特异性用于次要组织相容性(H)抗原HA-1的TCR及其用途
阅读：78发布：2022-06-14
专利汇可以提供特异性用于次要组织相容性(H)抗原HA-1的TCR及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本公开提供用于靶向次要组织相容性(H) 抗原 (HA‑1H？)以，例如 预防 或管控异基因造血干细胞移植(HCT)后恶性血液病复发的组合物和方法。还提供了转基因构建体，所述转基因构建体编码工程化的结合蛋白，诸如T细胞受体或嵌合抗原受体，任选地编码另外的组分诸如辅助受体和/或安全 开关 。此类转基因构建体可被转导到免疫细胞诸如T细胞中，并且可用作患有恶性血液病或有恶性血液病(例如，白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)复发危险的受试者中的免疫疗法。，下面是特异性用于次要组织相容性(H)抗原HA-1的TCR及其用途专利的具体信息内容。
1.一种工程化免疫细胞，其包含编码结合蛋白的异源多核苷酸，所述结合蛋白包括：
(a)T细胞受体(TCR)α链可变(Vα)域，其具有由TRAV17基因、TRAV21基因或TRAV10基因编码的氨基酸序列，以及TCRβ链可变(Vβ)域，其包含SEQ ID NO:13-17和86中的任一个的CDR3氨基酸序列；
(b)TCR Vα域，其包含SEQ ID NO:87-92中的任一个的CDR3氨基酸序列，以及TCR Vβ域，其具有由TRBV7-9基因编码的氨基酸序列；或
(c)TCR Vα域，其包含SEQ ID NO:87-92中的任一个的CDR3氨基酸序列，以及TCR Vβ域，其包含SEQ ID NO:13-17和86中的任一个的CDR3氨基酸序列，
其中所述编码的结合蛋白能够特异性结合至含有HA-1H抗原的肽并且不结合至不含有HA-1H抗原的肽。
2.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中：
(a)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；
(b)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；
(c)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；
(d)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；
(e)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；或
(f)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:86的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
3.如权利要求1或2所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的Vα域包含与SEQ ID NO:2、
4、6、8、10和12中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的Vβ域包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9和11中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
5.如权利要求3或4所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的Vα域不包含CDR1的氨基酸序列中的变化，所述编码的Vβ域不包含CDR1的氨基酸序列中的变化，或所述编码的Vα域的CDR1和所述编码的Vβ域的CDR1不包含氨基酸序列中的变化。
6.如权利要求3-5中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的Vα域不包含CDR2的氨基酸序列中的变化，所述编码的Vβ域不包含CDR2的氨基酸序列中的变化，或所述编码的Vα域的CDR2和所述编码的Vβ域的CDR2不包含氨基酸序列中的变化。
7.如权利要求1-6中任一项所述的工程化免疫细胞，其中：
(a)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成；
(b)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成；
(c)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成；
(d)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成；
(e)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；或
(f)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。
8.如权利要求1-7中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含与SEQ ID NO:19-22、24和26中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的TCRα链恒定域。
9.如权利要求1-8中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含与SEQ ID NO:18、23和25中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的TCRβ链恒定域。
10.如权利要求1-9中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:28、30、32、34、36和38中的任一个的氨基酸序列至少约90％同一的氨基酸序列的TCRα链。
11.如权利要求1-10中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含TCRα链，所述TCRα链包含SEQ ID NO:28、30、32、34、36和38中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
12.如权利要求1-11中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:27、29、31、33、35和37中的任一个的氨基酸序列至少约90％同一的氨基酸序列的TCRβ链。
13.如权利要求1-12中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含TCRβ链，所述TCRβ链包含SEQ ID NO:27、29、31、33、35和37中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
14.如权利要求8-13中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含：
(a)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(b)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(c)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(d)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(e)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
(f)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
15.如权利要求10-14中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述(i)编码所述TCRα链的异源多核苷酸和所述(ii)编码所述TCRβ链的异源多核苷酸被包含在单个开放阅读框中，其中所述单个开放阅读框还包含编码设置在(i)与(ii)之间的自切割肽的多核苷酸。
16.如权利要求15所述的工程化免疫细胞，其中编码所述自切割肽的所述多核苷酸包含SEQ ID NO:76-84中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
17.如权利要求15或16所述的工程化免疫细胞，其中所述单个开放阅读框包含与SEQ ID NO:59-63中的任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列。
18.如权利要求17所述的工程化免疫细胞，其中所述单个开放阅读框包含SEQ ID NO:
59-63中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
19.如权利要求15-18中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的单个开放阅读框包含SEQ ID NO:53-57中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
20.如权利要求1-19中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白能够H
特异性结合至HA-1肽:HLA复合物。
21.如权利要求20所述的工程化免疫细胞，其中所述HLA包含HLA-A*0201。
22.如权利要求1-21中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述HA-1H肽包含氨基酸序列VLHDDLLEA(SEQ ID NO:66)。
23.如权利要求1-22中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含TCR、TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体(CAR)。
24.如权利要求23所述的工程化免疫细胞，其中所述TCR的抗原结合片段包含单链TCR(scTCR)。
25.如权利要求23所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含CAR。
26.如权利要求23所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的结合蛋白包含TCR。
27.如权利要求1-26中任一项所述的工程化免疫细胞，其还包含编码以下的异源多核苷酸：
(a)安全开关蛋白；
(b)选择标志物；
(c)CD8辅助受体β链；
(d)CD8辅助受体α链；或
(e)其任何组合。
28.如权利要求27所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的安全开关蛋白包含：
(i)截短的EGF受体(tEGFR)；
(ii)iCasp9；
(iii)RQR多肽；
(iv)myc表位；或
(v)其任何组合。
29.如权利要求27或28所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的选择标志物包含：
(i)RQR多肽；
(ii)截短的低亲和力神经生长因子(tNGFR)；
(iii)截短的CD19(tCD19)；
(iv)截短的CD34(tCD34)；或
(v)其任何组合。
30.如权利要求27-29中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的CD8辅助受体包含β链，所述β链包含SEQ ID NO:71-75中的任一个的氨基酸序列。
31.如权利要求27-30中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的CD8辅助受体为重组CD8辅助受体，其包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的RQR多肽。
32.如权利要求31所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的RQR多肽被包含在所述编码的CD8辅助受体的β链中。
33.如权利要求31或32所述的工程化免疫细胞，其中所述编码的RQR多肽被包含在所述编码的CD8辅助受体的α链中。
34.如权利要求32所述的工程化免疫细胞，其包含编码iCasp9的异源多核苷酸和编码重组CD8辅助受体蛋白的异源多核苷酸，所述重组CD8辅助受体蛋白包含含有RQR多肽的β链。
35.如权利要求32或34所述的工程化免疫细胞，其包含从5'至3'编码([iCasp9多肽]-[猪捷申病毒2A(P2A)肽-[TCRβ链]-[P2A肽]-[TCRα链]-[P2A肽]-[包含RQR多肽的CD8β链]-[P2A肽]-[CD8α链])的异源多核苷酸。
36.如权利要求27-35中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述编码TCRβ链的多核苷酸包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列或由其组成，并且其中所述编码TCRα链的多核苷酸包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列或由其组成。
37.一种工程化免疫细胞，其包含异源转基因多核苷酸，所述异源转基因多核苷酸包含SEQ ID NO:85的核苷酸序列或由其组成。
38.如权利要求1-37中任一项所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞为T细胞、NK细胞或NK-T细胞。
39.如权利要求38所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞为CD4+T细胞或CD8+T细胞。
40.如权利要求39所述的工程化免疫细胞，其中所述免疫细胞包含PD-1基因、LAG3基因、TIM3基因、CTLA4基因、HLA组分基因、TCR组分基因或其任何组合的染色体基因敲除。
41.如权利要求40所述的工程化免疫细胞，其中所述染色体基因敲除包含HLA组分基因的敲除，所述HLA组分基因选自α1巨球蛋白基因、α2巨球蛋白基因、α3巨球蛋白基因、β1微球蛋白基因，或β2微球蛋白基因。
42.如权利要求41所述的工程化免疫细胞，其中所述染色体基因敲除包含TCR组分基因的敲除，所述TCR组分基因选自TCRα可变区基因、TCRβ可变区基因、TCR恒定区基因，或其组合。
43.一种组合物，其包含权利要求1-42中任一项所述的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
44.一种单位剂量，其包含有效量的(i)如权利要求1-42中任一项所述的工程化免疫细胞或(ii)根据权利要求43所述的组合物。
45.如权利要求44所述的单位剂量，其包含以约1:1比率组合在一起的(i)包含至少约
30％工程化CD4+T细胞的组合物，和(ii)包含至少约30％工程化CD8+T细胞的组合物，其中所述单位剂量基本上不含有天然T细胞。
46.一种用于治疗或预防受试者中以HA-1H抗原的表达为特征的过度增殖性疾病的复发的方法，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求44或45所述的单位剂量，从而治疗所述过度增殖性疾病。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述HA-1H抗原存在于由所述受试者中的过度增殖细胞表达的HLA复合物中。
48.如权利要求46或47所述的方法，其中所述过度增殖性疾病包括恶性血液病。
49.如权利要求48所述的方法，其中所述恶性血液病包括白血病、淋巴瘤、骨髓增生异常疾病或骨髓瘤。
50.如权利要求49所述的方法，其中所述恶性血液病包括白血病。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述白血病选自急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、混合表型急性白血病(MPAL)、慢性髓性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。
52.如权利要求51所述的方法，其中所述恶性血液病包括淋巴瘤。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述淋巴瘤选自霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、中枢神经系统淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、CD37+树突细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、粘膜相关淋巴组织(MALT)的结外边缘区B细胞淋巴瘤、结节性边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤或伯基特氏淋巴瘤。
54.如权利要求49所述的方法，其中所述恶性血液病包括骨髓增生异常疾病。
55.如权利要求54所述的方法，其中所述骨髓增生异常疾病选自难治性血细胞减少症伴单系发育异常(难治性贫血、难治性中性粒细胞减少症和难治性血小板减少症)、难治性贫血伴环形铁粒幼细胞(RARS)、难治性贫血伴环形铁粒幼细胞–血小板增多症(RARS-t)、难治性血细胞减少症伴多系发育异常(RCMD)、难治性血细胞减少症伴多系发育异常和环形铁粒幼细胞(RCMD-RS)、难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)、不可分类的骨髓增生异常或儿童难治性血细胞减少症。
56.如权利要求46-55中任一项所述的方法，其中所述受试者正接受或先前接受造血细胞移植(HCT)。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述HCT包括供体造血细胞，所述供体造血细胞包含编码HLA组分的基因的染色体敲除、编码TCR组分的基因的染色体敲除或两者。
58.如权利要求46-57中任一项所述的方法，其中所述受试者先前接受淋巴清除化疗。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述淋巴清除化疗包括环磷酰胺、氟达拉滨、抗胸腺细胞球蛋白、或其组合。
60.如权利要求46-59中任一项所述的方法，其中包含在所述单位剂量中的所述工程化细胞的一种或多种对于所述受试者是同种异体的。
61.一种用于调节过继免疫疗法的方法，所述方法包括向先前已接受根据权利要求27-
42中任一项所述并且包含编码安全开关蛋白的异源多核苷酸的工程化免疫细胞的受试者，施用有效消融所述受试者中先前施用的工程化免疫细胞的量的所述安全开关蛋白的同源化合物。
62.如权利要求61所述的方法，其中：
(a)所述安全开关蛋白包含tEGFR并且所述同源化合物为西妥昔单抗；
(b)所述安全开关蛋白包含iCasp9并且所述同源化合物为AP1903；
(c)所述安全开关蛋白包含RQR多肽并且所述同源化合物为利妥昔单抗；
(d)所述安全开关蛋白包含myc结合域并且所述同源化合物为特异于所述myc结合域的抗体；或
(e)(a)-(d)的任何组合。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述安全开关包含iCasp9并且所述AP1903结合至所述iCasp9。
64.一种编码结合蛋白的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含：
(a)T细胞受体(TCR)α链可变(Vα)域，其具有由TRAV17基因、TRAV21基因或TRAV10基因编码的氨基酸序列；以及TCRβ链可变(Vβ)域，其包含SEQ ID NO:13-17和86中的任一个的CDR3氨基酸序列；
(b)TCR Vα域，其包含SEQ ID NO:87-92中的任一个的CDR3氨基酸序列；以及TCR Vβ域，其具有由TRBV7-9基因编码的氨基酸序列；或
(c)TCR Vα域，其包含SEQ ID NO:87-92中的任一个的CDR3氨基酸序列；以及TCR Vβ域，其包含SEQ ID NO:13-17和86中的任一个的CDR3氨基酸序列，
其中所述编码的结合蛋白能够特异性结合至含有HA-1H抗原的肽并且不结合至不含有HA-1H抗原的肽，并且其中所述多核苷酸被密码子优化以用于在宿主细胞中表达。
65.如权利要求64所述的分离的多核苷酸，其中：
(a)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；
(b)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；
(c)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；
(d)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；或
(e)所述编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列，并且所述编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列。
66.如权利要求64或65所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的Vα域包含与SEQ ID NO:
2、4、6、8、10和12中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
67.如权利要求64-66中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的Vβ域包含与SEQ ID NO:1、3、5、7、9和11中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
68.如权利要求66或67所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的Vα域不包含CDR1的氨基酸序列中的变化，所述编码的Vβ域不包含CDR1的氨基酸序列中的变化，或所述编码的Vα域的CDR1和所述编码的Vβ域的CDR2不包含氨基酸序列中的变化。
69.如权利要求66-68中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的Vα域不包含CDR2的氨基酸序列中的变化，所述编码的Vβ域不包含CDR2的氨基酸序列中的变化，或所述编码的Vα域的CDR2和所述编码的Vβ域的CDR2不包含氨基酸序列中的变化。
70.如权利要求64-69中任一项所述的分离的多核苷酸，其中：
(a)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成；
(b)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成；
(c)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成；
(d)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成；
(e)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；
(f)所述编码的Vβ域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成，并且所述编码的Vα域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。
71.如权利要求64-70中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含与SEQ ID NO:19-22、24和26中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的TCRα链恒定域。
72.如权利要求64-71中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含与SEQ ID NO:18、23和25中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的TCRβ链恒定域。
73.如权利要求64-72中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:28、30、32、34、36和38中的任一个的氨基酸序列至少约90％同一的氨基酸序列的TCRα链。
74.如权利要求64-73中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含TCRα链，所述TCRα链包含SEQ ID NO:28、30、32、34、36和38中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
75.如权利要求74所述的分离的多核苷酸，其中所述编码TCRα链的多核苷酸包含SEQ ID NO:40、42、46、48、50或52中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
76.如权利要求64-75中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含具有与SEQ ID NO:27、29、31、33、35和37中的任一个的氨基酸序列至少约90％同一的氨基酸序列的TCRβ链。
77.如权利要求64-76中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含TCRβ链，所述TCRβ链包含SEQ ID NO:27、29、31、33、35和37中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
78.如权利要求77所述的分离的多核苷酸，其中所述编码TCRβ链的多核苷酸包含SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49或51中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
79.如权利要求64-78中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含：
(a)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(b)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:29的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:30的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(c)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:32的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(d)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:33的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:34的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；
(e)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:35的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:36的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成；或
(f)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成，以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或由所述氨基酸序列组成。
80.如权利要求64-79中任一项所述的分离的多核苷酸，其包含编码自切割肽的多核苷酸，所述多核苷酸设置在编码所述TCRβ链的所述多核苷酸与编码所述TCRα链的所述多核苷酸之间。
81.如权利要求80所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的自切割肽包含SEQ ID NO:
76-84中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
82.如权利要求80或81所述的分离的多核苷酸，其中所述单个开放阅读框包含与SEQ ID NO:59-63中的任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列。
83.如权利要求82所述的分离的多核苷酸，其中所述单个开放阅读框包含SEQ ID NO:
59-63中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
84.如权利要求80-83中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的([TCRβ链、自切割肽、TCRα链])包含SEQ ID NO:53-57中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
85.如权利要求64-84中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白能够特异性结合至HA-1H肽:HLA复合物。
86.如权利要求85所述的分离的多核苷酸，其中所述HLA包含HLA-A*0201。
87.如权利要求64-86中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述HA-1H肽包含氨基酸序列VLHDDLLEA(SEQ ID NO:66)。
88.如权利要求64-87中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含TCR、TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体(CAR)。
89.如权利要求88所述的分离的多核苷酸，其中所述TCR的抗原结合片段包含单链TCR(scTCR)。
90.如权利要求88所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含CAR。
91.如权利要求88所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的结合蛋白包含TCR。
92.如权利要求64-91中任一项所述的分离的多核苷酸，其还包含编码以下的多核苷酸：
(a)安全开关蛋白；
(b)选择标志物；
(c)CD8辅助受体β链；
(d)CD8辅助受体α链；或
(e)其任何组合。
93.如权利要求92所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的安全开关蛋白包含：
(i)截短的EGF受体(tEGFR)；
(ii)iCasp9；
(iii)RQR多肽；
(iv)myc表位；或
(v)其任何组合。
94.如权利要求92或93所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的选择标志物包含：
(i)RQR多肽；
(ii)截短的低亲和力神经生长因子(tNGFR)；
(iii)截短的CD19(tCD19)；
(iv)截短的CD34(tCD34)；或
(v)其任何组合。
95.如权利要求92-94中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的CD8辅助受体包含β链，所述β链包含SEQ ID NO:71-75中的任一个的氨基酸序列。
96.如权利要求92-95中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码的CD8辅助受体为重组CD8辅助受体，其包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的RQR多肽。
97.如权利要求96所述的分离的多核苷酸，其中编码所述RQR多肽的所述多核苷酸被包含在编码所述编码的CD8辅助受体的β链的多核苷酸中。
98.如权利要求96或97所述的分离的多核苷酸，其中编码所述RQR多肽的所述多核苷酸被包含在编码所述编码的CD8辅助受体的α链的多核苷酸中。
99.如权利要求98所述的分离的多核苷酸，其包含编码iCasp9的多核苷酸和编码重组CD8辅助受体蛋白的多核苷酸，所述重组CD8辅助受体蛋白包含含有RQR多肽的β链。
100.如权利要求99所述的分离的多核苷酸，其包含单个开放阅读框，所述单个开放阅读框从5’至3’含有([编码安全开关蛋白的多核苷酸]-[编码自切割肽的多核苷酸]-[所述编码TCRβ链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码TCRα链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码含有RQR多肽的CD8β链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码CD8α链的多核苷酸])。
101.如权利要求100所述的分离的多核苷酸，其中所述单个开放阅读框从5'至3'编码([iCasp9多肽]-[猪捷申病毒2A(P2A)肽]-[TCRβ链]-[P2A肽]-[TCRα链]-[P2A肽]-[包含RQR多肽的CD8β链]-[P2A肽]-[CD8α链])。
102.如权利要求92-101中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述编码TCRβ链的多核苷酸包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列或由其组成，并且其中所述编码TCRα链的多核苷酸包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列或由其组成。
103.一种分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含SEQ ID NO:85的核苷酸序列或由其组成。
104.如权利要求64-103中任一项所述的分离的多核苷酸，其中所述分离的多核苷酸被密码子优化以用于在T细胞中表达。
105.一种转基因构建体，其包含可操作地连接至如权利要求64-104中任一项所述的多核苷酸的表达控制序列。
106.一种转基因构建体，其包含可操作地连接至单个开放阅读框的表达控制序列，所述单个开放阅读框包含：
(a)编码安全开关蛋白的多核苷酸；
(b)编码TCRβ链的多核苷酸；
(c)编码TCRα链的多核苷酸；
(b)编码选择标志物的多核苷酸；
(c)编码CD8辅助受体β链的多核苷酸；以及
(d)编码CD8辅助受体α链的多核苷酸。
107.如权利要求106所述的转基因构建体，其中所述编码的安全开关蛋白包含：
(i)截短的EGF受体(tEGFR)；
(ii)iCasp9；
(iii)RQR多肽；
(iv)myc表位；或
(v)其任何组合。
108.如权利要求106或107所述的转基因构建体，其中所述编码的选择标志物包含：
(i)RQR多肽；
(ii)截短的低亲和力神经生长因子(tNGFR)；
(iii)截短的CD19(tCD19)；
(iv)截短的CD34(tCD34)；或
(v)其任何组合。
109.如权利要求106-108中任一项所述的转基因构建体，其中所述编码的CD8辅助受体为重组CD8辅助受体，其包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的RQR多肽。
110.如权利要求109所述的转基因构建体，其中所述编码的RQR多肽被包含在所述编码的CD8β链或所述编码的CD8α链中。
111.如权利要求110所述的转基因构建体，其中所述单个开放阅读框包含：
(a)编码安全开关蛋白的多核苷酸；
(b)编码TCRβ链的多核苷酸；
(c)编码TCRα链的多核苷酸；
(d)编码含有RQR多肽的CD8β链的多核苷酸；以及
(e)编码CDα链的多核苷酸。
112.如权利要求111所述的转基因构建体，其中所述单个开放阅读框从5'至3'编码([所述编码安全开关蛋白的多核苷酸]-[编码自切割肽的多核苷酸]-[所述编码TCRβ链的多核苷酸]-[所述编码自切割多肽的多核苷酸]-[所述编码TCRα链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[所述编码含有RQR多肽的CD8β链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[所述编码CD8α链的多核苷酸])。
113.如权利要求112所述的转基因构建体，其中所述单个开放阅读框从5'至3'编码([iCasp9多肽]-[P2A肽]-[TCRβ链]-[P2A肽]-[TCRα链]-[P2A肽]-[包含RQR多肽的CD8β链]-[P2A肽]-[CD8α链])。
114.一种载体，其包含如权利要求106-113中任一项所述的转基因构建体。
115.如权利要求114所述的载体，其中所述载体能够将所述转基因构建体递送至宿主细胞。
116.如权利要求115所述的载体，其中所述宿主细胞为造血祖细胞或人免疫系统细胞。
117.如权利要求116所述的载体，其中所述人免疫系统细胞为CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞、树突细胞或其任何组合。
+ +
118.如权利要求117所述的载体，其中所述免疫系统细胞为CD4T细胞或CD8T细胞。
119.如权利要求117所述的载体，其中所述T细胞为天然T细胞、中枢记忆T细胞、效应子记忆T细胞或其任何组合。
120.如权利要求114-119中任一项所述的载体，其中所述载体为病毒载体。
121.根据权利要求120所述的表达载体，其中所述病毒载体为慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体。
特异性用于次要组织相容性(H)抗原HA-1的TCR及其用途
[0002] 与本申请相关的序列表以文本形式提供，以代替纸质副本，并且特此以引用的方式并入到说明书中。包含序列表的文本文件的名称为360056_455WO_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为200KB，创建于2017年9月22日，并且通过EFS-Web电子递交。
[0003] 政府权益声明
[0004] 本发明在美国国立卫生研究院授予的CA154532政府资助下进行。政府对本发明具有一定的权利。
背景技术
[0005] 患有恶性血液病的患者可用异基因造血干细胞移植(HCT)来治疗。在美国，例如在过去的35年里，异基因HCT移植手术稳步上升，其中自2013年起每年有大约8,000例移植(参见CIBMTR 2016概述)。然而，此后可发生恶性血液病复发。目前，大量的接受HCT用于治疗急性白血病的患者复发(单单在美国，每年有大约2,000位患者在HCT后复发，或约25％至50％；参见Sucheston-Campbell等人,Curr.Hematol.Malig.Rep.10:45-58,2015)。在不能达到深度完全缓解和/或在HCT之前不能忍受高强度预处理方案的患者中，复发率尤其地高。针对具有HCT后复发的患者的预后很差：在HCT之后的<100、100-200和>200天复发的患者的两年存活率分别为3％、9％和19％。接受第二HCT的患者可能会有更好的结果，但是为了有资格进行第二HCT，患者必须首先达到缓解，所述缓解通常仅发生在约30％的患者中。
[0006] 在一些情况下，急性白血病复发可用来自原干细胞供体的供体淋巴细胞输注来治疗。然而，供体淋巴细胞输注的这种移植物抗白血病(GVL)效应常常伴随着移植物抗宿主疾病(GVHD)，从而导致严重的死亡率和发病率并且不一定是有效的。如果在不增强对抗正常组织的免疫应答(移植物抗宿主疾病，GVHD)的情况下可选择性地增加GVL，可预防HCT后的复发。
[0007] 某些次要H抗原表达在白血病干细胞和母细胞上(参见，例如Bleakley和R iddell,Nat.Rev.Cancer 4:371-380,2004；Bleakley等人,Blood 115:4923-4933,2010；Bleakley和Riddell,Immunol.Cell.Biol.89:396-407,2011；van der Ha rst等人,Blood
83:1060-1066,1994；Bonnet等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8639-8644,1999；Hambach等人,Leukemia 20:371-374,2006)，并且使用癌症特异性T细胞进行靶向。在具有HCT后复发的患者中的次要H抗原靶向的T细胞免疫疗法的小型临床试验中，在一些患者中观察到临床应答(Warren等人,Blood 115:3869-3878,2010)。在T细胞的遗传修饰方面的技术进步和不断增长的T细胞生物学知识意味着现在可有效制备给予患者的治疗剂量的抗原特异性T细胞，并且在体内持续和发挥强有力的抗肿瘤效应(Heemskerk等人,J.Exp.Med.199:885-
894,2004；Morgan等人,Science 314:126-129,2006；Griffioen等人,Haematologica 93:
1535-131543,2008；Ochi等人,J.Biomed.Biotechnol.2010:5212248,2010；Schmitt等人,Hum.Gene Ther.20:1240-1248,2009；Str omnes等人,Immunol Rev.257:145-164,2014)。
然而，存在对靶向白血病相关抗原的基于细胞的疗法的需要。目前公开的实施方案解决了这些需要并且提供了其他相关优点。
附图说明
83:1060-1066,1994；Bonnet等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:8639-8644,1999；Hambach等人,Leukemia 20:371-374,2006)，并且使用癌症特异性T细胞进行靶向。在具有HCT后复发的患者中的次要H抗原靶向的T细胞免疫疗法的小型临床试验中，在一些患者中观察到临床应答(Warren等人,Blood 115:3869-3878,2010)。在T细胞的遗传修饰方面的技术进步和不断增长的T细胞生物学知识意味着现在可有效制备给予患者的治疗剂量的抗原特异性T细胞，并且在体内持续和发挥强有力的抗肿瘤效应(Heemskerk等人,J.Exp.Med.199:885-
894,2004；Morgan等人,Science 314:126-129,2006；Griffioen等人,Haematologica 93:
1535-131543,2008；Ochi等人,J.Biomed.Biotechnol.2010:5212248,2010；Schmitt等人,Hum.Gene Ther.20:1240-1248,2009；Str omnes等人,Immunol Rev.257:145-164,2014)。
然而，存在对靶向白血病相关抗原的基于细胞的疗法的需要。目前公开的实施方案解决了这些需要并且提供了其他相关优点。
附图说明
[0008] 图1描绘了用于分离和表征本公开的HA-1H特异性T细胞克隆的方法。(图1的左上方)为了分离HA-1H特异性T细胞，用树突细胞(DC)引物接触CD8+细胞并且以微量培养方式扩增，所述树突细胞用HA1H肽(VL DDLLEA；SEQ ID NO:1)脉冲。(左中)在含有IL-12和IL-15的CTL培养基中孵育12天后，在分开的孔的微量细胞毒性测定中评估T细胞的等分试样，其中T2用或不用VLHDDLLEA肽脉冲。(左下)通过有限稀释来克隆对抗T2+VLHDDLLEA特异性反应的细胞，重新评价细胞毒性，并且快速扩增用于进一步评估(8种克隆)。(右上)示出指定的七种(7种)克隆的HA-1H特异性的流式细胞术数据。对HLA-A2-HA-1H葡聚糖聚合体(dextramer)染色(y轴)和CD8(x轴)染色。(右下)来自铬释放测定(CRA)实验的数据，其中在指定滴定下测试指定CTL克隆的51CR标记T2细胞的特异性裂解，所述51CR标记T2细胞用同源肽脉冲。
[0009] 图2A-2C示出了使用图1中所示的方法获得的分离的细胞毒性T细胞克隆的表征。(A)七种(7种)代表性HA-1H特异性克隆(1、2、10、13、4、16和5)以及特异于另一种肿瘤抗原的对照克隆的HLA-A2/HA-1H多聚体和CD8+单克隆抗体染色。(B)来自铬释放测定的数据，其中测试七种HA-1H特异性克隆对HA-1肽脉冲的靶细胞的杀伤。(C)来自细胞毒性测定的数H H H
据，其中HA-1特异性CTL克隆用肽脉冲T2细胞、HA-1 +AML细胞系THP-1、HA-1 +原代AML或HA-1-AML孵育。
据，其中HA-1特异性CTL克隆用肽脉冲T2细胞、HA-1 +AML细胞系THP-1、HA-1 +原代AML或HA-1-AML孵育。
[0010] 图3描绘了本公开的代表性编码HA-1H TCR的慢病毒构建体。
[0011] 图4示出了用于评估转导以表达HA-1TCR的T细胞的程序。
[0012] 图5A-5C示出了HA-1H转导的CD8+T细胞的表达和活性。(A)示出了用TCR2或TCR16转导的T细胞的HA-1H葡聚糖聚合体结合和CD8表达的流式细胞术数据。(B)用TCR2或TCR16转导的CD8+T细胞、以及对应的‘亲本克隆’(即TCR2和TCR16从其中分离的T细胞克隆)和特异于不同抗原对照(SMCY)的对照克隆的杀伤活性。左边：HA-1H脉冲的T2细胞的裂解。右边：用H H不相关SMCY肽脉冲的T2细胞。(C)通过HA-1 TCR2(带圆形的虚线)、HA-1 TCR16(带正方形的虚线)、亲本TCR2克隆(带圆形的实线)、亲本TCR16克隆(带正方形的实线)以及特异于SMCY肽的异源或亲本克隆(图上的下方两条线)对用指定量的HA-1H肽(x轴)脉冲的T2细胞进行的特异性裂解。
[0013] 图6A-6E示出了使用慢病毒载体进行的HA-1H TCR到CD8+T细胞中的转导和活性。(A)示出转导以含有编码HA-1H特异性TCR(确切地，TCR克隆1、2、10、16和5)(所述TCR克隆用慢病毒载体(LV)递送)的多核苷酸，或具有特异于不同次要H抗原(对照)的TCR的CD8+T细胞的HLA-A2/HA-1H多聚体染色的流式细胞术。(B-E)使用铬释放测定(CRA)来评估特异性裂解活性。(B)通过TCR转导的CD8+T细胞(实线和符号-TCR2圆形，TCR16正方形)、HA-1H特异性T细胞克隆(虚线，空心符号-克隆2＝圆形，克隆16＝正方形)或T细胞克隆对照(菱形)对用各种浓度下的HA-1肽抗原脉冲的T2靶细胞进行的裂解。(C)在指定效应子:靶标(E:T)比率下，通过用HA-1H特异性TCR2(圆形)或HA-1H特异性TCR16(正方形)转导的CD8+T细胞对HLA-A2+HA-
1H+LCL进行的裂解。(D)通过HA-1H TCR2转导的CD8+T细胞对HLA-A2+/HA-1+纯合子(H/H)(圆形n＝7)、HLA-A2+/HA1H+杂合子(H/R)(正方形n＝22)、HLA-A2+/HA-1H-(R/R)(三角形n＝17)或HLA-A2阴性(倒三角n＝41)造血细胞(LCL)靶标进行的裂解。(E)通过HA-1H TCR2转导的CD8+T细胞对具有常见HLA等位基因的LCL进行的裂解。除非另外说明，否则使用20:1的E:T比。还用HA-1H TCR16获得了可比得上(D)和(E)所示的数据(未示出)。
1H+LCL进行的裂解。(D)通过HA-1H TCR2转导的CD8+T细胞对HLA-A2+/HA-1+纯合子(H/H)(圆形n＝7)、HLA-A2+/HA1H+杂合子(H/R)(正方形n＝22)、HLA-A2+/HA-1H-(R/R)(三角形n＝17)或HLA-A2阴性(倒三角n＝41)造血细胞(LCL)靶标进行的裂解。(E)通过HA-1H TCR2转导的CD8+T细胞对具有常见HLA等位基因的LCL进行的裂解。除非另外说明，否则使用20:1的E:T比。还用HA-1H TCR16获得了可比得上(D)和(E)所示的数据(未示出)。
[0014] 图7提供了来自细胞毒性实验的数据，其中内源性地表达HA-1(HA-1H+LCL(H/H或H/R)和HA-1H-LCL(R/R)的靶细胞用TCR2转导细胞或用‘亲本’克隆2细胞孵育。还示出了特异于Y染色体相关次要H抗原(FIDSYICQV)的对照克隆。
[0015] 图8A-8E示出了通过HA-1H-TCR2转导的CD8+T细胞对HA-1+白血病细胞进行的特异H + H性杀伤。(A)CD107a在HA-1 -TCR2转导的CD8T细胞上的HA-1 特异性表达，示出了在用一组原代AML样品5h共同培养(1:1)之后的脱粒。(B-E)示出了通过HA-1TCR转导的CD8+T细胞对白血病和淋巴瘤靶标进行的裂解的CRA；(B)通过HA-1HTCR转导的CD8+T细胞(深灰色条棒)和HA-1H特异性T细胞克隆2(浅灰色条棒)对原代HA-1H+AML或HA-1-AML进行的裂解；(C)在各种+ H+
E:T比下的HLA-A2/HA-1 原代AML(AML1)；(D)B-ALL系(1)BALL-1、(2)RS4；11、T-ALL系(1)MOLT4、(2)CEM(3)RPMI-8402(4)HSB-2和AML系NB-4；(E)T细胞淋巴瘤(SUP-M2HLA-A2+、HA-1+；SU-DHL-1HLA-A2+HA-1-)细胞系。在(D)中，如果WT为HLA-A2-或具有HA-1H-基因型，HLA-A2-和/或HA-1H-(WT)细胞系用编码*HLA-A2或**HLA-A2和HA-1H小基因的LV来转导(TD)。除非另外说明，否则使用20:1的E:T比。
E:T比下的HLA-A2/HA-1 原代AML(AML1)；(D)B-ALL系(1)BALL-1、(2)RS4；11、T-ALL系(1)MOLT4、(2)CEM(3)RPMI-8402(4)HSB-2和AML系NB-4；(E)T细胞淋巴瘤(SUP-M2HLA-A2+、HA-1+；SU-DHL-1HLA-A2+HA-1-)细胞系。在(D)中，如果WT为HLA-A2-或具有HA-1H-基因型，HLA-A2-和/或HA-1H-(WT)细胞系用编码*HLA-A2或**HLA-A2和HA-1H小基因的LV来转导(TD)。除非另外说明，否则使用20:1的E:T比。
[0016] 图9A和9B示出了用对抗HA-1H+或HA-1H-原代白血病细胞的TCR2或TCR16(以及对应的亲本克隆)转导的T细胞的细胞毒性。9A：指定细胞系的特异性裂解(4h CRA)。9B：在指定效应子:靶标比率下靶细胞的特异性裂解。
[0017] 图10示出了来自细胞毒性测定的数据，其中在具有或不具有成纤维细胞暴露于干扰素γ(IFNγ)的情况下，用HA-1H基因型阳性的皮肤成纤维细胞孵育TCR2转导和TCR16转导的细胞(以及亲本克隆)。
[0018] 图11A-11C示出了用HA-1H TCR2和CD8辅助受体变体转导的CD4+T细胞的表征。(A)(i,ii)用所指示的CD8α和/或βM1-M5链转导的CD4+T细胞的HA-1H/HLA-A2多聚体染色的平均荧光强度(MFI)。(iii)各种CD8辅助受体构建体的MFI概括在图中。(B)示出了通过HA-1H特异性CD8+T细胞(实心圆形)，用CD8α和β链(正方形、菱形、向下的三角形)、单独CD8α链(向上的三角形)、或仅HA-1H TCR(空心圆形)转导的CD4+T细胞对用各种浓度下的HA-1H肽脉冲的T2进行的裂解的CRA。(C)示出响应于用HLA-A2+HA-1H+LCL、HA-1H-LCL或仅培养基进行的刺激，在(自上而下)用单独HA-1H TCR、用CD8α链、CD8α和βM1链、或CD8α和βM4链转导的CD4+T细胞中通过细胞分裂来稀释羧基荧光素(CFSE)染料的增殖测定。
[0019] 图12A和12B示出了用HA-1H-TCR2和CD8辅助受体转导的CD4+T细胞的进一步功能表征。(A)示出响应于HLA-A2+/HA-1H+AML或HLA-A2+/HA-1H-AML，通过用HA-1HTCR2LV(上图)或H + +HA-1 TCR2-CD8辅助受体LV(下图)转导的CD8T细胞(左)和CD4 T细胞(右)进行的IL-2和IFN-γ产生的细胞内细胞因子测定；(B)示出响应于HLA-A2+/HA-1H+原代AML、HLA-A2+/HA-
1H-AML或培养基对照，用HA-1H特异性TCR2LV(上图)或HA-1HTCR2-CD8辅助受体LV(下图)转导的CD8+T细胞(左)和CD4+T细胞(右)的增殖的CFSE测定。
1H-AML或培养基对照，用HA-1H特异性TCR2LV(上图)或HA-1HTCR2-CD8辅助受体LV(下图)转导的CD8+T细胞(左)和CD4+T细胞(右)的增殖的CFSE测定。
[0021] 图14提供了来自细胞毒性测定的数据，其中用表达安全开关基因的转基因构建体和HA-1H特异性TCR2转导(或用单独TCR2转导)原代T细胞，并且用HA-1H肽脉冲的T2细胞孵育。
[0022] 图15示出了在存在或不存在激活编码安全开关的“自杀药物”情况下的转导TCR的存活百分比。
[0023] 图16示出了在暴露于指定浓度下的同源安全开关激活药物之后的用HA-1H TCR2加上安全基因转导的CD8+T细胞的存活率。在用指定浓度的各自安全开关激活药物：AP1903；抗EGFR mAb(西妥昔单抗)+补体；抗CD20Mab(利妥昔单抗)+补体；抗myc mAb+补体+
孵育24小时之后，测量iCasp9-TCR2、tEGFR-TCR2、RQR8-TCR2和Myc-TCR2CD8 转导的T细胞的存活率。通过流式细胞术定量剩余的HA-1TCR2转导T细胞。箭头指示人体内可达到并且耐受的药物浓度。
孵育24小时之后，测量iCasp9-TCR2、tEGFR-TCR2、RQR8-TCR2和Myc-TCR2CD8 转导的T细胞的存活率。通过流式细胞术定量剩余的HA-1TCR2转导T细胞。箭头指示人体内可达到并且耐受的药物浓度。
[0024] 图17示出了用于评估iCasp 9-HA-1H TCR-CD8+表达构建体的五种(5种)不同类型的构建体：(i)iCasp 9和TCR2；(ii)TCR 2和CD8辅助受体；(iii)iCasp 9、TCR 2和CD8辅助受体；(iv)iCasp 9、TCR 2和CD8辅助受体，其中在CD8辅助受体上具有RQR标签；以及(v)iCasp 9、TCR 2和CD8辅助受体，其中在TCR的α链上具有Q(CD34)标签。
[0025] 图18描绘了用于评估本公开的TCR转导细胞的流程图。
[0026] 图19提供了示出在用HA-1葡聚糖聚合体富集之前(顶上一行)和之后(底下一行)的每个指定转基因构建体中的工程化TCR的表达的流式细胞术。
[0027] 图20A和20B示出了通过用转基因构建体：iCasp-9-TCR(--；第一条棒)；TCR和CD8辅助受体(-▲-；第二条棒)；iCasp-9-TCR-CD8辅助受体(-◆-；第三条棒)；iCasp9-TCR-RQR-CD8辅助受体(-■-；第四条棒)；以及iCas9-CD34tag-TCR-CD8辅助受体(-●-；第五条棒)转导的T细胞对肽脉冲的靶细胞(20A)和LCL系(20B)进行的特异性裂解。
[0028] 图21示出了在用HA-1H+(上方)或HA-1H-(下方)细胞系刺激之后，通过用指定转基因构建体转导的T细胞进行的细胞因子加工(cytokine elaboration)。
[0029] 图22示出了针对指定靶细胞系，用转基因构建体(上方)转导的T细胞的细胞裂解活性(下方)。
[0030] 图23示出了在存在或不存在干扰素-γ的情况下，针对指定非造血细胞用指定转基因构建体转导的T细胞的细胞裂解活性的缺失。HA-1H+造血对照细胞被T细胞杀伤。
[0031] 图24示出了当暴露于原代白血病细胞时，通过用指定转基因构建体转导的细胞进行的细胞因子加工。
[0032] 图25提供了示出当用HA-1H+原代白血病细胞刺激时转导T细胞的增殖的流式细胞术直方图。上方：用于通过使用CFSE染色F1细胞来测量增殖的图解(左)，以及来自用本公开的转基因构建体转导的T细胞的代表性增殖数据。下方：用指定转基因构建体转导的T细胞的增殖。
[0033] 图26示出了(上方)在引入指定浓度下的同源自杀药物之后，所示的用转基因构建体转导的T细胞的存活率(下方)。
[0034] 图27示出了针对本公开的工程化T细胞的富集图解。用指定转基因构建体转导T细胞(上方)，并且检查表达(中部)。使用具有抗CD34抗体的磁珠来选择表达可选择转导标志物(CD34表位；两个最右边散点图)的细胞。
[0035] 图28A和28B提供了示出在磁性选择之前(顶上一行)和之后(底下一行)的转导T细胞的频率的流式细胞术数据(28A)。左边的四个散点图：染色CD34选择标志物和CD8。右边的四个散点图：染色HA-1H葡聚糖聚合体和CD8。还示出了(28B)在选择之前和之后的表达CD34选择标志物(左)或特异于HA-1H(右)的细胞的细胞计数。
[0036] 图29提供了示出本公开的TCR-安全基因构建体的各种功能的示意图。
[0037] 图30提供了编码本公开的示例性iC9-HA-1H-TCR-RQR-CD8构建体的慢病毒递送载体的图。
[0038] 图31示出了用本公开的TCR2-CD8转基因构建体转导的CD8+和CD4+细胞的功能表H征。左图：示出响应于HA-1 肽抗原的细胞因子释放(IL-2；IFN-γ)的流式细胞术数据。中图：流式细胞术数据的定量。右图：响应于HA-1H的转导细胞的增殖。
[0039] 图32A-32E示出了用(HA-1H特异性TCR)-(RQR)-(CD8)转导并且扩增到临床规模的CD4+和CD8+T细胞的表征。(A)转导T细胞的生长。(B)通过用HA-1/HLA-A2多聚体染色的流式H细胞术而进行的在转导T细胞上的HA-1 TCR多聚体结合和CD34表达。(C)在CD45RA耗尽和在转导与扩增之后，在血浆分离置换法时共刺激和归巢分子在T细胞上的表达(N＝5)。(D,E)在最终细胞产物(N＝3)(D)和代表性实例(E)中，‘耗竭’标志物在HA-1H TCR CD8+和CD4+上的表达。
[0040] 图33A-E示出了来自功能识别测定的数据，其中临床规模HA-1H-TCR2-RQR-CD8转导的T细胞用靶细胞孵育。(A)通过在ET比为20:1下的CRA中的CD8+(实线)和CD4+T细胞(虚线)，对用一系列VLH(实线，深灰色)和VLR(实线，浅灰色)肽浓度脉冲的靶T2细胞进行的裂解。(B)通过CRA中的CD8+(实线)对HA-1H+A2+LCL、HA-1H--A2+LCL和AML HA-1H+A2+细胞系(THP-1)进行的裂解(C)响应于通过用10ng/ml的HA-1肽脉冲的T2细胞进行的刺激，由T细胞进行的IL-2、IFN-γ和TNFα产生。(D)展示出由T细胞分泌的细胞因子类型数目的饼图。(E)如通过多重免疫测定所测量，在通过用VLH或VLR肽脉冲的T2细胞进行的T细胞刺激之后24小时，在培养基中的细胞因子和颗粒酶B的浓度。
[0041] 图34A示出了(A)在通过CD34免疫磁珠进行的富集之前和之后，在最终产物中在T细胞上的CD34(左图)和HA-1H TCR(右图)表达(N＝3)。图34B示出了在用5ng/ml AP1903或仅培养基对照孵育24小时之后，在细胞产物中的T细胞的存活率。
[0042] 图35示出了针对用指定浓度下的HA-1H抗原脉冲的T2细胞，用本公开的另一种HA-1H TCR转导的T细胞(圆形)和对照细胞(三角形)的细胞裂解活性。
具体实施方式
[0043] 在一些方面，本公开提供了用于治疗特征在于表达次要组织相容性抗原HA-1H的过度增殖疾病的组合物和方法。考虑到背景因素，通常使用人白细胞抗原(HLA)测试来使器官、细胞和组织移植物受体与相容供体匹配。HLA测试鉴定人经遗传而得的主要HLA基因和存在于其细胞表面上的对应抗原或蛋白质。这些抗原帮助身体免疫系统区分哪些细胞为“自身的”，哪些为“外来的”或“非自身的”。识别为“非自身的”任何细胞可引发免疫应答，诸如T细胞介导的细胞毒性或抗体产生。值得注意的是，主要HLA基因的测试并不鉴定引起另外抗原的次要HLA基因。因此，甚至“HLA匹配的”供体细胞也可攻击表达认为“外来的”次要HLA蛋白或肽的健康受体细胞。表达在上皮组织上的次要H抗原为导致移植物抗宿主疾病的同种异体反应性T细胞的靶标。然而，一些次要H抗原与主要或完全在造血系统中表达的基因相关，包括可受恶性血液病影响的造血细胞。因此，具有限制性表达的次要H抗原为用于寻求增强移植物抗白血病效应并且从而预防复发的疗法的潜在靶标。
[0044] 次要组织相容性抗原HA-1H由聚合的HMHA1基因(又称为Rho GTP酶激活蛋白45)编码，并且高度表达在白血病细胞和正常造血细胞中(参见，例如Griffioen等人,Front.Immunol.7:100,2016；Spierings等人Biol.Blood Marrow Transpl.19:1244-1253,
2013，所述参考文献的HA-1表达公开内容以引用的方式并入本文)，但是未表达在正常非造血细胞中。存在于52％的个体中的HMHA1变体(rs1801284A/A或A/G)产生免疫原性肽，所述免疫原性肽含有组氨酸残基以代替精氨酸(VL DDLLEA；SEQ ID NO:66)(R139H多态性)，并且这种肽的HLA呈递发生在具有常见HLA-A*0201(A2)等位基因的个体中(den Haan等人,Science 279:1054-1057,1998)。因此，靶向HA-1H的T细胞疗法适用于大约25％的为了恶性H R
血液病而移植的受试者，并且要求HLA-A2阴性或HA-1 阴性的T细胞供体(“HA-1 ”；
rs1801284G/G-VL DDLLEA；SEQ ID NO:65)。
2013，所述参考文献的HA-1表达公开内容以引用的方式并入本文)，但是未表达在正常非造血细胞中。存在于52％的个体中的HMHA1变体(rs1801284A/A或A/G)产生免疫原性肽，所述免疫原性肽含有组氨酸残基以代替精氨酸(VL DDLLEA；SEQ ID NO:66)(R139H多态性)，并且这种肽的HLA呈递发生在具有常见HLA-A*0201(A2)等位基因的个体中(den Haan等人,Science 279:1054-1057,1998)。因此，靶向HA-1H的T细胞疗法适用于大约25％的为了恶性H R
血液病而移植的受试者，并且要求HLA-A2阴性或HA-1 阴性的T细胞供体(“HA-1 ”；
rs1801284G/G-VL DDLLEA；SEQ ID NO:65)。
[0045] 在一些方面，本公开提供了表达特异于HA-1H的结合蛋白诸如TCR和CAR的工程化免疫细胞。此类工程化免疫细胞可用作独立疗法来治疗恶性血液病或预防其复发或再现，或此类细胞可用作包括另外疗法或试剂的治疗方案的一部分(例如，在同种异体HCT之后、或与同种异体HCT组合)。
[0046] 在更详细地阐述本公开之前，提供待在本文中使用的某些术语的定义可帮助理解本公开。贯穿本公开阐述另外的定义。
[0047] 在本说明书中，除非另外指出，否则任何的浓度范围、百分数范围、比率范围或整数范围应被理解为包括所述范围内的任何整数值，并且当适当时包括其分数(诸如整数的十分之一和百分之一)。同样，除非另外指出，否则关于任何物理特征诸如聚合物亚基、大小或厚度在本文所述的任何数量范围应被理解为包括所述范围内的任何整数。如本文所使用，除非另外指出，否则术语“约”意指指定范围、值或结构的±20％。应当理解本文所使用的术语“一个/种(a/an)”是指枚举组分的“一种或多种”。替代方案的使用(例如，“或”)应当被理解为意指替代方案的一种、两种或其任何组合。如本文所使用，术语“包括”、“具有”和“包含”可同义使用，所述术语及其变体意图被解释为非限制性的。
[0048] 另外，应当理解的是，源自本文描述的结构和取代物的各种组合的单独化合物、或化合物的组通过本申请来公开，达到好像每种化合物或化合物的组被单独地阐述的相同程度。因此，具体结构或具体取代物的选择处于本公开的范围内。
[0049] 术语“基本上由......组成”不等同于“包含”并且是指权利要求的规定材料或步骤，或是指不实质影响要求权利的主题的基本特征的那些。例如，蛋白质域、区或模块(例如，结合域、铰链区、接头模块)或蛋白质(所述蛋白质可具有一个或多个域、区或模块)“基本上由”具体氨基酸序列组成，当域、区、模块或蛋白质的氨基酸序列包括扩展、缺失、突变或其组合(例如，在氨基末端或羧基末端处或在域之间的氨基酸)时，结合起来促成域、区、模块或蛋白质长度的至多20％(例如，至多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)，并且基本上不影响(即，不会使活性降低大于50％，诸如不大于40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)域、区、模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白的靶标结合亲和力)。
[0050] 如本文所使用，“免疫系统细胞”意指起源于骨髓中的造血干细胞的免疫系统的任何细胞，其产生两个主要谱系：髓样祖细胞(其产生髓样细胞诸如单核细胞、巨噬细胞、树突细胞、巨核细胞以及粒细胞)和淋巴样祖细胞(其产生淋巴样细胞诸如T细胞、B细胞和自然杀伤(NK)细胞)。示例性免疫系统细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、调节性T细胞、自然杀伤细胞以及树突细胞。巨噬细胞和树突细胞可被称为“抗原呈递细胞”或“APC”，其作为可在复合有肽的APC表面上的主要组织相容性复合物(MHC)受体与T细胞表面上的TCR相互作用时激活T细胞的专门细胞。
[0051] “T细胞”或“T淋巴细胞”为在胸腺中成熟并且产生T细胞受体(TCR)的免疫系统细胞。T细胞可为天然的(“TN”；未暴露于抗体；与TCM(本文描述)相比，CD62L、CCR7、CD28、CD3、CD127和CD45RA的表达增加，并且CD45RO的表达减少或不表达)记忆T细胞(TM)(抗原刺激过的和寿命长的)和效应子细胞(抗原刺激过的、细胞毒性的)。TM可进一步分成中央记忆T细胞(TCM，表达CD62L、CCR7、CD28、CD45RO)和效应子记忆T细胞(TEM，表达CD45RO，CD62L、CCR7和CD28的表达减少)的子集。效应子T细胞(TE)是指抗原刺激过的CD8+细胞毒性T淋巴细胞，其表达CD45RA，与TCM相比具有CD62L、CCR7和CD28的表达减少，并且对于颗粒酶和穿孔素为阳性的。辅助性T细胞(TH)为通过释放细胞因子影响其他免疫细胞活性的CD4+细胞。CD4+T细胞可激活并且抑制适应性免疫应答，并且诱导这两种功能中的哪一种将取决于其他细胞和信号的存在。可使用已知技术收集T细胞，并且各种亚群或其组合可通过已知技术来富集或耗尽，诸如通过亲和力结合至抗体、流式细胞术或免疫磁性选择。其他示例性T细胞包括调节性T细胞，诸如CD4+CD25+(Foxp3+)调节性T细胞和Treg17细胞，以及Tr1、Th3、CD8+CD28-和Qa-1限制性T细胞。
[0052] “T细胞受体”(TCR)是指能够特异性结合至与MHC受体结合的抗原肽的免疫球蛋白超家族成员(其具有可变结合域、恒定域、跨膜区和短胞质尾；参见，例如Janeway等人,Immunobiology:The Immune System in Health and Disease,第3版,Current Biology Publications,第433页,1997)。TCR可发现在细胞的表面上或以可溶的形式，并且通常包含具有α和β链(分别又称为TCRα和TCRβ)、或γ和δ链(分别又称为TCRγ和TCRδ)的异源二聚体。
[0053] 像其他免疫球蛋白(例如，抗体)一样，TCR链的细胞外部分(例如，α链、β链)含有两个免疫球蛋白域，可变域(例如，α链可变域或Vα链可变域或Vβ；通常基于Kabat编号(Kabat等人,"Sequences of Proteins of Immunological Interest,US Dept.Health and Human Services,Public Health Service National Institutes of Health,1991,第5版)在N-末端处的氨基酸1至116)和以及邻近细胞膜的一个恒定域(例如，α链恒定域或Cα，通常基于Kabat的5个氨基酸117至259；β链恒定域或Cβ，通常基于Kabat的氨基酸117至295)。同样，像免疫球蛋白一样，可变域含有通过框架区(FR)分开的互补决定区(CDR)(参见，例如Jores等人,Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 87:9138,1990；Chothia等人,EMBO J.7:
3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。
3745,1988；还参见Lefranc等人,Dev.Comp.Immunol.27:55,2003)。
[0054] 如本文所使用的“抗原”或“Ag”是指激起免疫应答的免疫原性分子。这种免疫应答可涉及抗体产生、特异性免疫感受态细胞(例如，T细胞)激活或两者。抗原(免疫原性分子)可例如为肽、糖肽、多肽、糖聚肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见的是，抗原可被合成、重组产生、或源自生物样品。可含有一种或多种抗原的示例性生物样品包括组织样品、肿瘤样品、细胞、生物流体或其组合。可通过已被修饰或基因工程化以表达抗原的细胞或内源性地(例如，在没有通过人为干预进行修饰或基因工程化的情况下)表达免疫原性突变或多态性的细胞来产生抗原。
[0055] “主要组织相容性复合物”(MHC)是指将肽抗原递送至所有有核细胞的细胞表面的糖蛋白。I类MHC分子为具有跨膜α链(具有三个α域)和非共价缔合β2微球蛋白的异源二聚体。II类MHC分子包含两个跨膜糖蛋白α和β，所述α和β这两者均跨越膜。每条链具有两个域。I类MHC分子将起源于细胞溶质的肽递送至细胞表面，其中肽:MHC复合物被CD8+T细胞识别。
II类MHC分子将起源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中它们被CD4+T细胞识别。人MHC被称为人白细胞抗原(HLA)。
II类MHC分子将起源于囊泡系统的肽递送至细胞表面，其中它们被CD4+T细胞识别。人MHC被称为人白细胞抗原(HLA)。
[0056] 术语“表位”或“抗原表位”包括被同源结合分子诸如免疫球蛋白、T细胞受体(TCR)、嵌合抗原受体或其他结合分子、域或蛋白质识别并且特异性结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇。表位决定簇通常含有分子的化学活性表面组群，诸如氨基酸或糖侧链，并且可具有特定的三维结构特征，以及特定的电荷特征。
[0057] 如本文所使用的“特异性结合”或“特异于”是指结合蛋白(例如，TCR受体)或结合域(或其融合蛋白)以等于或大于105M-1(其等于这个缔合反应的缔合速率(on-rate)[kon]与解离速率(off-rate)[koff]的比率)的亲和力或Ka(即，以1/M为单位的具体结合相互作用的平衡缔合常数)缔合或联合至靶分子，而不显著地与样品中的任何其他分子或组分缔合或联合。结合蛋白或结合域(或其融合蛋白)可被分类为“高亲和力”结合蛋白或结合域(或其融合蛋白)或“低亲和力”结合蛋白或结合域(或其融合蛋白)。“高亲和力”结合蛋白或结合域是指Ka为至少107M-1、至少108M-1、至少109M-1、至少1010M-1、至少1011M-1、至少1012M-1或至少1013M-1的那些结合蛋白或结合域。“低亲和力”结合蛋白或结合域是指Ka高达107M-1、高达
106M-1、高达105M-1的那些结合蛋白或结合域。可替代地，亲和力可被定义为以M为单位的具体结合相互作用的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M至10-13M)。
106M-1、高达105M-1的那些结合蛋白或结合域。可替代地，亲和力可被定义为以M为单位的具体结合相互作用的平衡解离常数(Kd)(例如，10-5M至10-13M)。
[0058] 在某些实施方案中，受体或结合域可具有“增强的亲和力”，其是指比野生型(或亲本)结合域具有与靶抗原的更强结合的选择的或工程化的受体或结合域。例如，增强的亲和力可能是由于比野生型结合域更高的靶抗原Ka(平衡缔合常数)引起，由于比野生型结合域的解离常数更低的靶抗原Kd(解离常数)引起，由于比野生型结合域的解离速率更低的靶抗原解离速率(koff)引起，或其组合。在某些实施方案中，增强亲和力的TCR可被密码子优化以增强在具体宿主细胞中的表达，诸如免疫系统的细胞、造血干细胞、T细胞、原代T细胞、T细胞系、NK细胞、或自然杀伤T细胞(Scholten等人,Clin.Immunol.119:135,2006)。T细胞可为CD4+或CD8+T细胞。
[0059] 已知各种测定用于鉴定特异性结合具体靶标的本公开的结合域，以及确定结合域或融合蛋白亲和力，诸如多聚体/四聚体染色、蛋白质印迹、ELISA、分析型超速离心、光谱法以及表面等离子体共振 分析(参见，例如Dolton等人,Immunology 146:11-22,2015；Scatchard等人,Ann.NY Acad.Sci.51:660,1949；Wilson,Science 20295:2103,
2002；Wolff等人,Cancer Res.53:2560,1993；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或等效物；所有参考文献均以引用的方式并入本文)。
2002；Wolff等人,Cancer Res.53:2560,1993；以及美国专利号5,283,173、5,468,614或等效物；所有参考文献均以引用的方式并入本文)。
[0061] 如本文所使用，术语“CD8辅助受体”或“CD8”意指呈α-α同源二聚体或α-β异源二聚体形式的细胞表面糖蛋白CD8。CD8辅助受体有助于细胞毒性T细胞(CD8+)的功能，并且经由其胞质酪氨酸磷酸化途径通过信号传导来起作用(Gao和Jakobsen,Immunol.Today 21:630-636,2000；Cole和Gao,Cell.Mol.Immunol.1:81-88,2004)。存在五种(5种)不同的CD8β链(参见UniProtKB标识符P10966)和单个CD8α链(参见UniProtKB标识符P01732)。
[0062] “CD4”为帮助TCR与抗原呈递细胞通信的免疫球蛋白辅助受体糖蛋白(参见Campbell&Reece,Biology 909(Benjamin Cummings,第六版,2002))。CD4发现在免疫细胞诸如辅助性T细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的表面上，并且包括在细胞表面处表达的四个免疫球蛋白域(D1至D4)。在抗原呈递过程中，CD4连同TCR复合物被募集以结合至MHCII分子的不同区(CD4结合MHCIIβ2，而TCR复合物结合MHCIIα1/β1)。不希望受理论约束，相信靠近TCR复合物将允许CD4相关激酶分子磷酸化存在于CD3的胞质域上的免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。这种活性被认为扩大了由激活TCR生成的信号，以便产生各种类型的辅助性T细胞。
[0063] 在某些实施方案中，TCR发现在T细胞(或T淋巴细胞)的表面上并且与CD3复合物缔合。“CD3”为与T细胞中信号传导的抗原缔合的六链多蛋白复合物(参见，Abbas和Lichtman,2003；Janeway等人,第172和178页,1999)。在哺乳动物中，所述复合物包含CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链、以及CD3ζ链的同源二聚体。CD3γ、CD3β和CD3ε链为含有单个免疫球蛋白域的免疫球蛋白超家族的高度相关细胞表面蛋白。CD3γ、CD3β和CD3ε链的跨膜区为带负电荷的，其为允许这些链与带正电荷的T细胞受体链缔合的特性。CD3γ、CD3β和CD3ε链的细胞内尾各自含有单个保守基序，所述保守基序被称为基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM，然而每条CD3ζ链具有三个。不希望受理论约束，相信ITAM对TCR复合物的信号传导能力是重要的。本公开所使用的CD3可来自各种动物种类，包括人、小鼠、大鼠或其他哺乳动物。
[0064] 如本文所使用，“TCR复合物”是指由CD3与TCR的缔合形成的复合物。例如，TCR复合物可包含CD3γ链、CD3β链、两条CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRα链以及TCRβ链。可替代地，TCR复合物可包含CD3γ链、CD3β链、两条CD3ε链、CD3ζ链的同源二聚体、TCRγ链以及TCRβ链。
[0065] 如本文所使用的“TCR复合物的组分”是指TCR链(即，TCRα、TCRβ、TCRγ或TCRδ)、CD3链(即，CD3γ、CD3δ、CD3ε或CD3ζ)、或由两条或更多条TCR链或CD3链形成的复合物(例如，TCRα和TCRβ的复合物、TCRγ和TCRδ的复合物、CD3ε和CD3δ的复合物、CD3γ和CD3ε的复合物、或TCRα、TCRβ、CD3γ、CD3δ和两条CD3ε链的亚TCR复合物)。
[0066] 如本文所使用，术语“HA-1H抗原”或“HA-1H肽抗原”或“含HA-1H肽抗原”(或“次要HA-1H抗原”或“次要HA-1H肽抗原”或“次要含HA-1H肽抗原”或“次要组织相容性HA-1H抗原肽”)是指长度在约7个氨基酸、约8个氨基酸、约9个氨基酸、约10个氨基酸、高达约20个氨基酸范围内并且包含R139H取代多态性的HMHA1蛋白的天然或合成产生的肽部分，其可与MHCH(例如，HLA)分子形成复合物，并且特异于HA-1 肽:MHC(例如，HLA)复合物的本公开的结合蛋白可特异性结合所述复合物。示例性HA-1H HA-1肽抗原包含具有氨基酸VLHDDLLEA(SEQ ID NO:66)的肽，其中序列中的粗体组氨酸表示R139H多态性。
[0067] 如本文所使用的术语“HA-1H特异性结合蛋白”是指特异性结合HA-1H肽抗原(或例H如细胞表面上的HA-1 肽抗原:HLA复合物)的蛋白质或多肽，诸如TCR或CAR，并且不结合不含有HA-1H多态性(例如，包含在SEQ ID NO:65中所示的氨基酸序列的肽)的HMHA肽，不结合含有此种HMHA肽的HLA复合物。
[0068] 在某些实施方案中，HA-1H特异性结合蛋白特异性结合含HA-1的肽(或HA-1H肽:HLA复合物)，其中Kd为小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M、小于约10-12M、或小于约10-13M，或其中亲和力约相同于、至少约相同于、或大于或大约为例如通过相同测定所测量的，本文提供的示例性HA-1H特异性结合蛋白(诸如本文提供的任何HA-1H特异性TCR)表现出的亲和力。在某些实施方案中，HA-1特异性结合蛋白包含HA-1特异性免疫球蛋白超家族结合蛋白或其结合部分。
[0069] 通过抗原呈递细胞(APC)(诸如树突细胞、巨噬细胞、淋巴细胞或其他细胞类型)进行的抗原处理、以及通过APC至T细胞的抗原呈递，包括免疫相容性(例如，共享至少一个与抗原呈递相关的MHC基因的等位基因形式)APC与T细胞之间的主要组织相容性复合物(MHC)限制性呈递的原理已被完全确定(参见，例如Murphy,Janeway’s Immunobiology(第8版)2011Garland Science,NY；第6、9和16章)。例如，起源于胞质的经过处理的抗原肽(例如，肿瘤抗原、细胞内病原体)的长度通常为约7个氨基酸至约11个氨基酸并且将与I类MHC(HLA)分子缔合，而在囊泡系统(例如，细菌、病毒)中处理的肽的长度将在约10个氨基酸至约25个氨基酸之间变化并且与II类MHC(HLA)分子缔合。
[0070] “改变的域”或“改变的蛋白”是指具有与野生型基序、区、域、肽、多肽或蛋白质(例如，野生型TCRα链、TCRβ链、TCRα恒定域、TCRβ恒定域)至少85％(例如，86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、
99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)不相同的序列同一性的基序、区、域、肽、多肽或蛋白质。
99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％)不相同的序列同一性的基序、区、域、肽、多肽或蛋白质。
[0071] 改变的域或改变的蛋白质或衍生物可包括基于所有可能的相同氨基酸密码子选择和基于保守性氨基酸取代的密码子选择的那些。例如，以下六组各自包含彼此为保守性取代的氨基酸：1)丙氨(ala；A)、丝氨酸(ser；S)、苏氨(thr；T)；2)天冬氨酸(asp；D)、谷氨酸(glu；E)；3)天冬酰胺(asn；N)、谷氨酰胺(gln；Q)；4)精氨酸(arg；R)、赖氨酸(lys；K)；5)异亮氨酸(ile；I)、亮氨酸(L)、甲硫氨酸(met；M)、缬氨酸(val；V)、以及6)苯丙氨酸(phe；F)、酪氨酸(tyr；Y)、色氨酸(trp；W)。(还参见WO97/09433的第10页；Lehninger,Biochemistry,第2版,Worth Publishers,Inc.,NY,NY,第71-77,1975；Lewin Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA,第8页,1990；Creighton，Proteins，W.H.Freeman and Company 1984)。另外，改变、添加或缺失编码序列中的单个氨基酸或少量氨基酸的各个取代、缺失或添加也是“保守性取代”。
[0072] 如本文所使用，“核酸”或“核酸分子”是指例如通过聚合酶链反应(PCR)或通过体外翻译生成的任何脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、多核苷酸、其片段，并且还指由任何连接、断裂、核酸内切酶作用或核酸外切酶作用生成的片段。在某些实施方案中，本公开的核酸通过PCR产生。核酸可包含天然存在的核苷酸(诸如脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸)的单体、天然存在的核苷酸(例如，天然存在的核苷酸的α-对映体形式)的类似物或两者的组合。修饰的核苷酸可具有糖部分或嘧啶或嘌呤碱基部分的修饰或置换。核酸单体可通过磷酸二酯键或此种键的类似物连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、二硒代磷酸酯、硫代苯胺基磷酸酯(phosphoroanilothioate)、苯胺基磷酸酯，氨基磷酸酯、氨基磷酸酯等。核酸分子可为单链或双链的。
[0073] 术语“分离的”意指将材料从其原始环境(例如，如果它是天然存在的，则为自然环境)中除去。例如，存在于活的动物中的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但是与天然系统中的一些或全部共存材料分开的同一核酸或多肽是分离的。这种核酸可为载体的一部分和/或这种核酸或多肽可为组合物(例如，细胞裂解产物)的一部分并且仍然是分离的，因为这种载体或组合物不是核酸或多肽自然环境的一部分。术语“基因”意指涉及产生多肽链的DNA区段；它包括编码区之前和之后的区域(“前导区和尾区”)以及各个编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0074] 如本文所使用，术语“重组”和“工程化”是指通过引入外源核酸分子而被修饰的细胞、微生物、核酸分子、多肽、蛋白质、质粒或载体，或是指通过人为干预—即通过引入异源核酸分子进行修饰而被基因工程化的细胞或微生物，或是指已经改变以使得内源核酸分子或基因的表达被控制、解除调控或成为组成型的细胞或微生物，其中此类改变或修改可通过基因工程化来引入。人生成的基因改变可包括例如引入编码一种或多种蛋白质或酶的核酸分子(其可包括表达控制元件，诸如启动子)的修饰，或其他核酸分子添加、缺失、取代、或其他细胞遗传物质的功能破坏或添加。示例性修饰包括来自参考或亲本分子的异源或同源多肽的编码区或其功能片段中的那些。
[0075] 如本文所使用，“突变”是指分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比核酸分子或多肽分子的序列中的变化。突变可导致序列中的若干种不同类型的变化，包括核苷酸或氨基酸的取代、插入或缺失。在某些实施方案中，突变为一个或三个密码子或氨基酸的取代，一个至约5个密码子或氨基酸的缺失，或其组合。
[0076] “保守性取代”在本领域中被认为是用一种氨基酸取代具有相似性质的另一种氨基酸。示例性保守性取代为本领域中众所周知的(参见，例如WO 97/09433的第10页；Lehninger,Biochemistry,第2版；Worth Publishers,Inc.NY,NY,第71-77页,1975；Lewin,Genes IV,Oxford University Press,NY and Cell Press,Cambridge,MA,第8页,1990)。
[0077] 术语“构建体”是指含有重组核酸分子的任何多核苷酸。“转基因”或“转基因构建体”是指含有两个或更多个基因的构建体，所述两个或更多个基因以在自然界中未发现的布置可操作地连接。术语“可操作地-连接(operably-linked)”(或在本文中的“可操作地连接(operably linked)”)是指两个或更多个核酸分子在单个核酸片段上的缔合，使得一者的功能受另一者的影响。例如，当启动子可影响编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制下)时，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。“未连接”意指相关遗传元件彼此不紧密相关，并且一者的功能不影响另一者。在一些实施方案中，存在于转基因中的基因可操作地连接至表达控制序列(例如，启动子)。
[0078] 构建体(例如，转基因)可存在于载体(例如，细菌载体、病毒载体)中或可整合到基因组中。“载体”为能够运送另一种核酸分子的核酸分子。载体可为例如，质粒、粘粒、病毒、RNA载体或线性或环状DNA或RNA分子，其可包括染色体、非染色体、半合成或合成的核酸分子。示例性载体为能够自主复制(附加型载体)或表达(表达载体)与它们连接的核酸分子的那些。本文进一步描述了有用于本公开的组合物和方法中的载体。
[0079] 如本文所使用的术语“表达”是指基于核酸分子的编码序列(诸如基因)产生多肽的方法。所述方法可包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰、或其任何组合。
[0080] 在将核酸分子插入到细胞中的背景下，术语“引入”意指“转染”、或“转化”、或“转导”，并且包括参考将核酸分子并入到真核或原核细胞中，其中核酸分子可并入到细胞的基因组中(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)，转变为自主复制子，或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
[0081] 如本文所使用，“异源的”或“外源的”核酸分子、构建体或序列是指对宿主细胞不是天然的核酸分子或核酸分子的一部分，但是可与来自宿主细胞的核酸分子或核酸分子的一部分为同源的。异源或外源核酸分子、构建体或序列的来源可来自不同的属或种。在某些实施方案中，通过例如缀合、转化、转染、转导、电穿孔等将异源或外源核酸分子添加(即，非内源或天然的)至宿主细胞或宿主基因组，其中添加的分子可整合到宿主基因组中或作为染色体外遗传物质(例如，作为质粒或其他形式的自我复制载体)而存在，并且可以多个拷贝存在。另外，“异源的”是指由引入到宿主细胞中的外源核酸分子编码的非天然酶、蛋白质或其他活性，即使宿主细胞编码同源蛋白质或活性。
[0082] 如本文所描述，可将多于一种异源或外源核酸分子引入到宿主细胞中作为单独的核酸分子、作为多个独自控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单个核酸分子、或其任何组合。例如，如本文所公开，宿主细胞可被修饰以表达两种或更多种编码所希望的特异于次要组织相容性(H)抗原HA-1H肽的TCR(例如，TCRα和TCRβ)的异源或外源核酸分子。当将两种或更多种外源核酸分子引入到宿主细胞中时，应理解可将两种或更多种外源核酸分子作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)引入在单独的载体上、整合到单个位点或多个位点处的宿主染色体中、或其任何组合。引用的异源核酸分子或蛋白质活性的数量是指编码核酸分子的数量或蛋白质活性的数量，而不是引入到宿主细胞中的单独核酸分子的数量。
[0083] 如本文所使用，术语“内源的”或“天然的”是指通常存在于宿主细胞中的基因、蛋白质或活性。此外，与亲本基因、蛋白质或活性相比，突变、过表达、改组(shuffle)、重复或以其他方式改变的基因、蛋白质或活性仍然被认为是对所述具体宿主细胞为内源或天然的。例如，可使用来自第一基因的内源控制序列(例如，启动子、翻译弱化序列)来改变或调节第二天然基因或核酸分子的表达，其中第二天然基因或核酸分子的表达或调节与亲本细胞中的正常表达或调节不同。
[0084] 术语“同源的”或“同源物”是指发现于或源自宿主细胞、物种或菌株的分子或活性。例如，异源或外源核酸分子可与天然宿主细胞基因同源，并且可任选地具有改变的表达水平、不同的序列、改变的活性、或其任何组合。
[0085] 如本文所使用的“序列同一性”是指在比对序列并且引入缺口(如果需要的话)以实现最大百分比序列同一性，并且不考虑任何保守性取代作为序列同一性的一部分之后，一个序列中的氨基酸残基与另一个参考多肽序列中的氨基酸残基同一的百分数。可使用NCBI BLAST 2.0软件生成序列同一性百分数值，所述软件如通过Altschul等人(1997),Nucl.Acids Res.25:3389-3402所定义，其中参数设定为缺省值。
[0086] HA-1H特异性结合蛋白、辅助蛋白和工程化的宿主细胞
[0087] 在某些方面，本公开提供了工程化的免疫细胞，其包含编码特异性结合HA-1H抗原H的结合蛋白的异源多核苷酸。在某些实施方案中，编码的结合蛋白为HA-1 抗原特异性T细胞受体(TCR)或HA-1H抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)。在另外的实施方案中，结合蛋白被表达为编码另外辅助蛋白的转基因构建体的一部分，所述另外辅助蛋白诸如安全开关蛋白、标签、选择标志物、CD8辅助受体β链、α链或两者、或其任何组合。
[0088] 在本文描述的任何实施方案中，本公开的编码多肽(例如，iCasp9、TCRβ链、TCRα链、CD8β链、CD8α链)可包含“信号肽”(又称为前导序列、前导肽或转运肽)。信号肽将新合成的多肽靶向至其在细胞内部或外部的适当位置。在定位或分泌完成的过程中或一旦定位或分泌完成，可将信号肽从多肽中除去。具有信号肽的多肽在本文中称为“前蛋白”，并且其信号肽被除去的多肽在本文中称为“成熟”蛋白或多肽。代表性信号肽包括SEQ ID NO:1-3、5-9和70-75中的任一个的从位置1至位置21的氨基酸，或SEQ ID NO:4、10和12中的任一个的从位置1至位置19的氨基酸。
[0089] 本公开的结合蛋白诸如TCR和CAR将含有特异于靶标(在此情况下，HA-1H)的结合域。如本文所使用的“结合域”(又称为“结合区”或“结合部分”)是指具有特异性地和非共价地缔合、联合或组合靶标(例如，HA-1H肽或HA-1H肽:MHC复合物)的能力的分子或其部分(例如，肽、寡肽、多肽、蛋白质)。结合域包括针对生物分子、分子复合物(即包含两种或更多种生物分子的复合物)或其他感兴趣的靶标的任何天然存在的、合成的、半合成的或重组产生的结合配偶体。示例性结合域包括单链免疫球蛋白可变区(例如，单链TCR(scTCR)、单链Fv(scFv))、受体胞外域、配体(例如，细胞因子、趋化因子)、或出于其结合生物分子、分子复合物或其他感兴趣的靶标的特异性能力而选择的合成多肽。
[0090] 在某些实施方案中，单独的HA-1H特异性结合域(即，不具有HA-1特异性结合蛋白的任何其他部分)可为可溶性的并且可结合至HA-1H，其中Kd为小于约10-8M、小于约10-9M、小于约10-10M、小于约10-11M、小于约10-12M或小于约10-13M。在具体实施方案中，HA-1H特异性结合域包括HA-1H-特异性scTCR(例如，单链αβTCR蛋白，诸如Vα-L-Vβ、Vβ-L-Vα、Vα-Cα-L-Vα、或Vα-L-Vβ-Cβ，其中Vα和Vβ分别为TCRα和β可变域，Cα和Cβ分别为TCRα和β恒定域，并且L为接头)。
[0091] 术语“可变区”或“可变域”是指涉及免疫球蛋白超家族结合蛋白(例如，TCR)与抗原的结合的免疫球蛋白超家族结合蛋白(例如，TCRα链或β链(或针对γδTCR，γ链和δ链))的域。天然TCR的α链和β链(分别为Vα和Vβ)的可变域通常具有相似的结构，其中每个域均包含四个保守框架区(FR)和三个CDR。Vα域由两个单独的DNA区段即可变基因区段和连接基因区段编码(V-J)；Vβ域由三个单独的DNA区段即可变基因区段、多样性基因区段和连接基因区段编码(V-D-J)。单个Vα或Vβ域可足以赋予抗原结合特异性。此外，结合具体抗原的TCR可使用来自结合抗原的TCR的Vα或Vβ域来分离，以便分别筛选出互补Vα或Vβ域的文库。
[0092] 术语“互补决定区”和“CDR”与“高变区”或“HVR”同义，并且在本领域中已知是指TCR可变区内的非连续氨基酸序列，其赋予抗原特异性和/或结合亲和力。通常，在每个α链可变区中存在三个CDR(αCDR1、αCDR2、αCDR3)，并且在每个β链可变区中存在三个CDR(βCDR1、βCDR2、βCDR3)。CDR3被认为是负责识别经过处理的抗原的主要CDR。CDR1和CDR2主要与MHC相互作用。
[0093] 在某些实施方案中，编码的结合蛋白包含：(a)T细胞受体(TCR)α链可变(Vα)域，其具有由TRAV17基因、TRAV21基因或TRAV10基因编码的氨基酸序列，以及TCRβ链可变(Vβ)域，其包含如SEQ ID NO:13-17和86中的任一个所示的CDR3氨基酸序列；(b)TCR Vα域，其包含如SEQ ID NO:87-92中的任一个所示的CDR3氨基酸序列，以及TCR Vβ域，其具有由TRBV7-9基因编码的氨基酸序列；或(c)TCR Vα域，其包含SEQ ID NO:87-92中的任一个的CDR3氨基酸序列，以及TCR Vβ域，其包含SEQ ID NO:13-17和86中的任一个的CDR3氨基酸序列，其中编码的结合蛋白能够特异性结合含有HA-1H次要抗原的肽并且不结合不含有HA-1H次要抗原的肽。
[0094] 在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCR Vα域和TCR Vβ域，其中：(a)编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列，并且编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列；(b)编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:14中示出的氨基酸序列，并且编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:88的氨基酸序列；(c)编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:15中示出的氨基酸序列，并且编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:89的氨基酸序列；(d)编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:16中示出的氨基酸序列，并且编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:90的氨基酸序列；(e)编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:17中示出的氨基酸序列，并且编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:91的氨基酸序列；或(f)编码的VβCDR3包含SEQ ID NO:86中示出的氨基酸序列，并且编码的VαCDR3包含SEQ ID NO:92的氨基酸序列。
[0095] 在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含Vα域，其中编码的Vα域包含与SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含Vβ域，其中编码的Vβ域包含与SEQ ID NO:1、3、5、
7、9和11中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
7、9和11中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。
[0096] 在一些实施方案中，编码的Vα域不包含CDR1的氨基酸序列中的变化，编码的Vβ域不包含CDR1的氨基酸序列中的变化，或编码的Vα域的CDR1和编码的Vβ域的CDR1不包含氨基酸序列中的变化。在另外的实施方案中，编码的Vα域不包含CDR2的氨基酸序列中的变化，编码的Vβ域不包含CDR2的氨基酸序列中的变化，或编码的Vα域的CDR2和编码的Vβ域的CDR2不包含氨基酸序列中的变化。
[0097] 在具体实施方案中，编码的结合蛋白包含TCR Vα域和TCR Vβ域，其中：(a)编码的Vβ域包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列或由其组成，并且编码的Vα域包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或由其组成；(b)编码的Vβ域包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列或由其组成，并且编码的Vα域包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或由其组成；(c)编码的Vβ域包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或由其组成，并且编码的Vα域包含SEQ ID NO:6的氨基酸序列或由其组成；(d)编码的Vβ域包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列或由其组成，并且编码的Vα域包含SEQ ID NO:8的氨基酸序列或由其组成；(e)编码的Vβ域包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或由其组成，并且编码的Vα域包含SEQ ID NO:10的氨基酸序列或由其组成；或(f)编码的Vβ域包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列或由其组成，并且编码的Vα域包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列或由其组成。
[0098] 由细胞表达的本公开的示例性结合蛋白可包括信号肽(例如，结合前蛋白)，并且细胞可除去信号肽以生成成熟结合蛋白。在某些实施方案中，结合蛋白包含两个组分，诸如α链和β链，其可缔合在细胞表面上以形成功能性结合蛋白。两个缔合的组分可构成成熟蛋白。在某些实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟Vβ域，其中成熟Vβ域包含SEQ ID NO:96、98、100、102、104或106中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟Vα域，其中成熟Vα域包含SEQ ID NO:97、99、101、103、105或107中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟Vβ域和成熟Vα域，其中成熟Vβ域包含SEQ ID NO:96、98、100、102、104或106中的任一个的氨基酸序列或由其组成，并且成熟Vα域包含SEQ ID NO:97、99、101、103、105或107中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟TCRβ链，其中成熟TCRβ链包含SEQ ID NO:108、110、112、114、116或118中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟TCRα链，其中成熟TCRα链包含SEQ ID NO:
109、111、113、115、117或119中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在还另外的实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟TCRβ链和成熟TCRα链，其中成熟TCRβ链包含SEQ ID NO:
108、110、112、114、116或118中的任一个的氨基酸序列或由其组成，并且成熟TCRα链包含SEQ ID NO:109、111、113、115、117或119中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，本公开的结合蛋白被表达具有CD8β链，并且CD8β链包含成熟CD8β链，其中成熟CD8β链包含SEQ ID NO:121-125中的任一个中示出的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，本公开的结合蛋白被表达具有CD8α链，并且CD8α链包含成熟CD8α链，其中成熟CD8α链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成。在更多的实施方案中，本公开的结合蛋白被表达具有CD8β链和CD8α链，其中CD8β链和α链包含成熟CD8β链和α链，其中成熟CD8β链包含SEQ ID NO:121-125中的任一个中示出的氨基酸序列或由其组成，并且成熟CD8α链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成。
109、111、113、115、117或119中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在还另外的实施方案中，本公开的结合蛋白包含成熟TCRβ链和成熟TCRα链，其中成熟TCRβ链包含SEQ ID NO:
108、110、112、114、116或118中的任一个的氨基酸序列或由其组成，并且成熟TCRα链包含SEQ ID NO:109、111、113、115、117或119中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在某些实施方案中，本公开的结合蛋白被表达具有CD8β链，并且CD8β链包含成熟CD8β链，其中成熟CD8β链包含SEQ ID NO:121-125中的任一个中示出的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，本公开的结合蛋白被表达具有CD8α链，并且CD8α链包含成熟CD8α链，其中成熟CD8α链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成。在更多的实施方案中，本公开的结合蛋白被表达具有CD8β链和CD8α链，其中CD8β链和α链包含成熟CD8β链和α链，其中成熟CD8β链包含SEQ ID NO:121-125中的任一个中示出的氨基酸序列或由其组成，并且成熟CD8α链包含SEQ ID NO:120的氨基酸序列或由其组成。
[0099] 在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含成熟TCR Vα域和成熟TCR Vβ域，其中：(a)Vβ域包含SEQ ID NO:96的氨基酸序列或由其组成，并且Vα域包含SEQ ID NO:97的氨基酸序列或由其组成；(b)Vβ域包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列或由其组成，并且Vα域包含SEQ ID NO:99的氨基酸序列或由其组成；(c)Vβ域包含SEQ ID NO:100的氨基酸序列或由其组成，并且Vα域包含SEQ ID NO:101的氨基酸序列或由其组成；(d)Vβ域包含SEQ ID NO:102的氨基酸序列或由其组成，并且Vα域包含SEQ ID NO:103的氨基酸序列或由其组成；(e)Vβ域包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或由其组成，并且Vα域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或由其组成；或(f)Vβ域包含SEQ ID NO:106的氨基酸序列或由其组成，并且Vα域包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列或由其组成。
[0100] 在一些实施方案中，包含在本公开的工程化免疫细胞中的编码的结合蛋白可包含TCR恒定域。在某些实施方案中，TCR恒定域被修饰以增强所希望的TCR链的配对。例如，由于修饰引起的异源TCRα链与异源TCRβ链之间的增强的配对产生比不希望的异源TCR链与内源TCR链的错配更优选的包含两个异源链的TCR的组装(参见，例如Govers等人,Trends Mol.Med.16(2):77(2010)，所述参考文献的TCR修饰以引用的方式并入本文)。增强异源TCR链配对的示例性修饰包括在每个异源TCRα链和β链中引入互补的半胱氨酸残基。在一些实施方案中，编码异源TCRα链的多核苷酸编码氨基酸位置48处的半胱氨酸(对应于全长成熟的人TCRα链序列)，并且编码异源TCRβ链的多核苷酸编码氨基酸位置57处的半胱氨酸(对应于全长成熟的人TCRβ链序列)。
[0101] 在某些实施方案中，编码的结合蛋白包含TCRα链恒定(Cα)域，其与SEQ ID NO:19、22、24和26中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCR Cα域，其与SEQ ID NO:19、22、24和26中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性，其条件是TCR Cα域保留位置48处引入的半胱氨酸残基。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCR Cα域，其包含SEQ ID NO:19、22、24和26中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
[0102] 在某些实施方案中，编码的结合蛋白包含TCRβ链恒定(Cβ)域，其与SEQ ID NO:18、23和25中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCR Cβ域，其与SEQ ID NO:18、23和25中的任一个的氨基酸序列具有至少约90％序列同一性，其条件是TCR Cβ域保留位置57处引入的半胱氨酸残基。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCR Cβ域，其包含SEQ ID NO:18、23和25中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
[0103] 在某些实施方案中，编码的结合蛋白包含TCRα链(例如，可操作地与TCR Cα域缔合的TCR Vα域)，其具有与SEQ ID NO:28、30、32、34、36和38中的任一个的氨基酸序列至少约90％同一的氨基酸序列，任选地其中TCR Cα域保留位置47(如从Cα域开始计数)处的半胱氨酸。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCRα链，其包含SEQ ID NO:28、30、32、34、36和38中的任一个的氨基酸序列或由其组成。在其他实施方案中，编码的结合蛋白包含TCRβ链(例如，可操作地与TCR Cβ域缔合的TCR Vβ域)，其具有与SEQ ID NO:27、29、31、33、35和37中的任一个的氨基酸序列至少约90％同一的氨基酸序列，任选地其中TCR Cβ域保留位置57(如从Cβ域开始计数)处的半胱氨酸。在另外的实施方案中，编码的结合蛋白包含TCRβ链，其包含SEQ ID NO:27、29、31、33、35和37中的任一个的氨基酸序列或由其组成。
[0104] 由本公开的工程化免疫细胞编码的结合蛋白可包含与任何公开的TCRβ链缔合的任何本发明公开的TCRα链。例如，在某些实施方案中，编码的结合蛋白包含：(a)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:27中示出的氨基酸序列或由其组成，以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:28中示出的氨基酸序列或由其组成；(b)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:29中示出的氨基酸序列或由其组成，以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:30中示出的氨基酸序列或由其组成；(c)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:31中示出的氨基酸序列或由其组成，以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:32中示出的氨基酸序列或由其组成；(d)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:33中示出的氨基酸序列或由其组成，以及TCRα链，其包含SEQ ID NO:34中示出的氨基酸序列或由其组成；(e)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:35中示出的氨基酸序列或由其组成，以及TCR-α链，其包含SEQ ID NO:36中示出的氨基酸序列或由其组成；或(f)TCRβ链，其包含SEQ ID NO:37中示出的氨基酸序列或由其组成，以及TCR-α链，其包含SEQ ID NO:38中示出的氨基酸序列或由其组成。
[0105] 本公开的工程化免疫细胞可包含编码如本文所述的结合蛋白的单个多核苷酸，或结合蛋白可由多于一种多核苷酸编码。换句话说，结合蛋白的组分或部分可由两种或更多种多核苷酸编码，所述两种或更多种多核苷酸可包含在单个核酸分子上或可包含在两个或更多个核酸分子上。
[0106] 在某些实施方案中，编码本公开的结合蛋白的两种或更多种组分或部分的多核苷酸包含在单个开放阅读框中可操作地缔合的两种或更多种编码序列。这样的布置可有利地允许所希望的基因产物协同表达，诸如例如同时表达TCR的α和β链，使得它们以约1:1的比率产生。在某些实施方案中，本公开的结合蛋白的两种或更多种取代基因产物诸如TCR(例如，α和β链)或CAR被表达为单独的分子并且在翻译后缔合。在另外的实施方案中，本公开的结合蛋白的两种或更多种取代基因产物被表达为单个肽，其中所述部分由可切割或可除去的区段分开。例如，有用于表达由单个多核苷酸或载体编码的可分开多肽的自切割肽为本领域已知的，并且包括例如猪捷申病毒-1 2A(P2A)肽，诸如由具有SEQ ID NO:76-81中的任一个中示出的核苷酸序列的多核苷酸编码的肽；明脉扁刺蛾病毒2A(T2A)肽，诸如由具有SEQ ID NO:82中示出的核苷酸序列的多核苷酸编码的肽；马鼻炎A病毒(ERAV)2A(E2A)肽，诸如由具有SEQ ID NO:83中示出的核苷酸序列的多核苷酸编码的肽；以及口蹄疫病毒2A(F2A)肽，诸如由具有SEQ ID NO:84中示出的核苷酸序列的多核苷酸编码的肽。
[0107] 在某些实施方案中，本公开的结合蛋白包含一个或多个连接氨基酸。“连接氨基酸”或“连接氨基酸残基”是指多肽的两个相邻基序、区或域之间，诸如结合域与相邻恒定域之间或TCR链与相邻自切割肽之间的一个或多个(例如，2至约10个)氨基酸残基。连接氨基酸可由编码融合蛋白的构建体的设计(例如，在构建编码融合蛋白的核酸分子的过程中，由使用限制酶位点产生的氨基酸残基)产生，或由例如邻近本公开的编码结合蛋白的一个或多个域的自切割肽(例如，设置在TCRα链与TCRβ链之间的P2A肽，其自切割可在α链、TCRβ链或两者中留下一个或多个连接氨基酸)的切割产生。
[0108] 在某些实施方案中，包含在本公开的工程化免疫细胞中的结合蛋白可特异性结合HA-1H肽:HLA复合物。例如，在具体实施方案中，本公开的结合蛋白能够特异性结合HA-1H肽:H
HLA复合物，其中HLA可包括HLA-A*0201。在具体实施方案中，HA-1 肽包含氨基酸序列VLHDDLLEA(SEQ ID NO:66)。
HLA复合物，其中HLA可包括HLA-A*0201。在具体实施方案中，HA-1 肽包含氨基酸序列VLHDDLLEA(SEQ ID NO:66)。
[0109] 在任何前面提到的实施方案中，包含在工程化免疫细胞中的编码结合蛋白可包含TCR、TCR的抗原结合片段(例如，单链TCR(“scTCR”))或嵌合抗原受体(“CAR”)。
[0110] 在某些实施方案中，TCR的抗原结合片段包括单链TCR(scTCR)，其包含TCR Vα和TCR Vβ域两者，但仅有单个TCR恒定域(Cα或Cβ)。在另外的实施方案中，TCR的抗原结合片段或嵌合抗原受体为嵌合的(例如，包含来自多于一种供体或物种的氨基酸残基或基序)、人源化的(例如，包含来自非人生物体的残基，其被改变或取代以便降低在人中的免疫原性风险)、或人的。
[0111] “嵌合抗原受体”(CAR)是指融合蛋白，其被工程化以包含两个或更多个天然存在的氨基酸序列，所述氨基酸序列以不天然存在或不在宿主细胞中天然存在的方式连接在一起，所述融合蛋白可在存在于细胞表面上时起到受体的作用。本公开的CAR包括细胞外部分，其包含连接至跨膜域和一个或多个细胞内信号传导域(任选地含有协同刺激域)的抗原结合域(即，获自或源自免疫球蛋白或免疫球蛋白样分子，诸如源自抗体或特异于癌症抗原的TCR的scFv、或源自或获自NK细胞的杀伤免疫受体的抗原结合域)(参见，例如Sadelain等人,Cancer Discov.,3(4):388(2013)；还参见Harris和Kranz,Trends Pharmacol.Sci.,37(3):220(2016)以及Stone等人,Cancer Immunol.Immunother.,63(11):1163(2014))。
[0112] 用于产生工程化的TCR的方法被描述在例如Bowerman等人,Mol.Immunol.,46(15):3000(2009)中，所述参考文献的技术以引用的方式并入本文。用于制备CAR的方法为本领域中众所周知的并且被描述在例如美国专利号6,410,319；美国专利号7,446,191；美国专利公布号2010/065818；美国专利号8,822,647；PCT公布号WO 2014/031687；美国专利号7,514,537；以及Brentjens等人,2007,Clin.Cancer Res.13:5426中，所述参考文献的技术以引用的方式并入本文。
[0113] 本公开的工程化免疫细胞可作为例如癌症的疗法施用。在一些情况下，可能希望降低或停止与细胞免疫疗法相关的活性。因此，在某些实施方案中，本公开的工程化免疫细胞包含编码结合蛋白和辅助蛋白诸如安全开关蛋白的异源多核苷酸，其当希望时可使用同源药物或其他化合物靶向以选择性地调节此类细胞的活性(例如，减轻或消融)。在这方面使用的安全开关蛋白包括例如，如本文所讨论的缺乏细胞外N-末端配体结合域和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但保留天然氨基酸序列、I型跨膜细胞表面定位以及针对药物级抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗(爱必妥(Erbitux))tEGF受体的构象完整结合表位的截短EGF受体多肽(huEGFRt)(tEGFr；Wang等人,Blood 118:1255-1263,2011)、半胱天冬酶多肽(例如，iCasp9；Straathof等人,Blood 105:4247-4254,2005；Di Stasi等人,N.Engl.J.Med.365:1673-1683,2011；Zhou和Brenner,Exp.Hematol.pii:S0301-472X(16)30513-6.doi:
10.1016/j.exphem.2016.07.011)、RQR8(Philip等人,Blood 124:1277-1287,2014)、人c-myc蛋白的10氨基酸标签(Myc)(Kieback等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:623-628,
2008)，以及标志物/安全开关多肽，诸如RQR(CD20+CD34；Philip等人,2014).
10.1016/j.exphem.2016.07.011)、RQR8(Philip等人,Blood 124:1277-1287,2014)、人c-myc蛋白的10氨基酸标签(Myc)(Kieback等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 105:623-628,
2008)，以及标志物/安全开关多肽，诸如RQR(CD20+CD34；Philip等人,2014).
[0114] 有用于治疗性细胞的其他辅助组分包括允许细胞被鉴定、分类、分离、富集或跟踪的标签或选择标志物。例如，具有所希望特征的经过标志的免疫细胞(例如，抗原特异性TCR和安全开关蛋白)可从样品中未经过标志的细胞中分选出来，并且更有效地激活和扩增以包含在所希望纯度的治疗性产品中。
[0115] 如本文所使用，术语“选择标志物”包括赋予细胞可鉴定的变化的核酸构建体，其允许检测和阳性选择用包含选择标志物的多核苷酸转导的免疫细胞。RQR为包含CD20的主要细胞外环和两个最小的CD34结合位点的选择标志物。在一些实施方案中，编码RQR的多核苷酸包含编码16个氨基酸CD34最小表位的多核苷酸。在一些实施方案中，诸如在本文实施例中提供的某些实施方案，在CD8茎域(Q8)的氨基末端位置处并入CD34最小表位。在另外的实施方案中，CD34最小结合位点序列可与CD20的靶表位组合以形成T细胞的紧密标志物/自杀基因(RQR8)(Philip等人,2014,所述参考文献以引用的方式并入本文)。这个构建体允许例如用结合至磁珠(Miltenyi)的CD34特异性抗体并且利用临床接受的药物抗体利妥昔单抗进行表达所述构建体的免疫细胞的选择，所述构建体允许选择性缺失表达工程化T细胞的转基因(Philip等人,2014)。
[0116] 另外的示例性选择标志物还包括通常不表达在T细胞上的若干种截短I型跨膜蛋白：截短低亲和力神经生长因子、截短的CD19和截短的CD34(参见例如，Di Stasi等人,N.Engl.J.Med.365:1673-1683,2011；Mavilio等人,Blood83:1988-1997,1994；Fehse等人,Mol.Ther.1:448-456,2000；每个参考文献整体并入本文)。CD19和CD34的一个特别吸引人的特征为现成的Miltenyi CliniMACsTM选择系统的可用性，所述系统可靶向这些标志物以用于临床级分选。然而，CD19和CD34为相对大的表面蛋白，其可对整合载体的载体包装能力和转录效率造成负担。还可采用含有细胞外、非信号传导域或各种蛋白质(例如，CD19、CD34、LNGFR)的表面标志物。-可采用任何选择标志物，并且对于良好生产规范应当是可接受的。在某些实施方案中，选择标志物用编码感兴趣的基因产物的多核苷酸(例如，本公开的结合蛋白，诸如TCR或CAR)表达。选择标志物的另外实例包括例如受体诸如GFP、EGFP、β-gal或氯霉素乙酰转移酶(CAT)。在某些实施方案中，选择标志物，诸如例如CD34由细胞表达，并且CD34可用于选择富集或分离(例如，通过免疫磁性选择)用于本文描述的方法的感兴趣的转导细胞。如本文所使用，CD34标志物区别于抗CD34抗体，或例如scFv、TCR或结合CD34的其他抗原识别部分。
[0117] 在某些实施方案中，选择标志物包括RQR多肽、截短低亲和力神经生长因子(tNGFR)、截短的CD19(tCD19)、截短的CD34(tCD34)、或其任何组合。
[0118] 考虑到背景因素，免疫疗法细胞产物中包含CD4+T细胞可提供抗原诱导的IL-2分泌，并且增强转移的细胞毒性CD8+T细胞的持久性和功能(参见，例如Kennedy等人,Immunol.Rev.222:129(2008)；Nakanishi等人,Nature462(7272):510(2009))。在某些情况下，CD4+T细胞中的I类限制性TCR可要求CD8辅助受体转移以增强TCR对I类HLA肽复合物的敏感性。CD4辅助受体在结构上与CD8不同并且不能有效取代CD8辅助受体(参见，例如Stone&Kranz,Front.Immunol.4:244(2013)；还参见Cole等人,Immunology 137(2):139(2012))。因此，用于本公开的组合物和方法的另一种辅助蛋白包括CD8辅助受体或其组分。
[0119] 在某些实施方案中，包含编码本公开的结合蛋白的异源多核苷酸的工程化免疫细胞可还包含编码CD8辅助受体蛋白或其β链或α链组分的异源多核苷酸。在一些实施方案中，编码的CD8辅助受体包括包含SEQ ID NO:71-75中的任一个的氨基酸序列的β链。在另外的实施方案中，编码的CD8辅助受体为还包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的RQR多肽的重组CD8辅助受体。不希望受理论约束，相信距离宿主细胞表面的距离对RQR多肽起到选择标志物/安全开关的作用是重要的(Philip等人,2010(同上))。在一些实施方案中，编码的RQR多肽被包含在编码的CD8辅助受体的β链、α链或两者中。在具体实施方案中，工程化的免疫细胞包含编码iCasp9的异源多核苷酸和编码重组CD8辅助受体蛋白的异源多核苷酸，所述重组CD8辅助受体蛋白包含含有RQR多肽的β链并且还包含CD8α链。-在具体实施方案中，编码的CD8α链包含SEQ ID NO:70中示出的氨基酸序列。
[0120] 在另外的实施方案中，工程化的免疫细胞包含编码iCasp9的异源多核苷酸和编码重组CD8辅助受体蛋白的异源多核苷酸，所述重组CD8辅助受体蛋白包含含有RQR多肽的α链并且还包含CD8β链。在一些实施方案中，编码的CD8α链和编码的CD8β链两者均含有RQR多肽。
[0121] 可有效地转导工程化的免疫细胞以含有并且可有效地表达编码结合蛋白、安全开关蛋白、选择标志物和CD8辅助受体蛋白的单个多核苷酸。例如，在一些实施方案中，本公开的工程化免疫细胞包含从5'至3'编码([iCasp9多肽]-[猪捷申病毒2A(P2A)肽-[TCRβ链]-[P2A肽]-[TCRα链]-[P2A肽]-[包含RQR多肽的CD8β链]-[P2A肽]-[CD8α链])的异源多核苷酸。在具体实施方案中，编码TCRβ链的多核苷酸包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列或由其组成，并且编码TCRα链的多核苷酸包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列或由其组成。
[0122] 在具体实施方案中，工程化的免疫细胞含有异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包含SEQ ID NO:85的核苷酸序列或由其组成。
[0123] 可将任何合适的免疫细胞工程化为包括编码本公开的结合蛋白的异源多核苷酸，包括例如T细胞、NK细胞或NK-T细胞。在一些实施方案中，工程化的免疫细胞包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或两者。用于使用所希望的合适转染/转导T细胞的方法已被描述(例如，美国专利申请公布号US 2004/0087025)为具有使用所希望的靶标特异性的T细胞进行的过继转移程序(例如，Schmitt等人,Hum.Gen.20:1240,2009；Dossett等人,Mol.Ther.17:742,2009；Till等人,Blood112:2261,2008；Wang等人,Hum.Gene Ther.18:712,2007；Kuball等人,Blood109:2331,2007；US 2011/0243972；US 2011/0189141；Leen等人,
Ann.Rev.Immunol.25:243,2007)，使得基于本文的技术想到将这些方法适用于本发明公开的实施方案。
Ann.Rev.Immunol.25:243,2007)，使得基于本文的技术想到将这些方法适用于本发明公开的实施方案。
[0124] 可使用任何适当的方法来转染或转导细胞，例如T细胞，或施用本发明方法的多核苷酸或组合物。用于将多核苷酸递送至宿主细胞的已知方法包括例如，使用阳离子聚合物、脂质样分子和某些商业产品诸如例如IN-VIVO-JET PEI。其他方法包括离体转导、注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖、超声载荷、脂质体介导的转染、受体介导的转导、微弹轰击法(microprojectile bombardment)、转座子介导的转移等。转染或转导宿主细胞的还另外的方法采用本文进一步详细描述的载体。
[0125] 在任何前述实施方案中，工程化的免疫细胞可为“万能供体”细胞，其被修饰以减少或消除编码涉及免疫信号传导或其他相关活性的多肽的一种或多种内源基因的表达。示例性基因敲除包括编码PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3、HLA分子、TCR分子等的那些。不希望受理论约束，某些内源表达的免疫细胞蛋白可被接受工程化免疫细胞的同种异体宿主识别为外源的，这可导致工程化免疫细胞(例如，HLA等位基因)的消除，或可下调工程化免疫细胞(例如，PD-1、LAG-3、CTLA4)的免疫活性，或可干扰本公开的异源表达的结合蛋白的结合活性(例如，结合非HA-1H抗原并且从而干扰结合表达HA-1H抗原的细胞的工程化免疫细胞)。因此，减少或消除此类内源基因或蛋白质的表达或活性可改善同种异体宿主内的工程化免疫细胞的活性、耐受性和持久性，并且允许用于施用的万能“现成”细胞(例如，无论HLA类型如何，针对任何受体)。
[0126] 在某些实施方案中，本公开的工程化免疫细胞包含编码PD-1、LAG-3、CTLA4、TIM3的一种或多种基因、HLA组分(例如，编码α1巨球蛋白、α2巨球蛋白、α3巨球蛋白、β1微球蛋白或β2微球蛋白的基因)或TCR组分(例如，编码TCR可变区或TCR恒定区的基因)的染色体基因敲除(参见，例如Torikai等人,Nature Sci.Rep.6:21757(2016)；Torikai等人,Blood 119(24):5697(2012)；以及Torikai等人,Blood 122(8):1341(2013)，所述参考文献的基因编辑技术和组合物以引用的方式整体并入本文)。如本文所使用，术语“染色体基因敲除”是指工程化免疫细胞中的基因改变，其通过工程化免疫细胞防止产生功能活性的内源多肽产物。导致染色体基因敲除的改变可包括例如，引入的无义突变(包括过早终止密码子的形成)、错义突变、基因缺失和链断裂，以及抑制工程化免疫细胞中的内源基因表达的抑制性核酸分子的异源表达。
[0127] 可通过免疫细胞的染色体编辑来引入染色体基因敲除。在某些实施方案中，通过免疫细胞的染色体编辑来制备染色体基因敲除。可使用例如内切核酸酶进行染色体编辑。如本文所使用的“内切核酸酶”是指能够催化多核苷酸链内的磷酸二酯键断裂的酶。在某些实施方案中，内切核酸酶能够切割靶向基因，从而使靶向基因失活或“敲除”。内切核酸酶可为天然存在的、重组的、基因修饰的或融合内切核酸酶。由内切核酸酶引起的核酸链断裂通常通过同源重组或非同源末端连接(NHEJ)的不同机制修复。在同源重组过程中，供体核酸分子可用于基因“敲入”以使靶基因失活。NHEJ为易于出错的修复过程，其常常导致切割位点处DNA序列的变化，例如，至少一个核苷酸的取代、缺失或添加。NHEJ可用于“敲除”靶基因。使用内切核酸酶破坏或敲除免疫细胞中的基因或基因表达的方法为本领域已知的，并且描述于例如PCT公布号WO 2015/066262；WO 2013/074916；以及WO 2014/059173中；来自每个专利的方法以引用的方式并入。内切核酸酶的实例包括锌指核酸酶、TALE-核酸酶、CRISPR-Cas核酸酶和兆核酸酶。
[0128] 如本文所使用，“锌指核酸酶”(ZFN)是指融合蛋白，其包含融合至非特异性DNA切割域的锌指DNA结合域，诸如Fokl内切核酸酶。每个具有约30个氨基酸的锌指基序结合约3个DNA碱基对，并且可变化某些残基处的氨基酸以改变三联体序列特异性(参见，例如Desjarlais等人,Proc.Natl.Acad.Sci.90:2256-2260,1993；Wolfe等人,J.Mol.Biol.285:1917-1934,1999)。多个锌指基序可串联连接以产生对所希望的DNA序列的结合特异性，所述DNA序列诸如长度范围为约9至约18个碱基对的区。考虑到背景因素，ZFN通过催化基因组中位点特异性DNA双链断裂(DSB)的形成来介导基因组编辑，并且通过同源定向修复来促进包含与DSB位点处的基因组同源的侧翼序列的转基因的靶向整合。可替代地，由ZFN生成的DSB可通过非同源末端连接(NHEJ)的修复产生靶基因敲除，所述NHEJ为易于出错的细胞修复途径，其导致在切割位点处的核苷酸插入或缺失。在某些实施方案中，基因敲除包括使用ZFN分子制备的插入、缺失、突变或其组合。
[0129] 如本文所使用，“转录激活因子样效应子核酸酶”(TALEN)是指包含TALE DNA结合域和DNA切割域的融合蛋白，诸如FokI内切核酸酶。“TALE DNA结合域”或“TALE”包含一个或多个TALE重复域/单元，每个通常具有高度保守的具有不同第12个和第13个氨基酸的33-35氨基酸序列。TALE重复域涉及TALE与靶DNA序列的结合。不同的氨基酸残基(称为重复可变二残基(RVD))与特异性核苷酸识别相关。已确定用于这些TALE的DNA识别的天然(规范)密码，使得位置12和13处的HD序列产生与胞嘧啶(C)的结合、NG与T结合、NI与A结合、NN与G或A结合，并且NG与T结合和非规范(非典型)RVD也是已知的(参见，例如美国专利公布号US 2011/0301073，所述非典型RVD以引用的方式整体并入本文)。TALEN可用于指导T细胞基因组中的位点特异性双链断裂(DSB)。非同源末端连接(NHEJ)连接来自双链断裂两侧的DNA，其中退火几乎没有或没有序列重叠，从而引入敲除基因表达的错误。可替代地，同源定向修复可在DSB位点处引入转基因，从而提供转基因中存在的同源侧翼序列。在某些实施方案中，基因敲除包括使用TALEN分子制备的插入、缺失、突变或其组合。
[0130] 如本文所使用，“聚集的规则间隔短回文重复/Cas”(CRISPR/Cas)核酸酶系统是指采用CRISPR RNA(crRNA)引导的Cas核酸酶来经由碱基配对互补性识别基因组内的靶位点(称为前间隔序列)，然后如果短的、保守性的前间隔序列相关基序(PAM)紧跟在互补靶序列的3'之后则切割DNA的系统。基于Cas核酸酶的序列和结构，将CRISPR/Cas系统分为三种类型(即I型、II型和III型)。I型和III型的crRNA引导的监测复合物需要多个Cas亚基。研究最多的II型系统包含至少三种组分：RNA引导的Cas9核酸酶、crRNA和反式作用的crRNA(tracrRNA)。tracrRNA包含双链体形成区。crRNA和tracrRNA形成双链体，所述双链体能够与Cas9核酸酶相互作用，并且经由crRNA上的间隔序列与PAM上游的靶DNA上的前间隔序列之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9/crRNA:tracrRNA复合物引导至靶DNA上的特异性位点。Cas9核酸酶在由crRNA间隔序列限定的区内切割双链断裂。通过NHEJ进行的修复导致插入和/或缺失，其破坏靶向基因座的表达。可替代地，可经由同源定向修复在DSB位点处引入具有同源侧翼序列的转基因。可将crRNA和tracrRNA工程化为单个引导RNA(sgRNA或gRNA)(参见，例如Jinek等人,Science 337:816-21,2012)。此外，与靶位点互补的引导RNA的区可被改变或编程以靶向所希望的序列(Xie等人,PLOS One 9:e100448,2014；美国专利申请公布号US 2014/0068797、美国专利申请公布号US 2014/0186843；美国专利号8,697,359和PCT公布号WO 2015/071474；每个所述专利的技术和组合物以引用的方式并入)。在某些实施方案中，基因敲除包括使用CRISPR/Cas核酸酶系统制备的插入、缺失、突变或其组合。
[0131] 如本文所使用，“兆核酸酶”(又称为“归巢内切核酸酶”)是指特征在于大识别位点(约12至约40个碱基对的双链DNA序列)的内切脱氧核糖核酸酶。兆核酸酶可基于序列和结构基序分为五个家族：LAGLIDADG、GIY-YIG、HNH、His-Cys盒(His-Cys box)和PD-(D/E)XK。示例性兆核酸酶包括I-SceI、I-CeuI、PI-PspI、PI-Sce、I-SceIV、I-CsmI、I-PanI、I-SceII、I-PpoI、I-SceIII、I-CreI、I-TevI、I-TevII和I-TevIII，其识别序列为已知的(参见，例如美国专利号5,420,032和6,833,252；Belfort等人,Nucleic Acids Res.25:3379-3388,
1997；Dujon等人,Gene 82:115-118,1989；Perler等人,Nucleic Acids Res.22:1125-
1127,1994；Jasin,Trends Genet.12:224-228,1996；Gimble等人,J.Mol.Biol.263:163-
180,1996；Argast等人,J.Mol.Biol.280:345-353,1998)。
1997；Dujon等人,Gene 82:115-118,1989；Perler等人,Nucleic Acids Res.22:1125-
1127,1994；Jasin,Trends Genet.12:224-228,1996；Gimble等人,J.Mol.Biol.263:163-
180,1996；Argast等人,J.Mol.Biol.280:345-353,1998)。
[0132] 在某些实施方案中，天然存在的兆核酸酶可用于促进选自PD-1、LAG3、TIM3、CTLA4、HLA编码基因或TCR组分编码基因的靶标的位点特异性基因组修饰。在其他实施方案中，对靶基因具有新型结合特异性的工程化兆核酸酶用于位点特异性基因组修饰(参见，例如Porteus等人,Nat.Biotechnol.23:967-73,2005；Sussman等人,J.Mol.Biol.342:31-41,2004；Epinat等人,Nucleic Acids Res.31:2952-62,2003；Chevalier等人,Molec.Cell
10:895-905,2002；Ashworth等人,Nature 441:656-659,2006；Paques等人,Curr.Gene Ther.7:49-66,2007；美国专利公布号US 2007/0117128；US 2006/0206949；US 2006/
0153826；US2006/0078552；以及US 2004/0002092)。
10:895-905,2002；Ashworth等人,Nature 441:656-659,2006；Paques等人,Curr.Gene Ther.7:49-66,2007；美国专利公布号US 2007/0117128；US 2006/0206949；US 2006/
0153826；US2006/0078552；以及US 2004/0002092)。
[0133] 在某些实施方案中，染色体基因敲除包含引入到工程化免疫细胞中的抑制性核酸分子，所述工程化免疫细胞包含编码特异性结合肿瘤相关抗原的抗原特异性受体的异源多核苷酸，其中抑制性核酸分子编码靶标特异性抑制剂，并且其中编码的靶标特异性抑制剂抑制工程化免疫细胞中的内源基因表达(即PD-1、TIM3、LAG3、CTLA4、HLA组分、TCR组分或其任何组合)。
[0134] 在使用敲除程序或试剂后，可通过工程化免疫细胞的DNA测序直接确认染色体基因敲除。染色体基因敲除也可在敲除后从基因表达的缺失(例如，由基因编码的mRNA或多肽产物的缺失)推断出来。
[0135] 在另一个方面，本文提供了包含本公开的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物。本文还提供了包含有效量的工程化免疫细胞或包含工程化免疫细胞的组合物的单位剂量。在某些实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、或至少约95％的工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞(即，与具有相当数量的PBMC的患者样品相比，具有小于约50％、小于约40％、小于约30％、小于约20％、小于约10％、小于约5％或小于约1％的存在于单位剂量中的天然T细胞群)。
[0136] 在一些实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约50％工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约50％工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞。在另外的实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约60％工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约60％工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞。在另外的实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约70％工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约70％工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞。在一些实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约80％工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约80％工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞。在一些实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约85％工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约85％工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞。在一些实施方案中，单位剂量包含以约1:1比率的(i)包含至少约90％工程化CD4+T细胞的组合物，与(ii)包含至少约90％工程化CD8+T细胞的组合物，其中单位剂量含有减少量或基本上没有天然T细胞。
[0137] 在本文描述的任何实施方案中，单位剂量包含相等或大约相等数量的工程化CD45RA-CD3+CD8+和工程化CD45RA-CD3+CD4+TM细胞。
[0138] 多核苷酸、转基因和载体
[0139] 在另外的方面，本公开提供了一种分离的多核苷酸，其编码如本文所述的结合蛋白(例如，包含如本文所述的TCR Vα和Vβ域(并且任选地还包含如本文所述的恒定域或其他组分)的HA-1H特异性TCR、scTCR或CAR)，并且可另外编码安全开关蛋白、选择标志物、CD8辅助受体β链或CD8辅助受体α链、或其任何组合，其条件是至少一部分分离的多核苷酸被密码子优化以在宿主细胞(例如，如本文所公开的工程化免疫细胞)中表达。
[0140] 具体地说，包含在工程化免疫细胞中的任何前面提到的异源多核苷酸(例如，编码本公开的任何结合蛋白)也可以或可替代地以分离形式提供，其中多核苷酸被密码子优化以在宿主细胞中表达。例如，在某些实施方案中，分离的多核苷酸编码HA-1H特异性结合蛋白的TCRβ链，并且包含SEQ ID NO:39、41、43、45、47、49或51中的任一个的核苷酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，分离的多核苷酸编码HA-1H特异性结合蛋白的TCRα链，并且包含SEQ ID NO:40、42、46、48、50或52中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
[0141] 在某些实施方案中，编码TCRα链的异源多核苷酸和编码TCRβ链的异源多核苷酸被包含在单个开放阅读框中，所述单个开放阅读框包含在工程化的免疫细胞中，其中单个开放阅读框还包含编码自切割肽的多核苷酸，所述多核苷酸设置在编码α链的多核苷酸与编码β链的多核苷酸之间。在一些实施方案中，编码自切割肽的多核苷酸包含SEQ ID NO:76-84中的任一个的核苷酸序列或由其组成。
[0142] 在另外的实施方案中，单个开放阅读框包含与SEQ ID NO:59-63中的任一个的核苷酸序列至少约80％同一的核苷酸序列。在具体实施方案中，单个开放阅读框包含SEQ ID NO:59-63中的任一个的核苷酸序列或由其组成。在另外的实施方案中，编码的([TCRβ链]-[自切割肽]–[TCRα链])包含SEQ ID NO:53-57中的任一个的氨基酸序列或由其组成，其在细胞除去信号肽之前并且在由自切割肽分开β链和α链之前存在。
[0143] 本公开的一种分离的多核苷酸可还包含编码如本文所公开的安全开关蛋白、选择标志物、CD8辅助受体β链(例如，SEQ ID NO:71-75)或CD8辅助受体α链(例如，SEQ ID NO:70)的多核苷酸，或可包含编码其任何组合的多核苷酸。在具体实施方案中，分离的包含编码iCasp9的异源多核苷酸和编码重组CD8辅助受体蛋白的异源多核苷酸，所述重组CD8辅助受体蛋白包含含有RQR多肽的β链或α链。
[0144] 在一些实施方案中，分离的多核苷酸包含单个开放阅读框，其从5'至3'含有([编码安全开关蛋白的多核苷酸]-[编码自切割肽的多核苷酸]-[编码TCRβ链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码TCRα链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码含有RQR多肽的CD8β链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码CD8α链的多核苷酸])。
[0145] 在另外的实施方案中，分离的多核苷酸包含单个开放阅读框，其从5'至3'编码([iCasp9多肽]-[猪捷申病毒2A(P2A)肽]-[TCRβ链]-[P2A肽]-[TCRα链]-[P2A肽]-[包含RQR多肽的CD8β链]-[P2A肽]-[CD8α链])。-在某些实施方案中，编码TCRβ链的多核苷酸包含SEQ ID NO:41的核苷酸序列或由其组成，并且其中编码TCRα链的多核苷酸包含SEQ ID NO:42的核苷酸序列或由其组成。
[0146] 在具体实施方案中，分离的多核苷酸包含SEQ ID NO:85的核苷酸序列或由其组成。
[0147] 在本文描述的任何实施方案中，分离的多核苷酸被密码子优化以在免疫细胞(诸如T细胞)中表达。
[0148] 在另一方面，本文提供了转基因构建体，其中转基因构建体包含可操作地连接至单个开放阅读框的表达控制序列(例如，启动子序列)，其包含(a)编码安全开关蛋白的多核苷酸；(b)编码TCRβ链的多核苷酸；(c)编码TCRα链的多核苷酸；(b)编码选择标志物的多核苷酸；(c)编码CD8辅助受体β链的多核苷酸；以及(d)编码CD8辅助受体α链的多核苷酸。
[0149] 对用于基因工程化和产生感兴趣的多肽的转基因构建体的构建可通过使用本领域已知的任何合适的分子生物工程化技术来实现。为了获得有效的转录和翻译，在某些实施方案中，本公开的每个转基因构建体中的多核苷酸包含至少一个适当的表达控制序列(又称为调节序列)，诸如前导序列，并且特别是可操作地(operably)(即可操作地(operatively))连接至编码感兴趣的多肽的核苷酸序列的启动子。在某些实施方案中，转基因构建体包含编码安全开关蛋白的多核苷酸，其中编码的安全开关蛋白包括：(i)截短的EGF受体(tEGFR)；(ii)iCasp9；(iii)RQR多肽；(iv)myc表位；或(v)其任何组合。
[0150] 在另外的实施方案中，编码的选择标志物包括：(i)RQR多肽；(ii)截短的低亲和力神经生长因子(tNGFR)；(iii)截短的CD19(tCD19)；(iv)截短的CD34(tCD34)；或(v)其任何组合。
[0151] 在一些实施方案中，编码的CD8辅助受体为包含RQR多肽的重组CD8辅助受体，所述RQR多肽具有SEQ ID NO:69中示出的氨基酸序列。在具体实施方案中，转基因构建体包括编码包含在编码的CD8β链中的RQR多肽的多核苷酸。在另外的实施方案中，转基因构建体包括编码包含在编码的CD8α链中的RQR多肽的多核苷酸。
[0152] 例如，在某些实施方案中，本公开的转基因构建体包含开放阅读框，其含有(a)编码安全开关蛋白的多核苷酸；(b)编码TCRβ链的多核苷酸；(c)编码TCRα链的多核苷酸；(d)编码含有RQR多肽的CD8β链的多核苷酸；以及(e)编码CD8α链的多核苷酸。本文中想到组分多核苷酸的任何布置，包括例如从5'至3'包含以下的单个开放阅读框：([编码安全开关蛋白的多核苷酸]-[编码自切割肽的多核苷酸]-[编码TCRβ链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码TCRα链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码含有RQR多肽的CD8β链的多核苷酸]-[编码自切割多肽的多核苷酸]-[编码CD8α链的多核苷酸])。
[0153] 在具体实施方案中，本公开的转基因构建体包含单个开放阅读框，其从5'至3'编码([iCasp9多肽]-[P2A肽]-[TCRβ链]-[P2A肽]-[TCRα链]-[P2A肽]-[包含RQR多肽的CD8β链]-[P2A肽]-[CD8α链])。
[0154] 在另外的实施方案中，转基因构建体可包含可操作地连接至如本文所述的多核苷酸的表达控制序列。例如，转基因构建体可包含可操作地连接至编码本公开的结合蛋白的多核苷酸的表达控制序列，其中结合蛋白包含：(a)T细胞受体(TCR)α链可变(Vα)域，其具有由TRAV17基因、TRAV21基因或TRAV10基因编码的氨基酸序列，以及TCRβ链可变(Vβ)域，其包含如SEQ ID NO:13-17和86中的任一个所示的CDR3氨基酸序列；(b)TCR Vα域，其包含如SEQ ID NO:87-92中的任一个所示的CDR3氨基酸序列，以及TCR Vβ域，其具有由TRBV7-9基因编码的氨基酸序列；或(c)TCR Vα域，其包含SEQ ID NO:87-92中的任一个的CDR3氨基酸序列，以及TCR Vβ域，其包含SEQ ID NO:13-17和86中的任一个的CDR3氨基酸序列，其中编码的结合蛋白能够特异性结合含有HA-1H抗原的肽并且不结合不含有HA-1H抗原的肽。
[0155] 本文还提供了包含本公开的转基因构建体的载体。载体的一些实例包括质粒、病毒载体、粘粒或其他载体。一些载体可能够在将它们引入到其中的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)，而其他载体可整合到宿主细胞的基因组中或在引入到宿主细胞后促进多核苷酸插入物的整合，从而与宿主基因组一起复制(例如，慢病毒载体、逆转录病毒载体)。另外，一些载体能够指导它们可操作地连接的基因的表达(这些载体可被称为“表达载体”)。根据相关实施方案，应进一步理解的是，如果将一种或多种药剂(例如，编码如本文所述的结合蛋白的多核苷酸)共同施用于受试者，则每种药剂可留存于分开的或相同的载体中，并且多种载体(每种含有不同的药剂或相同的药剂)可引入至细胞或细胞群或施用至受试者。
[0156] 在某些实施方案中，本公开的多核苷酸可可操作地连接至载体的某些元件。例如，可以可操作地连接实现连接它们的编码序列的表达和处理所需的多核苷酸序列。表达控制序列可包括适当的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA处理信号，诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，Kozak共有序列)；增强蛋白质稳定性的序列；以及可能增强蛋白质分泌的序列。如果表达控制序列与感兴趣的基因邻接，并且表达控制序列起反式作用或远距离地控制感兴趣的基因，则它们可被可操作地连接。
[0157] 在某些实施方案中，载体包括质粒载体或病毒载体(例如，选自慢病毒载体或γ-逆转录病毒载体的载体)。病毒载体包括逆转录病毒、腺病毒、细小病毒(例如腺病毒相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒诸如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水疱性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台)、正链RNA病毒诸如小核糖核酸病毒和甲病毒，以及双链DNA病毒，包括腺病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦巴尔病毒、巨细胞病毒)以及痘病毒(例如牛痘、禽痘和金丝雀痘)。其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳头多瘤空泡病毒、嗜肝DNA病毒以及肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括禽白血病-肉瘤、哺乳动物C型、B型病毒、D型病毒、HTLV-BLV组、慢病毒和泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication,In Fundamental Virology,第三版,B.N.Fields等人编著,Lippincott-Raven Publishers,Philadelphia,1996)。
[0158] “逆转录病毒”是具有RNA基因组的病毒，其使用逆转录酶逆转录成DNA，然后将逆转录的DNA并入到宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒”是指逆转录病毒科的一个属。γ逆转录病毒的实例包括小鼠干细胞病毒、鼠白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒和禽网状内皮组织增殖病毒。如本文所使用，“慢病毒载体”意指用于基因递送的基于HIV的慢病毒载体，其可为整合的或非整合的，具有相对大的包装能力，并且可转导一系列不同的细胞类型。慢病毒载体通常在将三种(包装、包膜和转移)或更多质粒瞬时转染到生产细胞中后生成。像HIV一样，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上的受体相互作用而进入靶细胞。进入时，病毒RNA经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录产物为双链线性病毒DNA，其是病毒整合到感染细胞DNA中的底物。
[0159] 在某些实施方案中，病毒载体可为γ逆转录病毒，例如莫洛尼鼠白血病病毒(MLV)衍生的载体。在其他实施方案中，病毒载体可为更复杂的逆转录病毒衍生的载体，例如慢病毒衍生的载体。HIV-1衍生的载体属于这一类。其他实例包括衍生自HIV-2、FIV、马传染性贫血病毒、SIV和梅迪-维斯纳病毒(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒病毒载体以及包装细胞用含有TCR或CAR转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法为本领域已知的，并且先前已被描述于例如：美国专利8,119,772；Walchli等人,PLoS One 6:327930,2011；Zhao等人,J.Immunol.174:4415,2005；Engels等人,Hum.Gene Ther.14:
1155,2003；Frecha等人,Mol.Ther.18:1748,2010；和Verhoeyen等人,Methods
Mol.Biol.506:97,2009中。逆转录病毒和慢病毒载体构建体以及表达系统也为可商购的。
其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；源自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(Krisky等人,Gene Ther.5:1517,1998)。
1155,2003；Frecha等人,Mol.Ther.18:1748,2010；和Verhoeyen等人,Methods
Mol.Biol.506:97,2009中。逆转录病毒和慢病毒载体构建体以及表达系统也为可商购的。
其他病毒载体也可用于多核苷酸递送，包括DNA病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(AAV)的载体；源自单纯疱疹病毒(HSV)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型HSV和减毒HSV(Krisky等人,Gene Ther.5:1517,1998)。
[0160] 最近开发用于基因疗法用途的其他载体也可与本公开的组合物和方法一起使用。此类载体包括源自杆状病毒和α-病毒的那些载体(Jolly,D J.1999.Friedmann T.编著的Emerging Viral Vectors.第209-40页The Development of Human Gene Therapy.New York:Cold Spring Harbor Lab)或质粒载体(诸如睡美人或其他转座子载体)。
[0161] 当病毒载体基因组包含多个待在宿主细胞中表达的多核苷酸作为单独的转录物时，病毒载体还可包含两个(或更多个)转录物之间的另外序列，从而允许双顺反子或多顺反子表达。用于病毒载体的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(IRES)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2A肽或其任何组合。
[0162] 在某些实施方案中，载体能够将转基因构建体递送至宿主细胞(例如，造血祖细胞或人免疫系统细胞)。在具体实施方案中，载体能够将转基因构建体递送至人免疫系统细胞，诸如例如CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4-CD8-双阴性T细胞、γδT细胞、天然杀伤细胞、树突细胞或其任何组合。在另外的实施方案中，载体能够将转基因构建体递送至天然T细胞、中枢记忆T细胞、效应子记忆T细胞或其任何组合。在一些实施方案中，编码本公开的多核苷酸或转基因构建体的载体可还包含编码核酸酶的多核苷酸，所述核酸酶可用于在宿主细胞中进行染色体敲除(例如，如本文所公开的CRISPR-Cas内切核酸酶或另一种内切核酸酶)或可用于在基因疗法替代或基因修复疗法中将治疗性转基因或其部分递送至宿主细胞。可替代地，可将用于染色体敲除或基因替代或基因修复疗法的核酸酶递送至宿主细胞，而不依赖于编码本公开的多核苷酸或转基因构建体的载体。
[0163] 用途
[0164] 在其他方面，本公开提供了用于治疗或预防受试者中特征在于表达HA-1抗原的过度增殖性疾病复发的方法，所述方法包括向受试者施用包含本公开的工程化免疫细胞的单位剂量(或包含工程化免疫细胞的组合物)，从而治疗过度增殖性疾病。
[0165] “治疗(treat)”或“治疗(treatment)”或“改善”是指受试者(例如，人或非人哺乳动物，诸如灵长类动物、马、猫、狗、山羊、小鼠或大鼠)的疾病、病症或病状的医学管控。通常，以足以引起治疗或预防益处的量施用包含本公开的工程化免疫细胞和任选的佐剂的适当剂量或治疗方案。治疗或预后/预防益处包括改善的临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；症状发生率下降；提高生活质量；更长的无病状态；疾病程度减少、疾病状态稳定；疾病进展延迟；缓解；存活；延长的存活期；或其任何组合。
[0166] 如本文所使用的“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生治疗作用的工程化免疫细胞的量，所述治疗作用包括改善的临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；症状发生率下降；提高生活质量；更长的无病状态；疾病程度减少、疾病状态稳定；疾病进展延迟；缓解；存活；或以统计学显著的方式延长的存活期。当提及单独的活性成分或表达单一活性成分的细胞时，单独施用的治疗有效量是指仅所述成分或表达所述成分的细胞的作用。当提及组合时，治疗有效量是指产生治疗作用的活性成分或组合的辅助活性成分与表达活性成分的细胞的组合量，无论是连续施用还是同时施用。组合也可为表达多于一种活性成分的细胞。
[0167] 术语“药学上可接受的赋形剂或载体”或“生理学上可接受的赋形剂或载体”是指生物学相容的媒介物，例如生理盐水，其在本文中更详细地描述，其适用于向人或其他非人哺乳动物受试者施用并且通常被认为是安全的或不引起严重不良事件。
[0168] 如本文所使用，“统计学显著的”是指当使用学生t-检验计算时p值为0.050或更小并且表明不太可能偶然出现测量的特定事件或结果。
[0169] 本发明公开的方法可有用于例如治疗或预防受试者中特征在于表达HA-1抗原的过度增殖性疾病复发，其中HA-1H抗原存在于由受试者中的过度增殖细胞表达的HLA复合物中。
[0170] 特征在于HA-1H:HLA复合物的过度增殖性疾病的实例包括恶性血液病。在某些实施方案中，恶性血液病包括白血病(例如，急性白血病或慢性白血病)。在具体实施方案中，白血病包括急性髓性白血病(AML)、急性淋巴细胞白血病(ALL)、混合表型急性白血病(MPAL)、慢性髓性白血病(CML)、B细胞幼淋巴细胞白血病、毛细胞白血病或慢性淋巴细胞白血病(CLL)。在某些实施方案中，恶性血液病包括淋巴瘤。在某些实施方案中，淋巴瘤包括霍奇金氏淋巴瘤(HL)、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、中枢神经系统淋巴瘤、小淋巴细胞淋巴瘤(SLL)、CD37+树突细胞淋巴瘤、淋巴浆细胞淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞骨髓瘤、骨外浆细胞瘤、粘膜相关结外边缘区B细胞淋巴瘤(MALT)淋巴组织、结节性边缘区B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、纵隔(胸腺)大B细胞淋巴瘤、前体B淋巴母细胞淋巴瘤、免疫母细胞性大细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤/白血病、不确定恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病以及移植后淋巴组织增生性疾病。-在某些实施方案中，恶性血液病包括骨髓增生异常疾病，诸如例如难治性血细胞减少症伴单系发育异常(难治性贫血、难治性中性粒细胞减少症和难治性血小板减少症)，难治性贫血伴环形铁粒幼细胞(RARS)、难治性贫血伴环形铁粒幼细胞–血小板增多症(RARS-t)、难治性血细胞减少症伴多系发育异常(RCMD)、难治性血细胞减少症伴多系发育异常和环形铁粒幼细胞(RCMD-RS)、难治性贫血伴原始细胞增多(RAEB)、不可分类的骨髓增生异常以及儿童难治性血细胞减少症。在另外的实施方案中，恶性血液病包括骨髓瘤。可通过本发明治疗的受试者通常为人和其他灵长类动物，诸如用于兽医目的的猴和猿。在任何前面提到的实施方案中，受试者可为人受试者。受试者可为男性或女性，并且可为任何合适的年龄，包括婴儿、儿童、青少年、成人和老年受试者。根据本公开的细胞可以如医学领域的技术人员所确定的适用于待治疗的疾病、病状或病症的方式施用。在任何上述实施方案中，将如本文所述的工程化免疫细胞或单位剂量静脉内、腹膜内、肿瘤内施用进入骨髓、进入淋巴结或进入脑脊髓液中，以便遇到靶细胞(例如，白血病细胞)。组合物的适当剂量、合适的持续时间和施用频率将由诸如以下这样的因素来确定：患者的病状；疾病、病状或病症的大小、类型和严重性；活性成分的具体形式；以及施用方法。
[0171] 组合物或单位剂量中的细胞的量为至少一个细胞(例如，一个工程化的CD8+T细胞亚群；一个工程化的CD4+T细胞亚群)或更通常大于102个细胞，例如，高达106个、高达107个、8 9 10
高达10 个细胞、高达10个细胞或大于10 个细胞。在某些实施方案中，细胞的施用范围为约106至约1010个细胞/m2，优选地约105至约109个细胞/m2。细胞数量将取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞类型。例如，经过修饰以含有特异于具体抗原的融合蛋白的细胞将包含含有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或更多此类细胞的细胞群。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更小、
500毫升或更小、250毫升或更小、或100毫升或更小。在实施方案中，所希望的细胞的密度通常大于104个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。细胞可在一段时间范围内作为单次输注或多次输注施用。临床相关数量的免疫细胞可被分配到累积等于或超过106、107、108、109、1010或1011个细胞的多次输注中。在某些实施方案中，单位剂量的工程化免疫细胞可与同种异体供体(例如，HA1H阴性、HLA-A2阴性或两者的供体)的造血干细胞共同施用(例如，同时或同时发生)。
高达10 个细胞、高达10个细胞或大于10 个细胞。在某些实施方案中，细胞的施用范围为约106至约1010个细胞/m2，优选地约105至约109个细胞/m2。细胞数量将取决于组合物的最终用途以及其中包含的细胞类型。例如，经过修饰以含有特异于具体抗原的融合蛋白的细胞将包含含有至少30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、
90％、95％或更多此类细胞的细胞群。对于本文提供的用途，细胞的体积通常为1升或更小、
500毫升或更小、250毫升或更小、或100毫升或更小。在实施方案中，所希望的细胞的密度通常大于104个细胞/ml，并且通常大于107个细胞/ml，通常108个细胞/ml或更大。细胞可在一段时间范围内作为单次输注或多次输注施用。临床相关数量的免疫细胞可被分配到累积等于或超过106、107、108、109、1010或1011个细胞的多次输注中。在某些实施方案中，单位剂量的工程化免疫细胞可与同种异体供体(例如，HA1H阴性、HLA-A2阴性或两者的供体)的造血干细胞共同施用(例如，同时或同时发生)。
[0172] 还想到了如本文所公开的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物(即组合物)。合适的赋形剂包括水、盐水、葡萄糖、甘油等以及其组合。在实施方案中，如本文公开的包含融合蛋白或宿主细胞的组合物还包含合适的输注介质。合适的输注介质可为任何等渗介质制剂，通常可使用生理盐水、Normosol R(Abbott)或Plasma-Lyte A(Baxter)、5％葡萄糖水溶液、乳酸林格氏液。输注介质可用人血清白蛋白或其他人血清组分补充。
[0173] 药物组合物可以如医学领域的技术人员所确定的适用于待治疗(或预防)的疾病、病状或病症的方式施用。组合物的适当剂量和合适的持续时间以及施用频率将由诸如以下这样的因素来确定：患者的健康病状、患者的大小(即，体重、质量或身体面积)、患者病状的类型和严重性、活性成分的具体形式以及施用方法。通常，适当的剂量和治疗方案提供了以下量的组合物，所述量足以提供治疗和/或预防益处(诸如本文描述的，包括改善的临床结果，诸如更频繁的完全或部分缓解、或更长时间无疾病和/或总存活期、或症状严重性减轻)。
[0174] 有效量的药物组合物是指在所需的剂量和时间段内足以实现如本文所述的所希望的临床结果或有益治疗的量。可以一次或多次施用来递送有效量。如果施用是针对已知或确认患有疾病或疾病状态的受试者，则术语“治疗量”可用于治疗，而“预防有效量”可用于描述施用有效量至易受或有发展疾病或疾病状态(例如，再现)风险的受试者作为预防过程。
[0175] 本文描述的药物组合物可存在于单位剂量或多剂量容器，诸如密封的安瓿或小瓶中。可冷冻此类容器以保持制剂的稳定性直至输注到患者体内。在某些实施方案中，单位剂量包含如本文所述的工程化免疫细胞，其剂量为约107个细胞/m2至约1011个细胞/m2。开发合适的给药和治疗方案以用于在各种治疗方案中使用本文描述的具体组合物，包括例如肠胃外或静脉内施用或制剂。
[0176] 如果肠胃外施用本发明组合物，所述组合物还可包括无菌水性或油性溶液或悬浮液。合适的无毒肠胃外可接受的稀释剂或溶剂包括水、林格氏溶液、等渗盐溶液、1,3-丁二醇、乙醇、丙二醇或聚乙二醇与水的混合物。水溶液或悬浮液可还包含一种或多种缓冲剂，诸如乙酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠或酒石酸钠。当然，用于制备任何剂量单位制剂的任何材料应当是药学上纯的并且在使用的量下基本上无毒的。此外，活性化合物可并入缓释制剂和配方中。如本文所使用，剂量单位形式是指适合作为待治疗受试者的单位剂量的物理上离散的单位；每个单位可含有预定量的工程化免疫细胞或活性化合物，其经过计算以与适当的药物载体一起产生所希望的效果。
[0177] 通常，适当的剂量和治疗方案提供足以提供益处的量的活性分子或细胞。与未治疗的受试者相比，可通过在治疗的受试者中建立改善的临床结果(例如，更频繁的缓解、完全或部分或更长的无疾病存活期)来监测这种应答。对肿瘤蛋白的预先存在的免疫应答的增加通常与改善的临床结果相关。通常可使用标准增殖、细胞毒性或细胞因子测定来评估这种免疫应答，这是常规的。
[0178] 对于预防性使用，剂量应当足以预防、延迟疾病或病症相关的疾病的发作或减轻其严重性。根据本文描述的方法施用的免疫原性组合物的预防益处可通过进行临床前(包括体外和体内动物研究)和临床研究并且通过适当的统计学、生物学和临床方法和技术分析从其中获得的数据来确定，所有这些均可由本领域技术人员容易地实施。
[0179] 如本文所使用，组合物的施用是指将所述组合物递送至受试者，无论递送的途径或模式如何。施用可连续或间歇地进行，并且肠胃外地实现。施用可用于治疗已经确认患有公认的病状、疾病或疾病状态的受试者，或用于治疗易患或有发展这种病状、疾病或疾病状态的受试者。与辅助疗法共同施用可包括以任何顺序和按照任何给药方案同时和/或顺序递送多种药剂(例如，具有一种或多种细胞因子的工程化免疫细胞；免疫抑制疗法，诸如钙调神经磷酸酶抑制剂、皮质类固醇、微管抑制剂、低剂量的霉酚酸前药或其任何组合)。
[0180] 在某些实施方案中，向受试者施用多个剂量的本文描述的工程化免疫细胞，其可在约2周至约4周之间的施用间隔下施用。
[0181] 本公开的治疗或预防方法可作为治疗过程或方案的一部分施用至受试者，其可包括在施用即时公开的单位剂量、细胞或组合物之前或之后的另外的治疗。例如，在某些实施方案中，接受单位剂量的工程化免疫细胞的受试者正在接受或先前已接受造血细胞移植(HCT；包括清髓性和非清髓性HCT)。在具体实施方案中，HCT包含HA-1-、HLA-A2-或两者的供体细胞，并且接受HCT供体细胞的受试者为HA-1+/HLA-A2+。在任何前述实施方案中，HCT中使用的造血细胞可为“通用供体”细胞，其被修饰以减少或消除编码选自HLA分子或TCR分子的多肽产物的一种或多种内源基因的表达(例如，通过根据本文描述的方法的染色体基因敲除)。用于进行HCT的技术和方案为本领域已知的，并且可包括移植任何合适的供体细胞，诸如源自脐带血、骨髓或外周血的细胞、造血干细胞、动员干细胞、或来自羊水的细胞。因此，在某些实施方案中，本发明的工程化免疫细胞可在改良的HCT疗法中与造血干细胞一起或在其后不久施用。
[0182] 在另外的实施方案中，受试者在接受工程化免疫细胞或HCT之前先前已接受了淋巴清除化学疗法。在某些实施方案中，淋巴清除化学疗法包括包含环磷酰胺、氟达拉滨、抗胸腺细胞球蛋白或其组合的预处理方案。
[0183] 根据本公开的方法可还包括施用一种或多种另外的药剂以治疗组合疗法中的疾病或病症。例如，在某些实施方案中，组合疗法包括与免疫检查点抑制剂一起施用工程化的免疫细胞(并发地、同时或相继地)。在一些实施方案中，组合疗法包括与刺激免疫检查点剂的激动剂一起施用工程化的免疫细胞。在另外的实施方案中，组合疗法包括与第二疗法，诸如化学治疗剂、放射疗法、手术、抗体或其任何组合一起施用工程化的免疫细胞。
[0184] 如本文所使用，术语“免疫抑制剂(immune suppression agent)”或“免疫抑制剂(immunosuppression agent)”是指提供抑制信号以帮助控制或抑制免疫应答的一种或多种细胞、蛋白质、分子、化合物或复合物。例如，免疫抑制剂包括部分或完全阻断免疫刺激；减少、预防或延迟免疫激活；或增加、激活或上调免疫抑制的那些分子。靶向(例如，用免疫检查点抑制剂)的示例性免疫抑制剂包括PD-1、PD-L1、PD-L2、LAG3、CTLA4、B7-H3、B7-H4、CD244/2B4、HVEM、BTLA、CD160、TIM3、GAL9、KIR、PVR1G(CD112R)、PVRL2、腺苷、A2aR、免疫抑制细胞因子(例如，IL-10、IL-4、IL-1RA、IL-35)、IDO、精氨酸酶、VISTA、TIGIT、LAIR1、CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5、Treg细胞、或其任何组合。
[0185] 免疫抑制剂(又称为免疫检查点抑制剂)可为化合物、抗体、抗体片段或融合多肽(例如，Fc融合物，诸如CTLA4-Fc或LAG3-Fc)、反义分子、核酶或RNAi分子、或低分子量有机分子。在本文公开的任何实施方案中，方法可包括单独地或以任何组合具有一种或多种下列免疫抑制组分中的任一种的抑制剂的工程化免疫细胞。
[0186] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与PD-1抑制剂组合使用，例如PD-1特异性抗体或其结合片段，诸如pidilizumab、纳武单抗、派姆单抗、MEDI0680(以前称为AMP-514)、AMP-224、BMS-936558或其任何组合。在另外的实施方案中，本公开的工程化免疫细胞(或表达所述工程化免疫细胞的工程化宿主细胞)与PD-L1特异性抗体或其结合片段组合使用，诸如BMS-936559、度伐单抗(MEDI4736)、阿特朱单抗(RG7446)、阿维单抗(MSB0010718C)、MPDL3280A或其任何组合。
[0187] 在某些实施方案中，本公开的工程化免疫细胞与LAG3抑制剂组合使用，诸如LAG525、IMP321、IMP701、9H12、BMS-986016或其任何组合。
[0188] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与CTLA4抑制剂组合使用。在具体实施方案中，工程化免疫细胞与CTLA4特异性抗体或其结合片段组合使用，诸如伊匹木单抗、替西木单抗、CTLA4-Ig融合蛋白(例如，阿巴西普、贝拉西普)或其任何组合。
[0189] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与B7-H3特异性抗体或其结合片段组合使用，诸如地诺单抗(MGA271)、376.96或两者。B7-H4抗体结合片段可为scFv或其融合蛋白，如在例如Dangaj等人,Cancer Res.73:4820,2013中所述以及在美国专利号9,574,000和PCT专利公布号WO/201640724A1和WO 2013/025779A1中描述的那些。
[0190] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与CD244抑制剂组合使用。
[0191] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与BLTA、HVEM、CD160或其任何组合的抑制剂组合使用。抗CD-160抗体描述于例如PCT公布号WO 2010/084158中。
[0192] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与TIM3抑制剂组合使用。
[0193] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与Gal9抑制剂组合使用。
[0194] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与腺苷信号传导的抑制剂诸如诱饵腺苷受体(decoy adenosine receptor)组合使用。
[0195] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与A2aR抑制剂组合使用。
[0196] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与KIR抑制剂，诸如利丽单抗(BMS-986015)组合使用。
[0197] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与抑制性细胞因子(通常，除TGFβ之外的细胞因子)或Treg发育或活性的抑制剂组合使用。
[0198] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与IDO抑制剂组合使用，诸如左旋-1-甲基色氨酸、埃帕卡斯特(INCB024360；Liu等人,Blood 115:3520-30,2010)、依布硒啉(Terentis等人,Biochem.49:591-600,2010)、indoximod、NLG919(Mautino等人,美国癌症研究协会第104届年会2013；2013年4月6-10日)、1-甲基-色氨酸(1-MT)-替拉扎明或其任何组合。
[0199] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与精氨酸酶抑制剂组合使用，诸如N(ω)-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)、N-ω-羟基-去甲基-l-精氨酸(去甲基-NOHA)、L-NOHA、2(S)-氨基-6-硼代己酸(ABH)、S-(2-硼乙基)-L-半胱氨酸(BEC)或其任何组合。
[0200] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与VISTA抑制剂，诸如CA-170(Curis,Lexington,Mass.)组合使用。
[0201] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与TIGIT的抑制剂诸如COM902(加拿大安大略省多伦多Compugen公司(Compugen,Toronto,Ontario Canada))、CD155的抑制剂诸如例如COM701(Compugen公司)或两者组合使用。
[0202] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与PVRIG、PVRL2或两者的抑制剂组合使用。抗PVRIG抗体描述于例如PCT公布号WO 2016/134333中。抗PVRL2抗体描述于例如PCT公布号WO 2017/021526中。
[0203] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与LAIR1抑制剂组合使用。
[0204] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与CEACAM-1、CEACAM-3、CEACAM-5或其任何组合的抑制剂组合使用。
[0205] 在某些实施方案中，工程化免疫细胞与增加刺激性免疫检查点分子的活性的试剂(即，为激动剂)组合使用。例如，工程化的免疫细胞可与CD137(4-1BB)激动剂(诸如例如乌瑞鲁单抗)、CD134(OX-40)激动剂(诸如例如MEDI6469、MEDI6383或MEDI0562)、来那度胺、泊马度胺、CD27激动剂(诸如例如CDX-1127)、CD28激动剂(诸如例如TGN1412、CD80或CD86)、CD40激动剂(诸如例如CP-870、CP-893、rhuCD40L或SGN-40)、CD122激动剂(诸如例如IL-2)、GITR的激动剂(诸如例如PCT专利公布号WO 2016/054638中描述的人源化单克隆抗体)、ICOS的激动剂(CD278)(诸如例如GSK3359609、mAb 88.2、JTX-2011、Icos 145-1、Icos 314-8或其任何组合)组合使用。在本文公开的任何实施方案中，方法可包括单独地或以任何组合与包括前述任何的刺激免疫检查点分子的一种或多种激动剂一起施用工程化免疫细胞。
[0206] 在某些实施方案中，组合疗法包括工程化免疫细胞和包含以下一种或多种的二级疗法：特异于由非发炎实体瘤表达的癌症抗原的抗体或其抗原结合片段、放射治疗、手术、化学治疗剂、细胞因子、RNAi或其任何组合。
[0207] 在某些实施方案中，组合疗法包括施用融合蛋白并且进一步施用放射治疗或手术。放射疗法为本领域中众所周知的，并且包括X射线疗法，诸如γ-照射和放射性药物疗法。适合于治疗受试者中的给定癌症的手术和外科手术技术为本领域普通技术人员所众所周知的。
[0208] 在某些实施方案中，组合疗法包括施用工程化免疫细胞并且进一步施用化学治疗剂。化学治疗剂包括但不限于染色质功能抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、微管抑制药物、DNA损伤剂、抗代谢物(诸如叶酸拮抗剂、嘧啶类似物、嘌呤类似物和糖修饰类似物)、DNA合成抑制剂、DNA相互作用剂(诸如嵌入剂)以及DNA修复抑制剂。说明性的化学治疗剂包括但不限于以下组：抗代谢物/抗肿瘤剂，诸如嘧啶类似物(5-氟尿嘧啶、氟尿苷、卡培他滨、吉西他滨和阿糖胞苷)和嘌呤类似物，叶酸拮抗剂和相关抑制剂(巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、喷司他丁和2-氯脱氧腺苷(克拉屈滨))；抗增殖/抗有丝分裂剂，包括天然产物诸如长春花生物碱(长春花碱、长春新碱和长春瑞滨)、微管破坏剂诸如紫杉烷(紫杉醇、多西紫杉醇)、长春新碱、长春花碱、诺考达唑、埃博霉素和长春瑞滨、表鬼臼毒素(依托泊苷、替尼泊苷)、DNA损伤药剂(放线菌素、安吖嗪、蒽环霉素、博来霉素、白消安、喜树碱、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、癌得星(Cytoxan)、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、六甲基蜜胺喹利铂、异膦胺、美法仑、氯苄胺、丝裂霉素、米托蒽醌、亚硝基脲、普力霉素、丙卡巴肼、紫杉醇、泰索帝、替莫唑胺、替尼泊苷、三乙基硫代磷酰胺和依托泊苷(VP 16))；抗生素诸如更生霉素(放线菌素D)、柔红霉素、多柔比星(阿霉素)、伊达比星、蒽环类、米托蒽醌、博来霉素、普卡霉素(光神霉素)和丝裂霉素；酶(系统代谢L-天冬酰胺并剥夺不具有合成自身天冬酰胺能力的细胞的L-天冬酰胺酶)；抗血小板药剂；抗增殖/抗有丝分裂烷化剂诸如氮芥(双氯乙基甲胺、环磷酰胺和类似物、美法仑、苯丁酸氮芥)、乙烯亚胺和甲基三聚氰胺(六甲三聚氰胺和塞替派)、烷基磺酸盐-白消安、亚硝基脲(卡莫司汀(BCNU)和类似物、链佐星)、曲嗪类-达卡巴嗪(DTIC)；抗增殖/抗有丝分裂抗代谢物诸如叶酸类似物(甲氨蝶呤)；铂配位复合物(顺铂、卡铂)、丙卡巴肼、羟基脲、米托坦、氨基戊二酰亚胺；激素，激素类似物(雌激素、他莫昔芬、戈舍瑞林、比卡鲁胺、尼鲁米特)和芳香酶抑制剂(来曲唑、阿那曲唑)；抗凝血剂(肝素、合成肝素盐和其他凝血酶抑制剂)；纤维蛋白裂解剂(诸如组织纤溶酶原激活剂、链激酶和尿激酶)、阿司匹林、双嘧达莫、噻氯匹定、氯吡格雷、阿昔单抗；抗迁移剂；抗分泌剂(布雷非德菌素)；免疫抑制剂(环孢菌素、他克莫司(FK-506)、西罗莫司(雷帕霉素)、硫唑嘌呤、霉酚酸酯)；抗血管生成化合物(TNP470，染料木黄酮)和生长因子抑制剂(血管内皮生长因子(VEGF)抑制剂、成纤维细胞生长因子(FGF)抑制剂)；血管紧张素受体阻断剂；一氧化氮供体；反义寡核苷酸；抗体(曲妥珠单抗、利妥昔单抗)；嵌合抗原受体；细胞周期抑制剂和分化诱导剂(维甲酸)；mTOR抑制剂、拓扑异构酶抑制剂(多柔比星(阿霉素)、安吖啶、喜树碱、柔红霉素、放线菌素、依地平苷、表柔比星、依托泊苷、伊达比星、伊立替康(CPT-11)和米托蒽醌、拓扑替康、伊立替康)、皮质类固醇(可的松、地塞米松、氢化可的松、甲基强的松龙、泼尼松和泼尼松龙)；生长因子信号转导激酶抑制剂；线粒体功能障碍诱导剂，毒素诸如霍乱毒素、蓖麻毒素、假单胞菌外毒素、百日咳博德特氏菌腺苷酸环化酶毒素或白喉毒素以及半胱天冬酶激活剂；以及染色质破坏剂。
[0209] 细胞因子越来越多地用于操纵针对抗癌活性的宿主免疫应答。参见，例如Floros&Tarhini,Semin.Oncol.42(4):539-548,2015。有用于促进免疫抗癌或抗肿瘤应答的细胞因子包括例如单独地或与本公开的工程化免疫细胞任意组合的IFN-α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-10、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-21、IL-24和GM-CSF。
[0210] 本文还提供了用于调节过继免疫疗法的方法，其中所述方法包括向先前已接受包含编码安全开关蛋白的异源多核苷酸的本公开的工程化免疫细胞的受试者，施用有效于在受试者中消融先前施用的工程化免疫细胞的量的安全开关蛋白的同源化合物。
[0211] 如本文所使用，术语“过继免疫疗法(adoptive immune therapy)”或“过继免疫疗法(adoptive immunotherapy)”是指施用天然存在的或基因工程的疾病或抗原特异性免疫细胞(例如，T细胞)。过继细胞免疫疗法可为自体的(免疫细胞来自受体)、同种异体(免疫细胞来自相同物种的供体)或同源(免疫细胞来自与受体遗传上相同的供体)。
[0212] 在某些实施方案中，安全开关蛋白包含tEGFR并且同源化合物为西妥昔单抗，或安全开关蛋白包含iCasp9并且同源化合物为AP1903(例如，二聚化的AP1903)，或安全开关蛋白包含RQR多肽并且同源化合物为利妥昔单抗，或安全开关蛋白包含myc结合域并且同源化合物为特异于myc结合域的抗体。
[0213] 在另外的方面，提供了用于制造本公开的组合物或单位剂量的方法。在某些实施方案中，方法包括将(i)用本公开的载体转导的宿主细胞的等分试样与(ii)药学上可接受的载体组合。在某些实施方案中，本公开的载体用于转染/转导宿主细胞(例如，T细胞)以用于过继转移疗法(例如，靶向癌症抗原)。
[0214] 在一些实施方案中，方法还包括在进行等分试样之前培养转导的宿主细胞，并且根据并入(即，表达)的载体选择转导的细胞。在另外的实施方案中，方法包括在培养和选择之后并且在进行等分试样之前，扩增转导的宿主细胞。在本发明方法的任何实施方案中，可冷冻所制造的组合物或单位剂量以用于后续使用。根据本发明方法，任何适当的宿主细胞可用于制造组合物或单位剂量，包括例如造血干细胞、T细胞、原代T细胞、T细胞系、NK细胞或NK-T细胞。在具体实施方案中，方法包括作为CD4+T细胞或CD8+T细胞的宿主细胞。
[0215] 实施例
[0216] 实施例1
[0217] HA-1H特异性TCR的分离和克隆
[0218] 使用先前描述的体外方法分离HA-1H特异性CD8+T细胞克隆(Bleakley等人,Blood 115:4923-4933,2010(图1)。确切地说，使用CD8+T细胞分离试剂盒和抗CD45RO免疫磁珠(Miltenyi Biotec)，从HLA-A2+供体(2个供体)外周血单核细胞(PBMC)分离CD8+T细胞。将自体树突细胞(DC)用1μg/mL HA-1H肽(VL DDLLEA)在37℃下脉冲3-6小时。纯化的CD8+TN在完全T淋巴细胞(CTL)培养基中与肽脉冲的DC以30:1的TN与DC的比率合并，并且以6x104个T细胞/孔在96孔板中共培养，自开始用10ng/mL IL-12补充并且自第7天用10ng/mL IL-15补充。在第11-13天，在分裂孔微量铬释放测定(CRA；μCRA)中评估细胞的HA-1H特异性细胞毒性。随后通过使用抗CD3单克隆抗体(mAb)、白细胞介素-2(IL-2)和饲养细胞的有限稀释来克隆裂解用1ug/mL HA-1H肽脉冲的T2细胞的T细胞系(>20％细胞裂解并且肽脉冲相对于未脉冲是靶标的细胞裂解多>5倍)。
[0219] 在第11-13天通过μCRA筛选克隆。通过快速扩增方案(REP)，使用抗CD3mAb、IL-2和饲养细胞扩增来自使用上述标准示出特异性细胞毒性的孔的T细胞克隆。通过CRA、HA-1/HLA-A2多聚体染色和细胞内细胞因子染色(ICC)评估扩增克隆的特异性。用HA-1H/HLA A2多聚体验证CTL克隆的HA-1H特异性。具体地说，使用HLA-A2/HA-1H多聚体和CD8+单克隆抗体(mAb)对HA-1特异性克隆(克隆1、2、10、13、14、16和5)和特异于另一种肿瘤抗原的对照克隆进行染色(图2A)。
[0220] 此外，使用铬释放测定(CRA)测试7种HA-1特异性CTL克隆(1、2、10、13、14、16和5)以用于杀伤HA-1H肽脉冲的靶标。T细胞克隆在非常低的肽浓度下识别HA-1H肽(VLDDLLEA)-脉冲的靶细胞，并且在10pM的肽浓度下观察到半数最大裂解。(图2B)(ICC数据未示出)。还检查了分离的克隆对具有或不具有内源HA-1H表达的细胞的细胞毒性。测定显示7种HA-1H特异性CTL克隆(TCR1、TCR2、TCR10、TCR13、TCR14、TCR16和TCR5)裂解HA-1H+急性髓性白血病(AML)细胞系(THP-1)和HA-1H+原发性AML而非HA-1H-AML(图2C)。
[0221] 接下来，克隆分离的HA-1H TCR。对8种CTL的TCR Vβ和Vα基因进行测序，并且鉴定出6种不同的TCR(发现TCR1和TCR13为相同的，TCR2和TCR14也是如此)。编码6种TCR的基因(和特异性等位基因)以及TCR的VβCDR3氨基酸序列如表1所示：
[0222] 表1.分离的TCR的基因和βCDR3序列
[0223]
[0224] 还鉴定了第七种TCR，“TCR29”并且进行测序。如下所述，测序后，编码HA-1H TCR的基因(TCR24除外，其在转导的CD8+T细胞中功能较差)进行密码子优化以最大化表达且引入半胱氨酸修饰，并且降低与内源性TCR链错配的风险。密码子优化和半胱氨酸修饰后的CTL克隆TCRβ和TCRα基因的核苷酸序列在SEQ ID NO 39-48和51-52中提供。
[0225] 从每个HA-1H特异性T细胞克隆中提取RNA。使用SMARTer RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech Laboratories)进行5'-第一链cDNA扩增和cDNA末端快速扩增(RACE)PCR以鉴定全长TCR区。使用5’CDS引物A、SMARTer IIA寡聚物和SMARTScribe逆转录酶从RNA合成cDNA。随后，使用 高保真性DNA聚合酶和用于TCRα(α)-(5’-GGTGAATAGGCAGACAGACTT-
3’)(SEQ ID NO:93)或TCRβ(β)-链(GTGGCCAGGCACACCAGTGT)(SEQ ID NO:94)的基因特异性引物，使用cDNA进行RACE PCR反应。纯化RACE PCR产物并且测序以鉴定TCRα和TCRβ链。使用IMGT/V-QUEST来定义TCR可变(V)区、多样性(D)区和连接(J)区。
3’)(SEQ ID NO:93)或TCRβ(β)-链(GTGGCCAGGCACACCAGTGT)(SEQ ID NO:94)的基因特异性引物，使用cDNA进行RACE PCR反应。纯化RACE PCR产物并且测序以鉴定TCRα和TCRβ链。使用IMGT/V-QUEST来定义TCR可变(V)区、多样性(D)区和连接(J)区。
[0226] 将第48位(Thr至Cys)和第57位(Ser至Cys)处的互补半胱氨酸残基并入TCRα和TCRβ基因的恒定域中以增加外源TCR配对并且减少与内源TCR的错配。为了确保协同的基因表达，TCR链由来自猪捷申病毒(P2A)的2A元件分开。对转基因进行密码子优化以增强表达并且由GeneArt(Life Technologies)合成，并且通过限制性消化和连接将其克隆到pRRLSIN.cPPT.MSCV.WPRE LV载体中。编码的TCR构建体的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:
53-57中。
53-57中。
[0227] 实施例2
[0228] HA-1H特异性TCR的异源表达和活性
[0229] 接下来，测试密码子优化的和半胱氨酸修饰的TCR的表达和活性。
[0230] 使用慢病毒(LV)载体来转导原代T细胞以递送编码工程化的HA-1H特异性TCR构建H H体的多核苷酸。对转导的T细胞进行分选、扩增，并且测试HA-1特异性(图4)。六种HA-1 TCR LV中的五种高效地转导原代CD8+T细胞和CD4+T细胞(图5A和6A)，并且赋予用少量HA-1H肽脉冲的HLA-A2+细胞的特异性识别。TCR2和TCR16表现出最强的细胞毒性活性，并且被选择用于进一步的实验。用这些TCR转导的T细胞杀伤HA-1H脉冲的细胞(图5B、5C、6B和35)、具有内H H
源HA-1表达的细胞系(图6C-6E和图7)和具有内源HA-1的原代白血病细胞(图8A-8E、图9)，但这些工程化的细胞未被HA-1H阴性细胞(图7)、原代白血病细胞(图8A、8B和9)或成纤维细胞(图10)激活并且未杀伤所述的这些细胞。另外，CD8+和CD4+HA-1H TCR T细胞响应于HA-1H肽刺激分泌IFNγ和IL-2(数据未示出)。HA-1H TCR CD4+细胞杀伤用高肽浓度脉冲的靶细胞，尽管单独用HA-1H TCR进行的LV转导不能使CD4+T细胞响应于具有天然水平的抗原的原代白血病细胞(数据未示出)。
源HA-1表达的细胞系(图6C-6E和图7)和具有内源HA-1的原代白血病细胞(图8A-8E、图9)，但这些工程化的细胞未被HA-1H阴性细胞(图7)、原代白血病细胞(图8A、8B和9)或成纤维细胞(图10)激活并且未杀伤所述的这些细胞。另外，CD8+和CD4+HA-1H TCR T细胞响应于HA-1H肽刺激分泌IFNγ和IL-2(数据未示出)。HA-1H TCR CD4+细胞杀伤用高肽浓度脉冲的靶细胞，尽管单独用HA-1H TCR进行的LV转导不能使CD4+T细胞响应于具有天然水平的抗原的原代白血病细胞(数据未示出)。
[0231] 总之，这些数据表明T细胞有效表达转导的HA-1H TCR并且具有对抗淋巴样细胞的抗原特异性杀伤活性。
[0232] 实施例3
[0233] CD4+HA-1H TCR细胞中的CD8辅助受体功能
[0234] 免疫疗法细胞产物中包含CD4+T细胞可提供抗原诱导的IL-2分泌，并且增强转移的细胞毒性CD8+T细胞的持久性和功能(参见，Kennedy等人,Immunol.Rev.222:129(2008)；Nakanishi等人,Nature 462(7272):510(2009))。然而，CD4+T细胞中的许多I类限制性TCR的优化功能要求CD8辅助受体转移以增强TCR对I类HLA肽复合物的敏感性。CD4辅助受体在结构上与CD8不同并且不能有效取代CD8辅助受体(参见，例如Stone&Kranz,
Front.Immunol.4:244(2013)；还参见Cole等人,Immunology 137(2):139(2012))。需要相对高的HA-1H肽浓度来诱导在单独用HA-1H TCR转导的CD4+T细胞中的细胞裂解活性，并且+
HA-1TCR CD4 T细胞不识别细胞系或白血病，暗示着TCR的CD8辅助受体依赖性(数据未示出)。
Front.Immunol.4:244(2013)；还参见Cole等人,Immunology 137(2):139(2012))。需要相对高的HA-1H肽浓度来诱导在单独用HA-1H TCR转导的CD4+T细胞中的细胞裂解活性，并且+
HA-1TCR CD4 T细胞不识别细胞系或白血病，暗示着TCR的CD8辅助受体依赖性(数据未示出)。
[0235] 探究了用于在转基因构建体中包括CD8辅助受体的各种选择。CD8辅助受体存在于人常规αβTCR T细胞的表面上，通常作为CD8α链和CD8β链的二聚体，并且存在五种具有不同胞质内尾序列的β链变体(βM1-5)(参见例如Thakral等人,J.Immunol.180(11):7431(2008)；还参见Thakral等人,PLoS One8(3):e59374(2013))。CD8辅助受体链的氨基酸序列提供在SEQ ID NO:48-53中。
[0236] 生成HA-1H TCR2构建体，其包括CD8α链和CD8β链中的一个或两个作为全长或截短变体。当用于转导原代CD4+T细胞时，α链和β链在细胞表面上表达；与β单体相比，αβ二聚体和α单体更大程度地增加了通过TCR转导的T细胞进行的HA-1H/HLA-A2多聚体结合(图11A(i-ii))。具有细胞内链组分截短的CD8α链和β链未能使多聚体结合增加至超过单独的TCR(图11A(iii))。与CD8α和βM2或βM5链相比，用CD8α和βM1或βM4变体的转导更大地改善了CD4+T细胞中的HA-1H TCR功能(图11B)。在功能测定中，与CD8α单体相比，βM1或βM4链的并入更大程度地改善了CD4+T细胞功能(图11B和11C)。βM1与βM4相比提供更高的应答特异性。因H此，选择βM1变体并且用于包括CD8α和βM1序列以及HA-1 TCR的多顺反子LV中。用载体转导的CD4+T细胞分泌IL-2和干扰素γ(IFNγ)(图12A)，并且在与HA-1H+AML细胞共培养时增殖(图12B)。
[0237] 实施例4
[0238] 将安全开关引入HA-1H TCR构建体中
[0239] 为了确保HA-1H TCR转导的T细胞可在任何意外毒性的情况下快速耗尽，生成了四个密码子优化的“安全开关”HA-1H TCR构建体：(1)诱导型半胱天冬酶9(iCasp9)是基于人半胱天冬酶9与修饰的人FK结合蛋白的融合，允许有条件的二聚化；当暴露于合成二聚化药物时，iCasp9被激活并且引发表达这个构建体的细胞的快速死亡(参见，例如Straathof等人,Blood 105(11):4247(2005))；(2)截短的人EGFR("tEGFR")为缺乏细胞外N-末端配体结合域和细胞内受体酪氨酸激酶活性的多肽，但保留I型跨膜细胞表面定位和药物级抗EGFR mAb西妥昔单抗的结合表位(参见Wang等人,Blood 118(5):4255(2011))；(3)RQR8为用于T细胞的紧凑组合标志物和安全开关，其组合来自呈递在截短的CD8辅助受体茎上的CD34(由抗体QBEnd10识别的标志物)和CD20抗原(细胞外环模拟表位)的靶表位；RQR8与药物级抗CD20mAb利妥昔单抗结合(参见Philip等人,Blood124(8):1255(2011))；(4)Myc-标记的TCR并入人c-Myc蛋白的10个氨基酸标签，所述人c-Myc蛋白与标签特异性mAb结合(参见Kieback等人,PNAS 105(2):623(2008))。
[0240] 相应的mAb与tEGFR、RQR8或myc-标签的结合提供了针对补体依赖性或抗体依赖性细胞细胞毒性和转导的细胞的消除的靶标。将安全开关分子克隆到TCR2LV构建体中，并且在TCRβ和TCRα编码序列的上游并与其可操作地缔合。通过来自猪捷申病毒的P2A元件分离TCRβ和TCRα序列以确保协同的基因表达。用iCasp9-HA-1H TCR、tEGFR-HA-1H TCR、RQR8-HA-1H TCR或Myc-标签的HA-1H-TCR转导的T细胞都展示出HA-1H TCR表达和HA-1H+靶细胞识别，相似于仅用HA-1H TCR转导的T细胞的识别(图14)。
[0241] 为了测试安全开关消除T细胞的能力，用最佳浓度(图16)的相应同源药物(用于iCasp9/HA-1H TCR的二聚化物AP1903；补体加适当的mAb(用于tEGFR-HA-1H TCR的抗EGFR H HmAb；用于RQR8-HA-1 TCR的抗CD20mAb；以及用于所有其他构建体中的Myc-标签的HA-1 -TCR的抗Myc标签mAb))，将转导的T细胞孵育24小时。所有安全开关转导的T细胞都易受其相应的触发剂影响(图16，还参见图15)。然而，用AP1903的iCasp9始终提供转导的T细胞的最快速且完全的消除，并且被选择用于进一步评估。
[0242] 实施例5
[0243] 转基因构建体的设计和选择
[0244] 接下来，分析并入iCasp9和CD8αβM1辅助受体的HA-1H TCR转基因的功能性。为了帮助选择和跟踪转导的T细胞，设计了两种标志物构造。在一种标志物构造中，将RQR多肽的最小CD34表位(“Q”)嵌套在HA-1H TCR的α链中。在另一种标志物构造中，将RQR多肽并入到全长功能性CD8αβM1辅助受体的β链中。然后创建五种LV转基因构建体，用它们转导CD8+T细胞，并且比较：(1)iCasp9-HA-1H TCR2；(2)HA-1H-TCR2-CD8辅助受体；(3)iCasp9-HA-1H TCR2-CD8；(4)iCasp9-HA-1H TCR2-RQR-CD8；以及(5)iCasp9-CD34-HA-1H TCR2-CD8(参见图17和18)。
[0245] 所有构建体均产生特异性分泌细胞因子并且杀伤HA-1H+但不杀伤HA-1H-AML细胞或成纤维细胞的T细胞，并且具有相似的功能(参见图19-26)，除了表现不佳的iCasp9-CD34-HA-1H TCR2-CD8构建体(具有嵌入到TCRα链中的CD34表位)。选择iCasp9-HA-1H TCR2-RQR-CD8转基因用于进一步研究，其含有所有所希望的元件(包括免疫磁性选择的能力；参见图27-29)并且与较不复杂的构建体所起作用一样好。这个构建体的示意图示于图30中，并且构建体的核苷酸序列提供在SEQ ID NO:85中。
[0246] 实施例6
[0247] HA-1H TCR T细胞的临床规模生产和测试
[0248] T细胞免疫疗法产品的细胞组成可对过继性T细胞转移后的抗原特异性T细胞的持久性和功能具有重要的下游作用(参见，例如Sommermeyer等人,Leukemia 30(2):492(2016)；还参见Wang等人,Blood 117(6):1888(2011)和Hinrichs等人,PNAS 106*41):17469(2009))。通常，输注源自“较年轻”T细胞亚群的抗原特异性T细胞(包括TN、T记忆干细胞(TSCM)和中枢记忆T细胞(TCM))似乎是有利的。在HCT后T细胞免疫疗法的背景下，考虑供体T细胞的天然TCR介导的GVHD的潜力也是重要的。TN在鼠模型中引起严重的GVHD，并且PBSC移植物中CD45RA+TN的耗尽降低了人类严重和/或慢性GVHD的风险(参见，例如Bleakley等人,J.Clin.Invest.125(7):2677(2015)。还希望包括特异于相同抗原的CD4+和CD8+细胞，因为CD4+T辅助细胞可通过增强肿瘤部位的克隆扩增并且防止激活诱导的细胞死亡来增强抗肿瘤CTL应答(参见，例如Giuntoli等人,Clin.Cancer Res.8(3):922(2002)；还参见Kennedy和Celis,J.Immunol.177(5):2862(2006))。因此，在分离CD8+和CD4+富集级分以确保一致的CD4:CD8组成(每种细胞类型约3x106个细胞)并且刺激(CD3/CD28微珠珠)且转导(用iCasp9-HA1TCR2-RQR-CD8LV)T细胞之前，T细胞产物(1-2x 109PBSC/PBMC)首先耗尽CD45RA+TN细胞以使严重GVHD的风险最小化，并且耗尽CD14+单核细胞以优化LV转导效率。
[0249] 4-5天后使用HA-1H/HLA-A2多聚体和CD34mAb对转导的细胞进行流动分选，并且使用包含OKT3细胞、PBMC、HA-1+LCL和IL-2的REP(快速扩增方案)在G-Rex烧瓶中进行培养。CD4+和CD8+HA-1HTCR记忆T细胞高效地扩增，其中平均扩增2000倍(图32A；还参见图31，最左侧的图)。收获并且合并CD4+和CD8+转导的T细胞(在第16-20天共3-6x109个细胞)，然后通过
9
选择CD34富集以产生具有≥1.5x 10个细胞的富集群体。然后进行释放测定以测试纯度(>
75％)、活力、功能、特异性、病毒的存在或不存在以及无菌性。最终的T细胞产物保留了HA-
1H TCR的表达(图32B)，主要具有CD45RO+CD28+表型(所述表型具有CD62L、CCR7和CD27的可变表达)(图32C)，并且包括不表达耗竭标志物的细胞，诸如PD-1(图32D、32E)。
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选择CD34富集以产生具有≥1.5x 10个细胞的富集群体。然后进行释放测定以测试纯度(>
75％)、活力、功能、特异性、病毒的存在或不存在以及无菌性。最终的T细胞产物保留了HA-
1H TCR的表达(图32B)，主要具有CD45RO+CD28+表型(所述表型具有CD62L、CCR7和CD27的可变表达)(图32C)，并且包括不表达耗竭标志物的细胞，诸如PD-1(图32D、32E)。
[0250] 扩增的CD8+和CD4+HA-1H TCR T细胞保留其响应于HA-1H脉冲的细胞(图33A)或HA-1H+白血病细胞系(图33B)的刺激来特异性杀伤和分泌细胞因子的能力，并且许多HA-1H TCR CD8+和CD4+细胞分泌多种细胞因子(图33C；还参见图31中图和右图)。此外，可使用抗CD34免疫磁珠富集细胞(图34A)，并且通过暴露于AP1903二聚化物药物中高效地消除细胞(图
34B)。最后，使用TCR免疫测序(Adaptive Biotechnologies)评估细胞产物中HA-1H TCR CD4+和CD8+T细胞中的天然TCR，并且观察到多种多克隆群(数据未给出)。此外，产物含有许多极低频率的TCR，这一发现最近与过继性T细胞转移后的持久性和扩增的可能性相关(Chapuis等人,Sci.Immunol.2(8)(2017)。
34B)。最后，使用TCR免疫测序(Adaptive Biotechnologies)评估细胞产物中HA-1H TCR CD4+和CD8+T细胞中的天然TCR，并且观察到多种多克隆群(数据未给出)。此外，产物含有许多极低频率的TCR，这一发现最近与过继性T细胞转移后的持久性和扩增的可能性相关(Chapuis等人,Sci.Immunol.2(8)(2017)。
[0251] 实施例7
[0252] 使用HA-1H T细胞治疗产品的临床研究
[0253] 使用实施例5中描述的HA-1H细胞治疗产品(用pRRLSIN iC9-HA-1H-TCR2-RQR-CD8转导的CD8+和CD4+记忆T细胞；下文缩写为“HA-1H TCR LV”)进行可行性和安全性研究。患者样品包括患有复发性白血病(AML、ALL、另一种急性白血病或CML)的儿童、青少年和成人。确切地说，0-70岁的患者被招募到两个年龄组，每组约12名受试者：一组年龄≥16岁，并且一组年龄<16岁。所有患者均表达HLA-A*0201并且具有HA-1(H)基因型(RS_1801284：A/G、A/A)。患者还具有通过机构标准进行了充分地HLA匹配的用于HCT的成人供体，并且目前正在经历或曾经经历同种异体HCT以用于AML、ALL、另一种类型的急性白血病或慢性髓性白血病。
[0254] 在怀疑复发后取得骨髓样品。然后患者在用T细胞产品输注之前通常接受淋巴清除化疗(氟达拉滨)。此后，当满足以下三个标准时，给患者施用单剂量的HA-1H TCR LV-T细胞(约1:1CD4+:CD8+TM)：(1)有证据表明HCT后复发或难治性疾病；(2)已生成HA-1H TCR T细胞；以及(3)施用淋巴清除化疗(如果有指示)。根据表2中提供的剂量方案，通过输注(与经由重力或注射泵穿过中心静脉导管耐受的那样快速)施用HA-1H TCR LV-T细胞。
[0255] 表2.临床给药方案
[0256]剂量水平 剂量(HA-1H TCR T细胞)
-1 高达3x 105/kg
0 高达1x 106/kg
1 高达3x 106/kg 起始剂量
2 高达10x 106/kg
3 高达30x 106/kg
-1 高达3x 105/kg
0 高达1x 106/kg
1 高达3x 106/kg 起始剂量
2 高达10x 106/kg
3 高达30x 106/kg
[0257] 在较年轻的群组中治疗受试者之前，对至少1-2名≥16岁的受试者进行治疗。在每个年龄组(≥16岁和<16岁)中，在5个剂量水平的HA-1H TCR T细胞中的一个下，从剂量水平6 H
1开始(3x 10HA-1 TCR T细胞/kg)在三个或更多个患者的群组中对患者进行治疗。观察将研究药剂施用给每个年龄组内的连续受试者之间的28天时期。在输注T细胞产品后的第4天、第18天和第32天取得骨髓样品。研究的其他方面包括监测：外周血中转移的HA-1H TCR T细胞的体内持久性；HA-1H TCR T细胞迁移至骨髓的能力；HA-1H TCR T细胞在过继性T细胞H
转移之前和(如果可能)之后的功能；输注HA-1 TCR T细胞后是否减少白血病负担；输注HA-1H TCR T细胞后是否减少接受者造血干细胞嵌合体；以及输注HA-1H TCR T细胞后是否出现或复发移植物抗宿主疾病(GVHD)的体征或症状。
1开始(3x 10HA-1 TCR T细胞/kg)在三个或更多个患者的群组中对患者进行治疗。观察将研究药剂施用给每个年龄组内的连续受试者之间的28天时期。在输注T细胞产品后的第4天、第18天和第32天取得骨髓样品。研究的其他方面包括监测：外周血中转移的HA-1H TCR T细胞的体内持久性；HA-1H TCR T细胞迁移至骨髓的能力；HA-1H TCR T细胞在过继性T细胞H
转移之前和(如果可能)之后的功能；输注HA-1 TCR T细胞后是否减少白血病负担；输注HA-1H TCR T细胞后是否减少接受者造血干细胞嵌合体；以及输注HA-1H TCR T细胞后是否出现或复发移植物抗宿主疾病(GVHD)的体征或症状。
[0258] 本申请要求其优先权的2016年9月23日提交的美国临时专利申请号62/399,291特此以引用的方式整体并入本文。
[0259] 可组合上述各种实施方案以提供另外的实施方案。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物均以引用的方式整体并入本文。如果必要，可修改实施方案的各方面以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供另外的实施方案。
[0260] 根据以上详细描述，可对实施方案进行这些和其他变化。通常，在以下权利要求书中，所使用的术语不应当被解释为将权利要求书限制于本说明书和权利要求书中公开的具体实施方案，而是应当被解释为包括所有可能的实施方案以及此类权利要求给予权利的等同物的全部范围。因此，权利要求书不受本公开的限制。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
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| 消融设备 | 2020-05-13 | 675 |
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| 消融导管 | 2020-05-14 | 583 |
| 消融过程中微泡形成的检测 | 2020-05-12 | 284 |
| 对消融导管的独立被动冷却设计 | 2020-05-12 | 873 |
| 具有可展开注入管的低温消融装置 | 2020-05-13 | 826 |
| 用于检测消融期间组织接触的系统 | 2020-05-13 | 436 |
| 消融导管 | 2020-05-15 | 40 |
| 消融导管 | 2020-05-15 | 947 |
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