蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用
阅读：115发布：2020-05-12
专利汇可以提供蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及蛇床子素在制备 治疗 溃疡性结肠炎的药物方面的应用。 发明人 研究发现蛇床子素能够应用于制备治疗溃疡性结肠炎的药物。，下面是蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用专利的具体信息内容。
1.蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用。
蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用
技术领域
[0001] 本发明提供中药有效成分蛇床子素的新用途，具体涉及蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用。
背景技术
[0002] 溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种肠道非特异性的炎症性疾病，属于炎症性肠病的一种，病变范围主要累及肠粘膜及粘膜下层，临床主要表现为腹痛、腹泻、粘液便和脓血便。有资料显示，UC的发病率和患病率在我国逐步升高，并且UC患者患结肠癌、直肠癌的风险是普通人群的3到20倍。目前UC的治疗还是以糖皮质激素、免疫抑制剂、柳氮磺胺吡啶、美沙拉秦等为主，但是这些药物治愈率低、副作用大，基于UC发病机制的新药物研究是近年来的热点。
[0003] UC的发病机制尚未完全明确，但多种研究证实过度产生的细胞因子在溃疡性结肠炎的发病过程中起着重要的作用。TNF-α是在UC研究中最重要的细胞因子，其下游关键转录因子NF-κB则调控多种细胞因子转录和表达。近年来已有使用抗炎症因子抗体治疗UC的研究和应用，但由于种种原因，接受这类抗体治疗的患者少，目前临床尚无大规模应用。基于阻断核转录因子（NF-κB）信号转导通路抑制炎症反应的新型药物是临床防治UC的又一途径。
[0004] 蛇床子素(OST，osthole) 是中药蛇床子的主要活性成分，来源于伞形科植物蛇床Cnidium monnieri (L.) Cuss. 的干燥果实，属于香豆素类化合物，其安全性高，疗效广泛。近年来大量实验证明，蛇床子素具有解痉、降血压、抗心律失常、增强免疫功能及广谱抗菌、抗炎作用。
发明内容
[0005] 本发明旨在提供蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用。
[0006] 技术方案：蛇床子素在制备治疗溃疡性结肠炎的药物方面的应用。
[0007] 发明人研究发现蛇床子素能降低DSS诱导的急性溃疡性结肠炎模型动物DAI评分，改善动物疾病严重程度，减轻溃疡性结肠炎所致小鼠结肠长度缩短，同时改善炎性细胞浸润，更重要的是，蛇床子素还能抑制血清细胞因子TNF-α水平升高和结肠组织中MPO活性增强，并且这种作用与其抑制炎性信号通路的关键转录因子NF-κB相关。研究证明蛇床子素可以减轻DSS诱导的溃疡性结肠炎模型动物炎症反应，改善动物疾病严重程度，可用于制备防治溃疡性结肠炎的药物。附图说明
[0008] 图1为蛇床子素对小鼠的临床症状效果统计图。
[0009] 图2为蛇床子素对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎结肠长度的影响统计图。
[0010] 图3为蛇床子素对病理损伤的影响统计图。
[0011] 图4为蛇床子素对DSS诱导UC小鼠血清TNF-α含量的影响的统计图。
[0012] 图5为蛇床子素对DSS诱导UC小鼠结肠组织中MPO活性的影响统计图。
[0013] 图6为蛇床子素对DSS诱导UC小鼠结肠组织中NF-κB表达的影响统计图。
具体实施方式
[0014] 为了更好地理解和实施本发明，下面结合具体药理实验数据说明本发明：本课题拟研究OST抗UC的作用，并分析其潜在机制。动物实验采用经典的葡聚糖硫酸钠(dextran sulphate sodium，DSS)水溶液诱导BALB/c小鼠形成急性溃疡性结肠炎模型，同时给予蛇床子素高中低3个剂量（40、20、10mg/kg）干预，分析其抗UC的作用强度，并分析药物干预对细胞因子TNF-α含量和NF-κB表达的影响，探讨OST抗UC的可能机制。本研究一方面能为UC的防治研究提供新的潜在防治药物，另一方面为中药抗UC作用及其机制分析提供新的研究方法。
[0015] 1、材料及方法1.1 实验动物及试剂
SPF级BALB/c小鼠42只，雄性，体重18-22g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)20120001，合格证号：0300970分笼饲养，室温22±1℃，相对湿度45%～
50%，自由通风，空气良好，自由摄食。蛇床子素由烟台大学药学院药理实验室提供，纯度
98%。美沙拉嗪来源于爱的发制药公司。DSS来源于MP Biomedicals公司，货号:M2066。小鼠肿瘤坏死因子alpha（TNF-alpha） ELISA检测试剂盒购自烟台赛尔斯生物技术有限公司，小鼠MPO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20120703，NF-κB p65 (NF-κB p65)多克隆抗体购自Abcam公司（ab16502）。
SPF级BALB/c小鼠42只，雄性，体重18-22g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK(京)20120001，合格证号：0300970分笼饲养，室温22±1℃，相对湿度45%～
50%，自由通风，空气良好，自由摄食。蛇床子素由烟台大学药学院药理实验室提供，纯度
98%。美沙拉嗪来源于爱的发制药公司。DSS来源于MP Biomedicals公司，货号:M2066。小鼠肿瘤坏死因子alpha（TNF-alpha） ELISA检测试剂盒购自烟台赛尔斯生物技术有限公司，小鼠MPO检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所，批号：20120703，NF-κB p65 (NF-κB p65)多克隆抗体购自Abcam公司（ab16502）。
[0016] 1.2 动物模型的建立及分组干预42只SPF级BALB/c小鼠随机分为六组，分别为：正常组（溶媒）、模型组（溶媒）、美沙拉嗪组（200mg/kg）、蛇床子素低、中、高组（10、20、40mg/kg，溶解在0.5%的羧甲基纤维素钠中），每组7只动物。根据Cooper等的方法建立急性DSS小鼠UC模型，实验当天，将配制好的3.5%的DSS水溶液分装于5个小鼠饮水瓶，供小鼠自由饮用（记为第1天），每天每个鼠笼保证
100mlDSS水溶液自由饮用，正常组给予去离子水自由饮用，连续饮用7天。药物干预组采用灌胃方式给药，造模当天开始灌胃，给药体积为0.1ml/10g，连续给药7天。
100mlDSS水溶液自由饮用，正常组给予去离子水自由饮用，连续饮用7天。药物干预组采用灌胃方式给药，造模当天开始灌胃，给药体积为0.1ml/10g，连续给药7天。
[0017] 1.3 一般情况观察参照疾病活动指数（Disease activity index DAI）的评分标准，给药期间，每天称体重，观察小鼠精神状态、毛色、大便性状，便血情况，活动状态，并进行评分。
[0018] 1.4 标本采集实验第8天，摘眼球取血，收集在非抗凝离心管中，室温血液自然凝固10-20分钟，离心
20分钟(5000转/分)，分离血清。将收集好的血清密封于离心管中，-20℃冻存，用于测炎症因子TNF-α的含量。处死小鼠，解剖，沿肠系膜分离结肠组织，在冰袋上测量结肠长度，在冷的生理盐水中清洗，观察结肠是否损伤、水肿、粘膜充血、形成溃疡、几处溃疡等病理状况，评分并做记录。在距肛门2cm处剪1cm结肠，剖开，去除内容物，展开，平铺固定在滤纸上，置于10%中性甲醛中固定，避光保存，用于组织病理检查。剩余的结肠用锡箔纸包好，储存在液氮罐中备用。
20分钟(5000转/分)，分离血清。将收集好的血清密封于离心管中，-20℃冻存，用于测炎症因子TNF-α的含量。处死小鼠，解剖，沿肠系膜分离结肠组织，在冰袋上测量结肠长度，在冷的生理盐水中清洗，观察结肠是否损伤、水肿、粘膜充血、形成溃疡、几处溃疡等病理状况，评分并做记录。在距肛门2cm处剪1cm结肠，剖开，去除内容物，展开，平铺固定在滤纸上，置于10%中性甲醛中固定，避光保存，用于组织病理检查。剩余的结肠用锡箔纸包好，储存在液氮罐中备用。
[0020] 1.6 ELISA法测定血清TNF-α含量按照试剂盒说明书测定TNF-α含量，简要步骤是从冰箱中取出冻存的血清样本于室温下自然解冻至全部溶解，试剂盒于室温下预平衡20min，每孔100 ul加入标准品或血清，按照标准曲线法孵育反应后在450nm测定吸光度，计算血清TNF-α含量。
[0021] 1.7 结肠组织中MPO活性测定按照试剂盒说明书测定MPO含量，简要操作步骤是，从冰箱中取出冻存的组织，准确称重，按1:9加入匀浆液，匀浆，依次加入反应试剂，测定吸光值，按照MPO单位／克湿重＝(测定管OD值－对照管OD值)／11.3×取样量(克)测定MPO活性。
[0022] 1.8 Western blot法测定NF-κB在结肠组织中的表达情况从冰箱中取出冻存的组织，准确称重，按1:10加入蛋白抽提试剂(含1 mM PMSF) 于冰浴中间隔超声5s以充分匀浆，10000 rpm离心5 min，收集上清，以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后，每孔加入30mg总蛋白，以10%的分离胶分离蛋白， 转膜，孵育一抗（1:800）和二抗（1:5000），ECL发光法检测NF-κB在结肠组织中的表达。
[0023] 1.9 数据处理采用SPSS18.0软件进行统计学分析，实验结果均以均值±标准差(±sd)表示。多组间总体比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用LSD检验，p<0.05表示有统计学差异。
[0024] 2、结果2.1 OST对DSS诱导UC小鼠DAI评分的影响
DSS诱导的小鼠急性UC出现在实验第3天。除正常组外的其他各组小鼠开始出现腹泻，肉眼看见便血或粪便中有血丝，随着实验推进，部分小鼠出现稀便、粘液便或粘液脓血便，体重下降明显，DAI评分明显高于正常组。实验第4天开始，美沙拉嗪组、OST中剂量组、OST高剂量组显著降低了小鼠DAI评分，与模型组比较，有显著性差异(p < 0.05)。OST 中剂量组和高剂量组与美沙拉嗪作用相当（见图1）。
DSS诱导的小鼠急性UC出现在实验第3天。除正常组外的其他各组小鼠开始出现腹泻，肉眼看见便血或粪便中有血丝，随着实验推进，部分小鼠出现稀便、粘液便或粘液脓血便，体重下降明显，DAI评分明显高于正常组。实验第4天开始，美沙拉嗪组、OST中剂量组、OST高剂量组显著降低了小鼠DAI评分，与模型组比较，有显著性差异(p < 0.05)。OST 中剂量组和高剂量组与美沙拉嗪作用相当（见图1）。
[0025] 图1为蛇床子素对小鼠的临床症状效果统计图。数据均为七只小鼠的平均值。*p < 0.05。
[0026] 2.2 OST对DSS诱导UC小鼠结肠长度的影响实验结果显示，饮用DSS 7天后，模型组小鼠肠壁充血、肿胀，重量略微增加，严重者自结肠至肛门肠段均为血内容物，结肠长度较正常组明显缩短(P < 0.01)，OST各剂量组不同程度抑制结肠缩短，其中，中剂量组和高剂量组有显著的抑制作用(P < 0.05 ,P < 0.01) (见图2)。
[0027] 图2为蛇床子素对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎结肠长度的影响统计图。数据均为七只小鼠的平均值。##p < 0.01 vs control; *p < 0.05,**p < 0.01 vs DSS alone。
[0028] 2.3 OST对DSS诱导UC小鼠组织学评分的影响大体形态方面，正常组小鼠无改变；模型组小鼠结肠缩短严重，大部分可见水肿、充血及溃疡形成，大多数动物远端结肠的损伤比近端严重；药物治疗组小鼠结肠缩短、水肿及充血等情况与模型组比较均较轻。
[0029] 病理切片显示，正常组腺体排列规则、结构清楚，无炎症细胞浸润及溃疡；模型组小鼠结肠粘膜不完整，可见多灶性浅溃疡，隐窝结构破坏严重，炎症细胞浸润较深；OST处理组结肠组织破坏范围缩小，炎症细胞浸润深度较模型组浅，炎性细胞数量也显著减少。模型组组织学评分明显高于正常组，经药物治疗后，与模型组比较，美沙拉嗪组（p<0.01）、蛇床子素高剂量组（p<0.01）、蛇床子素中剂量组（p<0.01）组织学评分明显降低，具有统计学差异（见图3）。
[0030] 图3为蛇床子素对病理损伤的影响统计图。##P < 0.01 vs control; **p < 0.01 vs DSS alone。
[0031] 2.4 OST对DSS诱导UC小鼠血清TNF-α含量的影响模型组TNF-α含量明显高于正常组，经药物治疗后，与模型组比较，美沙拉嗪组（p<
0.01）、蛇床子素高剂量组（p<0.01）、蛇床子素中剂量组（p<0.01）TNF-α含量明显降低，具有显著差异性（见图4）。
0.01）、蛇床子素高剂量组（p<0.01）、蛇床子素中剂量组（p<0.01）TNF-α含量明显降低，具有显著差异性（见图4）。
[0032] 图4为蛇床子素对DSS诱导UC小鼠血清TNF-α含量的影响的统计图。采用酶联免疫吸附法测定小鼠血清TNF-α水平。数据均为七只小鼠的平均值。#p < 0.05 vs control; **p < 0.01 vs DSS alone。
[0033] 2.5 OST对DSS诱导UC小鼠结肠组织中MPO活性的影响模型组小鼠结肠组织中MPO活性较正常组明显升高，提示炎症反应明显程度严重（图
5）。给予药物治疗后，各给药组小鼠MPO活性均不同程度降低，蛇床子素中剂量组与模型组比较有统计学差异(P < 0.05)，美沙拉嗪、蛇床子素中剂量组和高剂量组与模型组比较有统计学显著性差异(P < 0.05,P < 0.01)。
5）。给予药物治疗后，各给药组小鼠MPO活性均不同程度降低，蛇床子素中剂量组与模型组比较有统计学差异(P < 0.05)，美沙拉嗪、蛇床子素中剂量组和高剂量组与模型组比较有统计学显著性差异(P < 0.05,P < 0.01)。
[0034] 图5为蛇床子素对DSS诱导UC小鼠结肠组织中MPO活性的影响统计图。#P < 0.05 vs control; **P < 0.01 vs DSS alone。
[0035] 2.6 OST对DSS诱导UC小鼠结肠组织中NF-κB表达的影响结肠组织中NF-κB表达测定显示模型组的NF-κB蛋白表达明显高于正常组和各给药组。
小鼠结肠组织NF-κB蛋白表达情况见图6,给药后，NF-κB蛋白表达量不同程度降低，切随着OST剂量增高，NF-κB的表达逐步降低，提示OST可以剂量依赖性的抑制NF-κB表达。
小鼠结肠组织NF-κB蛋白表达情况见图6,给药后，NF-κB蛋白表达量不同程度降低，切随着OST剂量增高，NF-κB的表达逐步降低，提示OST可以剂量依赖性的抑制NF-κB表达。
[0036] 图6为蛇床子素对DSS诱导UC小鼠结肠组织中NF-κB表达的影响统计图。
[0037] 3.结论与讨论传统中药蛇床子性温，味苦。主要用于燥湿，祛风，杀虫、温肾壮阳等，近年来研究显示其对免疫系统疾病具有广泛的调控作用，并且其活性成分OST在多种急、慢性实验动物炎症模型中均表现出良好的抗炎作用。研究显示OST对切除双侧肾上腺的大鼠仍有明显的抗炎作用，这说明其抗炎作用并非通过调控垂体-肾上腺素系统实现；值得特别提出的是，有研究显示OST在模型动物体内不影响角叉莱胶性足跖炎症组织内前列腺素的含量，提示其可能通过增强非特异性免疫功能和／或抗变态反应而发挥抗炎作用，但具体机制尚未完全阐明，其抗炎作用的临床应用也有待深入挖掘。本课题中，我们发现OST能降低DSS诱导的急性UC模型动物DAI评分，改善动物疾病严重程度，减轻UC所致小鼠结肠长度缩短，同时改善炎性细胞浸润，更重要的是，OST还能抑制血清细胞因子TNF-α水平升高和结肠组织中MPO活性增强，并且这种作用与其抑制炎性信号通路的关键转录因子NF-κB相关。所有这些结论提示OST可以用于防治溃疡性结肠炎，减轻DSS诱导的UC模型动物炎症反应，改善动物疾病严重程度，其机制可能与抑制NF-κB信号通路及调节细胞因子TNF-α等的释放相关。
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