多重体：包封的微滴网络
阅读：323发布：2021-05-14
专利汇可以提供多重体：包封的微滴网络专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一种微滴包封体，其包含疏 水 性介质的液滴；包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和在外围层内的水性微滴，该水性微滴包含(a)水性介质和(b)围绕水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层。本发明还提供制备该微滴包封体的方法。本发明还描述了该微滴包封体的各种用途，包括它们作为药物递送载体的用途、在合成 生物 学中的用途、以及在膜蛋白研究中的用途。，下面是多重体：包封的微滴网络专利的具体信息内容。
1.一种微滴包封体，包含：
- 疏水性介质的液滴；
- 包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和
- 在所述外围层内的多个水性微滴，其中每个所述水性微滴包含：(a)水性介质，和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；其中所述水性微滴中的第一个水性微滴的部分外层接触所述水性微滴中的第二个水性微滴的部分外层，从而在所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
2.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中：
所述外围层包含单层的非聚合两亲性分子；和/或
所述外层包含单层的非聚合两亲性分子。
3.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中在所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的界面处的所述双层进一步包含膜蛋白。
4.根据权利要求3所述的微滴包封体，其中所述膜蛋白是孔、通道或泵。
5.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中所述水性微滴的数量为n，其中n是等于或大于3的整数。
6.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中至少一个所述水性微滴位于所述液滴的边缘，其中该水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在该水性微滴和所述外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。
7.根据权利要求6所述的微滴包封体，其中在所述水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层进一步包含膜蛋白。
8.根据权利要求7所述的微滴包封体，其中所述膜蛋白是孔、通道或泵。
9.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中所述第一个水性微滴和第二个水性微滴都位于所述液滴的边缘，其中第一个水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在第一个水性微滴和所述外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的第一双层，并且第二个水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在第二个水性微滴和所述外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的第二双层。
10.根据权利要求9所述的微滴包封体，其中所述第一双层或第二双层进一步包含膜蛋白，或者其中第一双层和第二双层都进一步包含膜蛋白。
11.根据权利要求10所述的微滴包封体，其中所述膜蛋白是孔、通道或泵。
12.根据权要求5所述的微滴包封体，其中第二个水性微滴的部分外层接触所述水性微滴中的第三个水性微滴的部分外层，从而在所述第二个水性微滴和第三个水性微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
13.根据权利要求12所述的微滴包封体，其中在第二个水性微滴和第三个水性微滴之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白。
14.根据权利要求12所述的微滴包封体，其中所述第一个水性微滴、第二个水性微滴和第三个水性微滴中的至少一个位于所述液滴的边缘，其中位于所述液滴边缘的水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在所述水性微滴和所述外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。
15.根据权利要求14所述的微滴包封体，其中在所述水性微滴和所述外围层之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白。
16.根据权利要求14所述的微滴包封体，其中所述第一个水性微滴、第二个水性微滴和第三个水性微滴都位于所述液滴的边缘，其中所述第一个水性微滴、第二个水性微滴和第三个水性微滴的每一个的部分外层都接触所述外围层，从而在所述第一个水性微滴、第二个水性微滴和第三个水性微滴与所述外围层之间的各界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。
17.根据权利要求16所述的微滴包封体，其中在所述第一个水性微滴、第二个水性微滴和第三个水性微滴与所述外围层之间的界面处的至少一个非聚合两亲性分子的双层进一步包含膜蛋白。
18.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中所述多个水性微滴包含多于两个水性微滴，这些水性微滴在链或网络中彼此接触，其中链或网络中的每个微滴的部分外层接触链或网络中的另一个微滴的部分外层，从而在链或网络中的微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
19.根据权利要求18所述的微滴包封体，其中在链或网络中的微滴之间的界面处的每个所述双层都进一步包含膜蛋白。
20.根据权利要求18所述的微滴包封体，其中所述链或网络中的所述水性微滴的数量为m，其中m是等于或大于4的整数。
21.根据权利要求20所述的微滴包封体，其中m等于或大于6。
22.根据权利要求18所述的微滴包封体，其中链或网络中的至少一个水性微滴位于所述液滴的边缘，其中位于所述液滴的边缘的水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在所述水性微滴和所述外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。
23.根据权利要求22所述的微滴包封体，其中在位于所述液滴的边缘的水性微滴和所述外围层之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白。
24.根据权利要求22所述的微滴包封体，其中链或网络中的至少一个水性微滴不接触所述外围层。
25.根据权利要求22所述的微滴包封体，其中链或网络中的至少两个水性微滴不接触所述外围层。
26.根据权利要求18所述的微滴包封体，其中：
在链或网络的一端的第一个水性微滴位于所述液滴的边缘，其中所述第一个水性微滴的部分外层接触所述外围层的第一部分，从而在所述第一个水性微滴和所述外围层的第一部分之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层；并且
在链或网络的另一端的第二个水性微滴位于所述液滴的边缘，其中所述第二个水性微滴的部分外层接触所述外围层的第二部分，从而在所述第二个水性微滴和所述外围层的第二部分之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层；
其中所述链或网络进一步包含位于所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的至少一个其他水性微滴，所述至少一个其他水性微滴不接触所述外围层。
27.根据权利要求26所述的微滴包封体，其中所述链或网络进一步包含位于所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的至少两个其他水性微滴，所述至少两个其他水性微滴不接触所述外围层。
28.根据权利要求26所述的微滴包封体，其中在所述第一个水性微滴和所述外围层的第一部分之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白，和/或在所述第二个水性微滴和所述外围层的第二部分之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白。
29.根据权利要求3、7、10、13、15、17、19、23和28的任一项所述的微滴包封体，其中所述膜蛋白是泵、通道或孔、受体蛋白、转运蛋白、或实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白质。
30.根据权利要求13、15、17、19、23和28的任一项所述的微滴包封体，其中所述膜蛋白是孔、通道或泵。
31.根据权利要求3、7、10、13、15、17、19、23和28的任一项所述的微滴包封体，其中所述膜蛋白是α-溶血素(αHL)孔。
32.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述疏水性介质包含油。
33.根据权利要求32所述的微滴包封体，其中所述油包含硅油、碳氢化合物、氟碳化合物、或它们的两种或更多种的混合物。
34.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述疏水性介质包含硅油和碳氢化合物的混合物。
35.根据权利要求33所述的微滴包封体，其中所述碳氢化合物是未取代的C10-C20烷烃。
36.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述水性介质是水或水性溶液。
37.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述水性介质是水性缓冲溶液。
38.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述微滴包封体的直径等于或小于2 mm。
39.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述微滴包封体的体积等于或小于4 μL。
40.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述微滴包封体的体积为
0.5 μL至2 μL。
41.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中每个水性微滴的直径等于或小于500 μm。
42.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中每个水性微滴的体积等于或小于80 nL。
43.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中每个水性微滴的体积为0.5 nL至70 nL。
44.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述非聚合两亲性分子包含脂质分子。
45.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述非聚合两亲性分子包含磷脂分子。
46.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述非聚合两亲性分子包含甘油磷脂分子。
47.根据权利要求45所述的微滴包封体，其中所述磷脂分子包含1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
48.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述非聚合两亲性分子的所述外围层进一步包含一种或多种PEG基化的脂质。
49.根据权利要求48所述的微滴包封体，其中所述一种或多种PEG基化的脂质选自PEG-磷脂、二酰基甘油-PEG、胆固醇-PEG衍生物、以及它们的混合物。
50.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述水性微滴或至少一个所述水性微滴进一步包含感测分子。
51.根据权利要求50所述的微滴包封体，其中所述感测分子是对目标分析物的存在敏感的分子或光敏感性分子。
52.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，其中所述微滴包封体进一步包含治疗剂、前药或诊断剂。
53.根据权利要求52所述的微滴包封体，其中所述治疗剂、诊断剂或前药存在于水性微滴的亲水性介质中，或存在于疏水性介质中。
54.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中所述微滴包封体进一步包含在所述包封体的分开的部分中的第一药剂和第二药剂，其中第一药剂位于所述水性微滴或至少一个水性微滴中，第二药剂位于所述疏水性介质中。
55.根据权利要求1所述的微滴包封体，所述微滴包封体进一步包含在所述包封体的分开的部分中的第一药剂和第二药剂，其中第一药剂和第二药剂位于所述包封体的不同水性微滴内。
56.根据权利要求54或55所述的微滴包封体，其中所述第一药剂和第二药剂选自治疗剂、诊断剂、组合疗法中一起使用的药物、前药及其相应活化剂、活性药物及相应的失活化合物、以及用于监测药物的生物学分布的对比剂。
57.根据权利要求54或55所述的微滴包封体，其中：
所述第一药剂和第二药剂是适合在组合疗法中一起使用的药物；或者
所述第一药剂是能够被活化剂活化的药物的无活性形式，所述第二药剂是所述活化剂；或者
所述第一药剂是能够被失活化合物失活的药物，所述第二药剂是所述失活化合物；或者
所述第一药剂是药物，所述第二药剂是适合用于监测该药物的生物学分布的对比剂。
58.根据权利要求54或55所述的微滴包封体，所述微滴包封体进一步包含第三药剂，所述第三药剂位于包封体的不同于所述第一药剂和第二药剂的部分或多个部分，其位于一个或多个不同的水性微滴中，或位于所述疏水性介质中。
59.根据权利要求58所述的微滴包封体，其中所述第三药剂是治疗剂、诊断剂、组合疗法中与所述第一药剂和第二药剂一起使用的药物、前药、前药的活化剂、活性药物的失活化合物、或用于监测药物的生物学分布的对比剂。
60.根据权利要求54或55所述的微滴包封体，其中活性药剂以预定的剂量比例存在于所述微滴包封体中。
61.根据权利要求54或55所述的微滴包封体，其中所述第一药剂和第二药剂是用于在化学反应中在一起反应的反应性化合物。
62.根据权利要求6所述的微滴包封体，其中在所述水性微滴和所述外围层之间的界面处的非聚合两亲性分子的所述双层的稳定性对刺激敏感。
63.根据权利要求1所述的微滴包封体，其中在所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的界面处的非聚合两亲性分子的所述双层的稳定性对刺激敏感。
64.根据权利要求9所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的非聚合两亲性分子的一个或多个所述双层的稳定性对刺激敏感。
65.根据权利要求12所述的微滴包封体，其中在水性微滴之间的界面处的非聚合两亲性分子的一个或多个所述双层的稳定性对刺激敏感。
66.根据权利要求62至65的任一项所述的微滴包封体，其中所述刺激选自pH变化；温度变化；超声波；机械刺激；剪切流；物质的临界浓度；磁场；电场；和电磁辐射。
67.根据权利要求62至65的任一项所述的微滴包封体，其中所述刺激是pH变化或温度变化。
68.根据权要求62至65的任一项所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层能够在暴露于7.5或以下的pH时破裂或泄露。
69.根据权利要求62至65的任一项所述的微滴包封体，在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含pH敏感性脂质。
70.根据权要求69所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含对pH不敏感的另一种脂质。
71.根据权利要求69所述的微滴包封体，其中所述pH敏感性脂质是pKa等于或小于8的脂肪酸。
72.根据权利要求71所述的微滴包封体，其中所述脂肪酸的pKa为7.5。
73.根据权利要求71所述的微滴包封体，其中所述脂肪酸是油酸。
74.根据权利要求62至65的任一项所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和油酸。
75.根据权利要求62至65的任一项所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层是温度敏感性的。
76.根据权利要求75所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层能够在暴露于等于或高于40℃的温度时破裂或泄露。
77.根据权利要求75所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含温度敏感性脂质。
78.根据权利要求77所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含温度敏感性脂质和另一种脂质，所述另一种脂质是磷脂。
79.根据权利要求77所述的微滴包封体，其中所述温度敏感性脂质是熔化转变温度Tm为
40℃至70℃的磷脂。
80.根据权利要求77所述的微滴包封体，其中所述温度敏感性脂质是1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)或1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC)。
81.根据权利要求75所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)的混合物，或1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)的混合物。
82.根据权利要求75所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含摩尔比为
1:1至5:1的1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC) 和1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)的混合物。
83.根据权利要求62至65的任一项所述的微滴包封体，其中在水性微滴和所述外围层之间的界面处的所述双层或者在水性微滴之间的界面处的所述双层的非聚合两亲性分子包含识别靶细胞表面物质的分子，其中对所述识别的响应包括所述双层的去稳定化。
84.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，所述微滴包封体的直径等于或小于10 μm。
85.根据权利要求1至28的任一项所述的微滴包封体，所述微滴包封体的体积等于或小于5.0 x 10-13 升。
86.根据权利要求85所述的微滴包封体，其中所述外围层中的非聚合两亲性分子包含具有第一曲率的脂质，并且每个水性微滴的外层中的非聚合两亲性分子包含具有第二曲率的脂质，其中第一曲率是正的、第二曲率是负的，或者第二曲率是正的、第一曲率是负的。
87.一种组合物，包含：一个前述任何一项权利要求中所定义的微滴包封体或多个所述微滴包封体，以及亲水性载体。
88.根据权利要求87所述的组合物，其中所述亲水性载体包含水性介质或离子液体。
89.根据权利要求87或88所述的组合物，其中所述亲水性载体包含水或水性缓冲溶液。
90.根据权利要求87或88所述的组合物，其中所述亲水性载体是药学上可接受的载体。
91.权利要求1至86的任一项所述的微滴包封体，或权利要求90所述的组合物，在通过疗法治疗人体或动物体的方法中或在实施于人体或动物体的诊断方法中的应用。
92.权利要求1至86的任一项所述的微滴包封体，或权利要求87至90的任一项所述的组合物，在合成生物学中的应用。
93.权利要求1至86的任一项所述的微滴包封体，或权利要求87至90的任一项所述的组合物，在制备原始细胞或原始细胞聚集体中的应用。
94.一种制备原始细胞的方法，所述方法包括：提供权利要求1至4的任一项所述的微滴包封体；以及
让所述水性微滴的外层与非聚合两亲性分子的所述外围层接触，或使所述水性微滴的外层与非聚合两亲性分子的所述外围层接触，从而围绕所述水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
95.根据权利要求94所述的方法，所述方法包括以下步骤：从所述微滴包封体中除去一些或所有所述疏水性介质，因而非聚合两亲性分子的所述外围层粘合至所述水性微滴的外层，从而围绕所述水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
96.一种原始细胞，其能够通过权利要求94或95所述的方法获得。
97.一种原始细胞，包含权利要求1至3的任一项所述的微滴包封体，其中所述非聚合两亲性分子的外围层接触所述水性微滴的外层，从而围绕所述水性微滴的一部分形成非聚合两亲性分子的双层。
98.一种制备原始组织的方法，所述方法包括：提供权利要求1至86的任何一项所述的微滴包封体，所述微滴包封体包含多个所述水性微滴；以及
让所述水性微滴的外层接触所述非聚合两亲性分子的外围层，或使所述水性微滴的外层接触所述非聚合两亲性分子的外围层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
99.根据权利要求98所述的方法，所述方法包括以下步骤：从所述微滴包封体中去除一些或部分疏水性介质，因而非聚合两亲性分子的外围层粘合至所述微滴的外层，因而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
100.一种原始组织，其能够通过权利要求98或99所述的方法获得。
101.一种原始组织，包含权利要求1至86的任一项所述的微滴包封体，该微滴包封体包含多个所述水性微滴，其中非聚合两亲性分子的外围层接触所述水性微滴的外层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成所述非聚合两亲性分子的双层。
102.一种原始组织，包含多个权利要求97或98所述的原始细胞。
103.包含膜蛋白的微滴包封体在于包封体内的微滴之间运输分子和/或从包封体中的微滴递送分子至外部环境中的应用，所述微滴包封体为权利要求3、4、7、8、10、11、13、15、
17、19、23和28至31的任一项所述的微滴包封体。
104.包含膜蛋白的微滴包封体在研究和/或筛选膜蛋白中的应用，所述微滴包封体为权利要求3、4、7、8、10、11、13、15、17、19、23和28至31的任一项所述的微滴包封体。
105.包含膜蛋白的微滴包封体在研究和/或筛选与膜蛋白相互作用的分析物中的应用，所述微滴包封体为权利要求3、4、7、8、10、11、13、15、17、19、23和28至31的任一项所述的微滴包封体。
106.包含膜蛋白的微滴包封体在研究和/或筛选非聚合两亲性分子的双层中的应用，所述微滴包封体为权利要求3、4、7、8、10、11、13、15、17、19、23和28至31的任一项所述的微滴包封体。
107.权利要求6中定义的第一微滴包封体和权利要求6中定义的第二微滴包封体，在研究和/筛选横跨两个非聚合两亲性分子的双层的膜蛋白中的应用，
其中所述第一微滴包封体和第二微滴包封体被定为使得第一微滴包封体的双层和第二微滴包封体的双层并置，并且其中膜蛋白横跨所述两个并置的双层。
108.一种传感器、电池或电性装置，其包含权利要求1至86的任一项所述的微滴包封体。
109.一种生产微滴包封体的方法，所述微滴包封体包含：
- 疏水性介质的液滴；
- 围绕所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和
- 在所述外围层内的多个水性微滴，其中每个所述水性微滴包含：(a)水性介质，和(b)围绕所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；其中所述水性微滴中的第一个水性微滴的部分外层接触所述水性微滴中的第二个水性微滴的部分外层，从而在所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层；
所述方法包括：
将水性微滴转移到疏水性介质的液滴中，其中每个水性微滴包含(a)水性介质，和(b)围绕所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层，所述疏水性介质的液滴具有围绕其表面的非聚合两亲性分子的外围层。
110.一种生产微滴包封体的方法，所述微滴包封体包含：
- 疏水性介质的液滴；
- 围绕所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和
- 在所述外围层内的多个水性微滴，其中每个所述水性微滴包含：(a)水性介质，和(b)围绕所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；其中所述水性微滴中的第一个水性微滴的部分外层接触所述水性微滴中的第二个水性微滴的部分外层，从而在所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层；
所述方法包括：
(i) 在存在非聚合两亲性分子的条件下，将疏水性介质的液滴引入亲水性载体中，从而产生疏水性介质的液滴和围绕该液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；
(ii) 在存在非聚合两亲性分子的条件下，将水性介质的微滴引入疏水性介质中，从而产生在疏水性介质内的水性微滴，其中每个水性微滴包含：(a)所述水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的所述非聚合两亲性分子的外层；
其中步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行或同时进行；以及
(iii) 将步骤(ii)中生产的水性微滴转移到步骤(i)中生产的所述疏水性介质的液滴中，从而产生所述微滴包封体。
111.一种生产微滴包封体的方法，所述方法包括：
(i)将水性介质的微滴从微流体装置的第一通道引入到该微流体装置的第二通道，该第一通道含有所述水性介质，该第二通道含有疏水性介质，
其中第一通道中的水性介质、或第二通道中的疏水性介质、或两者都进一步包含非聚合两亲性分子，
从而在第二通道中产生在所述疏水性介质内的水性微滴，所述水性微滴包含：(a)所述水性介质和(b)围绕所述水性介质的表面的所述非聚合两亲性分子的外层；以及(ii)将所述疏水性介质的液滴从所述第二通道引入到所述微流体装置的第三通道中，该疏水性介质的液滴包含多个所述水性微滴，其中该第三通道包含亲水性载体，其中第二通道中的疏水性介质、或第三通道中的亲水性载体、或两者都进一步包含非聚合两亲性分子，
从而在第三通道中产生在亲水性载体内的微滴包封体，该微滴包封体包含：
- 所述疏水性介质的液滴；
- 包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和
- 在所述外围层内的多个所述水性微滴；
其中所述水性微滴中的第一个水性微滴的部分外层接触所述水性微滴中的第二个水性微滴的部分外层，从而在所述第一个水性微滴和第二个水性微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
112.一种生产权利要求109至111的任一项所述微滴包封体的方法，所述方法进一步包括从所述亲水性载体中回收所述微滴包封体。
113.一种微滴包封体，其能够通过权利要求109至112的任一项所述的方法获得。
多重体：包封的微滴网络
发明领域
[0001] 本发明涉及微滴包封体(droplet encapsulate)，其在本文中也称作“多重体(multisome)”，以及包含这种微滴包封体的组合物。本发明还提供了制备该微滴包封体的方法。本发明还描述了该微滴包封体的各种用途，包括它们作为药物递送载体、在合成生物学中、以及在膜蛋白研究中的用途。
[0002] 发明背景
[0003] 在含脂油(lipid in oil)溶液中形成的水性微滴获得了脂单层表层，两个这样的水性微滴接触在一起会使得在它们的界面处形成脂双层，这称为微滴界面双层(DIB) (Funakoshi, K. et al. Anal. Chem. 78, 8169-8174 (2006); Holden, M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007))。类似地，平展的水凝胶支撑体可被用来替代其中一个微滴以形成在水凝胶上的微滴双层(DHB) (Heron, A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 16042-16047 (2007))。DIB和DHB已被证明对于单个膜蛋白的电学或光学测量是非常稳定的平台(Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007); Heron, A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 16042-16047 (2007); Syeda, R. et al., J. Am. Chem. Soc.130, 15543-15548 (2008); Heron, A. J. et al. J. Am. Chem. Soc. 131, 1652-1653 (2009))。除了单个界面双层在生物物理学测量中的用途外，可构建出通过DIB连接的微滴的功能性网络，该网络利用多种膜泵、通道和孔，以用作光传感器、电池和电性装置(Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007); Maglia, G. et al. Nat. Nanotechnol. 4, 437-440 (2009))。虽然微滴网络为制造功能性装置提供了手段，但它们受到了重大的限制：微滴必须被主体油相包围，这妨碍了它们在生理学和其他水性环境中应用。
[0004] 发明概述
[0005] 本发明提供了包封的水性微滴网络，其不需要主体油相并且在水性环境和其他亲水环境中是稳定的。被两亲性分子包围的水性微滴和微滴网络，通过将它们包封在疏水性介质的小滴内，而被稳定。所形成的微滴包封体(在本文也称作“多重体”)可通过膜蛋白与外部环境交流。此外，膜蛋白使得相同多重体内部的多个微滴彼此交流。这大体上使得多重体感测它们的环境、处理信息、以及偶尔地向周围环境递送物质。相同微滴包封体内的多个微滴也可同时向环境中释放它们的内容物，例如在pH下降或温度升高后释放，这为组合递送药物提供了有用的方法。多重体的更多的应用包括为膜蛋白的基础研究提供新的平台、作为“逆向”合成生物学的多腔室原始细胞支架(protocellular chassis)。
[0006] 因此，在一个方面，本发明提供一种微滴包封体，包含：
[0007] -疏水性介质的液滴；
[0008] - 包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；以及
[0009] - 在所述外围层内的水性微滴，所述水性微滴包含：
[0010] (a)水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层。
[0011] 所述外围层和外层可共同形成在水性微滴和外围层之间的界面处的所述非聚合两亲性分子的双层。
[0012] 在第二个方面，本发明提供一种生产微滴包封体的方法，所述微滴包封体包含：
[0013] - 疏水性介质的液滴；
[0014] - 包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；以及
[0015] - 在所述外围层内的水性微滴，所述水性微滴包含：
[0016] (a)水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；
[0017] 所述方法包括：
[0018] 将水性微滴转移到疏水性介质的液滴内，
[0019] 该水性微滴包含：(a)水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层，该液滴具有包围其表面的非聚合两亲性分子的外围层。
[0020] 本发明还提供一种能够通过上述本发明的第二个方面的方法获得的微滴包封体。
[0021] 在第三个方面，本发明提供一种生产微滴包封体的方法，该微滴包封体包含：
[0022] - 疏水性介质的液滴；
[0023] - 包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；以及
[0024] - 在所述外围层内的水性微滴，所述水性微滴包含：
[0025] (a)水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；
[0026] 所述方法包括：
[0027] (i) 在存在非聚合两亲性分子的条件下，将疏水性介质的液滴引入亲水性载体中，从而产生疏水性介质的液滴和围绕该液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；
[0028] (ii) 在存在非聚合两亲性分子的条件下，将水性介质的微滴引入疏水性介质中，从而产生在疏水性介质内的水性微滴，所述水性微滴包含：(a)所述水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的所述非聚合两亲性分子的外层；
[0029] 其中步骤(i)和(ii)可以按任何顺序进行或同时进行；以及
[0030] (iii) 将步骤(ii)中生产的水性微滴转移到步骤(i)中生产的所述疏水性介质的液滴中，从而产生所述微滴包封体。
[0031] 本发明还提供一种能够通过上述本发明的第三个方面的方法获得的微滴包封体。
[0033] 因此，在另一个方面，本发明提供一种生产微滴包封体的方法，所述方法包括：
[0034] (i)将水性介质的微滴从微流体装置的第一通道引入到该微流体装置的第二通道，该第一通道含有所述水性介质，该第二通道含有疏水性介质，
[0035] 其中第一通道中的水性介质、或第二通道中的疏水性介质、或两者都进一步包含非聚合两亲性分子，
[0036] 从而在第二通道中产生在所述疏水性介质内的水性微滴，所述水性微滴包含：(a)所述水性介质和(b)围绕所述水性介质的表面的所述非聚合两亲性分子的外层；以及[0037] (ii)将所述疏水性介质的液滴从所述第二通道引入到所述微流体装置的第三通道中，该疏水性介质的液滴包含所述水性微滴，其中该第三通道包含亲水性载体，[0038] 其中第二通道中的疏水性介质、或第三通道中的亲水性载体、或两者都进一步包含非聚合两亲性分子，
[0039] 从而在第三通道中产生在亲水性载体内的微滴包封体，该微滴包封体包含：
[0040] - 所述疏水性介质的液滴；
[0041] - 包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和
[0042] - 在所述外围层内的所述水性微滴。
[0043] 本发明进一步提供一种能够通过上述本发明的另一个方面的方法提供的微滴包封体。
[0044] 在另一个方面，本发明提供一种组合物，其包含：上述的本发明的微滴包封体，和亲水性载体。该组合物可包含多个本发明的微滴包封体和所述亲水性载体。
[0046] 因此，在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的微滴包封体，其进一步包含治疗剂，用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
[0047] 在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的微滴包封体，其进一步包含诊断剂，用于施用在人体或动物体上的诊断方法中。
[0048] 在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的组合物，其中微滴包封体进一步包含治疗剂，用于通过疗法治疗人体或动物体的方法中。
[0049] 本发明还提供了一种如上所述的本发明的组合物，其中微滴包封体进一步包含诊断剂，用于施用在人体或动物体上的诊断方法中。
[0050] 多重体的更多应用包括为膜蛋白的基础研究提供平台。如下文将进一步解释的，本发明的微滴包封体可包含非聚合两亲性分子的双层。特别地，包封体中的水性微滴的部分外层可接触所述外围层从而在水性微滴和外围层之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。此外或作为替代，包封体中可存在不止一个水性微滴，一个水性微滴的部分外层可接触另一个水性微滴的部分外层，以在两个微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。而且，不止一个水性微滴可与外围层形成双层。这样，本发明的微滴包封体可包含非聚合两亲性分子的一个或多个双层。在一些实施方式中，微滴包封体包含多个非聚合两亲性分子的双层。本发明的微滴包封体中的所述双层或每个双层都能够容纳一个或多个膜蛋白，因而本发明的微滴包封体可为膜蛋白的基础研究提供有用的平台，包括例如蛋白孔、蛋白通道或蛋白泵、受体蛋白以及实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白。包封体中的双层或每个双层都可包含多个膜蛋白，例如多个相同的膜蛋白或两个或更多个不同类别的膜蛋白。因此，本发明提供了如上所述的本发明的微滴包封体作为膜蛋白研究的研究工具的用途。
[0051] 本发明进一步提供了如本文所述的本发明的微滴包封体在研究和/或筛选膜蛋白的方法中的用途。
[0052] 在另一个方面，本发明提供了如本文所述的本发明的微滴包封体在研究和/或筛选与膜蛋白相互作用的分析物的方法中的用途。
[0053] 在另一个方面，本发明提供如本文所述的本发明的微滴包封体在研究和/或筛选非聚合两亲性分子的双层的方法中的用途。
[0054] 在另一个方面，本发明提供了如上所述的本发明的第一微滴包封体和如上所述的本发明的第二微滴包封体在研究和/或筛选横跨两个所述非聚合两亲性分子的双层的膜蛋白复合物中的用途，
[0055] 其中在每个所述第一和第二微滴包封体中，所述水性微滴位于液滴的边缘，其中水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层，
[0056] 并且其中所述第一和第二微滴包封体被定位以使得第一微滴包封体的双层和第二微滴包封体的双层并列，其中膜蛋白复合物横跨所述两个并列的双层。
[0057] 如下文图1a所示，通过利用膜蛋白和多个微滴，多重体可感测它们的环境、处理信息和视情况向周围环境递送物质。
[0058] 因此，在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的微滴包封体用于在包封体中的微滴之间运输分子。
[0059] 本发明还提供了如上所述的本发明的微滴包封体用于将分子从包封体的微滴递送至外部环境。
[0060] 本发明还提供了如上所述的本发明的微滴包封体用于在被包封的微滴与环境之间交换物质。
[0061] 在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的微滴包封体作为传感器的用途。例如，该微滴包封体可用作光传感器或感测是否存在目标分析物的传感器。
[0062] 微滴网络可在多重体内被构建，以利用多种膜泵、通道和孔，以用作光传感器、电池和电性装置。
[0063] 因此，本发明还提供了如上所述的本发明的微滴包封体作为传感器、电池或电性装置的用途。
[0064] 本发明还提供了包含如上所述的本发明的微滴包封体的传感器、电池或电性装置。
[0065] 本发明的微滴包封体还可用作多腔室原始细胞支架，用于“逆向”合成生物学。
[0066] 因此，在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的微滴包封体在合成生物学中的用途。
[0067] 本发明还提供了如上所述的本发明的组合物在合成生物学中的用途。
[0068] 在另一个方面，本发明提供了利用如上所述的本发明的微滴包封体制备原始细胞。
[0069] 本发明还提供了利用以上所述的本发明的微滴包封体来制备原始细胞的聚集体。原始细胞的聚集体也可称作原始组织(prototissue)。
[0070] 本发明还提供了利用以上所述的本发明的组合物来制备原始细胞。
[0071] 在另一个方面，本发明提供了利用以上所述的本发明的组合物来制备原始细胞的聚集体。
[0072] 在另一个方面，本发明一种制备原始细胞的方法，所述方法包括：
[0073] 提供如上所述的本发明的微滴包封体；和
[0074] 让水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的所述外围层，使水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的所述外围层，从而围绕水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0075] 可任选地通过从本发明的微滴包封体移除一些或所有疏水性介质而辅助双层形成。因此，在一个实施方式中，制备原始细胞的方法包括：从如上所述的本发明的微滴包封体移除一些或所有疏水性介质，因而非聚合两亲性分子的所述外围层粘合至所述水性微滴的外层，从而围绕所述水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0076] 在另一个方面，本发明提供能够通过上述用于制备原始细胞的本发明的方法获得的原始细胞。
[0077] 在另一个方面，本发明提供一种原始细胞，期包含如上所述的本发明的微滴包封体，其中非聚合两亲性分子的所述外围层接触所述水性微滴的外层，从而围绕部分所述水性微滴形成非聚合两亲性分子的双层。
[0078] 在另一个方面，本发明提供制备原始组织的方法，该原始组织包含原始细胞的聚集体，该方法包括：
[0079] 提供如上所述的本发明的微滴包封体，所述微滴包封体包含多个所述水性微滴；以及
[0080] 让所述水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的所述外围层，或使水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的外围层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0081] 可任选地通过从本发明的微滴包封体移除一些或所有疏水性介质而辅助双层形成。因此，在一个实施方式中，制备原始组织的方法包括：从如上所述的本发明的微滴包封体移除一些或所有疏水性介质，所述微滴包封体包含多个所述水性微滴，因而非聚合两亲性分子的所述外围层粘合至所述水性微滴的外层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0082] 在另一个方面，本发明提供能够提供上述用于制备原始组织的本发明的方法获得的原始组织。
[0083] 在另一个方面，本发明提供包含如上所述的本发明的微滴包封体的原始组织，该微滴包封体包含多个所述水性微滴，其中非聚合两亲性分子的外围层接触所述水性微滴的外层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成所述非聚合两亲性分子的双层。
[0084] 在另一个方面，本发明提供包含多个如上所述的本发明的原始细胞的原始组织。
[0086] 图1a-e包括本发明的多重体的示意图和图片。因此，图1a是显示被包封在油滴中的水性微滴的示意图；水性微滴彼此通过脂双层分开，使得网络内通过膜蛋白交流，例如蛋白孔、通道或泵；双层还存在于水性微滴的表面，其从油滴凸出，使得网络能够与主体溶液交流。所示处的多重体能够感测其环境、处理信息、并视情况向环境递送物质。感测和递送能力在本文的实施例中证实。
[0087] 图1b是被包封的两个微滴的网络的示意图，展示了本发明的多重体内的脂质单层和双层。
[0088] 图1c、1d和1e是分别含有一个、两个或三个内部微滴的多重体的图片。油滴悬浮在金属环上以允许延长时间的研究。水性微滴用25 μM磺酰罗丹明101(红色)或荧光素(绿色)染色。比例尺代表400 μm。
[0089] 图2a显示了包封的微滴相对于水平面的接触角θ1、θ2和θ3的定义，其几何形状如实施例1中所说通过计算机计算出来。
[0090] 图2b显示了，对于实施例1中给定的参数值，所计算的双层形成的自由能与接触角θ2和θ3的函数关系。箭头表明了最陡下降的方向。被包封的微滴在图中以红色圆圈标出的九个点处的几何形状被图示在每个点的附近。经计算确定的最稳定的状态(在图中以星形标示出)被图示在图2a中。
[0091] 图3涉及通过葡萄球菌α-溶血素(αHL)孔测量离子电流。因此，图3a是通过插在双层中的αHL孔测量在包封的微滴和主体水性溶液之间流动的离子电流的示意图。
[0092] 图3b显示电流的逐步增加，显示野生型(WT)αHL孔连续插入双层中，将包封的微滴与主体水性溶液分离。电流水平(对应电流柱状图中的峰值)相隔18.6 ± 0.8 pA (均值± s.d., n = 16)，这是单个αHL孔的预期的电流。图中只显示了数据样本。测量在500 mM KCl中以+50 mV进行。
[0093] 图3c显示了向主体溶液中加入 10 μM γ-环糊精(γCD)后单个WT αHL孔的电流~阻塞。所显示的是未被占用孔的电流水平、结合γCD的孔的电流水平、以及零电流水平。γCD电流阻塞的幅度为63.7 ± 2.0% (均值 ± s.d., n = 673)，并且离解速率为4.0 ±
0.6 s–1 (均值 ± s.d.)，与之前的研究成果一致。图中只显示了数据样本。测量在1 M KCl中以-50 mV进行。
0.6 s–1 (均值 ± s.d.)，与之前的研究成果一致。图中只显示了数据样本。测量在1 M KCl中以-50 mV进行。
[0094] 图4涉及通过经αHL孔扩散的交流。因此，图4a显示两个多重体在相同主体溶液中的荧光测量结果，每个多重体具有单个内部微滴。两个内部微滴都含有结合了葡聚糖的fluo-4，并且一个含有αHL。油滴和内部微滴当在图片中看不见时被画出轮廓，并且分别标记为“油”和“染料”。在向外部溶液添加Ca2+后，在含有αHL的微滴中观察到了荧光的增加，而没有蛋白的微滴的荧光仍然很微小。比例尺代表300 μm。
[0095] 图4b显示了包封的两微滴网络的荧光测量结果，其中一个微滴含有Ca2+，另一个含有结合了葡聚糖的fluo-4以及αHL；这两个微滴分别被标记为“Ca2+”和“染料”。仅在含染料的微滴中观察到了荧光的增加。比例尺代表300 μm。
[0096] 图5涉及pH依赖性递送。因此，图5a是证实由1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)和油酸(OA)的混合物制成的包封的两微滴网络的pH敏感性的实验的示意图。一个微滴含有Ca2+，另一个含有结合了葡聚糖的fluo-4。当将外部水性缓冲液的pH从8.0将至5.5时，两个微滴破裂，将其内容物释放到主体水性溶液中，在主体水性溶液中它们混合以产生荧光信号。
[0097] 图5b显示了图5a图示的实验的荧光测量结果。油滴以及含有Ca2+或fluo-4的内部微滴被画出轮廓，并分别标记为“油”、“ Ca2+”和“染料”。在降低外部溶液的pH后，两个微滴同时破裂。这首先导致荧光强度的轻微降低，因为染料微滴的内容物被稀释，随后强度急剧增加，因为fluo-4溶液与Ca2+溶液混合。最终，强度降低，因为混合物进入主体水相后变得稀释。比例尺代表500 μm。
[0098] 图6涉及温度依赖性递送。因此，图6a显示了具有单个内部微滴的多重体经受温度上升时的破裂温度(顶部：温度从室温以 1 ºC min–1的速率上升；底部：破裂温度的柱状~图)。破裂温度为43.6 ± 3.5 ºC (均值± s.d., n = 93)，排除在低于35℃破裂的三个多重体。
[0099] 图6b显示具有单个内部微滴的多重体在37.2 ± 0.4 ºC的恒定温度时的破裂时间。顶部图提供了时间曲线。底部图显示了在达到37℃的30分钟内破裂的多重体的比例，显示出93%的多重体在该温度存活了至少30分钟(n = 46)。
[0100] 发明详述
[0101] 本发明的微滴包封体在本文中也成为“多重体”，而不论是否只有一个还是多个水性微滴被包封在外围层内。因此，本文使用的术语“微滴包封体”和“多重体”都是指含有一个或多个被包封的微滴的合成结构。在本发明中，一个或多个水性微滴被包封在非聚合两亲性分子的外围层内，该层包围疏水性液滴的表面。该水性微滴或每个水性微滴包含(a)水性介质和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层。该一个或多个水性微滴完全或部分地在该疏水性液滴本身之内。因此，水性微滴可完全在疏水性液滴之内，完全被疏水性介质包围。或者，它可在或靠近该液滴的边缘，并与外围层接触，因而外层和外围层粘合以形成如图1b至1e所示的双层。水性微滴在或靠近液滴边缘因而外层与外围层形成双层的这种排布方式被认为是在热动力学上更稳定的。
[0102] 本发明的微滴包封体是合成的。因此，本发明的微滴包封体可被称作合成微滴包封体。
[0103] 本发明的微滴包封体包含疏水性介质的液滴；包围所述液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；以及在所述外围层内的水性微滴。该水性微滴包含水性介质和包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层。
[0104] 该非聚合两亲性分子通常以单层形式包围所述疏水性液滴的表面而设置，并且多重体内的该水性微滴或每个水性微滴的外层通常包含单层的非聚合两亲性分子。但是，当该或每个水性微滴粘合至该疏水性液滴的表面时，以及当水性液滴彼此粘合时，在界面处可形成非聚合两亲性分子的双层(见图1c-1e)。
[0105] 因此，该外围层通常包含单层的非聚合两亲性分子。
[0106] 通常，包围水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层包含单层的非聚合两亲性分子。
[0107] 通常，该外围层包含单层的非聚合两亲性分子，并且所述外层包含单层的非聚合两亲性分子。
[0108] 在本发明的微滴包封体的一些实施方式中，特别是当包封体首先被合成，而水性微滴尚未有时间粘合至所述外围层以形成热动力学上更稳定的结构时，该水性微滴会完全位于该疏水性液滴内；在这种情况下，非聚合两亲性分子的所述外层不与所述外围层接触，而是通常仅与该疏水性介质接触。
[0109] 因此，在一个实施方式中，水性微滴位于所述液滴内部，并且非聚合两亲性分子的所述外层不与外围层接触。通常，在该实施方式中，非聚合两亲性分子的外层接触疏水性介质。
[0110] 但是，通常，本发明的微滴包封体包含至少一个非聚合两亲性分子的双层。通常，例如，微滴包封体的外围层和水性微滴的外层能够共同在水性微滴和外围层之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。此外或作为选择，水性微滴的外层可与微滴包封体内的另一水性微滴的外层形成双层。
[0111] 因此，在一些实施方式中，水性微滴位于所述液滴的边缘，其中水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。通常，在这种实施方式中，外层的不同部分接触所述疏水性介质。这种排布方式的一个实施例的图片显示在图1c中。这种排布方式也图示在图1b中(图中存在两个水性微滴)。这种排布方式被发现是动力学上稳定的。
[0112] 水性微滴和外围层的界面处的双层可进一步包含膜蛋白。膜蛋白可为任何类型。内在膜蛋白的使用已被证实，但同等地预期外周膜蛋白也可被使用。膜蛋白可例如是膜泵、通道和/或孔，以允许通过微滴与外部溶液之间的物质交换和电通信实现精确控制。膜蛋白可以例如αHL孔。但是，可使用任何合适的膜蛋白，包括两种主要类别的膜蛋白，即β-桶或α-螺旋束。一个重要的应用是膜蛋白为孔或通道。除了蛋白孔或通道外，其他可能的膜蛋白包括，但不限于，受体蛋白、运输蛋白或实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白质。水性微滴和外围层之间的界面处的双层，以及微滴包封体内的任何其他双层，可包含不止一个膜蛋白。例如，特定的双层可含有相同膜蛋白的多个拷贝，或两种或更多不同种类的膜蛋白。
当存在不止一种类别时，该双层可包含每个不同类别的多个拷贝。
当存在不止一种类别时，该双层可包含每个不同类别的多个拷贝。
[0113] 本领域技术人员已知且容易得到能够实现物质交换和电通信的合适膜蛋白；许多这种蛋白是商业上可获得的，或者可通过已知的方法制备。例如，WT αHL单体可通过体外转录-翻译(IVTT)来制备，并通过与兔血红细胞膜一起温育而七聚化。该七聚体通常通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)来纯化(Maglia, G. et al. Method. Enzymol. 475, 591-623, 2010)。而且，Bayley, H. et al. Droplet interface bilayers. Mol. BioSyst. 4, 1191–1208 (2008)列出了已被测试可插入在主体油中制成的微滴界面双层的几种蛋白质。
[0114] 本发明的微滴包封体可在外围层内包含多个水性微滴。每个水性微滴包含：(a)所述水性介质，和(b)包围所述水性介质的表面的非聚合两亲性分子的所述外层。每个水性微滴的外层通常包含单层的非聚合两亲性分子。但是，当该或每个水性微滴粘合至包围疏水性液滴的外围层内部时，或当水性微滴彼此粘合时，也可形成非聚合两亲性分子的双层。
[0115] 包含多个微滴的微滴包封体中的所述水性微滴的数量可被标记为n，其中n等于或大于2。n是2的一个实施方式示意性地图示在图1b中，该实施方式的图片显示于图1d中。在一些实施方式中，n是等于或大于3的整数。n是3的一个实施方式的图片显示于图1e中，n是6的实施方式示意性地图示在图1a中。
[0116] 整数n原则上可以非常高，例如达百万级别。这是因为水性微滴可很小，并且疏水性液滴的尺寸没有上限。而且，如下文将进一步解释的，本发明的微滴包封体可包括大得水性微滴网络。这种网络原则上可包含数百万个微滴，并且可用于制备原始组织(即，原始细胞的聚集体)。因此，在一些实施方式中，整数n可能高达几百万，例如达约10000000，或例如达约5000000。
[0117] 在其他实施方式中，n可为几百，例如达约500，或例如达约400。实际上，通过在本发明的实施例中使用的手动吸液方法制成的多重体通常具有约 1 mm的外径，并且水性微~滴可容易地通过手动制成至 100-µm直径。因此，约500个这样的水性微滴可被装进一个1 ~
mm的球体中，或者由于包装限制而可能比这个数少至多 25%(虽然这取决于微滴的成分)。
~
因此，在一些实施方式中，整数n可能高达约500，或例如高达约400。
mm的球体中，或者由于包装限制而可能比这个数少至多 25%(虽然这取决于微滴的成分)。
~
因此，在一些实施方式中，整数n可能高达约500，或例如高达约400。
[0118] 例如，整数n可能为2至500的整数，或3至500的整数。n可为2至400的整数。在其他实施方式中，n可为2至300的整数，或3至200的整数。更常见的是，n为2至200。但是，在其他实施方式中，n是2至50的整数，或3至50的整数。例如，n可为2至20，或2至10。
[0119] 通常，当微滴包封体包含多个水性微滴时，第一个所述水性微滴的部分外层接触第二个所述水性微滴的部分外层，从而在所述第一个和第二个微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
[0120] 因此，更常见的是，本发明的微滴包封体通常包含所述非聚合两亲性分子的双层，该双层形成于水性微滴和外围层之间的界面处，或水性微滴和另一个水性微滴之间的界面处。
[0121] 所述第一个和第二个微滴之间的界面处的双层可进一步包含一个或多个膜蛋白。被包封的微滴可彼此之间通过加入在微滴之间的双层中的膜蛋白交换化学物质。合适的膜蛋白包括，但不限于，泵、通道和/或孔，例如αHL孔。
[0122] 通常，所述第一和第二微滴中的至少一个位于所述液滴的边缘，其中该水性微滴的部分外层与外围层接触，从而在该水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。
[0123] 在所述水性微滴和外围层之间的界面处的双层可进一步包含一个或多个膜蛋白。该膜蛋白可为任何类型，包括例如泵、通道和/或孔，例如αHL孔。被包封的微滴可通过这些蛋白在微滴和外部溶液之间交换物质。而且，如上所述，多重体中的被包封的微滴也可通过微滴之间的双层中的膜蛋白彼此之间交换物质。因此，具有微滴链或网络的微滴包封体能够通过该链或网络从一个微滴运输物质(例如化学化合物)到另一个微滴，以及运输至外部环境和从外部环境运输。以此方式可构造出复杂的运输系统，这样的系统的一个例子示意性地显示在图1a中。
[0124] 上述包含多个微滴的微滴包封体中的第一和第二微滴可都位于液滴的边缘，其中第一水性微滴的部分外层接触外围层，从而在第一水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的第一双层，第二水性微滴的部分外层接触外围层，从而在第二水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的第二双层。这种实施方式示意性地图示于图1b中，这种实施方式的图片显示于图1d中。第一和第二双层可进一步包含膜蛋白，或第一和第二双层都可包含膜蛋白。可使用任何合适的膜蛋白。例如，该膜蛋白或多个膜蛋白可选自泵、通道和/或孔，并且例如可为α-溶血素(αHL)孔。其他可能的膜蛋白包括，但不限于，受体蛋白、运输蛋白、或实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白。因此，通过膜蛋白，第一微滴和第二微滴都能够与外部环境及彼此之间进行电通信或物质交换。
[0125] 如上所述，本发明的微滴包封体优选包含所述非聚合两亲性分子的双层。
[0126] 因此，在优选的实施方式中，本文定义的本发明的微滴包封体包含在外围层内的一个水性微滴或多个水性微滴，其中该或每个水性微滴包含：(a)水性介质和(b)包围该水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层，并且该微滴包封体进一步包含所述非聚合两亲性分子的双层，其中
[0127] (i)一个所述水性微滴位于所述液滴的边缘，其中该水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在该水性微滴和该外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层；或
[0128] (ii)第一个所述水性微滴的部分外层接触第二个所述水性微滴的部分外层，从而在所述第一个和第二个微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
[0129] 在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，n等于或大于3，第一个所述水性微滴的部分外层接触第二个所述水性微滴的部分外层，从而在所述第一个和第二个微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层，并且其中第二个微滴的部分外层接触第三个所述水性微滴的部分外层，从而在所述第二个和第三个微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
[0130] 第一个和第二个微滴之间的界面处的双层可进一步包含膜蛋白。
[0131] 第二个和第三个微滴之间的界面处的双层可进一步包含膜蛋白。
[0132] 在一个实施方式中，第一个和第二个微滴之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白，并且第二个和第三个微滴之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白。因而三个微滴形成了彼此之间交流的微滴链。
[0133] 通常，所述第一、第二和第三微滴中的至少一个位于所述液滴的边缘，其中该至少一个水性微滴的部分外层接触外围层，从而在所述水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。
[0134] 该水性微滴和外围层之间的界面处的双层可进一步包含膜蛋白，例如泵、通道或孔。因而微滴也可与外部环境交流。
[0135] 通常，所述第一、第二和第三微滴的所有三个都位于所述液滴的边缘，其中所述第一、第二和点水性微滴的每一个的部分外层都接触外围层，从而在所述第一、第二和第三水性微滴和外围层之间的各界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。这种实施方式的一个例子的图片显示在图1e中。
[0136] 在所述第一、第二和第三水性微滴和外围层之间的界面处的至少一个非聚合两亲性分子的双层可进一步包含膜蛋白。可使用任何合适的膜蛋白或多个膜蛋白。例如，该一个或多个膜蛋白可选自泵、通道和/或孔，并且例如可为αHL孔。其他可能的膜蛋白包括，但不限于，受体蛋白、运输蛋白或实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白。
[0137] 本发明的微滴包封体可包括在疏水性液滴内的水性微滴的链或网络。链或网络中的水性微滴彼此通过非聚合两亲性分子的双层(通常为脂双层)而隔开，任选地，当双层中存在蛋白孔时，允许通过蛋白孔实现链或网络内的交流。如果微滴的“链”被视为“一维”结构(其中每个微滴接触最多两个其他微滴从而形成一排微滴)，那么网络可被视为二维或三维结构，其中至少一个微滴与多于两个的其他微滴接触。通常，在网络中，网络中多于一个微滴接触多于两个的其他微滴。在一些网络中，网络中的每个微滴接触多于两个的其他微滴。例如，网络可为微滴的“二维”单层或微滴的“三维”团块。双层也可存在于水性微滴接触疏水性液滴的外围层的表面，使得当存在膜蛋白时，链或网络能够经由膜蛋白与主体溶液交流。因此，制备出的多重体能够感测其环境、处理信息、以及视情况向环境递送物质或从环境接收物质。该感测和递送能力在本发明的实施例中被证实。
[0138] 因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体可包含在外围层内的多个所述水性微滴，其中所述多个水性微滴包含多于两个的水性微滴，它们在链或网络中彼此接触，其中链或网络中的每个微滴的部分外层接触链或网络中的另一个微滴的部分外层，从而在链或网络中的微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
[0139] 在一些实施方式中，在链或网络中的微滴之间的界面处的每个所述双层进一步包含膜蛋白。该一个或多个膜蛋白可选自泵、通道和孔，例如αHL。但是，原则是可使用任何膜蛋白。如上所述，其他可能的膜蛋白包括，但不限于，受体蛋白、运输蛋白或实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白。
[0140] 所述链或网络中的水性微滴的数量可被标记为m，其中m是等于或大于3的整数。在一些实施方式中，m等于或大于4。例如，整数m可至少为5，或至少为6。在一些实施方式中，m等于或大于6。
[0141] 整数m原则上可以很高，例如达百万级别。如上所述，水性微滴可以很小，所有水性微滴可存在于相同的网络。因此，整数m可高达几百万。这样大的微滴网络可用于制备原始阻止。因此，在一些实施方式中，m是高达约10000000的整数，或例如高达约5000000。
[0142] 在其他实施方式中，m可高达400或500。因此，在一个实施方式中，m是至多500的整数，或例如至多400。例如，m可为3至500的整数，或3至400的整数。在其他实施方式中，m可为4至500的整数，或4至400的整数。因此，例如，m可为6至500的整数，或10至400的整数。更常见的是，m为3至300，或3至200的整数。因此，m可为5至200。在一些实施方式中，n可为3至50的整数，或4至50的整数。例如，n可为3至20，或3至10。在一些实施方式中，m是4至10。
[0143] 通常，链或网络中的至少一个水性微滴位于液滴的边缘，其中该位于液滴边缘的水性微滴的部分外层接触外围层，从而在所述水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层。该双层可进一步包含一个或多个膜蛋白，以允许微滴的链或网络与外部环境之间的交流。该一个或多个膜蛋白可为任何合适的膜蛋白，例如泵、通道或孔。例如，膜蛋白可为αHL。该双层可含有相同膜蛋白的多个拷贝，或两个或更多不同种类的膜蛋白。当存在多于一个种类时，该双层可含有每个不同种类的多个拷贝。该双层例如可包含不同类别的离子通道膜蛋白，例如至少一个钠通道蛋白和至少一个钾通道蛋白。其他可能的膜蛋白包括，但不限于，受体蛋白，运输蛋白或实现细胞识别或细胞-细胞相互作用的蛋白。
[0144] 通常，链或网络中的至少一个水性微滴不接触外围层。因此，链或网络中的至少一个水性微滴可位于链或网络的中间，因而可被保持在远离多重体的边缘的位置。在一些实施方式中，链或网络中的至少两个水性微滴不接触外围层。链或网络中的两个水性微滴不接触外围层的实施方式被示意性地图示于图1a中，其中起处理模块作用的两个水性微滴存在于网络的中间，远离外围层。
[0145] 在本发明的包含所述链或网络的包封体的一个实施方式中，位于链或网络的一个末端的第一水性微滴处于液滴的边缘，其中所述第一水性微滴的部分外层接触外围层的第一部分，从而在所述第一水性微滴和外围层的所述第一部分之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层；并且
[0146] 位于链或网络的另一个末端的第二水性微滴也处于液滴的边缘(通常在液滴的相对的末端)，其中所述第二水性微滴的部分外层接触外围层的第二部分，从而在所述第二水性微滴和外围层的所述第二部分之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层；并且[0147] 该链或网络进一步包含位于第一和第二水性微滴之间的至少一个其他水性微滴。该至少一个其他水性微滴通常不接触外围层。
[0148] 通常，在该实施方式中，链或网络进一步包含位于所述第一和第二水性微滴之间的至少两个其他水性微滴。通常，所述至少两个其他水性微滴不接触外围层。
[0149] 这样的实施方式示意性地图示于图1a中。在图1a的实施方式中，位于一个末端的两个第一水性微滴用作感测模块，位于网络的另一个末端的两个第二水性微滴用作递送模块，并且两个另外的水性微滴(用作处理模块)位于第一(感测)和第二(递送)微滴之间。
[0150] 通常，在第一水性微滴和外围层的第一部分之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白，例如泵、通道或孔(如前所述)。因而，多重体中的微滴的链或网络会经由第一水性微滴和所述膜蛋白与外部环境交流。网络中的所述第一微滴可例如作为传感器模块，例如，其能够感测外部环境中是否存在特定化学物质，或能够感测光线。因此，在一些实施方式中，第一微滴包含感测分子。该感测分子可存在于微滴的水性介质中，或存在于双层中。该感测分子可为对特定化学物质(例如目标分析物)敏感的分子，或它可为光敏性分子。
[0151] 通常，在第二水性微滴和外围层的第二部分之间的界面处的双层进一步包含膜蛋白。因而，多重体中的微滴的链或网络也可通过第二水性微滴和所述膜蛋白与外部环境交流。例如，网络中的所述第二微滴可作为递送模块，其能够向外部环境递送特定的化学物质。例如，这种递送可视第一微滴感测是否存在化学物质，或例如是否存在光学的情况而定。
[0152] 因此，本发明的微滴孢粉体中的水性微滴可用作传感器模块，因此，在一个实施方式中，水性微滴，或如本文所述的本发明的微滴包封体中的至少一个水性微滴，可进一步包含感测分子。该感测分子可存在于微滴的水性介质中，或存在于水性微滴和外围层之间的界面处形成的双层中，或水性介质和另一个水性介质之间的界面处的双层中。可使用任何合适的感测分子。例如，感测分子可为对特定化学物质(例如目标分析物)的存在敏感的分子，或例如光敏性分子。合适的光敏性传感分子的一个例子是细菌视紫红质。细菌视紫红质是一种膜蛋白，其捕获光能并利用光能驱动质子通过膜。其他合适的感测分子的离子包括门控离子通道和受体蛋白。
[0153] 水性微滴，或本发明的水性包封体中的至少一个水性微滴，可进一步包含用于递送的分子。例如，从水性包封体向外部环境的分子的递送可视微滴或包封体中的另一个微滴中的感测分子的激活情况而定。
[0154] 本发明的微滴包封体中的疏水性介质可选自多种物质。疏水性介质可包含单个疏水性化合物。或者，它可包含两种或更多种不同的疏水性化合物的混合物。该介质是疏水的，因而多重体中的水性微滴或多个水性微滴仍以微滴形式被包封，而不会与该疏水性介质混合，然而疏水性介质可被自由选择。当制备多重体时，可选择影响多重体中的水性微滴的浮力以及包围水性微滴的非聚合两亲性分子的外层形成速度的疏水性介质。
[0155] 本发明的微滴包封体中的疏水性介质通常是油。该油可为单个的、纯的化合物，或者该油可包含两种或更多种化合物的混合物。只要油与水性微滴的亲水性介质以及外部主体相的界面张力足够的高从而阻止油和水性微滴的自发分解，并且只要油不打破所形成的双层的稳定性，那么任何类型的这样的油都是合适的。
[0158] 在一些实施方式中，该油是包含：(a)一种或多种碳氢化合物，和(b)一种或多种硅油的混合物。
[0159] 当油包含碳氢化合物时，该碳氢化合物可为带支链的或不带支链的，例如具有5至30个、或5至20个碳原子的碳氢化合物(输入较低分子量的碳氢化合物将需要控制蒸发)。优选地，碳氢化合物在本发明的微滴包封体的操作温度时是液体。合适的离子包括烷烃或烯烃，例如十六烷、癸烷、戊烷或鲨烯。通常，该油包含碳氢化合物。
[0160] 通常，该碳氢化合物是未取代的C10-C20烷烃，例如十六烷烃。虽然发现低密度纯十六烷烃使得通过本发明的实施例所述的方法组装多重体变得困难，但是十六烷烃以及更短的烷烃应当适合于浮力作用不太重要以及可更快形成单层的其他多重体，包括例如小于本发明实施例制备的多重体的“小型化”多重体。
[0161] 在一些实施方式中，碳氢化合物是较长链的碳氢化合物，例如未取代的C17-C20烷烃。
[0162] 其他类型的油也是可能的。例如，该油可为碳氟化合物。这可能对于研究某些系统是有用的，例如用来将特定膜蛋白或分析物从微滴中的损失降到最低，或用来控制气体(例如氧气)含量。因为碳氟化合物可同时为疏水性的和疏脂性的，包含碳氟化合物的油相通常可防止多重体粘附至表面。
[0163] 在另一个实施方式中，碳氢化合物可为溴取代的C10-C30烷烃，或者例如是溴取代的C10-C20烷烃，例如溴代十二烷。虽然溴代十二烷被发现需要长的温育时间以形成单层，但该油应更适合于单层可更快温育的其他多重体，例如“小型化多重体”，其小于本发明的实施例中制备的那些多重体。
[0164] 通常，该油包含硅油或碳氢化合物。任何合适的硅油都可被使用。
[0165] 硅油是有优势的，因为其密度接近水的密度，这确保了微滴包封体在水中是接近平衡浮力的。例如，硅油可为聚苯基甲基硅氧烷，其密度为约1 g.cm-3。
[0166] 该碳氢化合物通常具有5至20个碳原子(C5-C20碳氢化合物)，或更常见地是具有10至20个碳原子(C10-C20碳氢化合物)。通常，它是烷烃或烯烃。因此，该碳氢化合物可为C5-C20烷烃，或C10-C20烷烃。该碳氢化合物通常是未取代的。在一个优选的实施方式中，该碳氢化合物是未取代的C5-C20烷烃，优选是未取代的C10-C20烷烃。例如，该碳氢化合物可为鲨烯、十六烷或癸烷。在一个实施方式中，它是鲨烯。但是，在一些实施方式中，该碳氢化合物可被卤素原子(例如溴)取代。
[0167] 在一些实施方式中，疏水性介质包含硅油和碳氢化合物的混合物。这种混合物被发现有利地提供低温育时间，以形成稳定的多重体。混合物中的硅油和碳氢化合物可为如上定义的。通常该碳氢化合物是未取代的C10-C20烷烃，例如十六烷。通常，硅油的密度接近水的密度，以确保多重体在水性介质中具有接近平衡的浮力；它可为例如聚苯基甲基硅氧烷。通常，硅油与碳氢化合物的体积比等于或大于5:1。例如，硅油与碳氢化合物的体积比可为5:1至15:1，例如约9:1或约10:1。
[0168] 通常，用在本发明的微滴包封体中的疏水性介质的密度接近水的密度，例如密度为约1 g.cm-3，因为本发明的微滴包封体在水中是接近平衡浮力的。
[0169] 在一个实施方式中，疏水性介质包含硅油和十六烷。通常，硅油是聚苯基甲基硅氧烷。硅油与十六烷的体积比通常等于或大于5:1，例如从5:1到15:1。例如，体积比可为约9:1，或约10:1。
[0170] 本发明的微滴包封体中的水性微滴内的水性介质可为纯水。或者，该水性介质可为水性溶液，例如水性缓冲溶液。该水性溶液可因多重体或其使用或利用该多重体进行的实验而被自由选择。微滴包封体中每个微滴的水性溶液可以相同或不同。一个重要的性质是pH，并且pH可在很大范围内变化。例如，在一些实施方式中，水性微滴内的水性介质的pH可为5至9(或者例如为6至8)，但更高或更低的pH也是可能的。因此，该水性介质可为水性缓冲溶液。根据期望的pH，可使用任何合适的缓冲液。例如，缓冲溶液可包含具有KCl和EDTA的Tris HCl。在一些实施方式中，水性缓冲溶液的pH为5至9，或者例如是6至8。溶质的性质和浓度可被改变以改变溶液的性质。
[0171] 本发明的微滴包封体包含两亲性分子，它们不是聚合物并且不包含聚合物。这种两亲性分子存在于微滴包封体的外围层以及该或每个水性微滴的外层中，其在本文被称作“非聚合两亲性分子”。
[0172] 一般而言，非聚合两亲性分子可为任何类型的能够在多重体的疏水性介质中形成双层的非聚合两亲性分子。这取决于疏水性介质的性质以及微滴的水性介质的性质，但很多种非聚合两亲性分子都是可能的。两亲性分子是同时具有疏水性基团和亲水性基团的分子。如上所述，围绕水性微滴形成的外层通常包含单层的非聚合两亲性分子，它是通过疏水性基团和亲水性基团与水性介质的相互作用而自然形成和维持的，因而这些分子在微滴的表面上排成一行，其中亲水性基团向内朝向水性介质，而疏水性基团向外朝向疏水性介质。类似地，围绕疏水性液滴形成的外围层通常包含单层的非聚合两亲性分子，其同构疏水性基团和亲水性基团与以下物质的相互作用而自然形成和维持：(a)液滴的疏水性介质，以及当微滴包封体被悬浮于亲水性载体(例如水性介质或离子液体)时，(b)亲水性载体。
[0173] 可用在本发明的微滴包封体中的重要的一类非聚合两亲性分子是脂质分子。脂质分子可为任何主要类别的脂质，包括磷脂、脂肪酸、脂肪酰、甘油糖脂、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂(sterol lipids)、异戊烯醇脂、糖脂(saccharolipids)和聚酮。一些重要的离子包括磷脂和脂肪酸。脂质分子可为天然的或合成的。虽然已证实了由脂质分子形成双层，但预期该方法可适用于能够形成双层的任何非聚合两亲性分子。
[0174] 可存在于非聚合两亲性分子的常见的一类疏水性基团是碳氢化合物基团，如大多数脂质都是这样。但是，可被使用的另一种合适类别的疏水性基团是碳氟化合物基团。因此，非聚合两亲性分子的另一个重要的类别是包含至少一个碳氟化合物基团的非聚合两亲性分子。这种分子的一个例子是包含疏水性碳氟化合物尾巴和亲水性头部基团的脂质样分子。氟代两亲物可用来防止膜蛋白插入脂双层中，这可能是通过将蛋白隐藏在氟代两亲物的聚集体中实现的(Raychaudhuri et al. Biochemistry 50, 1599-1606 (2011))。
[0175] 微滴包封体中的非聚合两亲性分子不需要都是相同类型的。相反，在一些实施方式中，非聚合两亲性分子可为两种或更多不同种类的非聚合两亲性分子的混合物。另一个重要的实施例是，在多重体的不同水性微滴的各个外层中的非聚合两亲性分子可为不同类型，因而在不同水性微滴之间形成的双层可为非对称的。
[0176] 因此，通常，在本发明的微滴包封体中的非聚合两亲性分子包含脂质分子。脂质分子不需要都是相同类型的。因此，本发明的微滴包封体中的非聚合两亲性分子可包含单个类型的脂质或两种或更多种不同脂质分子的混合物。而且，微滴包封体的外围层的脂质成分可与水性微滴的外层的脂质成分相同或不同。当包封体中存在多于一个水性微滴时，这些水性微滴的外层的脂质成分可彼此相同或不同，并且可与外围层的脂质成分相同或不同。脂质分子是特别有利的，因为脂双层，或更概括地，非聚合两亲性分子的双层，是细胞膜的样式，因此本发明的微滴包封体可作为多种实验研究的极佳平台，包括例如作为膜蛋白的基础研究的新平台，或作为“逆向”合成生物学的多腔室原始细胞支架。
[0177] 磷脂因以上所述原因而是特别优选地，并且也是因为它们是所有细胞膜的主要成分，使得包含磷脂的微滴包封体特别适合于合成生物学应用以及药物发现。
[0178] 因此，本发明的微滴包封体的非聚合两亲性分子通常包含磷脂分子。磷脂分子可以相同或不同，即，微滴包封体中的非聚合两亲性分子可包含单个种类的磷脂，或两种或更多种不同磷脂的混合物。磷脂对于本领域技术人员来说是熟知的，并且许多是可商业获得的，例如供应商为Avanti Polar Lipids。磷脂分子可为甘油磷脂或鞘磷脂或两者的混合物。磷脂分子可包含阴离子磷脂、包含伯胺的磷脂、含胆碱的磷脂和/或鞘糖脂。通常，非聚合两亲性分子包含一种或多种甘油磷脂。如本领域技术人员将意识到的，甘油磷脂包括，但不限于，具有如以下结构式(I)所定义的结构的甘油磷脂：
[0179] (I)
[0180] 其中：
[0181] R1和R2相同或不同，且选自C10-C25烷基和C10-C25亚烷基；
[0182] R3不存在，因而OR3是O-；或R3存在并且是H、CH2CH2N(R4)3+、糖基、或氨基酸基团；并且
[0183] 每个R4相同或不同，且独立地选自H或未取代的C1-C4烷基。
[0184] 通常，当R3是CH2CH2N(R4)3+，每个R4相同或不同且选自H和甲基。如本领域技术人员将意识到的，当每个R4是甲基时，R3基团是胆碱基团，并且当每个R4是H时，R3基团是乙醇胺基团。
[0185] 当R3是氨基酸基团时，其可为例如丝氨酸基团，即-CH2CH(NH2)(COOH)。当R3是糖基时，其可为例如甘油，即-CH2CHOHCH2OH，或例如是肌醇，即-CH(CHOH)5。
[0186] R1和R2基团的常见例子是C10-C25烷基，包括但不限于线性C10-C25烷基，例如，CH3(CH2)10-、CH3(CH2)12-、CH3(CH2)14-、CH3(CH2)16-、CH3(CH2)18-、CH3(CH2)22-，以及带支链的C10-C25烷基，例如-CH2-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)-(CH2)3-CH(CH3)2。
[0187] R1和R2基团的其他常见例子是未取代的C10-C25亚烷基，包括但不限于，CH3(CH2)5CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)7CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)4CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-、CH3(CH2)4(CH=CHCH2)3CH=CH(CH2)3-、和 CH3CH2CH=CHCH2CH=CHCH2CH=CH(CH2)7-。
[0188] 如本领域技术人员将意识到的，磷酸基团中邻近OR3基团的O-基团在一些实施方式中可被质子化，或与合适的阳离子相连，例如金属阳离子(如Na+)。
[0189] 因此，非聚合两亲性分子可包含一种或多种具有上述式(I)结构的甘油磷脂。
[0190] 例如，非聚合两亲性分子可包含以下甘油磷脂中的任何一种或多种：1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)、1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)、1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC)、或1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-[磷酸-rac-(1-甘油)] (DPPG)或它们的一种或多种的混合物，它们可用作本发明的微滴包封体中的两亲性分子。也可使用甘油磷脂1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)，并且通常与pH敏感性脂质(例如脂肪酸)结合使用(详见下文)。
[0191] 本发明的微滴包封体中的非聚合两亲性分子可包含一种或多种脂肪酸，例如油酸。当然，脂肪酸对于本领域技术人员是熟知的，并且很多种脂肪酸是可商业获得的。
[0192] 例如，非聚合两亲性分子可包含混合物，该混合物包含：(a)一种或多种磷脂，和(b)一种或多种脂肪酸。
[0193] 除了非聚合两亲性分子外，本发明的微滴包封体的外围层可进一步包含PEG基化的脂质。本文所用的术语“PEG基化的脂质”是指用聚乙二醇衍生出的脂质。
[0194] 多重体的外围层中包含一种或多种PEG基化的脂质具有在体内稳定多重体的有用效果，特别是延长多重体的血浆半衰期。这意味着，当多重体含有一种或多种治疗剂或诊断剂时，在外围层中包含一种或多种PEG基化的脂质还具有延长多重体内的试剂的血浆半衰期的有用效果。这种效果之前在PEG基化的脂质用于脂质体药物制剂已观察到。PEG基化的脂质在本领域是已知的，并且在商业上可从例如NOF Corporation, Japan (see http://www.phospholipid.jp/phospholipid_2-3.html)等供应商处获得。在本发明中可使用任何合适的PEG基化的脂质，包括但不限于，PEG-磷脂、二酰基甘油-PEG、胆固醇-PEG衍生物、以及它们的混合物。
[0195] 因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体的外围层进一步包含PE G基化的脂质。外围层除了非聚合两亲性分子外还可包括一种或多种PEG基化的脂质，例如相同PEG基化的脂质的多个拷贝，或两种或更多不同类别的PEG基化的脂质的混合物。合适的PEG基化的脂质包括，但不限于，PEG-磷脂、二酰基甘油-PEG、胆固醇-PEG衍生物、以及它们的混合物。PEG基化的脂质的聚乙二醇(PEG)成分可具有几种不同几何形状中的任何一个。因此，它可为实质上线性的PEG或支链PEG。例如，支链PEG可具有从中央核心基团发出的三至十个PEG链。或者，支链PEG可为星形PEG，具有从中央核心基团发出的10至100个PEG链。或者，PEG可为梳状PEG，具有多个接枝到聚合物骨架上的PEG链。
[0196] 例如，用在外围层中的一种或多种PEG基化的脂质可包含以下结构式(II)的PEG-磷脂，
[0197] (II)
[0198] 其中R1和R2如以上关于式(I)的甘油磷脂所定义的，并且R5是包含聚乙二醇的基团。
[0199] 例如，包含聚乙二醇的基团可具有结构式-CH2CH2NHC(O)-X，或例如-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-X，其中X包含所述聚乙二醇。基团X例如可包含实质上线性的PEG，或例如支链PEG，该支链PEG例如具有三至十个从中央核心基团发出的PEG链。或者，它可为星形PEG，具有从中央核心基团发出的例如10至100个PEG链。或者，它可为梳状PEG，具有多个接枝到聚合物骨架上的PEG链。
[0200] 因此，例如，R5可为-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、
[0201] -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、或-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH，其中q是正整数。例如，整数q可为5至10000，或例如为10至1000。
[0202] 或者，R5可为-(CH2CH2O)qCH3或-(CH2CH2O)qH，其中q是正整数。例如，整数q可为5至10000，或例如为10至1000。
[0203] 此外或作为选择，该一种或多种PEG基化的脂质可包含结构式(III)的二酰基甘油-PEG，
[0204] (III)
[0205] 其中R1和R2如以上关于式(I)的甘油磷脂所定义的，并且R6是包含聚乙二醇的基团。
[0206] 例如，聚乙二醇可包括实质上线性的PEG，或例如是支链PEG，该支链PEG例如具有三至十个从中央核心基团发出的PEG链。或者，它可为星形PEG，具有从中央核心基团发出的例如10至100个PEG链。或者，它可为梳状PEG，具有多个接枝到聚合物骨架上的PEG链。
[0207] 例如，R6可为-(CH2CH2O)qCH3、-(CH2CH2O)qH、
[0208] -CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOCH3、-CH2CH2NHC(O)-(OCH2CH2)qOH、
[0209] -CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOCH3或-CH2CH2NHC(O)(CH2)3C(O)-(OCH2CH2)qOH，其中q是正整数。整数q可为5至10000，或例如为10至1000。
[0210] 此外或作为选择，该一种或多种PEG基化的脂质可包含结构式(IV)的胆固醇-PEG衍生物，
[0211] (IV)
[0212] 其中R7是包含聚乙二醇的基团。
[0213] 同样，聚乙二醇可包括实质上线性的PEG，或例如是支链PEG，该支链PEG例如具有三至十个从中央核心基团发出的PEG链。或者，它可为星形PEG，具有从中央核心基团发出的例如10至100个PEG链。或者，它可为梳状PEG，具有多个接枝到聚合物骨架上的PEG链。
[0214] 例如，R7可为-(OCH2CH2)qOH或-(OCH2CH2)qOCH3，其中q是正整数。整数q可为5至10000，或例如为10至1000。
[0215] 聚甘油可替代聚乙二醇使用，因此在一个实施方式中，本发明的微滴包封体的外围层可进一步包含含有聚甘油部分的脂质。
[0216] 本发明的具有500 μm至2000 μm(通常为约800 μm)直径的微滴包封体已通过实验生产出来。但是，预期可生产处更大的微滴包封体以及更小直径的微滴包封体。因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体的直径等于或小于2 mm，优选等于或小于1 mm。
[0217] 本发明的已通过实验产生的微滴包封体的体积通常为0.2 μL至2 μL，但同样地，预期可产生出更大的微滴包封体和更小体积的微滴包封体。因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体的体积等于或小于4 μL，优选等于或小于2 μL。例如，微滴包封体的体积可为0.2 μL至2 μL。
[0218] 通常，本发明的微滴包封体内的该或每个水性微滴的直径等于或小于500 μm，优选等于或小于300 μm。
[0219] 本发明的微滴包封体中的该或每个水性微滴的体积通常等于或小于80 nL，例如等于或小于20 nL。在一个实施方式中，该或每个水性微滴的体积为0.5 nL至70 nL。
[0220] 如上所述，预期可产生出具有更小体积和直径的微滴包封体。较小的微滴包封体对于体内施用(例如在药物递送应用中)是特别期望的。实际上，在需要多重体与活细胞相互作用的应用中，优选地，微滴包封体不大于几微米，并且理想地是<200 nm。
[0221] 因此，在一些实施方式中，本发明的微滴包封体的直径等于或小于10 μm，例如等于或小于200 nm。在一些实施方式中，本发明的微滴包封体的体积等于或小于0.5皮升，或例如等于或小于5阿托升(attolitre)。
[0222] 增加的曲率对于这些单层或双层的作用可能在这些尺寸的包封体中是显著的。因此，优选在这些微滴包封体中使用具有高内在曲率的脂质，从而适应单层和双层的曲率依赖性，例如相转变。具有高内在曲率的脂质对于本领域技术人员是熟知的。Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. Nat. Rev. Mol. Cell Bio.7, 9–19 (2006)提供了生产双层曲率的几种策略，并且该文献中的表1列出了一些具有高内在曲率的脂质，例如DOPE(具有负曲率)和各种溶血性脂质(具有正曲率)。因此，具有高内在曲率的脂质的离子包括以下溶血性磷脂，所有这些都具有正曲率：L-溶血性磷脂酰胆碱(L-溶血性PC)、O-溶血性磷脂酰胆碱(O-溶血性PC)、P-溶血性磷脂酰胆碱(P-溶血性PC)、溶血性磷脂酸(LPA)、L-溶血性磷脂酰乙醇胺(L-溶血性PE)、O-溶血性磷脂酰乙醇胺(O-溶血性PE)、以及S-溶血性磷脂酰乙醇胺(S-溶血性PE)。二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)也具有正曲率。具有高内在曲率的脂质的其他离子包括以下物质，所有都具有负曲率：二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、磷脂酸(PA)、1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)、胆固醇、二癸酰基甘油(DCG)和二酰基甘油(DAG) (Zimmerberg, J. & Kozlov, M.M. Nat. Rev. Mol. Cell Bio.7, 9–19 (2006))。
[0223] 因此，在一些实施方式中，本发明的微滴包封体中的非聚合两亲性分子可选自L-溶血性PC、O-溶血性PC、P-溶血性PC、LPA、L-溶血性PE、O-溶血性PE、S-溶血性PE、DOPS、DOPC、PA、DOPE、胆固醇、DCG和DAG。
[0224] 在直径小于10 μm的微滴包封体中，优选利用具有正曲率的脂质分别包覆被包封的水性微滴以及疏水性介质的液滴。这可通过将水性微滴在具有负曲率的含油脂质中温育，随后将该微滴转移到包覆有单层正曲率脂质的油滴中而实现。
[0225] 因此，通常，外围层中的非聚合两亲性分子包含具有第一曲率的脂质，该或每个水性微滴的外层中的非聚合两亲性分子具有第二曲率，其中第一曲率是正的并且第二曲率是负的，或者第二曲率是正的并且第一曲率是负的。
[0226] 具有负曲率的脂质的例子包括DOPC、PA、DOPE、胆固醇、DCG和DAG。具有正曲率的脂质的离子包括溶血性磷脂(L-溶血性PC、O-溶血性PC、P-溶血性PC、LPA、L-溶血性PE、O-溶血性PE和S-溶血性PE)和DOPS。
[0227] 如上所述，外围层可进一步包含一种或多种PEG基化的脂质(当存在多于一种时，其可以相同或不同)，从而增加多重体在血流中的寿命。
[0228] 本发明的微滴包封体可用作药物递送载体，例如作为体内递送治疗剂、诊断剂或对比剂的载体，或根据需要作为用于体内递送任何其他类型的化合物或组合物的载体。
[0229] 因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体进一步包含治疗剂。
[0230] 该治疗剂可为前药形式。因此在一个实施方式中，本发明的微滴包封体进一步包含前药。
[0231] 或者，本发明的微滴包封体可包含诊断剂，或例如对比剂。
[0232] 治疗剂、前药、诊断剂或对比剂可存在于本发明的微滴包封体内的水性微滴的亲水性介质中。或者，其可存在于液滴的疏水性介质中。通常，它存在于包封体的该或一个水性微滴的亲水性介质中。
[0233] 相同微滴包封体内的多个微滴可将它们的内容物同时或在不同时间点释放至环境中，例如当暴露于外部刺激时释放，例如pH或温度的变化；这为药物的组合递送提供了有用的方法。实际上，通过包封在常规脂质体中来向细胞递送多种药理学物质需要这些物质被一起包封从而允许它们之间发生可能的不期望的反应，或者这些药物被单独包封，此时每个细胞会接收到一定比例的每种物质，该比例难以控制。相反，递送包封在单个多重体的不同腔室中(包括在疏水相中)的几种药物将允许对剂量比例进行精确控制。这对于递送具有独立作用机制的药物是有利的；可以预期它们以固定比例被细胞吸收，从而增加它们的总体功效，并降低对任何一种药物发展出耐药性的可能性。
[0234] 因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体进一步包含第一药剂和第二药剂。通常，这些存在于包封体的不同部分。本文所述的包封体的部分包括液滴的疏水性介质，以及任何水性微滴的水性介质。
[0235] 因此，在一个实施方式中，第一药剂位于包封体的该水性微滴中或包封体的至少一个水性微滴中，而第二药剂位于疏水性介质内。
[0236] 在另一个实施方式中，本发明的微滴包封体是包含多个所述水性微滴的微滴包封体，并且第一药剂和第二药剂位于包封体的不同水性微滴内。
[0237] 通常，第一和第二药剂选自治疗剂、诊断剂、在组合疗法中一起使用的药物、前药和它们相应的激活剂、药物和它们相应的失活化合物、以及监测药物的生物学分布的对比剂。
[0238] 作为选择，第一和第二药剂可为在化学反应中在一起反应的反应物化合物。
[0239] 通常，第一和第二药剂在微滴包封体中以预定的比例存在，例如以预定的剂量比例存在，或例如以适于特定化学反应在两种药剂之间发生的化学计量比例存在。
[0240] 具有独立作用机制的多种药物的递送可以比每个单个药物的效果的总和更有效。药物组合的通常用途是阻止在很多种疾病中出现耐药性。如果各种药物以溶液递送，就难以控制被特定细胞吸收的每种药物的比例。相反，将这些药物包封在单个载体中，例如包封在本发明的微滴包封体中，使得能够对剂量比例进行精确控制。将多种药物包封在每个多重体的单个腔室中，阻止了药物之间的任何不期望的相互作用，并允许每个水性腔室中的条件为该腔室中的药物而作出优化。
[0241] 因此，在一个实施方式中，上述第一和第二药剂是两种不同的药物。通常，第一和第二药剂是适合在组合疗法中一起使用的药物。这些药物可以以预定的剂量比例存在于微滴包封体中，本领域已知有许多适合在组合疗法中一起使用，因而适合在本发明的微滴包封体中一起使用的药物组合。
[0242] 例如，不具有相同耐药机制的抗疟疾药的组合使用可降低耐药性几率(White, N. “Antimalarial drug resistance and combination chemotherapy.” Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 354,739–749 (1999))。因此，第一和第二药剂可为具有不同耐药性机制的两种不同的抗疟疾药物。特别地，该第一和第二抗疟疾药物可为乙氨嘧啶与周效磺胺或磺胺甲氧吡嗪(sulphalene)的组合，该组合可用来治疗由氯喹耐药性恶性疟原虫引起的疟疾。这两个化合物抑制叶酸生物合成的连续步骤。氯丙胍和氨苯砜的组合使用了相同的机制。其他具有不同作用机制的抗疟疾药物组合包括：阿托伐醌和氯胍、青蒿素和甲氟喹、蒿甲醚和苯芴醇、青蒿酯与阿托伐醌和氯胍、奎宁和四环素、以及奎宁和克林霉素。因此，第一和第二药剂可为上述组合的任何一种。
[0243] 另一个例子是癌症，其存在大量的组合化疗方案(参加例如http://www.macmillan.org.uk)。一些例子是用于霍奇金淋巴瘤的ABVD(阿霉素、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪)、用于非霍奇金淋巴瘤的CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)、以及用于乳腺癌的CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)。因此，本发明的微滴包封体可包含任何上述组合，并且不同的样品可被包含在包封体的相同或不同腔室内。
[0244] 可被包括在本发明的微滴包封体内的药物的另外的例子是用来治疗病毒感染的药物组合(参见Clavel, F. & Hance, A.J. HIV drug resistance. N. Engl. J. Med. 350, 1023–1035 (2004))。常见的组合包括核苷逆转录酶抑制剂(其抑制病毒基因组的逆转录)和非核苷逆转录酶抑制剂(其通过不同机制抑制病毒基因组的逆转录)或蛋白酶抑制剂(其抑制病毒颗粒组装)。一些当前推荐的方案是(参见http://aidsinfo.nih.gov)：恩曲他滨、替诺福韦和依法韦仑；恩曲他滨、替诺福韦和利托那韦；恩曲他滨、替诺福韦、地瑞纳韦和利托那韦；以及恩曲他滨、替诺福韦和雷特格韦。因此，本发明的微滴包封体可包含任何上述组合，并且不同的药物可被包含在包封体的不同腔室内。
[0245] 本发明的微滴包封体还允许递送单独使用时具有很小或不具有疗效并且仅在与其他化合物结合使用时有效的化合物。这些协同组合可用于某些细菌感染的治疗，以及用于前药的递送(活性药物的无活性前体)。在一些情况下，如在下文讨论的细菌感染的治疗中，多种化合物可被包封在一起，此时多重体的优点即如以上所述。在其他情况下，例如下文将讨论的前药的递送和活化中，成分在被集合在一起时发生反应。因此，当多重体被触发而是否其内容物时，在原位产生了具有不同于其母体化合物的性质的活性物质。一些例子列举如下：
[0246] 细菌感染[Walsh, C. Molecular mechanisms that confer antibacterial drug resistance. Nature 406, 775–781 (2000)]：阿莫西林与克拉维酸结合使用，后者使得在某些菌种中会使阿莫西林失活的酶失活。阿莫西林和舒巴坦的结合利用了相似的原理，其中舒巴坦是酶失活剂。另一个协同组合是奎奴普丁和达福普丁。
[0247] 因此，本发明的微滴包封体中的第一药物和第二药物例如可分别为阿莫西林和克拉维酸、分别为阿莫西林和舒巴坦、或分别为奎奴普丁和达福普丁。
[0248] 另一种可能性是酶-前药疗法[Xu, G. & McLeod, H.L. Clin. Cancer Res. 7, 3314–3324 (2001)]：HMR 1826，一种抗癌药物阿霉素的无活性衍生物，通过人β-葡萄糖醛酸酶被转化为阿霉素。在利用该组合的一个研究中，人β-葡萄糖醛酸酶基因首先被转染到肿瘤细胞中，细胞随后产生了酶并分泌了酶。前药HMR 1826被加至细胞外间隙，在那里该前药被转化成活性药物阿霉素。然而，HMR 1826不可透过细胞膜，而阿霉素能够到达细胞质。
因此，本发明的微滴包封体中的第一和第二药剂可为HMR 1826和人β-葡萄糖醛酸酶。
因此，本发明的微滴包封体中的第一和第二药剂可为HMR 1826和人β-葡萄糖醛酸酶。
[0249] 在另一个实施方式中，本发明的微滴包封体被用作用于同时递送前药及其活化剂的载体。在该应用中，多重体的一个内部微滴含有前药，并且相同多重体的另一个内部微滴含有其相应活化剂。在某些外部刺激下，联合地释放内容物，将允许前药和活化剂结合，从而在原位产生活性物质。这将允许施用例如在活性状态太不稳定或不溶而导致无法递送的药物。该方法也可被用来包封不可穿过多重体双层的前药，该前药被转化成能够透过细胞膜的活性药物。
[0250] 因此，在一个实施方式中，第一药剂是能够通过活化剂被活化的药物的无活性形式，而第二药剂是所述活化剂。该活化剂例如可为酶。所述药物的无活性形式可被称为前药。
[0251] 通常，前药是一种在活性状态太不稳定或不溶而导致无法递送的药物。因此，在一个实施方式中，前药是米普昔芬磷酸酯，而活化剂是碱性磷酸酶。米普昔芬磷酸酯是抗癌剂米普昔芬的无活性磷酸酯，它比米普昔芬具有大约1000倍的水溶解度。它通过碱性磷酸酶被转化成活性物质。
[0252] 特别适合在多重体中递送的前药是活化剂无法内源性地找到的那些药物。一些前药方案依赖于在前药的全身性、靶定递送后递送外源性活化剂。Xu, G. & McLeod, H.L. “Strategies for enzyme/prodrug cancer therapy” Clin. Cancer Res. 7, 3314–3324 (2001)提供了用在这些方案中前药/活化剂组合的例子，其可被用作本发明的微滴包封体中的第一药剂和第二药剂。例如，前药可为HMR 1826，此时活化剂是人β-葡萄糖醛酸酶。
[0253] 相反，本发明的微滴包封体可被用来递送被另一物质失活的活性药物，使得在活性药物的整个寿命期内实现精确控制。Bodor, N. & Buchwald, P. “Soft drug design: general principles and recent applications” Med. Res. Rev. 20, 58–101 (2000)提供了软药(soft drug)的几个例子，其通常通过内源性物质被失活。多重体可允许使用外源性失活剂，或比在体内发现的失活剂更高浓度的内源性失活剂。
[0254] 因此，在另一个实施方式中，第一药剂是能够被失活化合物失活的药物，第二药剂是所述失活化合物。例如，第一药剂可为药物米库氯铵，第二药剂可为相应的酶失活剂人血浆胆碱酯酶。
[0255] 除了药物，多重体还可被用来运载用于一些医学成像器械的对比剂。这将允许精确地确定包含在多重体中的药物的分布，同时保持标记物与药物分离，直到递送的时刻为止。应当可以包封对比剂，用于各种医学成像器械，这会允许观察运载药物的多重体如何在体内分布。对药物和示踪物使用单独的腔室会阻止两者之间任何化学反应。对比剂可被包括在多重体内以实现放射线照相术(例如泛影酸盐、碘异酞醇、碘克沙醇)、MRI(例如钆双胺、钆喷酸)、超声(如气泡)，或者放射性核素可被包封而用于正电子放射断层造影术(例如氟代脱氧葡糖(18F))、闪烁扫描术(例如碘苄胍)或单光子发射计算机断层照像术(例如Na123I)。
[0256] 因此，在另一个实施方式中，第一药剂是药物，第二药剂是适于监测该药物的生物学分布的对比剂。例如，对比剂可为用于放射线照相术的对比剂(例如泛影酸盐、碘异酞醇、碘克沙醇)、用于磁共振成像(MRI)的对比剂(例如钆双胺、钆喷酸)、或用于超声的对比剂(如气泡)，或者放射性核素可被包封而用于正电子放射断层造影术(例如氟代脱氧葡糖(18F))、闪烁扫描术(例如碘苄胍)或单光子发射计算机断层照像术(例如Na123I)。
[0257] 多重体可被制备成在不同腔室(包括油相)包含非药物化合物和药物。如上所述，非药物化合物的一种可能性是适合监测药物的生物学分布的对比剂。其他可能性如下所述：
[0258] 靶向剂[Pouponneau, P., Leroux, J.C., Soulez, G., Gaboury, L. & Martel, S. Co-encapsulation of magnetic nanoparticles and doxorubicin into biodegradable microcarriers for deep tissue targeting by vascular MRI
navigation. Biomaterials 32, 3481–3486 (2011)]：最近的研究将阿霉素和磁纳米颗粒(FeCo)包封在聚(乳酸-乙醇酸)微球中，并利用改进的MRI扫描仪来同时地成像和控制微颗粒通过体内血管。相似的原理可适用于本发明的微滴包封体，此时磁性颗粒和药物可被包封在单独的腔室中。
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[0260] 细胞：可能可以在多重体中包封活细胞，并将它们与单独包封在相同多重体的化合物一起释放到环境中，以引起特定行为。
[0261] 因此，在另一个实施方式中，第一药剂是药物，第二药剂是靶向剂、引发剂或活细胞。靶向剂或引发剂可选自以上所列的任何一种。
[0262] 本发明的微滴包封体可在包封体的不同部分包含三种或更多种不同的试剂。
[0263] 因此，在另一个实施方式中，微滴包封体是如上所述的微滴包封体，其包含在外围层内的多个所述水性微滴，并且进一步包含在包封体的不同部分的第一药剂、第二药剂和第三药剂。本文所称的包封体的部分包括液滴的疏水性介质以及不同的水性微滴。
[0264] 例如，在一个实施方式中，第一药剂存在于包封体的一个水性微滴中，第二药剂存在于疏水性介质中，第三药剂存在于另一个水性微滴中。在另一个实施方式中，本发明的微滴包封体是包含多于两个所述水性微滴的微滴包封体，并且第一、第二和第三药剂位于包封体的不同水性微滴内。
[0265] 第三药剂例如可为治疗剂、诊断剂、在组合疗法中与第一或第二药剂一起使用的药物、前药、前药的活化化合物、活性药物的失活化合物、或用于监测第一或第二药剂的生物学分布的对比剂。或者，第一、第二和第三药剂可为在化学反应中在一起反应的反应性化合物。
[0266] 通常，第一、第二和第三药剂以预定比例存在于微滴包封体中。如上所述，被包封在单个多重体的不同腔室(包括在疏水相中)的几种药物的递送将允许对剂量比例进行精确控制。这对于递送具有独立作用机制的药物是有利的。而且，可以预期它们以固定比例被细胞吸收会增加它们的总体功效，并降低对任何一种药物发展出耐药性的可能性。
[0267] 可被用在本发明的微滴包封体中的三种或更多种药物的组合的一些非限制性的例子(例如每种药物在一个单独的腔室内)包括以下癌症疗法：用于霍奇金淋巴瘤的ABVD(阿霉素、博来霉素、长春花碱和达卡巴嗪)、用于非霍奇金淋巴瘤的CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱和强的松)、以及用于乳腺癌的CMF(环磷酰胺、甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶)。
[0268] 也可以合理预期，多重体可能被用来包封当前未组合递送的物质。理想的化合物组合将由下述母化合物组成，即单独使用时是稳定的并且在从多重体被触发释放后发生反应以形成有活性的不稳定化合物。有活性化合物的不稳定性确保了远离触发区域的区域不受影响。
[0269] 在一些实施方式中，本发明的微滴包封体中的一个或多个双层的稳定性可对于刺激(例如外部刺激)是敏感的，因而当所涉及的双层暴露于该刺激时，它可将其内容物释放至周围环境中。对刺激敏感的双层可为在水性微滴和外围层之间的界面处形成的双层，即“外部双层”。此时，将微滴包封体暴露于所涉及的刺激可导致该外部双层泄漏或破裂，该水性微滴的内容物可从微滴包封体中释放。或者，对刺激敏感的双层可为在包封体的两个水性微滴之间的界面处形成的双层，即“内部双层”。此时，将双层暴露于刺激可导致该内部双层泄漏或破裂，以让两个水性微滴的内容混合。
[0270] 相同微滴包封体内的一个或多个微滴的外部双层例如可以对相同刺激敏感，因此，微滴可能能够在暴露于该刺激时同时释放它们的内容物。在其他实施方式中，相同微滴包封体内的两个或更多个微滴的外部双层可具有不同的稳定性，因此，这些微滴可能能够响应不同的刺激，或者例如响应不同水平或幅度的相同刺激，而在不同的时间将它们的内容物释放到环境中。 例如，微滴包封体中的第一微滴可能能够响应pH的变化而释放其内容物，而包封体中的第二微滴可能能够响应温度的变化而释放其内容物。或者，相同微滴包封体内的两个或更多个微滴可响应不同水平的相同刺激而释放它们的内容物。因此，例如，第一个微滴可能能够响应相对小的pH或温度变化而释放其内容物，而第二个微滴可能响应较大的pH或温度变化而释放其内容物。此外或作为选择，包封体内的一个或多个内部双层可对于刺激是敏感的，因而包封体内的两个或多个水性微滴的内容物可被混合。
[0271] 因此，在一些实施方式中，相同微滴包封体内的多个微滴能够在例如暴露于外部刺激(例如pH或温度的变化)时同时向环境中释放它们的内容物。此处所称的内容物可为上述第一、第二和/或第三药剂，或是用于从微滴包封体内释放的任何其他化合物或组合物。
[0272] 因此，在本文所述的包含所述非聚合两亲性分子的双层的本发明的微滴包封体的实施方式中，所述双层的稳定性对于刺激是敏感的。该刺激通常是外部刺激。
[0273] 而且，在本文所述的包含多个所述非聚合两亲性分子的双层的本发明的微滴包封体的实施方式中，一个或多个所述双层的稳定性可对刺激是敏感的。在一些实施方式中，至少一个所述双层的稳定性对刺激是敏感的。该刺激通常是外部刺激。在其他实施方式中，多于一个所述双层的稳定性对刺激是敏感的。在其他实施方式中，每个所述双层的稳定性对刺激都是敏感的。双层所敏感的刺激可以相同或不同。
[0274] 在本文所述的本发明的微滴包封体的实施方式中，当水性微滴的部分外层接触外围层从而在水性微滴和外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层(即，“外部双层”)时，所述双层的稳定性对刺激敏感。该刺激通常是外部刺激。
[0275] 同样，在本文所述的包含在外围层内的多个水性微滴的本发明的微滴包封体的实施方式中，其中多于一个所述水性微滴的外层接触外围层以形成多个外部双层，一个或多个所述双层的稳定性对刺激敏感。该刺激通常为外部刺激。在一些实施方式中，至少一个所述双层的稳定性对刺激敏感。在其他实施方式中，多于一个所述双层的稳定性对刺激敏感。在其他实施方式中，每个所述双层的稳定性都对刺激敏感。外部双层所敏感的刺激可以相同或不同。
[0276] 在本文所述的包含在外围层内的多个水性微滴的本发明的微滴包封体的实施方式中，其中第一个所述水性微滴的部分外层接触第二个所述水性微滴的部分外层，从而在所述第一个和第二个水性微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层(“内部双层”)，所述双层的稳定性可以对刺激敏感或不敏感。在一些实施方式在，所述内部双层的稳定性对外部刺激敏感。
[0277] 而且，在本文所述的包含多个非聚合两亲性分子的所述内部双层的本发明的微滴包封体的实施方式中，一个或多个所述双层的稳定性可对刺激敏感。该刺激可为外部刺激。在一些实施方式中，至少一个所述内部双层的稳定性对刺激敏感。在其他实施方式中，每个所述内部双层的稳定性对刺激敏感。内部双层所敏感的刺激可以相同或不同。
[0278] 通常，本发明的微滴包封体是一个进一步包含用于递送的药剂的包封体，例如如上所述的治疗剂、前药、诊断剂、或对比剂。或者，其可为包含两种或更多种这种用于递送的药剂的包封体。如上所述，这两种或更多种药剂可位于包封体的分开的部分，或位于相同部分。例如，本发明的微滴包封体可为，如上所述，包含在包封体的分开部分的第一药剂和第二药剂的包封体，或如上所述，可为包含在包封体的分开部分的第一、第二和第三药剂的包封体。
[0279] 如上所述，该刺激可为pH变化(例如pH的增加或降低)、温度变化(例如加热或冷却)，但是可使用任何其他合适的刺激。其他可被使用的合适刺激包括，但不限于超声；机械刺激；剪切流；物质的临界浓度(例如二价阳离子的临界浓度)；磁场；电场；和电磁辐射(光)，包括但不限于，红外、UV、X射线和γ射线。此外或作为选择，非聚合两亲性分子的双层的稳定性可通过将分子包括在一个或多个双层中而被控制，该分子例如是识别靶细胞上的表面物质的脂质或蛋白质。该表面物质可本身为蛋白质。这种识别的响应可能是双层的立即去稳定作用，或者其可能是间接的。因此，在一个实施方式中，所述双层的非聚合两亲性分子包含识别靶细胞上的表面物质的分子，其中对识别的响应包含双层的去稳定作用。该响应可包括双层的立即去稳定作用，或者它可包括双层的间接去稳定作用。该分子例如可为脂质或蛋白质。
[0280] 但是，通常外部刺激是pH变化或温度变化。
[0281] 在一个实施方式中，外部刺激是pH变化。非聚合两亲性分子的双层所敏感的pH变化可以是pH从高于7.5降低至低于7.5，或例如pH从高于7.0降低至低于7.0，或例如pH从高于7.0降低至低于6.5。更常见地，所述pH变化是pH从高于7.0降低至低于6.0，或例如pH从高于7.5降低至低于7.0，或例如pH从高于7.5降低至低于6.5，或例如pH从高于7.5降低至低于6.0，或例如pH 从高于7.5降低至低于5.5。因此，在一些实施方式中，所述双层的非聚合两亲性分子被选择使得该双层在所述pH变化时破裂或泄露。本文所述的“破裂”是指不可逆地破裂，因而微滴包封体的整个内容物被释放到环境中。本文所述的术语“泄露”是指一些内容物从微滴包封体释放，例如当微滴包封体的双层的结构变得较不稳定时，从而泄露出它们的内容物，但微滴包封体的总体结构仍几乎是完整的。
[0282] 在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，非聚合两亲性分子的所述双层能够在暴露于小于7.5的pH时破裂或泄露。在本发明的微滴包封体的另一个实施方式中，非聚合两亲性分子的所述双层能够在暴露于酸性pH(即，小于7.0的pH)时破裂或泄露。通常，在该实施方式中，所述酸性pH为6.5的pH或以下。更常见地，所述酸性pH是6.0的pH或以下，或例如5.5的pH或以下。
[0283] 这可通过在所涉及的双层中使用pH敏感性脂质来实现。例如，pH敏感性脂质可为脂肪酸，当被加入该双层时，该脂肪酸在期望该非聚合两亲性分子应当变得不稳定时所在的pH或该pH附近具有pKa。在大于脂肪酸的pKa的pH时，脂肪酸被去质子化，因而有强的两亲性，因而适合稳定多重体的内部或外部双层。相反，在低于pKa的pH时，脂肪酸被质子化并且具有较低的两亲性，从而破坏其所在双层的稳定性。本领域技术人员会意识到，双层中的脂肪酸的pKa相比于水性溶液中游离脂肪酸的pKa有变化。因此，本文所称的每个pKa是指脂肪酸存在于微滴包封体中的非聚合两亲性分子的双层中时的pKa。本领域技术人员可利用本领域已知的方法容易测量出双层中的脂肪酸的pKa，例如通过已知的光谱法，特别是已知的利用NMR光谱法的方法。
[0284] 因此，在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，双层的非聚合两亲性分子包含pH敏感性脂质。
[0285] 通常，pH敏感性脂质是脂肪酸。在一个实施方式中，pH敏感性脂质是具有等于或小于约8.5的pKa的脂肪酸。
[0286] 在另一个实施方式中，pH敏感性脂质是具有等于或少于约8.0的pKa的脂肪酸。在另一个实施方式中，pH敏感性脂质是具有等于或少于约7.5的pKa的脂肪酸。
[0287] 例如，pH敏感性脂质可为pKa为6至8的脂肪酸，例如pKa为约7.5的脂肪酸。合适的脂肪酸包括油酸，当其存在于双层中时具有约7.5的pKa。
[0288] 在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，双层的非聚合两亲性分子包含如上所述的pH敏感性脂质，以及对pH不敏感的另一种脂质。通常，该对pH不敏感的另一种脂质是一种倾向于非双层状态但在中性pH时与pH敏感性脂质结合形成稳定的双层的脂质。通常，该对pH不敏感的另一种脂质是磷脂。更常见地，它是甘油磷脂。用于此目的的合适的甘油磷脂为1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。
[0289] 因此，在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，双层的非聚合两亲性分子包含如上所述的pH敏感性脂质以及1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)。因此，例如，本发明的微滴包封体的非聚合两亲性分子可包含DOPE和油酸的混合物。在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，双层的非聚合两亲性分子包含摩尔比为1:1至3:1、优选摩尔比为约2:1的DOPE和油酸。
[0290] 在另一个实施方式中，本发明的微滴包封体中的非聚合两亲性分子的双层是温度敏感性的。因此，在一些实施方式中，非聚合两亲性分子的双层可能能够在暴露于升高的温度时或暴露于降低的温度时破裂或泄露。在一个实施方式中，非聚合两亲性分子的双层能够在暴露于升高的温度时破裂或泄露。为了可用于体内药物递送，该升高的温度通常约为体温或高于体温，例如，约或高于37℃。因此，在本发明的微滴包封体的一个实施方式中，非聚合两亲性分子的双层能够在暴露于等于或高于约37℃的温度破裂或泄露。在另一个实施方式中，非聚合两亲性分子的双层能够在暴露于等于或高于约40℃的温度，或例如等于或高于约42℃的温度破裂或泄露。这样的实施方式可与至多42℃的局部中等体温过高结合使用，从而在体内产生多重体的药物释放的响应的局部提升。
[0291] 通常，在这些实施方式中，非聚合两亲性分子的双层包含温度敏感性脂质。或者，非聚合两亲性分子的双层可包含温度敏感性脂质和另一种脂质。通常，该温度敏感性脂质是磷脂，更常见的是甘油磷脂。该另一种脂质通常是磷脂。
[0292] 通常，该温度敏感性脂质是在感兴趣温度时或该温度附近具有熔化转变温度Tm的脂质，在该感兴趣的温度，期望的是，该非聚合两亲性分子的双层应当变得不稳定。已知以这种脂质制成的脂质体在Tm附近具有局部最大透过率，这是由于脂质体双层的固相和液相之间的边界引起的。
[0293] 即便这样，微滴包封体的爆裂温度可显著不同于(通常低于)温度敏感性脂质的转变温度。如果存在另一种脂质时通常即是这种情况，因为另一种脂质的存在可具有拓宽温度敏感性脂质的熔化转变的效果，和/或具有降低温度敏感性脂质的峰值转变温度的效果。第二，温度敏感性脂质体的内容物释放的程度已显示出随着它们的尺寸而增加，因而对于给定的温度敏感性脂质，本发明的微滴包封体的爆裂温度可随着微滴包封体的尺寸增加而降低。
[0294] 因此，通常，用在本发明的微滴包封体中的双层中的温度敏感性脂质的熔化转变温度Tm等于或大于感兴趣的温度，在该感兴趣的温度，期望的是，该非聚合两亲性分子的双层应当变得不稳定。
[0295] 因此，该温度敏感性脂质可为熔化转变温度Tm等于或大于约37℃的脂质。更常见地，它是为熔化转变温度Tm等于或大于约40℃的脂质。因此，它可为熔化转变温度Tm为37℃至90℃、或例如40℃至70℃的脂质。在一个实施方式中，该温度敏感性脂质是熔化转变温度Tm为40℃至60℃的脂质。
[0296] 通常，该温度敏感性脂质是甘油磷脂。它可为例如1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)或1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC)。如果有另一种脂质与该温度敏感性脂质同时存在，那么它通常是甘油磷脂，例如是本文所述式(I)的甘油磷脂。例如，该另一种脂质可为1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
[0297] 因此，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体中的非聚合两亲性分子的双层包含1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。通常，在这个实施方式中，该非聚合两亲性分子包含摩尔比为1:1至5:1，优选摩尔比为约3:1的1,2-二硬脂酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC)和1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
[0298] 在另一个实施方式中，该非聚合两亲性分子包含1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC)和1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。
[0299] 本发明的微滴包封体在水性环境和其他亲水性环境中是稳定的。
[0300] 因此，本发明提供一种组合物，其包含：(a)如本文所述的本发明的微滴包封体，和(b)亲水性载体。
[0301] 通常，该组合物包含多个本文所述的本发明的微滴包封体和所述亲水性载体。
[0302] 该亲水性载体可为任何合适的亲水性介质。通常，它是水性的。因此，该亲水性载体通常包含水。例如，该亲水性载体可为纯水或水性溶液。通常，它是水性缓冲溶液。但是，也可使用非水亲水性物质，例如亲水性离子液体。因此，在一个实施方式中，该亲水性载体包含离子液体。对于某些应用，期望的是，该亲水性载体是药学上可接受的。
[0303] 因此，本发明进一步提供一种药物组合物，其包含：(a)本文所述的本发明的微滴包封体，和(b)药学上可接受的亲水性载体。通常，在本发明的这个方面，本发明的微滴包封体是如上所述的进一步包含用于体内递送的药剂(例如治疗剂、前药、诊断剂或对比剂)的包封体。或者，它可为如上所述的在包封体分开的部分包含两种或更多种药剂的包封体。例如，本发明的微滴包封体可为如上所述的在包封体的分开的部分包含第一药剂和第二药剂的包封体，或如上所述的在包封体的分开的部分包含第一、第二和第三药剂的包封体。
[0304] 本发明进一步本文所述的本发明的微滴包封体或本文所述的本发明的组合物在通过疗法治疗人体或动物体的方法中的应用。通常，在这个方面，本发明的微滴包封体，或组合物中的该或每个微滴包封体，是如上所述的进一步包含治疗剂或前药的本发明的微滴包封体。例如，它可为如上所述的在包封体的分开的部分包含两种或更多种药剂的包封体。例如，本发明的微滴包封体可为如上所述的在包封体的分开的部分包含第一药剂和第二药剂的包封体，或如上所述的在包封体的分开的部分包含第一、第二和第三药剂的包封体。
[0305] 本发明进一步提供本文所述的本发明的微滴包封体或本文所述的本发明的组合物在施用于人体或动物体的诊断方法中的应用。通常，在这个方面，本发明的微滴包封体，或组合物中的该或每个微滴包封体，是如上所述的进一步包含诊断剂或对比剂的本发明的微滴包封体。例如，它可为如上所述的在包封体的分开的部分包含两种或更多种药剂的包封体。例如，本发明的微滴包封体可为如上所述的在包封体的分开的部分包含第一药剂和第二药剂的包封体，或如上所述的在包封体的分开的部分包含第一、第二和第三药剂的包封体。
[0306] 多重体的其他应用包括为膜蛋白的基础研究提供新的平台，以及用作“逆向”合成生物学的多腔室原始细胞支架。特别地，本发明的微滴包封体可被用于制备原始细胞或原始细胞的聚集体(原始组织)。
[0307] 因此，本发明提供本文所述的本发明的微滴包封体或本文所述的本发明的组合物在合成生物学中的应用。
[0308] 本发明进一步提供本文所述的本发明的微滴包封体或本文所述的本发明的组合物在制备原始细胞中的应用。
[0309] 本发明进一步提供本文所述的本发明的微滴包封体或本文所述的本发明的组合物在制备原始组织中的应用。
[0310] 原始细胞可通过从本发明的微滴包封体中除去疏水性介质或降低疏水性介质的量来制备，所述微滴包封体例如是在外围层内仅含有一个水性微滴的微滴包封体。通过让疏水性介质蒸发和/或机械地将其移除(例如利用微量移液器)，该疏水性介质可从水性微滴周围被移除。当越来越多的疏水性介质被移除，非聚合两亲性分子的外围层越来越靠近水性微滴的外层，其最终与水性微滴的非聚合两亲性分子的外层形成双层。两个单层粘合形成双层是不需要除去油的。但是，油的去除会导致单层进一步粘合到双层中。因此，疏水性介质的移除或量的减少会导致在水性微滴的表面周围形成双层，以产生出类细胞结构，其本身可被用作原始细胞或可被用来产生原始细胞。将油全部去除会导致双层完全围绕水性微滴表面形成。在疏水性介质被移除或量被减少后，双层快速形成，这是因为在缺少一定量的介于中间的疏水性介质后，双层比两个单层具有较低的自由能，因而具有用于形成的负自由能；因此它是自发的事件。双层也可在不去除或不减少疏水性介质的量的情况下形成；如前所述，双层形成仅需要两个包覆单层的表面彼此靠近，如果水性微滴在油滴中不是呈平衡浮力的，双层形成可自发进行；但是，油的去除可导致单层进一步粘合进入双层。
[0311] 原始组织可利用类似方法来生产，其以本发明的包含水性微滴的链或网络的微滴包封体开始。此时，水性微滴已经在它们之间形成了双层；但是，链或网络的部分外层仍为单层形式，并暴露于多重体中的疏水性介质中。从链或网络周围减少或除去疏水性介质会导致外围单层越来越靠近链或网络中的水性微滴的外部单层表面，最终，外围单层将与水性微滴的外部单层结合从而形成双层。因此，除去或减少疏水性介质的量会导致围绕链或网络的表面形成双层，以产生出类细胞结构的网络，其可被用作生产原始组织的基础。除去所有的油会导致双层完全围绕链或网络的表面形成。如上所述，双层也可在不去除或不减少疏水性介质的量的情况下形成，但油的去除可诱导单层进一步粘合进入双层。
[0312] 因此，本发明进一步提供制备原始细胞的方法，该方法包括：提供如如上所述的本发明的微滴包封体，以及让水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的所述外围层，或使得水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的所述外围层，从而围绕所述水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0313] 如上所述，双层形成可通过从本发明的微滴包封体中除去部分或所有疏水性介质来辅助进行。因此，在一些实施方式中，制备原始细胞的方法包括：从如上所述的本发明的微滴包封体中除去一些或所有疏水性介质，因而非聚合两亲性分子的所述外围层粘合至所述水性微滴的外层，从而围绕该水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0314] 通常，在本发明的制备原始细胞的方法中，该本发明的微滴包封体是仅含有一个水性微滴的包封体。
[0315] 本发明进一步提供能够通过如上所述的用于制备原始细胞的本发明的方法获得的原始细胞。
[0316] 本发明进一步提供一种包含如本文所述的本发明的微滴包封体的原始细胞，其中费聚合两亲性分子的所述外围层接触所述水性微滴的外层，从而围绕水性微滴的一部分形成非聚合两亲性分子的双层。通常，该本发明的微滴包封体是仅含有一个水性微滴的包封体。
[0317] 本发明的微滴包封体中的该水性微滴当在外部施加剪切流时(例如外部水相)可从油滴脱离，以产生油滴和单独的大型单层囊泡。例如，该囊泡可用作原始细胞。
[0318] 因此，本发明进一步提供制备囊泡的方法，该方法包括对本发明的微滴包封体施加剪切流。
[0319] 本发明进一步提供制备原始细胞的方法，该方法包括对本发明的微滴包封体施加剪切流。
[0320] 本发明还提供能够通过如上所述的制备原始细胞的本发明的方法获得的原始细胞。
[0321] 本发明进一步提供制备原始组织的方法，该方法包括：提供如本文所述的包含多个所述水性微滴的本发明的微滴包封体，并且让水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的外围层或使水性微滴的外层接触非聚合两亲性分子的外围层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0322] 如上所述，双层形成可通过从本发明的微滴包封体中除去一些或所有疏水性介质来辅助进行。因此，在一些实施方式中，制备原始组织的方法包括：从如上所述的本发明的微滴包封体中除去一些或所有疏水性介质，因而非聚合两亲性分子的所述外围层粘合至所述水性微滴的外层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成非聚合两亲性分子的双层。
[0323] 通常，在本发明的制备原始组织的方法中，本发明的微滴包封体是包含两个或更多个水性微滴的包封体，或例如包含多于两个水性微滴的包封体，这些水性微滴在链或网络中彼此接触，其中链或网络中的每个微滴的部分外层接触链或网络中的另一个微滴的部分外层，从而在链或网络中的微滴之间的界面处形成非聚合两亲性分子的双层。
[0324] 本发明还提供能够通过如上所述的用于制备原始组织的本发明的方法获得的原始组织。
[0325] 本发明还提供包含如上所述的本发明的微滴包封体的原始组织，该微滴包封体包含多个所述水性微滴，其中非聚合两亲性分子的外围层接触所述水性微滴的外层，从而围绕所述多个水性微滴的至少部分表面形成所述非聚合两亲性分子的双层。
[0326] 本发明还提供包含如上所述的本发明的多个原始细胞的原始组织。
[0327] 如图1所示，通过利用膜蛋白和经双层连接的多个微滴，多重体可感测其环境、处理信息、并视情况向周围环境递送物质。因此，本发明进一步提供如本文所述的本发明的微滴包封体用于在包封体的微滴之间运输分子和/或从包封体的微滴递送分子到外部环境的用途。更普遍地，本发明进一步提供如本文所述的本发明的微滴包封体用于在被包封的微滴和环境之间交换物质的用途。
[0328] 多重体也可被用作膜蛋白的基础研究的平台：本发明的微滴包封体提供了制造弯曲的脂质双层的简单方法，并具有多种方法控制双层曲率。而且，它们通过几乎任何微米操作和纳米操作手段而允许将两个脂质双层紧密地并列放置，从而便于进行各种实验。这些实验包括研究和/或筛选膜蛋白，研究和/或筛选与膜蛋白相互作用的分析物，以及研究和/或筛选微滴包封体中的弯曲双层。实际上，一般来说，本发明的微滴包封体可被用来研究通常涉及发生在双层或经由双层的过程的任何双层现象。
[0329] 因此，本发明进一步包括本文所述的本发明的微滴包封体在研究和/或筛选膜蛋白的方法中的应用。如下文将进一步解释的，本发明的微滴包封体特别是用于研究横跨两个紧密并列的双层的膜蛋白。因此，在一个实施方式中，膜蛋白是横跨两个双层的膜蛋白。
[0330] 在另一个方面，本发明提供如本文所述的本发明的微滴包封体在研究和/或筛选与膜蛋白相互作用的分析物的方法中的应用。
[0331] 在另一个方面，本发明提供了如本文所述的本发明的微滴包封体在研究和/或筛选非聚合两亲性分子的双层的方法中的应用。
[0332] 本发明的微滴包封体也可用来研究插入到双层中的膜蛋白的性质。例如，可确定膜蛋白的性质的电压依赖性。研究脂质双层中的膜蛋白的技术在本领域是熟知的。可通过测量例如经由膜蛋白流动通过脂质双层的离子电流，来确定通道或孔的功能。运输蛋白的功能可通过测定易位通过脂质双层的分子的量来确定，这可通过例如质谱分析法或ELISA或通过利用荧光标记的或放射性标记的底物来进行。
[0333] 如上所述，本发明的微滴包封体对于研究横跨两个双层的膜蛋白是特别有用的。例如，通过将两个具有单个内部微滴的多重体定位成使它们的双层并列，本发明的微滴包封体可被用来在单分子水平研究横跨两个脂质双层的成孔蛋白复合物，例如间隙连接及核孔。
[0334] 因此，在另一个方面，本发明提供如上所述的本发明的第一个微滴包封体和如上所述的本发明的第二个微滴包封体，用于研究和/筛选横跨两个所述非聚合两亲性分子的双层的膜蛋白复合物的用途，
[0335] 其中，在每个所述第一和第二微滴包封体中，一个所述水性微滴位于液滴的边缘，其中该水性微滴的部分外层接触所述外围层，从而在该水性微滴和该外围层之间的界面处形成所述非聚合两亲性分子的双层，
[0336] 其中所述第一和第二微滴包封体被设置使得第一微滴包封体的双层和第二微滴包封体的双层并列，并且其中膜蛋白横跨所述两个并列的双层。
[0337] 利用多种膜泵、通道和孔，可构建出通过微滴界面双层连接的水性微滴的网络，以作为光传感器、电池和电性装置。这在Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007)和Maglia, G. et al. Nat. Nanotechnol. 4, 437-440 (2009)中有描述，其涉及在主体油相中构建这样的微滴网络。这种微滴网络也可在多重体内被构建，其利用本文所述的方法进行，以提供起传感器、电池或电性装置作用的本发明的微滴包封体。
[0338] 因此，本发明进一步提供如本文所述的本发明的微滴包封体作为传感器、电池或电性装置的应用。本发明进一步提供包含如本文所述的本发明的微滴包封体的传感器、电池或电性装置。
[0339] 本发明也设想出彼此之间通过包含多个多重体的主体亲水(通常为水性)相交流的多个多重体，其中第一个多重体通过将物质释放到主体溶液中“发送”信号，这可通过经由外部双层中的孔的扩散实现，或通过pH或温度诱导的爆裂实现，而第二个多重体随后“接收”该信号。该第二个多重体可通过将物质经由外部双层中的孔扩散到第二个多重体的水性微滴中，或通过利用第二个多重体的对该信号敏感的外部脂质单层中的另一种物质而接收该信号。
[0340] 本发明还设想了与外部化学物质和生物学物质交流的多重体，包括例如与生物学细胞、组织或生物体交流的多重体。例如，在一个实施方式中，本发明的微滴包封体能够通过释放神经末梢能够检测到的神经递质而与神经末梢交流。神经递质可通过经由多重体的外部双层中的孔的扩散或通过pH或温度诱导的爆裂而被释放。一旦被多重体释放，神经递质随后被神经末端检测到，因而信号从该多重体被发送至神经。
[0341] 本发明的微滴包封体可通过本发明生产微滴包封体的方法来制备，该微滴包封体包含：
[0342] - 疏水性介质的液滴 ；
[0343] - 包围该液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；和
[0344] - 外围层内的水性微滴，该水性微滴包含(a)水性介质和(b)包围该水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；
[0345] 该方法包括：
[0346] 将水性微滴转移到疏水性介质的液滴中，该水性微滴包含(a)水性介质和(b)包围该水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层，其中所述疏水性介质的液体具有包围其表面的非聚合两亲性分子的外围层。
[0347] 通常，本发明的方法包括以下步骤：
[0348] (i)在存在非聚合两亲性分子的情况下，将疏水性介质的液滴转移到亲水性载体中，从而产生疏水性介质的液滴和包围该液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；
[0349] (ii)在存在非聚合两亲性分子的情况下将水性介质的微滴引入到疏水性介质中，从而产生位于疏水性介质中的水性微滴，所述水性微滴包含：(a)所述水性介质和(b)包围该水性介质的表面的非聚合两亲性分子的外层；
[0350] 其中步骤(i)和(ii)可以以任何顺序或同时进行；以及
[0351] (iii)将步骤(ii)中产生的水性微滴转移到步骤(i)中产生的疏水性介质的液滴中，从而产生所述微滴包封体。
[0352] 步骤(i)中使用的亲水性载体可为任何合适的亲水性载体。通常，它是水性的。因此，该亲水性载体通常包含水。例如，该亲水性载体可为纯水或水性溶液。通常，它是水性缓冲溶液。但是，可以使用非水的亲水性物质，例如亲水性离子液体。因此，在一个实施方式中，该亲水性载体包含离子液体。在优选的实施方式中，该亲水性载体是水性介质，例如水或水性缓冲溶液。
[0353] 用在步骤(i)中的疏水性介质可为如上关于本发明的微滴包封体所定义的疏水性介质。疏水性介质的液滴可在存在非聚合两亲性分子的情况下被引入到亲水性载体中。疏水性介质的液滴通常可利用移液管被引入亲水性载体中。通常，非聚合两亲性分子存在于该疏水性介质本身中，即，它们存在于疏水性液滴中。或者，它们可被提供在亲水性载体中，例如它们可被溶解在亲水性载体中，或以脂质囊泡形式悬浮于亲水性载体中。该非聚合两亲性分子可为如以上关于本发明的微滴包封体所定义的非聚合两亲性分子。优选地，如果非聚合两亲性分子不存在于疏水性介质中，那么它们存在于微滴的水性介质和步骤(i)中使用的亲水性载体中。这改善了多重体的稳定性。
[0354] 疏水性液滴的直径可通过在具有相似直径的环上形成该液滴而控制。通常，疏水性液滴形成于亲水性载体内的环上。因此，空环首先被浸没在亲水性载体中，然后疏水性介质的液体被引入到亲水性载体中，并随后引入到该环上。通常，疏水性介质的液滴通过移液管被移入亲水性介质中并移到环上。
[0355] 或者，如果期望获得较小的疏水性液滴，那么可利用微量移液管来控制疏水性液滴的直径，即，通过将来自微量移液管的疏水性介质的液滴引入亲水性载体内。
[0356] 疏水性液滴的直径通常为500 μm至2000 μm，更常见地是500 μm至1500 μm，例如约800 μm。但是，也可使用较大的液滴或较小直径的微滴。因此，疏水性液滴的直径可等于或小于约2 mm，或例如等于或小于1 mm。
[0357] 围绕液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层的形成是直接形成的。如上所述，这仅通过在液滴的疏水性介质中或在亲水性载体中提供非聚合两亲性分子而实现，如果液滴留在亲水性载体中足够长的时间，可自然形成该层。非聚合两亲性分子在亲水性载体和疏水性液滴之间的界面处自发形成一层，通常为单分子层，其变成本发明的微滴包封体的外围层。
[0358] 步骤(i)中使用的疏水性介质还可包含任何另外的药剂，例如任何治疗剂、药物、前药、诊断剂或其他期望被包括在所形成的的微滴包封体的疏水性介质中的药剂。
[0359] 步骤(ii)涉及要被包括在多重体中的水性微滴的生产，在步骤(ii)中，水性介质的微滴被在存在非聚合两亲性分子的情况下引入到疏水性介质中。当然，如果多于一个水性微滴要被包括在多重体内，那么多于一个微滴可在此阶段根据步骤(ii)被制备，随后所形成的用于多重体的每个微滴可根据步骤(iii)被转移到疏水性液滴中。
[0360] 步骤(ii)中使用的疏水性介质通常与步骤(i)中用来产生疏水性液滴的疏水性介质相同，并且它可为如上关于本发明的微滴包封体所述的任何一种疏水性介质。非聚合两亲性分子通常存在于疏水性介质中。但是，作为选择，它们可存在于微滴的水性介质中，例如溶解于水性介质中，或以脂质囊泡形式悬浮于水性介质中。优选地，如果非聚合两亲性分子不存在于疏水性介质中，那么它们存在于微滴的水性介质和步骤(i)使用的亲水性载体中。这改善了多重体的稳定性。用在步骤(ii)中的非聚合两亲性分子可为以上关于本发明的微滴包封体所描述的任何一种非聚合两亲性分子。
[0361] 步骤(ii)中所使用的水性介质可为纯水。或者，它可为水性溶液。该水性溶液可根据多重体内所涉及的微滴的目的和用途而被选择。一个重要的性质是pH，其可在大范围内改变。因此，水性介质可为水性缓冲溶液。可使用任何合适的缓冲液，这取决于期望的pH。例如，缓冲溶液可包括具有KCl和EDTA的Tris HCl。如果水性微滴要含有药剂，例如治疗剂、药物、前药、诊断剂、活化剂、失活剂或感测分子，该试剂通常存在于用来在此阶段形成微滴的水性介质中。类似地，如果水性微滴要与多重体中的其他微滴交流，或与外部环境交流，那么合适的膜蛋白通常会存在于此阶段的水性介质中。该蛋白可为之前关于本发明的微滴包封体所讨论的任何一种膜蛋白。
[0362] 在步骤(ii)中，水性介质的微滴可利用微量移液管被引入到疏水性介质中，例如通过具有电泳凝胶加样尖端的移液管进行。微量移液管的尖端通常填充有水性介质，随后被浸没在疏水性介质中。刚好足够的水性介质可随后被推出以暴露出小的悬滴，该微滴随后可利用任何常规方法而与尖端分离，例如通过靠着含有该疏水性介质的管的壁按压该尖端来分离。水性微滴的体积通常等于或小于80 nL，但是例如可等于或小于20 nL。
[0363] 围绕水性介质的表面的所述非聚合两亲性分子的外层的形式是直接形成的。如上所述，这仅通过在疏水性介质中或在液滴的水性介质中提供非聚合两亲性分子而实现，如果微滴留在疏水性介质中足够长的时间，可自然形成该外层。非聚合两亲性分子在液滴和疏水性介质之间的界面处自发形成一层，通常为单分子层。
[0364] 将水性微滴转移到疏水性介质的液滴以产生本发明的所述微滴包封体的步骤可利用任何合适的方法进行；这些微滴很强健并且容易操作。该步骤通常利用移液管进行。但是，该步骤也可作为自动程序的一部分在微流体装置中进行(见下文)。
[0365] 如果微滴包封体要包含多于一个水性微滴，那么多于一个微滴可以此方式被转移到疏水性液滴内，这可通过将完整DIB网络、链或多个水性微滴转移到疏水性液滴中，或通过转移随后可在原位形成双层的未连接的微滴而实现。如上所述，这些微滴很强健并且容易操作。
[0366] 通常，在足以实现以下情形的时间段过去之后，再进行步骤(iii)：(a)围绕水性介质的微滴的表面形成非聚合两亲性分子的外层，和(b)围绕疏水性介质的液滴的表面形成非聚合两亲性分子的外围层。形成稳定单层所需的这个时间段可被称为温育时间。该温育时间根据所使用的疏水性介质以及非聚合两亲性分子的浓度而变化。
[0367] 在一个实施方式中，在完成步骤(i)和(ii)后至少5分钟再进行步骤(iii)。在其他实施方式中，在完成步骤(i)和(ii)后至少10分钟再进行步骤(iii)，或例如在完成步骤(i)和(ii)后至少25分钟再进行步骤(iii)。在仅使用DPhPC的实施方式中，该等待时间为 10分~钟；在使用DOPE/OA混合物的实施方式中，该等待时间为 25分钟；在使用DSPC/DPhPC混合物~
的实施方式中，该等待时间为 10分钟。
~
的实施方式中，该等待时间为 10分钟。
~
[0368] 本发明的用于生产本发明的微滴包封体的方法可进一步包括从亲水性载体中回收所述微滴包封体。该微滴包封体可利用任何合适的技术被回收，例如通过使用移液管来从亲水性载体中移除微滴包封体而回收。
[0369] 该方法可进一步包括将所回收的微滴包封体重新引入到另一个亲水性载体中。例如，该另一个亲水性载体可为药学上可接受的组合物、水或水性溶液、离子液体、或例如是粘性的或刚性的亲水性载体材料。
[0370] 或者，本发明的用于生产本发明的微滴包封体的方法可进一步包括以另一个亲水性载体更换该亲水性载体。因此，例如，当亲水性载体是水性溶液时，该方法可进一步包括通过连续稀释而以新的水相更换所述水性溶液。
[0371] 本发明进一步提供能能够通过如上所述的用于生产微滴包封体的本发明的方法获得的微滴包封体。
[0372] 本发明的微滴包封体也可利用微流体技术来生产，例如其可利用连续剪切或流动聚焦微流体装置。这种技术特别适合于生产具有小的体积和直径(例如约100 μm的直径)的微滴包封体。因此，微流体技术对于生产用于体内施用的微滴包封体是合乎需要的，例如用于药物递送应用中。
[0373] 因此，在另一个方面，本发明提供一种生产微滴包封体的方法，该方法包括：
[0374] (i)从微流体装置的第一通道将水性介质的微滴引入到该微流体装置的第二通道，该第一通道含有所述水性介质，该第二通道含有疏水性介质，
[0375] 其中第一通道中的水性介质，或第二通道中的疏水性介质，或两者都进一步包含非聚合两亲性分子，
[0376] 从而在第二通道内产生位于疏水性介质内的水性微滴，所述水性微滴包含：(a)所述水性介质和(b)包围该水性介质的表面的所述非聚合两亲性分子的外层；以及
[0377] (ii)从该第二通道将所述疏水性介质的液体引入到该微流体装置的第三通道，该疏水性介质的液滴包含该水性微滴，其中第三通道含有亲水性载体，
[0378] 其中第二通道中的疏水性介质，或第三通道中的亲水性载体，或两者都进一步包含非聚合两亲性分子，
[0379] 从而在第三通道中生产出位于亲水性载体内的微滴包封体，该微滴包封体包含：
[0380] - 疏水性介质的液滴；
[0381] - 围绕该液滴的表面的非聚合两亲性分子的外围层；以及
[0382] - 在所述外围层内的所述水性微滴。
[0383] 例如，该方法可为连续剪切法(Okushima, S. et al., Langmuir 20, 9905-9908 (2004))或流动聚焦法(Chu, L. Y. et al., Angew. Chem. Int. Edit. 46, 8970-8974 (2007); Seo, M. et al., Soft Matter 3, 986-992 (2007))。
[0384] 在一个实施方式中，该方法是连续剪切法。通常，在该实施方式中，第一通道与第二通道形成实质上T形的连接，第二通道与第三通道形成实质上T形的连接。这种排布促进了在第一和第二通道连接处形成水性微滴，以及在第二通道的末端形成所述疏水性介质的液滴。通常，第一和第二通道由疏水性材料制成。这促进了这些通道内的水性介质形成微滴并保持微滴形式。通常，第三通道由亲水性材料制成。这促进了所述疏水性介质的液体(其本身含有水性微滴)在第三通道中保持液滴的形式。
[0385] 在另一个实施方式中，该方法是流动聚焦法。通常，在这个实施方式中，生产水性介质的微滴的第一通道的末端伸入第二通道内，生产所述疏水性介质的液滴的第二通道的末端伸入第三通道内。通常，水性介质流动通过所述第一通道，所述疏水性介质流动通过所述第二通道，而所述载体介质流动通过所述第三通道，这是一个连续的过程。
[0386] 该方法可进一步包括从微流体装置中回收在所述亲水性载体内的所述微滴包封体。
[0387] 该方法可进一步包括从亲水性载体中回收微滴包封体。该微滴包封体可利用任何合适的技术回收，例如通过利用移液管从亲水性载体中除去微滴包封体，或通过利用微流体装置中的自动程序实现。例如，微流体装置可配备有一个或多个用于多重体的凹陷，以允许更换外部水相，同时将多重体保持在原位。或者，微流体装置可在生产多重体时利用一个外部水相，随后将多重体输出到不同的外部水相中。
[0388] 该方法可进一步包括将回收的微滴包封体重新引入到另一个亲水性载体中。例如，该另一个亲水性载体可为药学上可接受的组合物、水或水性溶液、离子液体、或例如是粘性或刚性的亲水性载体材料。
[0389] 或者，本发明的用于生产本发明的微滴包封体的方法可进一步包括用另一个亲水性载体更换该亲水性载体。因此，例如，当亲水性载体是水性溶液时，该方法可进一步包含通过连续稀释而用新的水相更换所述水性溶液，或通过利用微流体装置中的自动程序实现。
[0390] 本发明进一步提供能够通过以上所述本发明的用于生产微滴包封体的方法获得的微滴包封体。
[0391] 本发明进一步在以下实施例中被阐释。实施例
[0392] 一般性方法
[0393] 脂质和油
[0394] 所有脂质都从Avanti Polar Lipids以粉末形式购得，并以10 mg ml–1溶解于戊烷(DPhPC、DOPE)或氯仿(DSPC)中。部分这些储存液通过使用氮气流并在真空下处理至少30分钟而被蒸发。残留物以不同浓度在不同的油混合物中被再溶解。对于仅使用DPhPC的实验，脂质浓度为0.1–0.2 mg ml–1，油为硅油(Silicone Oil AR 20)与十六烷(均购自Sigma-Aldrich)的9:1 (v/v)混合物。pH敏感性实验使用在硅油和十六烷的19:1(v/v)混合物中、10 mg ml–1总浓度的DOPE和OA (Sigma-Aldrich)的2:1 (mol/mol)混合物。温度敏感性实验使用在硅油和十六烷的9:1(v/v)混合物中、1 mg ml–1总浓度的DSPC和DPhPC (Sigma-Aldrich)的3:1 (mol/mol)混合物。
[0395] αHL孔
[0396] 通过提问转录翻译(IVTT)制备野生型(WT)葡萄球菌α-溶血素(αHL)单体，并通过与兔红细胞膜温育而被七聚化。该七聚体随后通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯化至 1 ng μl–1的终浓度(Maglia, G. et al. Method. Enzymol. 475, ~591-623, 2010)。该蛋白质被稀释10至100倍，以用于电记录(electrical recording)实验。用于制备用在荧光实验中的αHL的程序已有描述(Maglia, G. et al. Nano Lett. 9,
3831-3836, 2009)。简言之，从金黄色葡萄球菌的Wood 46菌株的单个菌落生长出培养物。
通过阳离子交换色谱法和凝胶电泳来纯化自发寡聚化的αHL七聚体，并以 2 mg ml–1存储于~
pH 8.0、含有150 mM NaCl和0.3% (w/v) SDS的20 mM磷酸钠缓冲液中。该蛋白质溶液以50倍稀释液的浓度添加至水性微滴中。
3831-3836, 2009)。简言之，从金黄色葡萄球菌的Wood 46菌株的单个菌落生长出培养物。
通过阳离子交换色谱法和凝胶电泳来纯化自发寡聚化的αHL七聚体，并以 2 mg ml–1存储于~
pH 8.0、含有150 mM NaCl和0.3% (w/v) SDS的20 mM磷酸钠缓冲液中。该蛋白质溶液以50倍稀释液的浓度添加至水性微滴中。
[0397] 缓冲液
[0398] 所使用的缓冲液是25 mM Tris HCl、pH 8.0、含KCl、EDTA及脂质，浓度在文中给出，但pH敏感性实验除外，此时缓冲液为10 mM Tris.HCl、10 mM琥珀酸、50 mM KCl、50 μM EDTA，pH 8.0或pH 3.0。
[0399] 实施例1：包封
[0400] 多重体在三个步骤中制成。首先，利用移液管将直径 300 µm的缓冲液微滴移液到~含油的溶解脂质中；通常，该油为硅油和十六烷的9:1 (vol/vol)混合物，该脂质为1,2-二植烷酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPhPC)。其次，直径 800 µm的相同油溶液的微滴被放入主~
体缓冲液中。最后，5 min后，利用移液管将许多水性微滴转移到油滴中。在 1 min的包封~ ~
中，内部微滴彼此粘合，并且粘合至油滴的表面(图1c-e)。这些结构体在至少24小时内是稳定的。为简洁起见，在本文中无论有多少被包封体的微滴，都使用术语“多重体”。
体缓冲液中。最后，5 min后，利用移液管将许多水性微滴转移到油滴中。在 1 min的包封~ ~
中，内部微滴彼此粘合，并且粘合至油滴的表面(图1c-e)。这些结构体在至少24小时内是稳定的。为简洁起见，在本文中无论有多少被包封体的微滴，都使用术语“多重体”。
[0401] 在包封前等待数分钟(温育时间)是合乎需要的。如果转移得太快，水性微滴倾向于彼此融合，并于外部水相融合。该温育时间对于围绕水性微滴和油滴形成有序聚集的脂质单层可能是需要的。随后，这些单层可粘合以形成脂双层，该脂双层或位于两个被包封的微滴之间(内部双层)，或位于内部微滴和外部水性溶液之间(外部双层)。
[0402] 在大多数可预见的应用中，多重体应当在水中是接近平衡浮力的，因而所用的硅–3油应选择其密度为1.01 g.cm 。但是，与给定的油形成稳定多重体所需的最少温育时间同样重要：对于含有0.2 mg ml–1 DPhPC的硅油与十六烷混合物来说，该温育时间<5分钟，但以
1-溴代十二烷(密度1.04 g cm–3)制备的多重体即使在较长的温育时间后和较高的脂质浓度下也是不稳定的。
1-溴代十二烷(密度1.04 g cm–3)制备的多重体即使在较长的温育时间后和较高的脂质浓度下也是不稳定的。
[0403] 包封 – 方法
[0404] 为研究在长时间内的多重体，需要固定它们的位置，同时避免与容器的壁的任何相互作用(可能破坏其结构)。例如，如果多重体的油滴在其被脂质单层完全包覆之前接触空气-主体水性界面，该油滴经在该界面扩散。类似地，如果多重体在单层形成之前接触容器壁，油滴会粘合至该表面，会阻碍外部双层的形成。这是通过将每个多重体悬浮于浸没在主体水性缓冲液中的直径 0.8–1.5 mm的银丝或塑料小环上而实现的。银环是通过绕着圆~柱形样板卷绕100 μm直径的银丝而制成的。塑料环由从移液管尖端切割的断面构成。每个环随后附接至固定于容器壁的银丝。多重体可通过机械干扰而被从银环上驱离，而塑料环很可靠地保持住多重体，因为它们具有对油滴的强的粘合力。
[0405] 含脂油溶液被分散在环上，以形成悬浮于缓冲液中的体积为 0.5–2 μl的油滴。微~机械化的丙烯酸孔被填充有相同的油溶液，利用带有电泳凝胶加样尖端的2 μl移液管在这些孔中形成体积为 0.5–70 nl的水性微滴。该尖端被填充有 200 nl的水性溶液，随后被浸~ ~
没在该油溶液中。刚好足够的溶液被挤出以暴露出小的悬滴，通过对这孔的底部按压移液管尖端将该悬滴与尖端分离。在所述等待时间后，使用移液管将一个或多个水性微滴转移到主体水性溶液中的油滴中。在仅使用DPhPC的实验中，该等待时间为 10 min；在使用~
DOPE/OA混合物的实验中，该等待时间为 25 min；在使用DSPC/DPhPC混合物的实验中，该等~
待时间为 10 min。具有多个内部微滴的多重体可通过转移完整的DIB网络，或通过转移未~
连接的微滴(随后在原位形成双层)来形成。
没在该油溶液中。刚好足够的溶液被挤出以暴露出小的悬滴，通过对这孔的底部按压移液管尖端将该悬滴与尖端分离。在所述等待时间后，使用移液管将一个或多个水性微滴转移到主体水性溶液中的油滴中。在仅使用DPhPC的实验中，该等待时间为 10 min；在使用~
DOPE/OA混合物的实验中，该等待时间为 25 min；在使用DSPC/DPhPC混合物的实验中，该等~
待时间为 10 min。具有多个内部微滴的多重体可通过转移完整的DIB网络，或通过转移未~
连接的微滴(随后在原位形成双层)来形成。
[0406] 自由能分布图
[0407] 在包封之后、双层形成之前，多重体中的油滴和内部微滴通过采用球形几何形状而使它们的表面能最小化。在双层形成后，多重体具有图2b-d所示的几何形状。这些几何形状代表了并置单层形成双层的有利粘合与暴露出更大的单层或双层表面积的不利变形之间的亚稳定折中状态。这些状态仅是动力学上稳定的，因为内部微滴与主体水相的融合会进一步降低系统的自由能。单层和双层的表面张力分别为γm 和γb，它们是形成单位面积的每种界面的能量成本的量度。通过考虑多重体的可能的几何形状的范围以及计算每种几何形状相对于双层形成前的状态的能量成本或益处，我们可预测出最有利的几何形状。我们在本文概述了用于具有单个内部微滴的多重体的这种计算。
[0408] 首先，为开发出所有可能的几何形状，需要确定多重体的结构的参数。假设每两个单层和每个双层都将它们自身的表面能降到最低，那么多重体的几何形状由球冠构成。多重体的几何形状随后可由图2a中示出的三个接触角来定义。利用油滴和内部微滴的体积守恒，这些角度中的一个被约束，另外两个仍可自由变化。选择哪个角度被约束是任意的。
[0409] 形成具有特定几何形状的多重体的自由能仅通过单层和双层表面积相对于球形状态的变化并用每个界面的表面张力加权而获得。形成具有接触角(θ1, θ2, θ3)的多重体的自由能为：
[0410]
[0411] 其中R1和R2分别是油滴和内部微滴在双层形成前的半径；ri是对应于接触角θi的三个球冠的曲率半径，其可θ i、R1和R2由求值得出。
[0412] 选择θ2和θ3作为自由变量，我们可求出在每个可能的θ2和θ3组合时的ΔF，从而得出自由能分布图(图2b)，其使用以下参数值：R1 = 400 μm、R2 = 200 μm、γm = 5 mN m–1 (Yue, B. Y. et al., J. Chem. Soc. Farad. T. 1 72, 2685-2693 (1976); Morisaku, T., et al. Anal. Sci. 20, 1605-1608 (2004))并且γb/γm = 0.68。γb/γm的值通过测量DIB接触角来获得。图中最小值代表局部平衡几何形状，其显示于图2a中。在计算分布图的情况下，平衡接触角为(θ1, θ2, θ3) = (33º, 173º, 77º)。
[0413] γm或γb的绝对值仅用来计算形成的绝对自由能。多重体的平衡几何形状可在仅给出微滴体积比和γb/γm比率时计算出。相反，给定多重体的特定的期望的平衡几何形状，对本文所提供的进行相似分析，可以对相关微滴体积和表面张力施加设计限制。
[0414] 实施例2：电测量
[0415] 通过与主体油中的DIB系统进行对比(Holden, M. A. et al. J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007))，向多重体双层中加入膜泵、通道和孔将允许对各个内部微滴和外部溶液之间的物质交换和电通信进行精确控制。为确定多重体的外部双层是否可以支持插入膜蛋白，在具有单个内部微滴的多重体的外部双层上进行电测量。为此，制造了玻璃封装的Ag/AgCl电极，其仅在其尖端被电性地暴露(见以下方法部分)。紧接在水性微滴被转移到油滴之后，电极尖端被插入内部微滴。通过对电极的微操作，将内部微滴带至油滴的表面以允许双层形成(图3a)。
[0416] 当野生型(WT)葡萄球菌α-溶血素(αHL)被包括在内部微滴时，如所插入的电极以及在外部水性溶液中的Ag/AgCl未封装电极(plain electrode)所记录的，在双层形成的1分钟内观察到离子电流的逐步增加。这种电流轨迹的样本显示于图3b中。阶跃的幅度为18.6 ± 0.8 pA (均值± s.d., n = 16)，这与在给定条件下(+50 mV, 500 mM KCl) (Stoddart, D. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 7702-7707 (2009))的αHL孔的 18.6 pA的预期电流一致。因此，电流阶跃对应于αHL孔向外部双层的连续插入。
~
~
[0417] 为确认所插入的孔是αHL，以较低浓度的蛋白重复该实验，以降低多个插入的可能性。在几分钟后，电流从零阶跃至稳定水平，对应于单个αHL孔向外部双层的插入。紧接其后，向外部水性溶液中加入γ-环糊精(γCD，10 μM)，这导致电流通过该孔的不可逆阻塞~(图3c)，在–50 mV、1 M KCl时的阻塞幅度为63.7 ± 2.0% (均值± s.d., n = 673)。对驻留时间的以10为底数的对数柱状图进行最小二乘法线性拟合，得出解离速率为4.0 ± 0.6 s–1 (均值± s.d.)。一个使用DIB的先前研究发现，在pH 7.0的缓冲液中，阻塞幅度为 60%，~
解离速率为2.0 s–1 (Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007))。此处所见的在pH 8.0的缓冲液中较高的解离速率与β-环糊精从αHL解离的速率随pH增加的这样的发现一致(Gu, L. Q. et al., Biophys. J. 79, 1967-1975 (2000))。
解离速率为2.0 s–1 (Holden, M. A. et al., J. Am. Chem. Soc. 129, 8650-8655 (2007))。此处所见的在pH 8.0的缓冲液中较高的解离速率与β-环糊精从αHL解离的速率随pH增加的这样的发现一致(Gu, L. Q. et al., Biophys. J. 79, 1967-1975 (2000))。
[0418] 本文开发出的电记录平台可被用来在单分子水平研究横跨两个脂双层的成孔蛋白复合物，例如间隙连接(Nakagawa, S. et al., Curr. Opin. Struc. Biol. 20, 423-430 (2010))和核孔(Strambio-De-Castillia, C. et al., Nat. Rev. Mol. Cell Bio.
11, 490-501 (2010))，其通过将两个具有当个内部微滴的多重体定位成使它们的双层并列来实现。
11, 490-501 (2010))，其通过将两个具有当个内部微滴的多重体定位成使它们的双层并列来实现。
[0419] 电测量–方法
[0420] 在DIB和用纯硅油制成的多重体上测得的电流显示出偶尔爆发的电流泄露，通过将该油与小比例的十六烷混合，这种情况得到抑制。
[0421] 通过利用Ag/AgCl电极、膜片钳放大器(Axopatch 200B, Axon Instruments)以及16位数字转换器(1322A, Molecular Devices)来测量电流。利用2 kHz低通Bessel滤波器在10 kHz处获取数据，并进一步用400 Hz低通Bessel滤波器进行过滤以用于分析。
[0422] Ag/AgCl电极通过用25%次氯酸钠溶液处理直径为25或100 μm的银丝(分别购自Scientific Wire Company和Sigma Aldrich)至少30分钟而制备。
[0423] 通过-将25 μm直径的银丝穿过内径和外径分别为142 μm和559 μm的玻璃毛细管(Drummond)来制造玻璃封装的电极。该毛细管随后被拉伸(PC-10, Narishige)，并且银丝在其内，使得其分成两段。在其中一段内的银丝在毛细管的较大开口处被焊接至电极销。使用钳子从毛细管被拉伸的一端剪出 50 μm的玻璃，以暴露出银丝的末端。该末端随后用上~述次氯酸钠溶液处理。靠近毛细管被拉伸的一段的区域用硅胶(3140 RTV Coating, Dow Corning)包覆，以防止内部微滴和外部水性溶液之间的电流泄露(图3a)。
[0424] 实施例3：通过扩散的交流
[0425] 已确认了αHL孔可插入多重体的外部双层，我们研究了多重体的内部微滴是否可利用这些孔来被动地彼此交流或与外部水性溶液交流；即，在没有用外部施加的电压驱动离子流的情况下交流。
[0426] 首先，我们测试了被包封的微滴是否可以与外部水性溶液交流。制造出具有单个内部微滴的多重体，其含有αHL孔和结合至10,000 MW葡聚糖的fluo-4 (一种Ca2+-敏感性染2+
料)，并通过荧光显微镜监测。向外部溶液中添加Ca 导致最初黑色的内部微滴在 1.5 h内~
变得发荧光(图4a)，而没有αHL的多重体未显示出荧光增加(n=6)。我们总结，含有αHL的多重体中的荧光增加是由于Ca2+ 离子从外部水性溶液通过外部双层中的αHL孔扩散到内部微滴中引起的。根据在具有与多重体中使用的相同浓度的αHL的DIB上进行的电测量，预期插入到多重体双层中的αHL孔的数量为几千个。
料)，并通过荧光显微镜监测。向外部溶液中添加Ca 导致最初黑色的内部微滴在 1.5 h内~
变得发荧光(图4a)，而没有αHL的多重体未显示出荧光增加(n=6)。我们总结，含有αHL的多重体中的荧光增加是由于Ca2+ 离子从外部水性溶液通过外部双层中的αHL孔扩散到内部微滴中引起的。根据在具有与多重体中使用的相同浓度的αHL的DIB上进行的电测量，预期插入到多重体双层中的αHL孔的数量为几千个。
[0427] 我们随后测试了多重体中两个内部微滴是否可以以相似方式彼此交流，这通过将结合有葡聚糖的fluo-4和αHL包括在一个微滴中，并将包括Ca2+在另一个微滴中实现。含有fluo-4的微滴在 1 h内荧光增加(图4b)，表明Ca2+离子在内部微滴之间通过内部双层中的α~HL孔扩散。总而言之，这些结果证实 了多重体与外部溶液之间，以及多重体的内部微滴内，通过被动扩散交流。
[0428] 荧光测量显示出Ca2+流的启动与荧光增加之间的时间滞差。这是由于EDTA竞争性结合Ca2+而导致的，EDTA被包括在内部微滴中用于螯合存在于缓冲盐中的少量污染性Ca2+，如果不除去这些污染性Ca2+，将会产生背景荧光。Ca2+以相似速率结合至fluo-4和EDTA (kon ~107–108 M–1 s–1)，但从fluo-4上解离要比从EDTA上解离快得多，koff分别为~400 s–1和<1 s–1(Naraghi, M., Cell Calcium 22, 255-268 (1997); Johnson, J. D. et al., Biophys. J. 76, 1514-1522 (1999))。因此，在分钟时标上，EDTA作为微滴中几乎所有Ca2+的吸收器，并且仅当EDTA饱和时，大量的fluo-4分子才会结合Ca2+离子。
[0429] 方法–荧光测量
[0430] 结合有10,000 MW葡聚糖(Invitrogen)的fluo-4的钾盐被溶解于纯水中，并以25 μM的最终染料浓度被加至微滴中。含有染料的微滴还含有50 μM EDTA二钠盐。含有Ca2+的微滴含有100 mM CaCl2。
[0431] 利用具有Nikon CFI DL 10X 物镜的Nikon Eclipse TE2000-S倒置显微镜进行荧光显微镜检查，使用汞弧灯用于照明以及合适的滤镜。使用Hamamatsu C9100 EMCCD相机拍照，400 ms的曝光时间和179的增益。利用ImageJ软件测量荧光强度(Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J. & Ram, S. J. Image processing with ImageJ. 11, 36-42 (2004))。
[0432] 实施例4：用于药物递送的多重体
[0433] 单个多重体将几种化学物质保持在不同腔室并让它们以受控的方式结合的能力使得其成为新的药物递送手段。利用常规脂质体递送多于一种药理学物质需要这些物质被包封在一起(这允许它们之间发生可能不期望的反应)或单独包封(此时，每个细胞接收到每种物质的比例难以控制)。相反，被包封在单个多重体(包括在油相中)的不同腔室中的几种药物的递送将允许对剂量比例进行精确控制。这对于递送具有独立作用机制的药物可能是有利的；可以预期它们以固定的比例被细胞吸收，以增加它们的总的功效，并降低对任何一种药物发展出耐药性的可能性。
[0434] 除了同时递送独立的药物外，多重体递送特别适用于前药—可通过其他物质活化的药物无活性形式(Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008))。此时，每个多重体在一个内部微滴内含有前药，在另一个内部微滴内含有活化剂。在某些外部刺激下(例如pH或温度变化)联合是否微滴内容物，将允许前药和活化剂结合，从而在原位产生活性物质。例如，这将允许施用太不稳定或不溶而无法以活性状态递送的药物。例如，米普昔芬磷酸酯是抗癌剂米普昔芬的无活性磷酸酯，其具有比米普昔芬大 1000倍的水~
溶性，并且通过碱性磷酸酶转化为活性物质(Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008))。反过来，多重体可被用来递送“软药”(被另一种物质失活的活性药物，Bodor, N. et al., Med. Res. Rev. 20, 58-101 (2000))。在相同多重体的单独微滴中包括活性药物及其失活剂可实现对活性药物的寿命进行精确的控制。
溶性，并且通过碱性磷酸酶转化为活性物质(Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008))。反过来，多重体可被用来递送“软药”(被另一种物质失活的活性药物，Bodor, N. et al., Med. Res. Rev. 20, 58-101 (2000))。在相同多重体的单独微滴中包括活性药物及其失活剂可实现对活性药物的寿命进行精确的控制。
[0435] 目前有大致两种方法实现前药递送。一种方法利用已存在于体内的活化剂(Rautio, J. et al. Nat. Rev. Drug Discov. 7, 255-270 (2008))，因此活化剂的选择有限。在另一种方法中，如在抗体导向的、基因导向的、和病毒导向的酶前药疗法中一样(分别为ADEPT、GDEPT和VDEPT)，外源性活化剂在全身性施用前药之前被提供至靶细胞(Niculescu-Duvaz, I. I. et al., Adv. Drug Deliver. Rev. 26, 151-172 (1997))。虽然这些方法可利用更广范围的活化剂，但它们面临着大量的阻碍。在ADEPT中，活化剂被连接至靶定至特定细胞类型的表面的抗体。该抗体结合的开发成本会很高，并且引入了免疫原性并发症(Xu, G. et al., Clin. Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001))；而且，活性药物必须能够从细胞外空间穿过并进入细胞质。虽然GDEPT和VDEPT通过将前药活化酶的遗传材料递送至靶细胞来避免这些问题，但是这两种方法受限于可以高水平表达的蛋白质活化剂(Xu, G. et al., Clin. Cancer Res. 7, 3314-3324 (2001))。
[0436] 现有前药递送系统的限制可通过用多重体递送而规避，该多重体在单独的腔室内包含前药和活化剂。所有药物递送载体的共同问题是在适当的位点触发被包封的药物的释放。我们在本文中证实了多重体的两个已建立的触发释放的机制，第一个基于pH的降低，第二个基于温度的上升。
[0437] pH敏感性
[0438] 脂质体可被细胞在使用和不使用特定靶定分子的情况下吞噬(Torchilin, V. P. Nat. Rev. Drug Discov. 4, 145-160 (2005))。脂质体内容物向细胞质的是否可通过改造脂质体以在酸性pH时失去稳定来实现，因而它们在内涵体发展成溶酶体之前与内涵体膜融合，在溶酶体内内容物可被隔离或分解(Chu, C. J. et al., Pharm. Res. 7, 824-834 (1990))。被吞噬并被制成在酸性pH处失去稳定的小型化多重也可通过在内涵体中同时释放前药和活化剂来实现细胞内药物递送。活性药物要接近细胞质，其必须被制成可透过内涵体膜；反过来，前药和活化剂必须是不能透过多重体膜，从而防止过早的药物泄露。特定的例子包括：
[0439] 被独立包封的HMR 1826和人β-葡萄糖醛酸酶。后者将前者转化为阿霉素。虽然HMR 1826不能透过细胞膜，但阿霉素可以；
[0440] 被独立包封的米普昔芬磷酸酯和碱性磷酸酶活化剂。后者将前者转化为米普昔芬。米普昔芬比米普昔芬磷酸酯的水溶性小 1000倍，因而可能更加能透过膜。~
[0441] 或者，活性药物可通过流出(efflux)(例如通过循环途径)而进入内涵体或溶酶体的细胞质。
[0442] 制造pH敏感性脂质体的一种策略是利用两种脂质的混合物(Drummond, D. C. et al., Prog. Lipid Res. 39, 409-460 (2000))。一种有利于非双层状态，例如1,2-二油酰-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)；另一种在高于其pKa(当加入在双层中时为~7.5 (Hamilton, J. A. & Cistola, D. P. Proc. Natl Acad. Sci. USA 83, 82-86 (1986)), (Small, D. M., Cabral, D. J., Cistola, D. P., Parks, J. S. &
Hamilton, J. A. Hepatology 4, 77S-79S (1984))) 的pH值时稳定双层状态，例如油酸(OA)，但在较低的pH值时不能够稳定双层中，在较低的pH时，大比例的OA被质子化了。我们在本文中使用这种策略对多重体提供pH敏感性。
Hamilton, J. A. Hepatology 4, 77S-79S (1984))) 的pH值时稳定双层状态，例如油酸(OA)，但在较低的pH值时不能够稳定双层中，在较低的pH时，大比例的OA被质子化了。我们在本文中使用这种策略对多重体提供pH敏感性。
[0443] 以DOPE和OA的混合物制成的多重体在pH 8.0的外部水性溶液中在至少一天内是稳定的(n=7)。当通过将该溶液的一半替换为pH 3.0的相同缓冲液从而将pH从8.0降至 5.5~时，外部双层突然裂开，使得内部微滴的内容与彼此混合并与外部溶液混合(图5a)。微滴总是彼此在<2 min内爆裂，通常在<1 min (n = 8) 内爆裂。如果以相同pH的缓冲液更换pH
8.0缓冲液，则多重体不会爆裂，显示出爆裂并非是机械扰动导致。
8.0缓冲液，则多重体不会爆裂，显示出爆裂并非是机械扰动导致。
[0444] 为测试微滴的内容物是否在扩散到外部溶液之前彼此混合，制造了具有两个内部微滴的多重体，其中一个内部微滴含有结合了葡聚糖的fluo-4，另一个含有Ca2+。通过荧光显微镜监测这些多重体。在降低外部溶液的pH后不久，两个内部微滴同时爆裂，将Ca2+和fluo-4释放到外部溶液中；随着fluo-4变得稀释，荧光强度相应地降低(图5b)。在几秒内，fluo-4阴影和Ca2+阴影在外部溶液中开始混合，它们相交的部分显示出荧光强度的急剧增加。最终，该明亮的混合物变得稀释，再次降低了荧光强度。
[0445] pH敏感性–方法
[0446] 含有染料的微滴含有25 µM结合了葡聚糖的fluo-4和50 µM EDTA。含有Ca2+的微滴含有10 mM CaCl2。被包封的微滴在形成后被允许平衡 15 min，随后约一半体积的外部水~性溶液被相同体积的相同pH 8.0缓冲液替换。随后重复该步骤，但以相同体积的pH 3.0缓冲液替换。
[0447] 温度敏感性
[0448] 我们还应用了温度触发的多重体释放的机制。用熔化转变温度为Tm的脂质制成的脂质体在Tm附近局部最大透过率，这是由脂质体双层的固相和液相之间的边界引起的(Mills, J. K. et al., BBA-Biomembranes 1716, 77-96 (2005))。利用这种现象的递送机制正在被开发已结合至多42℃的局部中等发热使用，该局部中等发热产生药物释放的局部增强(Needham, D. et al. Adv. Drug Deliver. Rev. 53, 285-305 (2001))。
[0449] 使用1,2-二棕榈酰-sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DPPC)(Tm = 41 ºC)(经常用于温度敏感性脂质体)形成多重体时，在多个脂质浓度和温育时间尝试都没有产生稳定的双层。在其他文献中注意到了大的DPPC脂质体的不稳定性(Akashi, K. et al., Biophys. J. 71, 3242-3250 (1996); Korlach, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 8461-
8466 (1999))。但是，以DPPC和DPhPC的1:1 (mol/mol)混合物制成的多重体是稳定的，90%~
存活至少12 h (n = 8)。当经受温度梯度时，以该脂质混合物制成的具有单个内部微滴的多重体的外部双层在32.6 ± 1.6 ºC (n = 11)时突然破裂，将内部微滴的内容物释放到外部水性溶液中。爆裂温度没有显示出随着DPhPC的摩尔比例从 15%变化至75%时的明显趋~
势，并且显著较低的比例的DPhPC不能稳定双层。
8466 (1999))。但是，以DPPC和DPhPC的1:1 (mol/mol)混合物制成的多重体是稳定的，90%~
存活至少12 h (n = 8)。当经受温度梯度时，以该脂质混合物制成的具有单个内部微滴的多重体的外部双层在32.6 ± 1.6 ºC (n = 11)时突然破裂，将内部微滴的内容物释放到外部水性溶液中。爆裂温度没有显示出随着DPhPC的摩尔比例从 15%变化至75%时的明显趋~
势，并且显著较低的比例的DPhPC不能稳定双层。
[0450] 爆裂温度显著低于DPPC的转变温度可能是两个原因引起的。第一，已知向DPPC添加DPhPC会显著扩宽熔化转变，并降低峰值转变温度(Lindsey, H. et al., Biochim. Biophys. Acta 555, 147-167 (1979))。第二，温度敏感性脂质体的内容物的释放程度已显示随着它们的尺寸增加(Ueno, M. et al., B. Chem. Soc. Jpn 64, 1588-1593 (1991))。因此，我们的模型多重体中相比于脂质体的大面积的双层可产生升高的温度敏感性。与添加DPhPC导致的熔化转变的提前进行一起，该增加的敏感性可引起所观察到的双层在远低于纯DPPC的Tm的温度显著破坏。
[0451] 假设类似于DPPC的脂质在与DPhPC混合时会遭受类似的熔化转变的拓宽，DPPC被1,2-二硬脂酰- sn-丙三基-3-磷酸胆碱(DSPC) (Tm 55 ºC)替代，从而将多重体的爆裂温~
度升高至适于临床中等体温过高的范围。以DSPC和DPhPC的3:1 (mol/mol)混合物制成的具有单个内部微滴的多重体在室温下在至少一天内是稳定的(n = 11)。
度升高至适于临床中等体温过高的范围。以DSPC和DPhPC的3:1 (mol/mol)混合物制成的具有单个内部微滴的多重体在室温下在至少一天内是稳定的(n = 11)。
[0452] 以此脂质混合物制成的多重体经受 1 ºC min–1的温度上升，记录每个多重体爆裂~时的温度(图6a)。排除 3%的在 30℃爆裂的多重体，爆裂温度为43.6 ± 3.5 ºC (均值± ~ ~
s.d., n = 93)。当具有两个内部微滴的多重体以相同方法被加热时，在70%的情况下，每个多重体的两个内部微滴在42.9 ± 3.5 ºC (均值 ± s.d., n = 10)爆裂，彼此相差0.1 ºC的温度范围。
s.d., n = 93)。当具有两个内部微滴的多重体以相同方法被加热时，在70%的情况下，每个多重体的两个内部微滴在42.9 ± 3.5 ºC (均值 ± s.d., n = 10)爆裂，彼此相差0.1 ºC的温度范围。
[0453] 多重体能够在经受体温过高之前在体温时保持它们的内容物；当具有单个内部微滴的多重体在37.2 ± 0.4 ºC保持时，93%存活至少30分钟 (n = 46) (图6b)。
[0454] 温度敏感性–方法
[0455] 将能够容纳12个在塑料环上的多重体的容器放置在加热块上，主体水性溶液的温度用热电偶温度计测定。使用电机持续搅拌主体溶液，以确保温度均一性使用温度测量的实时反馈来控制加热块恒温器，以实现本文所述的上升的和恒定的温度方案。
[0456] 结论
[0457] 本发明的实施例已显示，多重体在水性溶液中是稳定的。被包封的微滴可彼此之间以及与环境通过加入在双层中的膜蛋白来交换化学物质。而且，多重体可响应外部刺激(例如pH和温度)以共同释放被包封体的微滴的内容物。这些功能显著地扩展了微滴网络装置的应用性，例如作为载体用于组合的药物递送。
[0458] 本文研究的多虫子的直径为 800 µm(图1c-e)。这种尺寸方便单个多重体的初始~操作和研究。但是，一些要求多重体与活细胞相互作用的应用可能要求它们不大于几微米，并且理想地是<200 nm，以实现它们在药物递送中的应用(Devine, D. V., Biochim. Biophys. Acta 1191, 43-51 (1994))。多重体单层和双层的增加的曲率的效果可能对于直径小于 1 µm的多重体更明显(Lichtenberg, D. et al. Biochemistry (Mosc.) 20, ~
3462-3467 (1981))。
3462-3467 (1981))。
[0459] 小型化多重体的高通量制造可通过利用现有的微流体技术实现，其使用连续剪切(Okushima, S. et al., Langmuir 20, 9905-9908 (2004))或流动聚焦(Chu, L. Y. et al., Angew. Chem. Int. Edit. 46, 8970-8974 (2007); Seo, M. et al., Soft Matter 3, 986-992 (2007))而将水性微滴包封在位于主体水性溶液中的 100 µm直径油~滴中。这些结构体通常通过表面活性剂或嵌段共聚物来稳定。最近的一项研究(Shum, H. C. et al., Angew. Chem. Int. Edit. 50, 1648-1651 (2011))使用流动聚焦微流体学来制造通过嵌段共聚物的双层连接的水性微滴群。
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