方法中的前驱体气体。利用PECVD方法沉积绝缘层的时间可介于约40秒～2分钟之间。在一个例子中，该时间为约45秒。

[0073] 为制备绝缘层，PECVD反应器的腔室内的气压为约800mTorr(106.66Pa)～1000mTorr(133.32Pa)。在一个实施例中，该气压为约850mTorr(113.32Pa)。

[0074] 在一个实施例中，为制备绝缘层，作为前驱体气体的氧气进入PECVD反应器的腔3 3 3
室中的流量介于约0.03m/s sccm～约0.04m/s之间，或为约0.033m/s。另一方面，TEOS进入腔室中的流量可介于约0.4l/min～约0.6l/min之间。在一个例子中，TEOS的流量为约0.5l/min。

[0075] 如本文所述的，如果想在第一电极和第二电极涂上不同的核酸探针，那么在将第二核酸探针固定到两个电极之一的顶面上之前，需要将第一核酸探针从两个电极之一的顶面去除。具体地说，可通过电剥离而从电极的表面去除核酸探针。在该过程中，对表面上将要去除核酸探针的电极相对于参考电极进行电位扫描。在约0.1V～1V之间的范围内进行电位扫描。在一个实施例中，该电位扫描的扫描速率为约150～250mV/s。在一个例子中，该扫描速率为约200mV/s。

[0076] 本文所示例性地描述的发明在缺少任一元件或多个元件、一个限制或多个限制的情况下可适当地进行实施，而不限于这里所具体公开的内容。因此，例如术语“包括”、“包含”、“含有”等应理解为开放式且没有限制。另外，已将本文采用的术语和表述用作说明的词语且没有限制，且在使用所述术语和表述时没有意图将所示和所述的特征的任何等同和其部分排除在外，而应认识到，可在本发明要求的范围内作出各种变化。于是，应当理解的是，虽然通过优选实施例和可选特征具体地公开了本发明，但本领域技术人员可以对本文公开的发明进行各种修改和变化，且所述修改和变化均被认为落入本发明的范围内。

[0077] 本文宽泛地概括性地描述了本发明。落入上位的公开内容里面的每个较窄的物种和次上位的组合也构成本发明的部分。这包括本发明的带有从物种中去除任何主题的限制性或否定性的限制的上位描述，而不管本文是否具体地记载了离体的材料。

[0078] 其它的实施方式落入下述权利要求书以及非限制性示例的范围内。另外，本发明的各个特征或方面以马库什(Markush)组合的方式进行了描述，本领域技术人员将认识到本发明也可按照马库什组合的任意单个成员或者成员的子组合进行描述。

[0079] 实验部分

[0080] 化学物和材料

[0081] 本文使用的末端含巯基的DNA捕获探针由西格玛-格恩奥斯(Sigma-Genosys)(乌德兰德斯公司(Woodlands)，德克萨斯州)定制并拿来使用。其它的寡核苷酸来自第一贝斯普特有限公司(1stBase Pte Ltd)(新加坡)。所有其它的试剂购买于西格玛-奥尔德里奇(密苏里州圣路易斯)且无需作进一步纯化而使用。磷酸盐缓冲盐溶液(PBS，10mM磷酸盐缓冲液+139mM NaCl+2.7mM KCl)用于CP(捕获探针)和AP(退火探针)(annealing probe)的固定化中。将pH值为8.5的10mM Tris-HCl-1.0mM EDTA-0.10M NaCl(TE)缓冲溶液用作第一杂交和清洗缓冲液，将含有50mM MgCl2的TE缓冲液(TEM)用于第二杂交和清洗中。信使RNA标准品(cDNA)是相应的mRNA进行RT-PCR的产物。根据生产商推荐的方案，利用TRIzol试剂(加利福尼亚州卡尔斯巴德市英潍捷基公司(Invitrogen))提取总RNA。总RNA的产量和质量常规地由凝胶电泳和UV光谱测量法评估。为使RNases对miRNA的稳定性的影响最小化，将焦碳酸二乙酯处理的去离子水用于所有样本溶液和缓冲液的制备，且利用RNaseZap(德克萨斯州阿姆贝恩公司(Ambion))净化表面。为去除所有有机残留物或剩余的光刻胶，将该器件首先在溶液中清洗15分钟，用去离子水彻底地漂洗，并在氮气气流中干燥。

[0082] 传感器的制备

[0083] 利用标准的光刻蚀技术，在4英寸的硅片(涂有500nmSiO2)上制备金属/绝缘体/金属(这里简称为“纳米-MIM)多层器件(图2)。利用两种不同的方法，使得为分子桥接所必需的绝缘层和顶电极的轮廓良好的侧壁图形化，这两种方法是(i)反应离子刻蚀(RIE)和(ii)光刻蚀剥离(photolithography-liftoff)工艺。RIE工艺导致了侧壁的更好的轮廓(例如参见图3)。因此，在制备过程中采用了RIE工艺。利用等离子体增强化学气相沉积法(PECVD)沉积SiO2绝缘层。在完成底电极之后，通过PECVD方法并使用作为硅源的四乙氧基硅烷(TEOS)蒸气和作为前驱体气体的O2，在整个晶片上沉积5～20nm的SiO2绝缘层。SiO2绝缘层的形态和电学性质对纳米-MIM传感器的性能起着关键的作用。因此，必须制备相当致密均匀的SiO2层。在850mTorr的腔压以及O2和TEOS蒸气的流量分别是2000sccm和0.5L/min的状态下，使用45s的沉积时间。利用椭圆偏振测量法，可确定出在上述条件下，在整个4英寸基板上SiO2层厚度仅有小于0.5nm的偏差(图4)。然后进行标准的光刻蚀工艺以对顶电极进行图形化，之后在Ti(15nm)粘合层上进行Au(150nm)的RF 磁控溅射。经剥离之后，将晶片放入RIE腔中，以从底电极的不期望的部分将SiO2层选择性地和全部去除。在这种情况中，上金属叠层用作刻蚀SiO2层的良好轮廓的掩模，并且显微观察表明获得了相当陡峭的边缘和光滑的金表面(图5)。通过在SiO2沉积过程中调节实验变量而可容易地制备具有5nm薄的SiO2绝缘层的合适的纳米-MIM结构。

[0084] 传感器阵列制备

[0085] 利用标准的光刻蚀技术，在涂有500nmSiO2的1.5×1.5cm的硅芯片上制备由多达1600个单个的纳隙传感器构成的、具有垂直排列的金/SiO2/金叠层结构的传感器阵列。图
6所示为由总共625个单个的纳隙传感器[(5×5)×(5×5)]构成的阵列芯片的光学图像。
如上所述，底部的金电极的粗糙度对纳隙传感器的性能起着关键的作用。通过对金电极表面进行AFM表征而确定金电极的如表面粗糙度等的特征。在这个实施例中，金层的粗糙度为理想的2nm之内。然后在最佳条件下，利用等离子体增强化学气相沉积法(PECVD)并使用作为硅源的四乙氧基硅烷(TEOS)蒸气和作为前驱体气体的O2，沉积SiO2绝缘层。椭圆偏振测量表示在整个晶片上SiO2厚度的偏差小于0.50nm。如上述，将顶部的金层作为天然掩模并利用反应离子刻蚀(RIE)，制备为mRNA桥接所需的绝缘层和顶部金电极的良好轮廓的侧壁。电镜观察表明获得了陡峭的边缘和光滑的金表面(参见图7)。

[0086] 捕获探针(CP)固定化

[0087] 在该示例性实施例中，使用了两组具有不同序列的捕获探针。5’正向捕获探针(CP1；SEQ ID NO：1)为具有9个碱基的间隔长度的21-碱基寡核苷酸，而3’反向捕获探针(CP2；SEQ ID NO：2)也为21-碱基寡核苷酸。利用这些探针，可将全长的人蛋白激酶B-2(PKB2，1446bp；SEQ ID NO：4)检测为模式靶DNA。两个捕获探针的特性对于PKB2都是独特的，且探针分别与PKB2的5’端和3’端杂交。简言之，在室温下，在包含1.0μMCP1溶液的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS：10mM磷酸盐缓冲液，139mM NaCl，和2.7mM KCl)中对刚刚清洗过的传感器进行2个小时的孵育，利用大量的DI水漂洗，且在氮气气流中干燥。在此阶段，通过硫醇-金的相互作用可预料到在两个电极(顶和底)上有CP 1的自组装单分子层(SAM)。随后，对该器件进行电化学剥离，从而从底电极选择性地或全部地去除CP1。在0～1.0V(对Ag/AgCl))之间，以200mV/s的扫描速率进行底电极的单次电位扫描。之后，在室温下，将该器件在包含1.0μMCP2的溶液中孵育2个小时。经DI水彻底清洗之后就完成了该器件。

[0088] 杂交和检测

[0089] 在CP1和CP2分别在两个电极上的固定化之后，通过CP1和CP2与TE缓冲液(pH值为8.0的10mM Tris-HCl，100mM NaCl，和1.0mM EDTA)中各种浓度的靶DNA的5.0μL滴液之间30分钟的杂交，将纳隙桥接，其中靶DNA的两个末端分别与两个表面结合的捕获探针互补。经杂交之后，该器件使用SSC缓冲液(80mM NaCl，8mM柠檬酸钠，和0.1％十二烷基硫酸钠；低于熔解温度的5-7℃)进行三次严格的清洗，以去除任何非特异性吸收或不完全杂交的DNA链。最后，通过简单的金属化步骤使跨越间隙的杂交后的分子导电。该过程包括银离子沿杂交后的DNA链的矢量“集合”，之后沿DNA骨架进行对苯二酚催化的银纳米线的还原形成(Braun，E.，Eichen，Y.，1998，Nature，vol.391，pp.775)。简单地说，将杂交后的传感器在含有0.10M的AgNO3的氨水(pH为10.5)中孵育10分钟。经彻底漂洗之后，通过含有50mM的对苯二酚的氨水(PH为10.5)对吸收后的银离子进行还原。利用参数分析器进行电导测量。为更好地显现银纳米线的形成，将银增强工艺应用于样本以进行扫描电镜(SEM)实验。即，在位于传感器上的银离子的集合和还原之后，将含有1.0mM的AgNO3的柠檬酸盐缓冲液(pH为3.5)和含有2.0mM的对苯二酚的柠檬酸盐缓冲液(pH为3.5)混合，并将其施加在传感器上。通常，5～10分钟的时间足够形成在SEM下高度可见的银纳米线。

[0090] 结果

[0091] 传感器制备

[0092] 图8中描述了纳隙器件以及感测步骤的图示。纳米-MIM制造为，其中如SiO2等的纳米厚的绝缘层夹于一对垂直叠放的金属层(导体)之间。SiO2绝缘层在上金属电极和下金属电极之间形成“台阶”或“纳隙”，其中在上金属电极和下金属电极上固定分别与靶DNA的两个末端互补的不同序列的两个捕获探针。经杂交和随后的银纳米线的形成，该纳隙通过靶DNA链的桥接产生了主电路(图8(B))。未能与捕获探针杂交的非互补DNA链没有跨越形成于顶电极和底电极之间的台阶而桥接，于是对两个金属电极之间的电流没有贡献。这种方法的可行性的关键是具有微小的背景电流，其优选地应比经DNA或RNA桥接之后而产生的信号低几个数量级。一般地，背景电流主要由于载流子穿过位于电极(5μm×5μm)的相对较大的共同区域内的绝缘层的隧道效应。虽然根据相同的制备步骤可得到更高规模
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的集成，但为了说明起见，在100mm 的基板面积上制备了7个器件的阵列(图9)。

[0093] 通过利用该方法，可制备从5～100nm变化的不同间隙尺寸、具有精确控制的绝缘层尺寸(1.0nm)、具有高的器件一致性和无限的可扩展性的传感器阵列。正如已知的，绝缘层的形态和电学性质对传感器的期望性能至关重要。例如，对于10～20nm厚的SiO2层，发现表面粗糙度约为0.5nm(图7)。而且在1V的外加偏压下，发现漏电流(空白传感器芯片的电导)介于约0.2～约0.8pS的范围内。该极低的漏电流促进了该器件随后在核酸检测中的应用。

[0094] 捕获探针固定化

[0095] 现在，必须将每一组捕获探针跨越形成于顶电极和底电极之间的台阶而选择性地固定在两个相应电极的其中一个上(图10A)。换言之，需要10～20nm分辨率的捕获探针的固定化步骤。该步骤非常关键，因为事实上即使借助自动测位仪也不可能直接将捕获探针溶液涂在指定的电极上。幸运的是，通过电化学剥离技术成功地完成了改任务。为提供直接的证据，在每个步骤之后将几个具有代表性的器件在含有1.0μM荧光标记靶DNA的TE缓冲液中孵育。参照图10B中的荧光图像，CP1的确明显地在两个电极的表面上形成了理想的SAM。为验证CP1的选择性的去除，在电化学剥离之后，使用Cy3标记的互补靶对该器件进行孵育，并在荧光显微镜下观察。如图10C所示，从荧光在底电极完全消失可判断出，CP1仅存在于纳米-MIM器件(传感器)的顶电极上。由于CP1的单层已存在于顶电极上，故利用CP2溶液的后期处理将可能导致CP2的SAM在底电极上形成。通过在TE缓冲液中孵育一组传感器来证实上述可能，TE缓冲液含有1.0μM的FAM(绿色染料)标记靶DNA和Cy3标记的DNA，该靶DNA的碱基序列与CP2互补，Cy3标记的DNA的碱基序列与CP1互补。图10D提供了很好的直观的证据，证明可在一对具有纳米间隔的电极的表面上选择性地固定两个不同的捕获探针的SAM。这是第一次实现了DNA固定化的纳米分辨率。另外，荧光图像明显地表示了固定后的捕获探针的高的表面覆盖度以及良好的杂交效率，这为超灵敏DNA感测器件的研发铺平了道路。而且，正如从非常清晰的荧光图像可证实的，在基板或电极表面上的非特定性吸收是可以忽略的。

[0096] 靶DNA的检测

[0097] 跨越在每个传感器中形成于两个电极之间的台阶而进行两个末端的电测量。图11A描述了含有1.0fM靶DNA的样本溶液的典型的电流-电压(i-V)特征曲线，这是以背景(对照物)为参照的。在1.0V偏压下，经杂交和银金属化后的器件，可检测到高于约2个数量级的电流。该代表性的曲线为非线性，这可能是由银纳米线中的颗粒间边界电阻造成的。
在阵列中经过相同处理的器件产生了相似的i-V曲线。

[0098] 为验证响应的真实性，进行了一系列的对照实验。首先，用相同长度、但具有与PKB2的对应末端非互补的5个中心碱基的另一捕获探针(CP*；SEQ ID NO：3)代替CP1。杂交、清洗和银金属化条件都保持不变。可观察到在背景电流中无明显的变化，这明显地表明引入该系统的非互补物阻止了靶DNA与CP*完全地杂交，因此不能经受严格的清洗。未与位于顶电极的捕获探针杂交的DNA链可能平放在底电极，对器件的电导根本没有贡献。

[0099] 此外，将一滴空白缓冲溶液进行点样，且器件经过相同的步骤。再次未观察到可检测的信号，这证实了输出电流并不会由于沿捕获探针形成的银种子的不受控制的增加而来自于纳隙的偶然桥接。

[0100] 最后，验证跨越台阶的如PKB2的长靶DNA的非特定性吸收是否能够对信号作出贡献。为了这个试验，将几个刚刚清洗过的、预先固定有非互补的捕获探针的器件用靶DNA溶液孵育，然后进行最佳的银离子集合和纳米线形成的步骤。不存在任何可检测到的电导的变化进一步确定了已测得的信号的可靠性。

[0101] 将这种以杂交后的DNA为模板形成的银纳米线用作信号发生器，在具有纳隙间隔的电极之间的电导主要依赖于在顶电极和底电极之间形成的银纳米线(桥接)的数量。杂交后的靶DNA分子越多，在两个电极之间就会有越多的银纳米线，于是电导就越高。在受控制的实验条件下，可预料在电导和靶DNA浓度之间具有简单明了的线性关系。为构成校准曲线，对每个浓度进行多次测量以获得电导的平均值。

[0102] 事实上，如图11(B)和图12所示，发现在电极对之间的电导随着靶DNA浓度的增加而升高。将这种依赖于浓度的电导与在电极对之间形成的银纳米线的统计数量关联起来。在超低的DNA浓度(如1.0fM)的情况中，仅仅几份DNA有可能杂交并将形成于电极之间的台阶桥接。随着试验溶液中的靶DNA的浓度的增加，更多的DNA链跨越台阶而杂交，从而相应地增加了并行传导路径的数量。在最佳的条件下，以对于每个传感器芯片从杂交到检测正好60分钟之内的总分析时间，可在1.0fM～1.0pM的动态范围内定量检测靶DNA。该灵敏度与电化学/电生物传感器的最好的灵敏度相当(Zhang，Y.，Austin，R.H.，2002，
2
Phys.Rev.Lett.，vol.89，Art.No.198102)。回归系数R 与相对标准偏差(RSD)被发现分别为0.96和≤20％。所述信号变化反映了捕获探针固定化、杂交、银离子集合以及纳米线的形成这些步骤的再现性的累积度。在更长的4～6小时的杂交之后，可以获得依赖于基因的长度(由于其较高的杂交效率，较短的基因(SEQ ID NO：5)可能更为灵敏)的稍微更低的0.3～0.5fM的检测限度，但鉴于长的杂交时间，这几乎没有现实意义。如图11(B)所
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示，在校准曲线的高浓度端，电导高达毫西门子，比背景高1.25×10 倍，其转换成每单位浓
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度2.1×10％的相对变化，其远远好于任何其它的基于电转换的方法。该巨大的信号强度主要是由于垂直的台阶(纳隙)所获得的明显减少的背景电导(小于1.0pS)，这是因为其它具有纳隙和微米隙间隔的电极也可产生毫西门子等级的电导，但这基于次微西门子的巨大背景( R.，Powell，R.D.，et al.，2005，Nano Lett.，vol.5，no.7，pp.1475)。

[0103] 与其中经杂交、松弛结合以及非特定性地吸收的所有靶DNA分子都对器件的电导有贡献的平面纳米和微米结构不同，极低的背景表示了该独特的垂直的纳米-MIM结构(传感器结构)和两个捕获探针的方法明显地将背景减少到与在DNA检测中的仪器噪声相当的水平，这是因为仅当靶DNA的两个末端与捕获探针杂交时才实现桥接。换言之，为产生电导增量，必须利用跨越台阶(纳隙)的两个捕获探针将靶DNA分子垂直“把持”。被发现平放于底电极的靶DNA链对电导的影响非常小。原则上，利用台阶厚度为10nm的传感器可对≥60个碱基对的靶DNA链进行检测，该靶DNA链几乎涵盖了所有已知的基因。

[0104] 为评估在区分单碱基错配(SBM)中所提出的方法的能力，用相同长度、但在中间仅有一个A-T错配的捕获探针代替CP1，从而使新的器件与相同的靶DNA进行单碱基错配。在1.0pM处，可发现SBM器件的电导增量小于当使用完全互补的捕获探针所发现的电导增量的4％(图11C)。也就是说，利用本文提出的具有远高于光学微阵列的至少为25∶1的SBM选择因数的步骤和很多其它先前报道的方法，可对SBM突变进行检测。而且，因为台阶(纳隙)的垂直的构造实际上抵消了大部分与非杂交相关的作用(背景)。假设背景在所有条件下保持不变，则其对SBM选择性的作用可描述为

[0105] 背景作用＝(Scomp+B)/(SSBM+B)-(Scomp/SSBM) (1)

[0106] 其中，SSBM、B以及Scomp分别为SBM DNA、背景和互补DNA的电导。当Scomp＞SSBM且B＜SSBM时，

[0107] 背景作用＝B(SSBM-Scomp)/(SSBM(SSBM+B))＜0 (2)

[0108] 如等式(2)中所示，背景对SBM选择性的作用总为负。利用高的背景，则失去相当多的错配选择性。仅当背景可忽略不计时，才能实现基于杂交的DNA传感器的真实SBM选择性。

[0109] 然后对暴露于对照物(图13(C))和互补的DNA样本(图13(D))的生物传感器芯片进行SEM表征。图像如图13所示。可以看出在银沉积之前和之后，传感器芯片的二氧化硅表面显示出没有可以看到的变化(图13(A))，而在银纳米线沉积之后，由于银纳米线或更确切地是短纳米线的存在，使得涂有捕获探针的金电极明显地变得粗糙(图13(C))，所述纳米颗粒可能是短纳米线的积聚物。为了比较，空白传感器芯片的SEM图像如图13(B)所示。

[0110] 一个可能的原因是紧密聚集的短捕获探针(6～7nm)，其不可避免地随着银纳米线的生长而聚集。另一个可能的原因是随着银纳米线形成的进行以及位于捕获探针上的负电荷的同时的屏蔽，出现了过卷绕的多形体和银纳米线的积聚，从而降低了相邻捕获探针之间的静电排斥。由于相邻的链之间的静电排斥，捕获探针应该“站立”于金表面上。伴随着银形成的进行的负电荷的屏蔽导致了DNA-银加合物的积聚。捕获探针不再站立而是朝金表面向下弯曲。因此，沉积后的银可能呈现不规则的积聚后的网状构造，而不是带有清晰边界的独立线。

[0111] 幸运的是，在使用垂直排列的台阶(纳隙)电极来研发电测量的过程中，积聚是期望的特征，因为其促进了在电极表面上的二维特征的形成，而不是向着顶电极的三维特征，大大地减小了由捕获探针实现的台阶桥接的可能性，并可读出具有高信号噪声比的电信号。

[0112] 在相同条件下，在对照物上沉积的银的形态与在互补的DNA杂交后的传感器表面上沉积的线状银明显不同(图13(D))。对图13D进行仔细检查，显示出的确存在一些跨越台阶而垂直地排列的银纳米线，有效地将两个金电极桥接，从而产生可测量的电信号。

[0113] 本文提出的传感器提供了新颖的超灵敏的传感器阵列，该传感器阵列用于在30分钟的杂交之后以飞摩尔检测限度(femtomolar detection limit)对DNA进行检测。该灵敏度是电核酸生物传感器中最佳的。还公开了利用常规的、高产的制备工艺可批量生产的纳米-MIM传感器或传感器阵列的制备技术。因为极低的背景，所以获得了突出的信号强度和良好的错配差异。按照本方法的步骤，可将传感器阵列集成于用于检测一系列靶DNA的读出单元上。当需要快速的、并行的DNA分析时，本文描述的传感器阵列可能是特别有益的(例如，用于表征病原体、在表达谱期间测量mRNA的水平或者现场即时检测应用中)。

[0114] 用于RNA检测的捕获探针固定化

[0115] 上面的实验涉及了DNA的检测。在下面，将给出使用本发明的传感器进行RNA的检测的实施例。表1给出了在该RNA的检测方法中使用的核酸。

[0116] 表1：在RNA的检测方法中使用的核酸序列

[0117]GAPDH 3’-HS-(CH2)6-TGTACCGGAGGTTCCCTCATT-5’ SEQ ID NO：6
BRCA1 3’-HS-(CH2)6-GGACTATGAAAAGACCTACGGAG-5’ SEQ ID NO：7
His4 3’-HS-(CH2)6-TCCATTGACGTAGCGCCTAA-5’ SEQ ID NO：8
退火探针 3’-TTTTTTTTTTTTTTTTTT-(CH2)6-SH-5’ SEQ ID NO：9

[0118] 这里提出的使用阶梯式电极结构检测mRNA的方法包括针对每个靶mRNA的一对寡核苷酸捕获探针，即捕获探针(CP)(SEQ ID NO：6，7和8)以及退火探针(AP，Annealing Probe)(SEQ ID NO：9)。CP的特征对于待测的代表性的mRNA是独特的，并具有相同的熔解温度。AP(多聚(T))与所有mRNA的多聚(A)尾互补且都具有完全相同的长度(SEQ ID NO：9)。为具有最高的捕获效率以及最低的与非杂交相关的mRNA摄取的摄取率，当使靶mRNA正与捕获探针选择性地杂交时，以几乎没有mRNA多聚(A)尾的杂交的方式设计两组探针。
简单地说，将1.0μM CP溶液的2.0μl的滴液涂敷于刚刚清洗过的传感器阵列芯片的5×5阵列簇。经在室温下2个小时的孵育之后，利用大量的水对其进行漂洗，且在氮气气流中对其进行干燥。在此阶段，可预料到通过硫醇-金的相互作用而在两个电极(上和下)上有CP的自组装单层(SAM)。随后，使该器件接受电化学剥离，从而将CP从顶电极选择性地和全部地去除。以200mV/s的扫描速率，在0～1.0V(相对于Ag/AgCl))之间进行顶电极的单个电位扫描。之后，在室温下，将整个传感器芯片在含有1.0μM AP的PBS中孵育2个小时。经水彻底清洗之后就完成了该器件。

[0119] mRNA的杂交和检测

[0120] 在CP和AP分别在两个电极上固定化之后，通过与TE缓冲液中的总RNA的2.0μl的滴液的30分钟的杂交，将台阶桥接，其中总RNA的两个末端分别与两个表面结合的CP和AP互补。在第一杂交之后，该器件使用SSC缓冲液(80mM NaCl+8mM柠檬酸钠+0.1％十二烷基硫酸钠；低于熔解温度的5-7℃)进行三次严格的清洗，以去除所有非特异性吸收或不完全杂交的mRNA链。之后，在室温下，将多份TEM缓冲液添加在芯片上。在该步骤，位于底电极的杂交后的mRNA的多聚(A)尾进一步与位于顶电极上的AP杂交，形成跨越纳隙的mRNA“桥”。

[0121] 最后，通过沿上述的mRNA桥的边缘而形成的简单的以mRNA为模板的银纳米线而使跨越台阶的杂交后的mRNA链导电。

[0122] 结果

[0123] 传感器阵列制备

[0124] 图14描述了用于检测RNA的传感器以及感测过程的图示。SiO2绝缘层在顶电极的顶面和底金电极的顶面之间形成“台阶”，其中将具有不同序列的、分别与mRNA的5’-末端和3’-末端互补的两个捕获探针固定于顶电极和底电极上。经杂交化和随后的银纳米线形成，由靶mRNA链实现该台阶的桥接，由此产生了主电路(图14，A-C)。首先，对该方法的可行性至关重要的是具有良好的绝缘SiO2，或换言之，是空白传感器芯片的微小漏电流(或电导)，应至少比经mRNA桥接之后所产生的最低信号低1个数量级。如上所述的，漏电流一般主要是由于载流子在电极的相对较大的共同区域(10μm×10μm)中穿过SiO2绝缘层的隧道效应。于是，这里制备并且使用了具有相当光滑、致密均匀的绝缘层的传感器(参见上面)。利用这里描述的方法，可制备具有高的器件一致性和无限的可扩展性、从5nm～100nm变化的不同间隙尺寸、以及间隙尺寸可精确控制(小于±1.0nm)的传感器阵列。原则上，在10nm的传感器阵列上可对包含了真核有机物中所有已知的基因的靶mRNA链≥50或≥60个碱基进行检测。

[0125] 其次，CP和AP对必须有选择地跨越纳隙分别固定在两个对应的电极上，这意味着需要5～10nm的分辨率的捕获探针固定化过程。如上所述，该步骤非常重要，因为事实上不可能采用任何现有的捕获探针固定化技术来实现该目的。因此，使用上述的剥离技术以将不同的探针固定于两个电极上。

[0126] 为提供直接的证据，选择了代表性的5×5簇，并将其在含有1.0μM的FAM(绿色染料)标记的寡核苷酸以及Cy3(红色染料)标记的寡核苷酸的TE缓冲液中孵育，FAM(绿色染料)标记的寡核苷酸的碱基序列与AP互补，Cy3(红色染料)标记的寡核苷酸的碱基序列与CP互补。图10A-D提供了很好的直观证据，即可在一对具有纳米间隔的电极的表面上选择性地固定两个不同的捕获探针。这是第一次在核酸固定化中实现了纳米分辨率。

[0127] 另外，荧光图像明显地表明了固定化后的捕获探针的高的表面覆盖度以及良好的杂交效率，这为超灵敏mRNA感测器件的发展铺平了道路。而且，正如从非常清晰且轮廓很好的荧光图像可证实的，在基板或电极表面上的非特定性吸收是可以忽略的。

[0128] 图14A-C表示生物传感器阵列的工作原理的逐个步骤。分别在下金电极和上金电极上跨越纳隙组装CP和AP的两个单层，用作与生物亲和的感测界面(图14(C))。CP与样本mRNA的相互作用形成双链体，将靶mRNA桥接于底电极上(图14(D))。杂交后的mRNA的多聚(A)尾用作固定地点，提供必要的局部环境以促进跨越台阶的桥接。因此，在与位于顶电极上的AP杂交之后，使紧靠台阶的杂交后的mRNA链垂直地跨越台阶而保持，且杂交后的以mRNA为模板的银纳米线的形成为mRNA的检测提供了更需要的灵敏度(图14(E))。

[0129] 为使mRNA的与非杂交相关的摄取率最小化以及增加杂交效率，CP和AP在该实施例中以如此方式设计，即熔解温度至少具有20℃的差异，从而在靶mRNA捕获过程(第一杂交)期间具有非常少的多聚(A)尾的杂交。而且，在顶电极上的阴离子AP的高密度降低了mRNA的非特定性吸收，从而产生高的信号/噪声比。

[0130] 在第一可行性试验中，在生物传感器阵列上对100ng的总RNA进行试验，其中CP和AP对为GAPDH mRNA而设计。经分别在50℃处30分钟的杂交以及在25℃处的退火，使GAPDH选择性地与其互补的CP和AP结合，并且跨越台阶而固定于生物传感器表面上。在随后的孵育期间，通过以mRNA为模板的银金属化形成，沿杂交后的GAPDH链的边缘生成银纳米线。经银处理后的生物传感器的典型的i-V曲线如图15所示。为了比较，图15的轨迹线1为生物传感器的i-V曲线，其中，底电极在相同处理后涂有非互补的CP(对照生物传感器)。如图15所示，在杂交后的传感器处观察到比对照物高的多的电流(在1.0V处的电导)。大量的清洗以及在-1.0V～1.0V之间变化的电压并未产生明显的变化，这表示银纳米线与两个金电极之间的杂交后的mRNA链牢固结合，从而有效地跨越台阶而桥接。

[0131] 可预料到的是，靶mRNA与CP和AP的杂交导致了跨越台阶的垂直排列的mRNA链的形成。当在银金属化溶液中孵育杂交后的生物传感器阵列时，通过静电互相作用和化学结合，银离子在杂交后的mRNA链的周围聚集并排列。在mRNA周围的这种高的银浓度提供了经还原后的银成核中心的高密度的局部环境，其促进了沿mRNA链的银纳米线的大多数地形成，提供了实现高电导所更期望的结构。由此形成的银纳米线用于mRNA感测，在银纳米线中银包围在mRNA模板周围。对于互补的mRNA则获得了相当大的电导增加量，而针对对照传感器，当与空白传感器的漏电流相比较时，仅观察到微小的增加量。

[0132] 这清楚地证明了跨越台阶的银纳米线的形成是由杂交后的mRNA链引导，且得到的银纳米线网状结构有效地将台阶(纳隙)桥接，产生可测量的电导变化。对照物的结果意味着该生物传感器阵列的与非杂交相关的信号极低，从而有利于在超低浓度下检测mRNA。这可能归因于二台阶捕获和退火杂交、以及使用以夹层式构造的方式垂直排列而不是常规的平面结构的台阶。另外，i-V曲线在低mRNA浓度下为非线性，这可能是由银纳米线中的粒间边界电阻引起的。

[0133] 为进一步证实电导增加量的确是由于杂交后的GAPDH，在杂交之前，以每5.0fM的增量将连续的多份GAPDH cDNA加入总RNA中，监测电导的变化。发现电导进一步增加(图16)。对于被添加的总RNA，观察到的信号随GAPDH cDNA浓度的增加而线性地增加，这表示在总RNA样本中产生的信号来自GAPDH mRNA，且基本表示了传感器阵列的再现性。

[0134] 这里提出的传感器阵列在mRNA表达分析中的应用性然后在基因组的样本上进行试验。在该研究中，将全长GAPDH(1008bp)用作校准标准。对从0.1fM～100pM变化的不同mRNA浓度的溶液进行试验。对于对照实验，在传感器制备中使用了非互补的捕获探针。如图17所示，GAPDH的动态范围为0.5fM～10pM，相对标准的偏离小于10％，检测限度为
0.3fM。相比于以前的直接的mRNA检测过程，在本文提出的过程中，迫使杂交后的mRNA跨越台阶间隙而排列起来，从而大大地提高了桥接能力和电检测的响应，因此增加了生物传感器阵列的灵敏度和检测限度。灵敏度现在是由银纳米线的密度和直径确定，而银纳米线的密度和直径反过来是由跨越台阶间隙排列的mRNA链的总数量确定。假设，如果对于所有mRNA的银金属化和杂交效率维持不变，则应获得相同的信号强度(每单位浓度的电导)和检测限度。然而，却发现灵敏度和检测限度都依赖于靶mRNA的长度，mRNA越长，就观察到信号强度和检测限度就越高，且在长度和信号强度(或检测限度)之间没有直接的关系，这表示金属化和杂交效率也依赖于靶mRNA的长度。

[0135] 可以理解的是，靶mRNA越长，预计杂交效率越低，于是检测限度就越高。较高的信号强度可能是沿较长mRNA边缘的较宽的银纳米线的直接结果，这是由于在未杂交的区域9
存在次级结构。如图17所示，在校准曲线的高浓度端，电导高达毫西门子，高于背景约10
4
倍，其转换成每单位浓度约2×10％的相对变化，这比任何其它的基于电转换的生物传感器好得多。该巨大的信号强度主要是由于具有垂直的台阶而获得的显著减少的背景电导(小于1.0pS)，因为其它纳米和微米台阶的电极也可产生毫西门子等级的电导，但这基于次微西门子的巨大背景。

[0136] 与经杂交、松弛结合以及非特定性地吸收的所有靶DNA分子都影响器件的电导的平面纳米和微米结构不同。该极低的背景表明该独特的垂直的排列和二台阶杂交方法明显地将背景减少到与在核酸检测中仪器噪声相当的水平，这是因为仅当靶mRNA的5’-端和3’-端分别与CP和AP杂交时才实现桥接。换言之，为产生电导增量，必须利用跨越形成于电极的顶面之间的台阶的CP和AP将靶mRNA链垂直地“把持”。发现平放于底电极处的信使RNA链对电导几乎没有影响。

[0137] 由于具有很大提高的灵敏度，该传感器阵列允许其在从HeLa细胞提取的总RNA的真实样本中分析mRNA表达。利用这里所提出的生物传感器和RT-qPCR来确定三个具有代表性的mRNA的表达水平。将结果标准化为总RNA。基于相同的样本，利用生物传感器所得到的结果与RT-qPCR的结果非常一致。在5.0fM～2.0pM的浓度范围内，基于单个miRNA与mRNA试样有关的相对误差通常小于10％。因此，在两种条件下识别mRNA，允许表达水平具有低于50％的差异(大于3×10％)。因为在不同条件下很多最感兴趣的mRNA的表达经常有点不同，因此这是其优势所在。本文提出的传感器阵列在识别被不同地表达的mRNA中呈现较高的精确度，减少了进行太多重复的需要。相比于常规的mRNA表达技术，由于大大提高的灵敏度，本文提出的方法还从微克到纳克明显地减少了所需要的总RNA的量。

[0138] 上述的无PCR的传感器阵列简单、灵敏且大大地不受与样本有关的偏差的影响。其可以高灵敏度和特定性直接测量复合样本中的mRNA，这是因为其使样本控制最小化，将mRNA的直接杂交与信号生成结合在一起。在需要RNA尺寸分级或多次净化步骤的更复杂的协议下，直接使用总RNA的测定法使不可避免的样本损耗最小化。因此需要能够同时测量所有mRNA的表达的定量测定法。定量的测定法要求每步以高产量可重复地进行，且对来自标准协议的微小偏离不敏感。如果没有可引入与样本相关的变化的扩增或最少分离的步骤，且如果标记和杂交都在平衡附近达到稳定的终点，最小地依赖于反应动力学或浓度，则有利于这些目的的实现。本文提出的阵列允许杂交在实际相同的条件下同时进行且更加靠近平衡。CP的相似的熔解温度确保使大部分mRNA在平衡处占优势地杂交。突出的信号强度允许杂交后的mRNA链的数量的精确测量。因此，这里所述的阵列可当作真正定量的、完全多元的mRNA表达测定法的将来发展的基础。

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