技术领域
[0001] 本
发明属于环境保护技术领域，涉及一种垃圾堆肥中
苏云金芽孢杆菌菌落的测定方法。
背景技术
[0002] 堆肥化（Composting）是指在有控制的条件下，使有机废弃物在
微生物（主要为细菌）作用下，发生降解，并同时使有机物向稳定的
腐殖质方向转化的过程。堆肥化后的产物称之为堆肥（Compost）。堆肥过程可以将混合物的体积有效地减少40%-50%，并且可以依靠在高温阶段中代谢产生的热量杀死垃圾中的病原物质。堆肥不是一项新的技术，但用这种方法处理城市固体垃圾，符合环境的利益，因为在堆肥过程中清除或者减少了城市固体垃圾中的毒性并使得最终的产物可以被用来进行再利用。堆肥的程序包括原料的预处理、原料
发酵和后处理，堆肥过程受
水分、
氧含量、C/N比、
温度、pH和通
风情况等因素的影响。
[0003] 堆肥化过程的实质是微生物在适宜条件下的代谢作用，在堆肥化过程中，生活垃圾中的可溶解有机物质透过微生物的细胞壁和细胞膜而被微生物所吸收，而微生物通过自身的生命活动过程，把吸收的有机物转
化成无机物。微生物在堆肥过程中扮演着重要
角色，与堆肥周期和堆肥
质量密切相关。因此，堆肥中微生物的研究对开发堆肥微生物资源，
加速堆肥过程，减短堆肥周期，提高堆肥质量都具有重要的意义。
[0004] 微生物种类繁多，自然界中仅有极少数的微生物得到鉴定，能够存活、培养的种类更是少之又少，至多为微生物总量的l%。目前，国内外对于堆肥中的微生物进行了一系列理论和实践的研究。但是堆肥中存在着非常复杂的微生物体系，整个堆肥过程中的微生物结构的变化和演替也非常巨大，采用传统的分离培养和生理生化实验方法和手段难以完全认识，但随着研究手段的改善和研究方法的创新，分子生物学方法、杂交技术、PCR和DNA指纹等新技术的应用，为堆肥微生物学的研究提供了新的途径。运用分子生物学技术和研究手段，可以直接对堆肥微生物的总DNA进行研究，突破了菌株分离和培养的限制，能够动态地研究微生物的群落多样性，有利于更加深入的了解堆肥中的微
生物群落，并可能发现新的微生物物种。
[0005] 苏云金芽孢杆菌是目前国际上生产量最大并成功地用于防治农、林、贮粮
害虫和一些卫生害虫的微生物
杀虫剂，苏云金芽孢杆菌在形成芽孢的同时，可以形成一种由杀虫晶体蛋白组成的伴孢晶体，它的主要
杀虫活性成分是伴孢晶体蛋白。研究发现，这种蛋白对多种农林害虫具有特异性杀伤作用。昆虫取食芽孢晶体混合物后，晶体在昆虫体内的中肠
碱性环境和蛋白酶的作用下被降解形成杀虫活性蛋白，研究结果表明这些毒蛋白单独作用或不同蛋白间协同作用对昆虫具有不同程度的毒杀作用，进一步加强苏云金芽孢杆菌在防治和控制害虫危害方面的研究，对于保护人类生存环境实现可持续发展具有重大意义。
[0006] 近几年来，由于化学制剂引起的环境问题日益严重，以及人们环保意识的日益增强，利用微生物制剂作为化学
农药的补充或替代品来促进
植物生长、防治植物病害，已经成为当前生防制剂开发的重点并引起人们的高度重视。研究发现，垃圾堆肥中微生物种类丰富、数量庞大，生长活跃，具有广泛的应用价值，将堆肥中部分微生物提取出来制成复合菌剂对草坪植物生长、矿质营养吸收均有显著地提高。本研究从堆肥悬浊液中取出部分悬浊液，在适合不同的菌株生长的固体培养基上培养分离，分离后的菌株分别进行纯化培养，从而将堆肥中有利于增强植物抗逆性的有益菌种进行鉴定。
发明内容
[0007] 本发明采用的苏云金芽孢杆菌（拉丁名：Bacillus thuringiensis）菌种保藏号:CFCC10206,保藏单位：中国林业微生物菌种保藏管理中心，对外可以提供。
[0008] 生理生化特性：细胞呈革兰氏阳性，杆状，大小为1.0-1.2×3-5μm。形成半孢晶体，对阿拉伯糖甘露醇不产酸产
淀粉酶，
硝酸盐还原到亚硝酸盐。
[0009] 苏云金芽孢杆菌毒性：对人、畜低毒，大鼠口服急性LD50 852.7-856.7毫克/公斤，对
家禽、
鸟类、鱼、畜等低毒。
[0010] 本发明公开了一种垃圾堆肥中苏云金芽孢杆菌菌落的测定方法，其特征在于按如下的步骤进行：
[0011] （1）将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛-1 -2有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0 浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0 、-3 -4 -5 -6
l0 、l0 、l0 、l0 几种浓度的堆肥稀释液；
[0012] （2）分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0-2、l0-3、l0-4、l0-5、l0-6稀释液，注入到
牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照；
[0013] （3）用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整 培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨培养基的平板倒置于37℃恒温
培养箱中培养1天；
[0014] （4）用接菌环直接挑起待分离纯化的菌落，接种到事先准备好的平板培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，然后将培养皿倒置于恒温培养箱内培养；
[0015] （5）苏云金芽孢杆菌的菌落计数方法：先计算相同稀释度的平均菌落数，若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数，选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的微生物菌落总数。
[0016] 本发明更加详细的测定方法如下：
[0017] 1 实验材料
[0018] 实验菌种分离自天津小淀垃圾堆肥处理厂的垃圾堆肥原料。
采样方式为：选取适当的采样地点，人工捡去垃圾堆肥中的木头、塑料、金属等杂物，再用
铁铲去去除表层堆肥，取深度为5-15cm处堆肥作为实验用样品，放入样品袋中扎好，标记，记录采样时间，地点等。将采集好的样品带回实验室进行处理，不能及时处理的样品放入4℃
冰箱中保存，按照同样的采样方法采集天津师范大学主校区校园园土作为对照。
[0019] 1.2 实验方法
[0020] 1.2.1 堆肥微生物的分离
[0021] 苏云金芽孢杆菌的分离采用牛肉膏蛋白胨固体培养基，具体方法为：将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充-1 -2 -3 -4 -5 -6分混匀，此为l0 浓度的稀释溶液，按此方法分别稀释成l0 、l0 、l0 、l0 、l0 几种浓度-2 -3 -4 -5 -6
的堆肥稀释液。分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0 、l0 、l0 、l0 、l0 稀释液，注入到不同的平板培养基上，每一稀释度重复三次，无菌水为空白对照。用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整个培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天。
[0022] 1.2.2 菌种的纯化
[0023] 菌种的纯化采用平板划线分离的方法：用接菌环直接挑起待分离纯化的菌落，接种到事先准备好的平板培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，注意接种环不要嵌入培养基内划破培养基，划线完毕，将培养皿倒置于恒温培养箱内培养。
[0024] 2 微生物菌落总数及鉴定结果
[0025] 菌落计数方法：先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数，选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的微生物菌落总数。
[0026] 2.1苏云金芽孢杆菌的菌落总数
[0027] 表1苏云金芽孢杆菌的菌落数（个）
[0028]
[0029] 结论：通过在牛肉膏蛋白胨培养基上生长的苏云金芽孢杆菌的菌落数情况可以看-4 -5 -6出，堆肥中的苏云金芽孢杆菌菌落数高于
土壤对照，由于l0 倍浓度下的土壤中和l0 、l0的浓度下堆肥和土壤中的菌落数均少于30，因此无法进行统计计数。
[0030] 2.2苏云金芽孢杆菌的鉴定结果
[0031] 在牛肉膏蛋白胨培养基上挑取与苏云金芽孢杆菌相似的菌落，发现在培养基上形成的菌落为圆形，白色，边缘光滑，不透明，革兰氏
染色为阳性，菌体在
显微镜下观察呈椭圆形杆状，芽孢为椭圆形，用溴酚蓝和番红染液进行伴胞晶体染色，镜下观察到有红色菌体，无色芽孢以及蓝色伴孢晶体，初步鉴定其为苏云金芽孢杆菌。
[0032] 2.3细菌的生理生化实验结果
[0033] 将初步鉴定为苏云金芽孢杆菌的菌株定为测菌株，对其进行生理生化实验的检测，得到结果如下表：
[0034] 表2细菌的生理生化实验结果
[0035]
[0036] 对待测菌株进行了生理生化测试，结果如表2所示。待测菌株为革兰氏阳性，过氧化氢酶阳性，V.P反应阳性，
葡萄糖发酵产酸，
水解淀粉、明胶，都能利用
柠檬酸盐。
[0037] 根据以上实验结果，进一步鉴定待测菌株为苏云金芽孢杆菌。将菌株纯化保存，以备后续实验使用。
[0038] 2.4 研制结论
[0039] 本实验中，垃圾堆肥中苏云金芽孢杆菌数量高于土壤对照，表明垃圾堆肥中微生物的数量更为庞大，这可能与垃圾堆肥中氮、磷、
钾等有机质含量较高有关。与土壤相比，选择生活垃圾堆肥作为原料分离对草坪植物生长有益的微生物，不仅在微生物的数量上有优势，而且可以更好的利用垃圾堆肥资源，减少土壤资源的浪费。
附图说明
[0040] 图1为苏云金芽孢杆菌的生长曲线；
[0041] 图2为苏云金芽孢杆菌菌落照片。
具体实施方式
[0042] 为了更充分的解释本发明的实施，提供下述制备方法实施实例。这些实施实例仅仅是解释、而不是限制本发明的范围。
[0044] （1）选取适当的采样地点，人工捡去垃圾堆肥中的木头、塑料、金属等杂物，再用铁铲去去除表层堆肥，取深度为10cm处堆肥作为实验用样品，放入样品袋中扎好，标记，记录采样时间，地点等。然后将新鲜堆肥样品称取10g，放入加有20粒玻璃珠的90ml无菌水三角瓶中，振荡，使样品中的微生物充分且均匀分布于液体中，用移液枪在三角瓶中取lml母-1液，加入盛有9ml无菌水的大试管中充分混匀，此为l0 浓度的稀释溶液，按此方法分别稀-2 -3 -4 -5 -6
释成l0 、l0 、l0 、l0 、l0 几种浓度的堆肥稀释液；
[0045] （2）分别用移液枪吸取0.1毫升浓度为l0-2、l0-3、l0-4、l0-5、l0-6稀释液，注入到牛肉膏蛋白胨培养基的平板上，每一稀释度重复三次；
[0046] （3）用无菌玻璃刮刀将菌悬液均匀涂抹在整 培养基上，使微生物均匀分布，将含有牛肉膏蛋白胨培养基的平板倒置于37℃恒温培养箱中培养1天；
[0047] （4）用接菌环直接挑起待分离纯化的菌落，接种到事先准备好的平板培养基中，在平板上自左向右轻轻划线，然后将培养皿倒置于恒温培养箱内培养；
[0048] （5）苏云金芽孢杆菌的菌落计数方法：先计算相同稀释度的平均菌落数，若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该稀释度的平均菌落数，选择平均菌落数在30~300之间的，当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，则以该平均菌落数乘其稀释倍数即为该样品的微生物菌落总数。
