发明领域

本发明涉及具有至少一个改变的O-或N-型糖基化位点的mpl配 体类似物。本发明也涉及编码这些mpl配体类似物的DNA序列和表达类 似物的重组质粒和宿主细胞。

                      发明背景

MGDF，或巨核细胞生长发育因子为一种新近克隆的细胞因子，它 似乎是循环血小板水平的主要调节物。可参见如下文献：Bartley，T.D. 等，《细胞》(Cell)77卷1117-1124页(1994)；Lok，S.等，《自 然》(Nature)369卷565-568页(1994)；de Sauvage，F.J.等， 《自然》(Nature)369卷533-538页(1994)；Miyazake，H.等， 《实验血液学》22卷838页(1994)；Kuter，D.J.等PNAS USA， 91卷11104-11108页(1994)。Bartleg，T.D.等在《细胞》 77卷1117 -1124页(1994)中也将MGDF称为血小板生成素(TPO)、mpl 配体和巨核细胞生成素。本文中“mpl配体”通常是指激活mpl受体的 所有多肽，包括TPO和MGDF。mpl受体是一种细胞表面蛋白，激活后 引起巨核细胞和血小板的生成和/或发育。参见WO 92/07074。

“mpl配体类似物”为与天然序列有区别的多肽，这种区别影响糖 基化位点的数量、位置和类型。这些多肽为本发明的一个方面。成熟的 天然人mpl配体蛋白总共有332个氨基酸。该蛋白质的序列(与一长度 为21个氨基酸的先导序列相连接)及相应的cDNA示于图1(序列号： 1和2)。    

中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和大肠杆菌细胞产生的重组mpl配体具 有生物活性，在猫、鼠和猴体内能够特异性刺激或增加巨核细胞和/或血 小板。例如可参见Hunt.P.等，《血液》(Blood)84卷10期390A页 (1994)。切断的人mpl配体分子(与人cDNA编码的332氨基酸蛋白 相比)有至少151个氨基酸(从图1中的22位氨基酸开始)，它们在体 内仍然保持生物活性。图2(序列号：3和4)列出了一个切断的mpl 配体分子的实例，该分子的成熟形式有174个氨基酸，具有生物活性。 图2显示这个174个氨基酸的蛋白质与一个21个氨基酸的N端先导序列 连接。该分子在下面实施例中用来创制某些mpl配体类似物。其它类似 物是以图1中1-199、1-191和1-183的氨基酸为基础。也有可 能从成熟人mpl配体蛋白质N末端除去头6个氨基酸而仍保持生物活 性。因而，生物活性似乎取决于图1中成熟人mpl配体氨基酸序列中的 第7位到第151位氨基酸(包括第7、第151位氨基酸)。

通常，真核细胞产生的很多细胞表面蛋白和分泌蛋白均带有一个或 多个寡糖基因。这种修饰称为糖基化，能够显著地影响蛋白质的物理特 性，对蛋白质的稳定性、分泌和亚细胞定位也很重要。正确的糖基化对 生物活性是必需的。实际上，真核生物的某些基因在细菌(如大肠杆菌) 中表达时，由于细菌缺乏对蛋白质进行糖基化处理的细胞过程，产生的 蛋白质未进行糖基化，因而活性很低或没有活性。

糖基化发生在多肽骨架的特定位置或位点，通常有两类：O-型寡 糖连接到丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)残基上，而N-型寡糖(链) 连接到天冬酰胺(Asn)残基上。这些氨基酸残基为Asn-X-Ser/Thr序列 的一部分，其中X可为除脯氨酸之外的任何氨基酸，优选除脯氨酸之外 的19种天然氨基酸中的一种。每一类型中N-型和O-型寡糖和糖残 基的结构是不同的，上述两类中常见的一类糖为N-乙酰神经氨酸(下 面称为唾液酸)。唾液酸常为N-型和O-型寡糖的末端残基，并且由 于它带负电荷，可能会使糖蛋白呈酸性。

本文中，糖基化“位点”是指结构上能够与糖残基相连接的氨基酸 残基，而这些位点实际上可能与糖残基相连也可能不与糖残基相连。如 上所述，O-型位点是Ser或Thr残基，而N-型位点是Asn-X-Ser或 Asn-X-Thr，这里X为除Pro外的任何氨基酸(优选除Pro之外的19种 天然氨基酸中的一种)。一个位点是否被糖链所糖基化取决于表达该分 子的宿主细胞、相邻位点的氨基酸和其它因素。

本文所说的连接于一个mpl配体类似物的“链”的数量是指连接于 特定宿主细胞表达的一个mpl配体上的碳水化合物(即糖基)链的平均 数。应注意到，天然和对应的重组mpl配体的糖基化位点通常是一样的， 而链的数量可能不同，这取决于用于重组表达的特定宿主细胞是否将糖 链连接于这个位点(与天然来源的配体相比)。本文中，对重组和天然 mpl配体类似物进行比较时，都比较相同数目的氨基酸，而不论天然来 源是否实际产生了具有该长度的mpl配体分子。因而，“天然”是指特 定种类(如人)中使用的序列，而不是指在这种天然来源中实际表达的 分子的长度。

天然存在的mpl配体是一糖基化的分子。天然mpl配体的糖基化类 型与mpl配体中的两个关键区域有关。成熟人mpl配体的前151个左右 的氨基酸序列，与该分子的活性部位相对应，它与一种能够刺激红细胞 生成的细胞因子促红细胞生成素(EPO)表现出相当的同源性，被称为 人mpl配体的“EPO-样”区域。成熟蛋白的其余氨基酸组成一个所谓 “N-型碳水化合物”区域，因为它们包括了至少大多数天然N-型糖 基化位点。在人mpl配体中有六个N-型糖基化位点，都在N-型糖基 化区域内。两个区域都有O-型糖基化位点。整个分子中约有12-14 个O-型糖基化链。在CHO细胞中重组表达人mpl配体DNA的实验数 据表明在EPO-样区域中至少有两个O-型位点糖基化，这两个位点为 第1位(Ser)和第37位(Thr)。

象mpl配体这样的糖蛋白可用等电聚焦(IEF)等技术分成不同的 带电形式。例如有几个研究小组已报道了粗制和部分纯化的促红细胞生 成素制品的IEF研究结果。(Lukowsky等，《生物化学杂志》(J. Biochem.)50卷909页(1972)；Shelton等，《医学生物化学》(Biochem. Med.)12卷45页(1975)；Fuhr等，《生物化学与生物物理学研究 通讯》(Biochem.Biophys.Res.Comm.)98卷930页(1981))。

尽管有关mpl配体分子的糖基化有上述了解，但仍有必要得到糖基 化方式不同的mpl配体分子，这种分子保持或提高了生物活性。

因而，本发明的目的之一是提供新的糖基化的mpl配体分子，即mpl 配体类似物。本发明的另一个目的是提供含这些分子的药用组合物和用 本发明的mpl配体类似物治疗可用mpl配体治疗的疾病的方法。

                      发明概述

在一个实施方案中，本发明涉及包括一种氨基酸序列的mpl配体类 似物，与相应的天然序列的mpl配体相比，该序列包括至少一个增加的、 至少一个缺失的、和/或同时有至少一个增加的和至少一个缺失的糖基化 位点。增加或缺失糖基化位点可导致以下结果；同相应天然序列的mpl 配体，尤其是人mpl配体相比，类似物的碳水化合物链的数目增加或减 少，唾液酸含量升高或降低。例如，一种类似物可能包括在相同的或不 同的位置缺失一个或多个N-或O-型位点，或者增加一个或多个N- 或O-型位点。

上述实施方案中，本发明另一方面涉及包括一些氨基酸序列的mpl 配体类似物，这些序列中一个或多个N-或O-型糖基化位点被一个或 多个非天然存在的位点所取代。因而，一个N-型位点可能会被另一个 不同的N-型位点所取代；一个N-型位点可能会为一个O-型位点所 取代；一个O-型位点可能会被另一个不同的O-型位点所取代；一个 O-型位点可能会为一个N-型位点所取代。

任何上述改变的组合也包括在本发明之中。

本发明还包括编码这些mpl配体类似物的DNA序列和表达类似物的 重组质粒和宿主细胞。

上述各种情况下，糖基化位点的改变导致所得mpl配体类似物中糖 链数目、含量、位置或类型(N-对O-)的改变，并且保持了mpl配 体的生物活性，即类似物仍能激活mpl受体。mpl受体的激活意味着巨 核细胞生成增加，因而导致体内血小板的增加。

                      附图简述

图1示出天然人mpl配体的DNA和氨基酸序列，包括信号肽(- 21位到-1位氨基酸)和成熟氨基酸序列(1-332)。

图2示出与21个氨基酸的信号肽相连接的、对应于成熟人mpl配体 1-174位氨基酸的mpl配体的DNA和氨基酸序列。在编码区的侧翼序 列的5′末端和3′末端分别引入XbaI和SalI克隆位点。

图3示出大肠杆菌和CHO表达的mpl配体的Western印迹结果。 MK代表Met-Lys，为了在大肠杆菌中表达，它被加到mpl配体的N -末端，用组织蛋白酶C等二肽酶可切除。MK被去除的分子称为 desMK。图中指出了糖苷酶神经氨酸酶和O-聚糖酶处理的情况。

图4示出在正常小鼠体内大肠杆菌和CHO表达的mpl配体活性(用 血小板计数表示)。所得数据表明糖基化mpl配体(CHO材料)的活性 较未糖基化的(大肠杆菌)高。这可能是由于糖基化配体的半衰期较长。 例如，CHO 332表示CHO细胞表达的人mpl配体1-332位氨基酸(图 1)。

图5示出表达重组人mpl配体和类似物4、6、7、9、10和11 的COS细胞上清液Western印迹分析结果。类似物的构建在例4中述及。 类似物4、7、10至少含有一个额外的碳水化合物链，因为它们在凝胶 中运动较慢。类似物编号与表1(如11对应于类似物N11)中的类似物 编号相对应。表1中的对照为N1。

图6示出表达重组人mpl配体和类似物4、5、13、14和15的 COS细胞上清的Western印迹分析结果。类似物的构建在例4中述及。 类似物4、13、14和15至少含有一个额外的碳水化合物链，因为它们 在凝胶中运动较慢。

图7示出表达人mpl配体和所示的mpl配体类似物的COS细胞上清 用N-聚糖酶处理后的Western印迹分析结果。结果表明类似物有不同 的糖基化方式。

图8示出以mpl配体类似物对人巨核细胞生长进行活体分析的结 果。A组和D组分别为阳性和阴性对照。A组孔接受了37.5pg野生型 (即天然序列)mpl配体1-174的COS-1条件培养基，表现出了大 量的巨核细胞生长。D组接受了1.5μl COS-1模拟条件培养基，未见 生长。B组和C组分别为mpl配体1-174类似物7和10。B组接受 了9.0pg mpl配体COS-1条件培养基，而C组接受了27pg，二者均 表现出良好的巨核细胞生长。

图9示出CHO mpl配体1-174以及类似物N4和N15(见表1) 的Western印迹分析结果。在凝胶中运动较慢证实类似物N4(4B)含 有一个额外的寡糖，而类似物N15(15-8)含有两个额外的寡糖。

图10示出CHO细胞产生的mpl配体类似物用和不用N-聚糖酶处 理后的Western印迹结果。用N-聚糖酶处理后，在凝胶中运动较慢证 实存在有N-型寡糖。

图11示出用不同类型不同剂量的mpl配体处理小鼠，其血小板计数 的结果。所得数据证实增加N-和/或O-型碳水化合物的数量可使体内 活性增加。

图12示出COS产生的mpl配体1-174以及类似物N10、N15、 N33、N39、N31、N35和N40的Western印迹分析结果。图中也指出 了增加的N-型糖基化位点的数量。图形显示增加N-型位点的数量也 使得N-型碳水化合物的数量增加，从而降低了mpl配体的运动性。

图13示出COS产生的mpl配体1-174和类似物N15、N29、N30 和N38的Westenr印迹分析结果，图中也指出了N-型糖链的数量。

                      发明详述

本发明提供了与具有相应序列的天然mpl配体相比糖基化位点不同 的mpl配体。优选所得分子含有额外的糖基化位点，这些位点在以哺乳 动物细胞(如COS、CHO和人细胞)表达时为糖链所占据。

在第一实施方案中，本发明涉及包括一种氨基酸序列的mpl配体类 似物，与相应的天然序列的mpl配体相比，该序列至少增加一个、至少 缺失一个和/或至少既增加一个又缺失一个糖基化位点。与相应的天然序 列的mpl配体，尤其是与人mpl配体相比，增加或缺失糖基化位点导致 碳水化合物链的数目增加或减少，唾液酸含量的升高或降低。同时有一 个位点缺失和另一个位点增加不会导致位点数量的改变，但位点的位置 和/或类型发生了改变。本发明也包括这种同时改变的类似物。

上述实施方案中，本发明另一方面涉及包括一些氨基酸序列的mpl 配体类似物，其序列中一个或多个N-或O-型糖基化位点被一个或多 个非天然存在的位点所取代。因而，一个N-型位点可能会被另一个不 同的N-型位点所取代；一个N-型位点可能会被一个O-型位点所取 代；一个O-型位点可能会被另一个不同的O-型位点所取代；和/或一 个O-型位点可能会被一个N-型位点所取代。基本上在同一位置的一 个位点取代另一个位点可能会增加该位点的糖基化效率，或引起其它效 应。例如，本文的证据表明苏氨酸残基取代丝氨酸残基可能会增加O- 型位点的糖基化效率。

本文中，mpl配体包括天然mpl配体、天然mpl配体的截短物以及 某些非天然的多肽，这些多肽具有和天然mpl配体完全一样的氨基酸序 列和糖基化，这具有特异性刺激巨核细胞和/或血小板的生长、发育和/ 或生成的生物活性。优选基于至少图1中的7-151位氨基酸到1-332 位氨基酸的mpl配体类似物。

在一个优选实施方案中，mpl配体为转染到真核宿主细胞的外源基 因的表达产物；即在优选实施方案中mpl配体为“重组mpl配体”，优 选的真核细胞为哺乳动物细胞，更优选CHO细胞。按照本文和本文引用 的出版物所介绍的有关mpl配体的克隆和表达的方法，有利于产生重组 mpl配体。

根据图1，其他一些优选的mpl配体分子具有以下氨基酸序列：

mpl配体1-332    图1的氨基酸1-332

mpl配体1-199    图1的氨基酸1-199

mpl配体1-191    图1的氨基酸1-191

mpl配体1-183    图1的氨基酸1-183

mpl配体1-174    图1的氨基酸1-174

mpl配体1-163    图1的氨基酸1-163

mpl配体1-153    图1的氨基酸1-153

mpl配体1-152    图1的氨基酸1-152

mpl配体1-151    图1的氨基酸1-151

mpl配体7-332    图1的氨基酸7-332

mpl配体7-199    图1的氨基酸7-199

mpl配体7-191    图1的氨基酸7-191

mpl配体7-183    图1的氨基酸7-183

mpl配体7-174    图1的氨基酸7-174

mpl配体7-163    图1的氨基酸7-163

mpl配体7-153    图1的氨基酸7-153

mpl配体7-152    图1的氨基酸7-152

mpl配体7-151    图1的氨基酸7-151

例如，应当注意到，与较短的序列相比，mpl配体1-183、1- 191、7-183和7-191在其C末端包含有一个或两个额外的天然存 在的糖基化位点。在上述所有的例子中，N端可进一步包含甲硫氨酸- 赖氨酸。

本文所说的体外特异活性是测定相对的体外特异活性，而非测定绝 对体外特异活性。对本申请来说，特异活性仅用来比较用同一种检测法 在同一条件下所测定的mpl配体类似物的相对活性，这些条件包括同样 的内标，对用来计算特异活性的数据进行同样的分析。

本文“mpl配体类似物”这个词是指mpl配体的氨基酸序列中有一 或多处改变，而使碳水化合物连接位点的类型(N-或O-型，这会影 响连接的碳水化合物的含量)、数量或位置改变。在一个优选实施方案 中，糖基化位点的改变引起连接到mpl配体分子上的糖链数量的改变。 在一更优实施方案中，糖基化位点的改变增加了至少一个(通常1-6 个，优选1-5个，更优选2-4个)糖链，最优选通过N-键加上该 链。在另一更优实施方案中，根据生物活性检测的结果，同天然序列的 mpl配体(如人mpl配体)相比，mpl配体类似物保留了至少相同的体 内生物活性，可能具有基本上更高的体内活性。这些检测包括测定巨核 细胞或血小板的生成。

制备这些mpl配体类似物，优选采用定点诱变的方法使其氨基酸残 基增加、缺失或替换，从而使糖基化位点增加、缺失或改变。“改变” 是指一个位点缺失，同时在此缺失位点的同一位置或不同位置增加了另 一位点。然而，正如本领域的技术人员所了解的那样，其他方法也可以 产生编码同样氨基酸序列的基因，本文也包括了这些方法。所得类似物 同天然人/重组mpl配体相比，连接的碳水化合物链更少或更多(优选更 多)。

本发明的一个重要目的是使mpl配体增加一个或多个碳水化合物 (即糖)链。比相应天然存在的氨基酸序列(如1-332或1-174等) 含更多碳水化合物链的mpl配体类似物加入不破坏其二级或三级结构的 糖基化位点，从而基本上不降低其生物活性。本文中，“天然存在”的 mpl配体指与相关配体氨基酸数目相同的氨基酸序列，即使特定长度的 mpl配体种类在天然物种中实际上并不表达。极为有利的是，mpl配体 类似物有多达6个额外的N-糖基化或O-糖基化位点，这使得其可加 上1到6个额外的N-型或O-型碳水化合物链(或同时具有两种链)。

例如，30位的脯氨酸为天冬酰胺取代，32位的缬氨酸为苏氨酸取 代就产生了天冬酰胺-谷氨酸-苏氨酸序列，它可作为N-糖基化的新 位点(参见后页表1中的类似物N4)。

有两个或两个以上N-型链的类似物也可通过联合突变进行构建； 例如，表1所述的类似物N4和N10可进行联合以产生有两个额外的可 加入碳水化合物的位点的类似物(即表1中的类似物N15)。以同样方 式可构建有三个或三个以上加入链的类似物。如本领域的技术人员所了 解的那样，本发明包括有不同糖基化位点(根据位点的数目、类型、位 置区分)的多种其他mpl配体类似物。本发明的mpl配体类似物在各种 条件下均更优选基于含人氨基酸序列的mpl配体(见图1和图2)；然 而，本文也包括基于其它种类(如狗、猪、猴子、小鼠或大鼠)的mpl 配体序列。

插入氨基酸以产生糖基化位点也在考虑之列。例如下面显示了57位 的Glu被Thr所取代，同时Asn插入55位的Met和56位之间：

        -Gln-Met-Glu-Glu-Thr-

         54  55  56  57  58

                 →

       -Gln-Met-Asn-Glu-Thr-Thr-

        54  55  55′56  57  58

这增加了一个新的糖基化位点(氨基酸55′、56和57)。参见以下的类 似物N23。

本发明的类似物也包括在mpl配体的羧基端伸出一个或多个氨基酸 的类似物，羧基末端的突出物提供了至少一个额外的碳水化合物位点。 mpl配体的羧基末端根据所用的mpl配体的特定形式(如1-332位氨 基酸的mpl配体或1-163位氨基酸的mpl配体)而有所变化。在羧基 末端加入含一个或多个N-或O-型糖基化位点的氨基酸能使mpl配体 的羧基末端加入一个额外的碳水化合物位点。

表1和表6列出了一些代表性的mpl配体类似物，它们含有可加入 N-型糖链的额外位点，这些类似物的人mpl配体多肽链基于人氨基酸 序列，在多肽链的不同位置上有Asn-X-Ser或Asn-X-Thr序列以产生N -型位点。表4和表7列出了加入至少一个额外的N-型糖链的类似物， 这可由这些糖蛋白在SDS凝胶中的迁移所证实(参见例6和图3、5、 6、7、9、10、12和13)。注意这些表中也包括一些截短物(即N1、 N16、N17和N31)，它们不是本文所定义的“类似物”。它们列在表 中是为了显示怎样制备不同的截短物。

本发明也包括编码本文公开的mpl配体的DNA序列，优选编码的类 似物含有加入N-型链的额外位点。实施例4和14公开了用来向mpl 配体DNA序列中引入变化以产生、删除和/或改变碳水化合物连接位点 的方法。

这些mpl配体类似物可以是外源DNA序列的表达产物，外源DNA 即通过重组DNA技术产生的序列，它们可以是化学合成的产物，或者也 可以通过联合的方法产生。外源DNA序列包括编码mpl配体类似物的 cDNA、基因组DNA或化学合成的DNA。本发明也提供了用来表达这 些类似物的重组DNA质粒和真核宿主细胞。表达载体包括能够在真核宿 主细胞中表达克隆DNA序列的任何载体，尤其是用来在COS和CHO细 胞中进行表达的载体。这些载体的实例包括pDSRα和pDSRα2质粒，参 见《分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)8卷466-472页(1988)； WO 91/13160(1991)和WO 90/14363(1990)。表达mpl配体类似 物的COS和CHO宿主细胞的培养采用本领域的技术人员已知的标准方 法进行。

改变连接于mpl配体的碳水化合物链的数目、类型、位置或含量可 能会产生一些有利的特性，如溶解度增加、对蛋白酶的抗性增加、免疫 原性下降、血清中半衰期延长和生物活性增加或改变。

对表达mpl配体类似物N2-N15(N1为人mpl配体1-174，参 见图2)的COS细胞的条件培养基进行了分析，以确定其体外生物活性， 结果示于表4。

对表达mpl配体类似物/截短物N15-N40的COS细胞的条件培养 基进行了分析，以确定其体外生物活性，结果示于表7。

各种形式的体内生物活性结果列出于图11中(见实施例13)。

本发明的另一实施方案涉及哺乳动物(如中国仓鼠卵巢，CHO)宿 主细胞，此细胞优先合成mpl配体或每一分子有更多唾液酸的mpl配体 类似物，例如，它们的唾液酸含量超过了真核细胞天然产生或重组产生 的mpl配体1-332、1-199、1-191、1-183、1-174、1 -163、1-153、1-152或1-151。在CHO细胞中表达的类似物 N4和N15和全长及不同长度的类似物的体外活性见表5。

mpl配体分子的唾液酸含量可能会影响其体内生物活性。例如，四 触角形(四个分支)N-型寡糖通常提供四个可能的唾液酸的连接位 点，而二触角形和三触角形寡糖(它们可在天冬氨酸连接的位点取代四 触角形寡糖)通常最多只有两个或三个唾液酸连接。O-型寡糖通常提 供两个唾液酸的连接位点。因而，如果N-型寡糖是四触角形的话，以 N-型碳水化合物取代O-型碳水化合物的mpl配体分子可以在每条链 提供两个额外的唾液酸。对哺乳动物细胞培养物进行筛选，以找出通常 向重组mpl配体加入四触角形链的细胞，从而使唾液酸连接位点的数目 达到最大值。

二氢叶酸还原酶缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞是常用来生产重 组糖蛋白、包括重组mpl配体的宿主细胞。

本发明还包括含有有效治疗剂量的根据本发明的mpl配体类似物的 组合物，该组合物中还包括mpl配体疗法中有用的、合适的稀释剂、佐 剂和/或载体。本文中，“有效治疗剂量”指在给定条件和用药方案下起 到治疗效果的剂量。

该组合物可以肠道外方式全身性给药。组合物可以选择静脉或皮下 方式给药。全身性给药时，本发明的治疗用组合物可以是无热原的、肠 道外可接受的水溶液形式。制备这种可药用的蛋白质溶液，同时考虑 pH、等渗性、稳定性和其它方面，这是在本领域的技术之内的。特定途 径的选择取决于待治疗的疾病。使用mpl配体或mpl配体类似物时，优 选将其作为一种制剂的一部分，该制剂含有合适的载体(如人血清白蛋 白)、合适的稀释剂(如缓冲液溶液)和/或合适的佐剂。需要的剂量是 足够提高病人血小板水平的量，并根据待治疗疾病的严重程度、用药方 法及其它条件而有所改变。

以本发明的方法和组合物所治疗的疾病通常是已表现巨核细胞血小 板缺乏或预期将会出现巨核细胞/血小板缺乏(如由于计划进行外科手 术)的疾病。这些疾病通常是由于体内缺乏(暂时或永久)活性mpl配 体。血小板缺乏的通用术语是血小板减少症，因而本发明的方法和组合 物通常可用来治疗血小板减少症。

血小板减少症(血小板缺乏)可由多种原因引起，包括化疗、骨髓 移植和多种药物治疗、放疗、外科手术、意外失血以及其它特殊疾病。 与血小板减少症有关并根据本发明进行治疗的代表性的特殊疾病包括： 传统方法监测。

本发明的类似物也可以进行其它修饰，如增加活性、稳定性、半衰 期等。例如聚乙二醇化(PEG化)(多个或一个)可以通过蛋白质上的氨 基或碳水化合物基团加入到mpl配体类似物上。脂肪酸或其它多聚物也 可连接到蛋白质或碳水化合物基团上。

更具体地讲，不符包括以下实施方案：

1)一种mpl配体类似物，其中

(a)所述mpl配体类似物具有特异性刺激或者增加巨核细胞或血小板 的生物活性，

(b)所述mpl配体类似物是外源DNA在CHO或COS细胞中表达的 产物，并且

(c)所述mpl配体具有至少一个增加的N-型糖基化位点，它选自图 1中氨基酸序列1-174或1-199的以下配体：

[Asn25]mpl配体；

[Asn30，Thr32]mpl配体；

[Asn82，Ala83]mpl配体；

[Asn120，Thr122]mpl配体；

[Asn53，Thr55]mpl配体；

[Asn58，Thr60]mpl配体；

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122]mpl配体；

[Asn54，Ser56]mpl配体；

[Asn52，Thr54]mpl配体；

[Asn81，Thr83]mpl配体；

[Thr163，Asn164]mpl配体；

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122，Asn55(i)，Thr57]mpl配体；

[Asn30，Thr32，Asn55′(i)，Thr57，Thr163，Asn164]mpl配体；

[Asn55，Thr57]mpl配体；

[Asn56]mpl配体；

[Thr163，Asn164，Thr166]mpl配体；和

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122，Asn55，Thr57，Thr163，Asn164，Thr166]mpl配 体。

2)上述1)的类似物，它是

[Asn25]mpl配体1-174；

[Asn30，Thr32]mpl配体1-174；

[Asn82，Ala83]mpl配体1-174；

[Asn120，Thr122]mpl配体1-174；

[Asn53，Thr55]mpl配体1-174；

[Asn58，Thr60]mpl配体1-174；

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122]mpl配体1-174；

[Asn54，Ser56]mpl配体1-174；

[Asn52，Thr54]mpl配体1-174；

[Asn81，Thr83]mpl配体1-174；

[Thr163，Asn164]mpl配体1-174；

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122，Asn55(i)，Thr57]mpl配体1-174；

[Asn30，Thr32，Asn55′(i)，Thr57，Thr163，Asn164]mpl配体1-174；

[Asn30，Thr32，Asn55′(i)，Thr57，Thr163，Asn164]mpl配体1-199；

[Asn55，Thr57]mpl配体1-174；

[Asn56]mpl配体1-174；

[Thr163，Asn164，Thr166]mpl配体1-174；

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122，Asn55，Thr57，Thr163，Asn164，Thr166]mpl配体 1-174；或

[Asn30，Thr32，Asn120，Thr122，Asn55，Thr57，Thr163，Asn164，Thr166]mpl配体 1-199。

3)一种编码上述2)的mpl配体类似物的DNA序列。

4)一种以上述3)的DNA序列转染的CHO或COS细胞，其转染的 方式为使宿主细胞可以表达mpl配体类似物。

5)一种包括有效治疗剂量的上述1)的mpl配体类似物以及可药用 的稀释剂、佐剂或载体的药物组合物。

6)一种编码上述2)的mpl配体类似物的DNA序列。

7)一种以上述6)的DNA序列转染的CHO或COS细胞，其转染的 方式为使宿主细胞可以表达mpl配体类似物。

8)一种包括有效治疗剂量的上述2)的mpl配体类似物以及可药用 的稀释剂、佐剂或载体的药物组合物。

以下提供的实施例是为了充分说明本发明，而不应被理解为限制本 发明的范围。实施例中用于活性检测的mpl配体标准品为在大肠杆菌中 表达后重新折叠成活性构象并经纯化的重组mpl配体标准品。因而，只 测定了相对特异活性。

                      实施例1

                Mpl配体1-174的构建

编码图2中的氨基酸1-174(起始序列为S-P-A-P-P-A...) 的人mpl配体基因通过聚合酶链反应(PCR)由人胎肝cDNA文库产生 (Bartley等，《细胞》(Cell)77卷1117-1124页(1994))。5′PCR引物 编码人mpl配体的氨基末端、XbaI位点和优化的Kozak序列。3′引物包 括终止密码子和SalI限制位点。扩增的DNA片段用XbaI和SalI消化， 然后连接到XbaI和SalI切下的pDSRα2上。所得质粒pDSRα2mpl配体 1-174在哺乳动物细胞中进行表达。所得基因序列(包括信号肽)示于 图2中。

含mpl配体1-174的质粒DNA用XbaI和SalI限制酶消化，所得 DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，605个核苷酸的mpl配体1-174 DNA 片段用GeneCleanTM试剂盒按照生产商(BIO 101，Inc.)提供的方法从 凝胶中分离出来。WO 90/14363中所述的质粒pDSRα2也用XbaI和SalI 限制酶消化，回收载体片段。连接两个片段得到pDSRα2(mpl配体1- 174)。

                     实施例2

        Mpl配体1-174在CHO细胞中的表达和纯化

用pDSRα2-mpl配体1-174转染二氢叶酸还原酶缺陷(DHFR-) 的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。转染前一天，将1×106个CHO DHFR- 传统方法监测。

本发明的类似物也可以进行其它修饰，如增加活性、稳定性、半衰 期等。例如聚乙二醇化(PEG化)(多个或一个)可以通过蛋白质上的 氨基或碳水化合物基团加入到mpl配体类似物上。脂肪酸或其它多聚物 也可连接到蛋白质或碳水化合物基团上。

以下提供的实施例是为了充分说明本发明，而不应被理解为限制本 发明的范围。实施例中用于活性检测的mpl配体标准品为在大肠杆菌中 表达后重新折叠成活性构象并经纯化的重组mpl配体标准品。因而，只 测定了相对特异活性。

                    实施例1

                Mpl配体1-174的构建

编码图2中的氨基酸1-174(起始序列为S-P-A-P-P- A…)的人mpl配体基因通过聚合酶链反应(PCR)由人胎肝cDNA文 库产生(Bartley等，《细胞》(Cell)77卷1117-1124页(1994))。 5′PCR引物编码人mpl配体的氨基末端、XbaI位点和优化的Kozak序 列。3′引物包括终止密码子和SalI限制位点。扩增的DNA片段用XbaI 和SalI消化，然后连接到XbaI和SalI切下的pDSRα2上。所得质粒 pDSRα2 mpl配体1-174在哺乳动物细胞中进行表达。所得基因序列(包 括信号肽)示于图2中。

含mpl配体1-174的质粒DNA用XbaI和SalI限制酶消化，所得 DNA片段进行琼脂糖凝胶电泳，605个核苷酸的mpl配体1-174 DNA 片段用GeneCleanTM试剂盒按照生产商(BIO 101，Inc.)提供的方法从 凝胶中分离出来。WO 90/14363中所述的质粒pDSRα2也用XbaI和SalI 限制酶消化，回收载体片段。连接两个片段得到pDSRα2(mpl配体1 -174)。

                      实施例2

           Mpl配体1-174在CHO细胞中的表达和纯化

用pDSRα2-mpl配体1-174转染二氢叶酸还原酶缺陷(DHFR-) 的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。转染前一天，将1×106个CHO DHFR- 细胞接种于100毫米组织培养皿中，在CHO D-培养基(DMEM，10％ 胎牛血清，1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺，1％非必需氨基酸(Gibco) 和1％HT添加物(Gibco))中生长。进行四次转染。每次转染时，质 粒DNA(50微克)均以PvuI和缓冲液H(Boehringer Mannheim) 消化成线状。每次使用哺乳动物细胞转染试剂盒(Speciality Media) 时，使DNA沉淀并逐滴加入平板中。在组织培养箱中培养24小时后， 以新鲜CHO D-培养基置换其中的培养基。24小时后，细胞移至96 孔组织培养板中，每孔含有100微升CHO选择培养基(D-MEM， 5％透析过的胎牛血清，1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺，1％非必需氨基 酸(Gibco))，筛选转化子。每周更换培养基，直至出现克隆。两周 后，采用下述的32D细胞繁殖检测法(见例9)筛选mpl配体的表达。 表达超过1×105单位/毫升的克隆进行扩增并低温冻存。一个克隆进行 扩增以用于转瓶生产，产生了将近8升条件培养基。

含有mpl配体1-174 cDNA的质粒pDSRα2按上述方法转染至 DHFR缺陷的CHO细胞中。两升种有表达mpl配体1-174的CHO细 胞的转瓶无血清CHO细胞条件培养基(50％D-MEM，50％HAMS -F12，1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺，1％非必需氨基酸(Gibco))， 用2升的Amicon 2000型搅拌室和截留10000道尔顿的膜(YM10， Amicon)浓缩15倍。然后将45毫升浓缩的条件培养基以0.4ml/min流 速用Pharmacia FPLC直接上样于4ml hu-MPL-X亲和层析柱上。此亲和 层析柱的构建按生产商推荐的方法进行：每毫升Pharmacia CNBr活化的 Sepharose树脂偶联1.5-2.5毫克Mpl-X(mpl受体的可溶性胞外结 构域)。上样后，用10ml磷酸盐缓冲液(PBS；10mM NaPO4 pH 6.8/150mM NaCl)洗柱，然后用24ml 10mM Tris，pH 8.0/1M NaCl洗柱。Mpl配体(1-174)用40ml 20mM CAPS(3-[环己胺] -1丙磺酸)pH 10.5/1M NaCl/5mM CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙 基)二甲氨]-1-丙磺酸)洗脱下来，以每份6ml进行收集。第2份在 14％SDS凝胶中产生单一的带型。将其浓缩并对0.9％NaCl盐溶液透 析，它在体内及体外均有生物活性。CHO细胞表达的其它mpl配体以类 似方式进行纯化。

                    实施例3

          重组人Mpl配体的体内生物活性

对以不同类型的mpl配体治疗的小鼠进行了血小板计数。产生了 CHO来源的mpl配体1-332、1-174、1-163和1-153，并用 Mpl受体亲和层析进行纯化。也产生了大肠杆菌来源的Met-Lys-mpl 配体1-332、Met-Lys-mpl配体1-174、Met-Lys-mpl配体1- 163和Met-Lys-mpl配体1-153，用常规层析进行纯化。

图4示出用不同类型的CHO细胞来源的(实线)或大肠杆菌来源的 (虚线)重组人mpl配体治疗的小鼠的血小板计数结果。正常雌性Balb/C 小鼠连续5天经皮下注射所示浓度的mpl配体。最后一次注射后24小 时，在尾静脉侧面切一个小口，采集血样。以Sysmex电子血细胞分析仪 (Baxter Diagnostics，Inc. Irvine，CA)对血细胞进行分析。所示数 据为4只动物测定值的平均值、平均值的+/-标准差。其它血细胞参数 (如白细胞总数或红细胞数)未受这些治疗的影响(数据未列出)。

结果显示CHO细胞表达的mpl配体的体内活性较大肠杆菌产生的同 种mpl配体的活性高。如实施例6中所述，CHO细胞表达的各种mpl 配体均含有N和/或O-型碳水化合物，而大肠杆菌表达的mpl配体没 有。这表明碳水化合物提高mpl配体的体内活性。碳水化合物使体内活 性提高可能由于增加了循环半衰期、稳定性或使二者同时增加。

                   实施例4

          Mpl配体类似物N2-N15的构建

在mpl配体上产生额外的糖基化位点的方法如下。

合成以下寡核苷酸引物用来进行体外诱变以制备类似物N2-N14 (这些类似物的结构见表1)：

N2  -  CCCATGTCAATCACAGCAGACT        SEQ ID NO.：5

N3  -  CTTCACAGCAACCTGAGCCAGT        SEQ ID NO.：6

N4  -  CAGTGCAACGAGACCCACCCTTTG      SEQ ID NO.：7

N5  -  GCCTACAAATGTCACGCTGCCTGCT     SEQ ID NO.：8

N6  -  CCCACTTGTAACTCATCCCTC         SEQ ID NO.：9

N7  -  CAACTGAACGCCACTTGTCTCTCA      SEQ ID NO.：10

N8  -  ACTTGTCTCAACTCCACCCTGGGGGA    SEQ ID NO.：11

N9  - CTCCTGGGGAACCTTTCTGGA               SEQ ID NO.：12

N10 - GACCACAAATCACACCGATCCCAAT           SEQ ID NO.：13

N11 - ACCCTTTGTCTACAAATGTCACGCTGCCTGCT    SEQ ID NO.：14

N12 - TCTCTCAAACCTCACGGGGGAGCTT           SEQ ID NO.：15

N13 - TGGAAAAATCAGACGGAGGAGAC             SEQ ID NO.：16

N14 - TGGAGGAGAACAAGACACAGGACAT           SEQ ID NO.：17

为构建m13mp18 mpl配体1-174，图2中的基因引入XbaI和 SalI限制酶消化的m13mp18 DNA。单链DNA由m13mp18(mpl配体1 -174)感染的大肠杆菌RZ1032菌株的上清回收。方法见Kunkel等， 《酶学方法》(Methods in Enzymol.)154卷367页(1987)和 Messing，《酶学方法》(Methods in Enzymol.)101卷20页(1983)。 进行体外诱变时，将近0.5μg单链DNA和0.125皮摩尔上述任一合成引 物与6μl缓冲液(250mM Tris pH 7.8，50mM MgCl2，50mM二硫 苏糖醇和1％牛血清白蛋白(BSA-Pharmacia))混合。引物预先用 ATP和T4多核苷酸激酶激活。引物与模板退火时，反应体积用水调整为 10μl，混合物加热至65℃保持5分钟，随后冷却至室温。进行延伸反应 时，加入dTTP、dATP、dGTP和dCTP各2.5μl和1ml ATP(浓度 均为10μM)，随后加入1μl(1个单位)大肠杆菌DNA聚合酶(Klenow 片段)和1μl(1个单位)T4 DNA连接酶。混合物于14℃过夜，按所 述方法(Messing，同上)转化大肠杆菌JM 109(Yanisch-Perron等， 《基因》(Gene)33卷103页(1985))。

以示差杂交鉴别突变克隆。营养琼脂上的蚀斑转移到Gene Screen 滤膜(New England Nuclear)。将滤膜置于1800型紫外交联仪中 采用自动交联方式(Stratagene)通过照射使DNA交联于滤膜上。然后 将滤膜置于含1％SDS的6×SSC(0.9M NaCl/0.09M柠檬酸钠)中 于60℃温育1小时。杂交时，上述的寡核苷酸引物(8皮摩尔)以T4 多核苷酸激酶和γ32P标记的ATP进行末端标记，与滤膜一起在含0.5％ SDS和125μg/ml鲱精DNA的6×SSC中温育过夜。根据估计的寡核苷 酸熔点来选择杂交温度。通常杂交温度比熔点低10℃左右。第二天，在 杂交温度下用6×SSC/1％SDS洗膜2次，随后再在杂交温度下用6× SSC洗两次，然后放射自显影。若有必要，滤膜在较高温度下以6×SSC 清洗，直至几乎或完全测不出含野生型mpl配体cDNA序列的菌斑的杂 交信号。鉴别出在这些条件下有阳性杂交信号的克隆，将其重新转染JM 109以分离出纯化的克隆。双脱氧链终止序列分析表明发生了突变。

带有所需变化的双链m13 mpl配体1-174DNA用QIAGEN试剂盒 (Chatsworth CA.)按生产商提供的方法从JM 109转染的细胞中回收。 DNA以XbaI和SalI消化，分离出605bp的mpl配体DNA片段。pDSRα2 以XbaI和SalI消化。分离出载体片段并连接到上述mpl配体片段上。通 过限制酶切分析鉴定重组质粒。所得质粒(称为mpl配体1-174-NX， 其中NX为类似物的序号)含有编码mpl配体类似物的DNA，该类似物 在所示位置上有改变的氨基酸残基。所得质粒然后再进行测序，以证实 存在所需突变。

构建了在30位和120位有两个额外的N-型糖基化位点的类似物 N15。带有Asn30和Thr32突变的PDSRα2 mpl配体174-N4以XbaI 和PstI限制酶消化，分离出大约385个核苷酸的DNA片段。含有Asn120 和Thr122突变的PDSRα2 mpl配体1-174-N10用PstI和SalI限制酶 消化，分离出约220个核苷酸的DNA片段。pDSRα2以XbaI和SalI消 化。分离出载体片段并将其连接到上述mpl配体片段上。这样就产生了 带有Asn30、Thr32、Asn120和Thr122置换的PDSRα2 mpl配体174 -N15。

这些普通方法用来构建示于表1中的mpl配体类似物。图中示出了 每一类似物中的DNA序列改变；否则用来诱变的寡核苷酸引物序列有与 人mpl配体互补的序列。

                         表1

类似物/

种类序号             氨基酸置换                        序列改变

N1             (1-174)；Pro175→Gly332  缺失        CCA→TGA(终止密码子)

N2                  Leu22→Asn22                   CCT→AAT

N3                  Arg25→Asn25                   AGA→AAC

N4             Pro30，Val32→Asn30，Thr32        CCA，GTT→AAC，ACC

N5             Pro38，Leu40→Asn38，Thr40        CCT，CTG→AAT，ACG

N6                  Leu86→Asn86                   CTC→AAC

N7             Gly82，Pro83→Asn82，Ala83        GGA，CCC→AAC，GCC

N8             Ser87，Leu89→Asn87，Thr89        TCA，CTC→AAC，ACC

N9                  Gln92→Asn92                   CAG→AAC

N10            Ala120，Lys122→Asn120，Thr122     GCT，AAG→AAT，ACC

N11                 Pro36，Pro38，Leu40→         CCT，CCT，CTG→

                    Ser36，Asn38，Thr40           TCT，AAT，ACG

N12            Ser88Leu90→Asn88，Thr90          TCC，CTG→AAC，ACG

N13            Thr53，Met55→Asn53，Thr55        ACC，ATG→AAT，ACG

N14            Thr58，Ala60→Asn58，Thr60        ACC，GCA→AAC，ACA

N15            Pro30，Val32，Ala120，Lys122→     CCA，GTT，GCT，AAG→

               Asn30，Thr32，Asn120，Thr122       AAC，ACC，AAT，ACC

注意：此处类似物N2-N15指类似物2-15。并且，此处所称的[Asn22] mpl配体指被研究的特定mpl配体的22位氨基酸被置换为天冬酰胺，优 选的mpl配体至少含有图1中7-151位氨基酸的人源序列(包括上述 优选的人mpl配体序列)。因而，以天冬酰胺残基置换mpl配体1-174 (人源序列)的22位亮氨酸残基产生的mpl配体类似物可以用[Asn22] mpl配体1-174表示。

将mpl配体DNA插入到pDSRα2构建的质粒称为pDSRα2 1-174 -NX，此处NX是类似物的序号。表达载体pDSRα2在WO 90/14363 (1990)中已大体述及。用XbaI和SalI消化pDSRα2可得到pDSRα2 mpl 配体1-174-NX质粒。分离出载体片段并将其连接到含所需序列的 大约605bp的片段上。

                   实施例5

     Mpl配体和Mpl配体N1-N15在COS细胞中的表达

人mpl配体和表1所述的mpl配体类似物的cDNA克隆通过电穿孔 法转到COS-1细胞(ATCC No. CRL-1650)。从半汇合的培养 皿中收集COS-1细胞，用培养基(含有10％胎牛血清和1％L-谷 氨酰胺/青霉素/链霉素(Irvine Scientific)的Dulbecco改良必需培养 基)清洗后，重新悬浮，使其浓度为6×106细胞/ml。0.5ml细胞转移 到0.2cm电穿孔池(Bio-Rad)中，与50μg编码mpl配体类似物的质 粒DNA进行电穿孔，所用系统为BTX电穿孔系统电子细胞操作器600 (BTX Electroporation System Electrocell Manipulator 600)，工 作条件为130伏的低电压和650μF。电穿孔处理过的细胞以10ml培养基 涂布于100mm组织培养皿中。涂布后12到24小时以10ml新鲜培养基 替换原来的培养基。电穿孔后3到5天收集条件培养基。

                    实施例6

         Mpl配体和Mpl配体N1-N15的鉴定

A.鉴定碳水化合物的加入

含有大约30-60ng mpl配体或mpl配体类似物的COS细胞上清在 室温下以兔抗mpl配体多克隆抗体进行免疫沉淀过夜，该COS细胞如例 5中所述用mpl配体类似物cDNA转染。在某些情况下表达水平较低， 则用于免疫沉淀的最大体积为大约8-9ml。抗体为抗大肠杆菌中表达 的纯化mpl配体1-163的抗体。将30μl含0.1％叠氮化钠的磷酸盐缓 冲液(PBS)中的1∶1蛋白质A-Sepharose加入免疫沉淀物中，在室 温下温育1小时。样品离心后以PBS洗涤，重新悬浮于SDS样品缓冲液 中(0.125M Tris-HCl pH 6.8/4％SDS/20％甘油/10％β-巯基 乙醇/0.001％溴酚蓝)中。样品进行12％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 分析，转移到硝酸纤维素膜上，再用小鼠单克隆抗体进行Western分析 (可参见以下文献：Burnette等，《生物化学分析》(Anal.Biochem.112 卷195-203页(1981)；Elliott等，《基因》(Gene)79卷167- 180页(1989))所用抗体为合成的mpl配体肽(如相应于图1中的氨 基酸残基47-62)作抗原而产生的。含mpl配体的带能用ECL试剂盒 (Amersham)显色。

图5显示类似物N4、N7和N10 DNA转染的COS细胞上清中的 蛋白较人源序列的mpl配体174(N1)大。图6显示N13、N14和N4 DNA转染的COS细胞上清中的蛋白也比人源序列的mpl配体大。这种 增大表明存在有一个额外的N-型碳水化合物链。N15含两个额外的N -型糖基化位点。图6表明该类似物中含有比只有1处额外的N-型糖 基化更大的材料。蛋白质的大小根据它们在SDS-PAGE上相对已知分 子量的蛋白质标准物的运动性进行估计。由图6计算出来的较大的带的 估计大小列于表2。这一结果表明N15含有2个额外的N-型糖链。其 它选定的类似物的Western印迹分析也示于图6。

                    表2

             N-型碳水化合物的估算 Mpl配体类似物    分子量     分子量变化    可能的N-型 (1-174)          (Da)          (Da)       链的数量                          (较天然序列增加) (@4KDa/位点) N1天然           23500         0               0     N4           28700         5200            1     N7           27200         3700            1     N10          27200         3700            1     N13          26700         3200            1     N14          28700         5200            1     N15          33500         10000           2

为了证实mpl配体类似物增大是由于N-型碳水化合物的加入而进 行了试验。按上述方法免疫沉淀含mpl配体的COS细胞条件培养基并用 PBS清洗。然后每一管加入10μl 0.5％SDS，每一样品煮沸3分钟。 然后加入下列成分：10.8μl 0.5M NaPO4 pH8.6，5ml 7.5％辛基 酚聚氧乙烯醚和3μl 250单位/毫升的N-聚糖酶(Genzyme)。N- 聚糖酶处理除去N-型碳水化合物。样品37℃下保温6小时。加入SDS -PAGE样品缓冲液终止反应，按上述方法用抗mpl配体的单克隆抗体 和抗小鼠ECL Western检测试剂盒(Amersham)进行SDS-PAGE Western分析(12％丙烯酰胺)。采用这种方法对人mpl配体和mpl配 体类似物进行的N-型链分析示于图7。N4、N7和N10用N-聚糖 酶处理后在Western印迹上的运动性下降至与N1相同。正如所预料的那 样，N1用N-聚糖酶处理之后对运动性没有影响，因为N1没有N- 型糖基化位点。这些结果表明所见的增大是由于N-型碳水化合物的加 入。

B.mpl配体上O-型碳水化合物的分析

为了分析O-型碳水化合物对人mpl配体的作用，从上述的CHO 细胞条件培养基中纯化出几种蛋白质。每一种蛋白质均以O-聚糖酶(糖 肽α-N-乙酰半乳糖胺酶，Oxford GlycoSystems)进行+/-处理。 O-聚糖酶除去糖蛋白中的O-型碳水化合物。用大肠杆菌表达的每种 蛋白形式作为未糖基化的对照。为分析O-型碳水化合物对分子量差别 的作用，有必要首先除去所有N-型碳水化合物。由于全长形式的mpl 配体1-332含有N-型碳水化合物，CHO细胞表达的全长样品同上述 COS细胞表达的mpl配体类似物一样进行N-聚糖酶(肽-N4-(N -乙酰-β-葡糖氨基)天冬酰胺酰胺酶)处理，只是此处N-聚糖酶 处理是保温过夜。

对全长(1-332)mpl配体进行O-聚糖酶处理前，样品pH用 1/15体积的100mM乙酸(pH2.2)调整至pH6.0-pH7.0之间。1微 克蛋白质在SDS中煮沸3分钟变性，然后与1U/ml神经氨酸苷酶(唾液 酸酶，来自Arthrobacter Urefaciens，Boehringer Mannheim)、1mM 乙酸钙(pH6.8)和20mM磷酸钠(pH6.8)溶液37℃保温60分钟。

随后进行O-聚糖酶处理：加入5mU酶使终体积为100μl，37℃ 保温过夜。蛋白质(0.2μg/道)采用SDS-PAGE(15％丙烯酰胺)进 行分离。然后转移到0.2μm硝酸纤维素膜上，与抗mpl配体的多克隆抗 体温育过夜，用抗兔ECL Western检测试剂盒(Amersham)使mpl 配体蛋白显色。

图3示出4种不同形式的人源mpl配体的Westenr印迹结果。1-3 道为全长mpl配体1-332，4-6道为mpl配体1-174，7-9道 为mpl配体1-163，10-12道为mpl配体1-153。神经氨酸苷酶 和O-糖苷酸处理后的配体示于2、5、8和11道中，其分子量降至与 3、6、9和12道中未糖基化的配体相同。每一例中运动性均增加到与 大肠杆菌中表达的未糖基化形式相同。这些结果表明1、4、7和10道 中较大的带是由于O-型碳水化合物引起的。每条带的分子量是与已知 分子量的蛋白质的运动性比较而估计的。

从表3中列出的不同蛋白质的估计分子量可见，运动性的明显改变 可归因于多个O-型碳水化合物，mpl配体1-332含多达14个O- 型碳水化合物链(估计950道尔顿/链)，mpl配体1-174含9个链， mpl配体1-163含4个链，mpl配体1-153含2个链。2道中的样品 为全长mpl配体1-332。该蛋白显然被降解，这可能是由于同糖苷酶 在37℃保温的时间延长所致。因而，3道中大肠杆菌表达的未糖基化的 形式用来计算加入到CHO，细胞表达的mpl配体1-332中的O-型碳 水化合物的大致分子量。

这些结果与测试的CHO表达的所有mpl配体形式均存在碳水化合物 是一致的。通过单糖成分的直接分析证实CHO细胞表达的mpl配体1- 332、1-174和1-163中存在O-型碳水化合物。唾液酸、GalNAc 和Gal通过酸水解从糖蛋白中释放出来。单糖采用高压阴离子交换层析 和脉冲电流检测。每种形式的mpl配体均测得了这三种糖。这一结果表 明存在着含O-型碳水化合物的唾液酸。这一结果与图4中的体内结果 是一致的，图4中CHO细胞表达的mpl配体形式比大肠杆菌中表达的相 应形式的体内活性要高。因此存在碳水化合物能提高mpl配体的体内活 性。

                      表3

               O-型碳水化合物计算 Mpl配    O-聚糖酶处理  分子量    分子量变化   可能的O-型链的 体形式    (+/-)         (Da)   数目(@950Da/链)  1-332      -          54200       13600           14   ″    大肠杆菌变体   40600  1-174      -          24600       8600            9   ″        +          16000  1-163      -          18400       3900            4   ″        +          14500  1-153      -          15200       2300            2   ″        +          12900

                       实施例7

                 Mpl配体的ELISA检测

多克隆抗体的产生：在长达三个月的时间里用大肠杆菌产生的重组 人mpl配体1-163使新西兰白兔超免疫。收集表现出高抗体效价的六 只兔子的抗血清，特异的抗mpl配体的抗体进行亲和纯化。

亲和纯化：重组人mpl配体1-163根据厂商说明共价联结到Actigel -ALD(Sterogene Bioseparations，Inc.)上。一份兔抗血清样品加入 到mpl配体亲和凝胶上，混合物置于搅拌器上4-8℃缓慢搅动过夜。 未结合的血清蛋白用PBS从胶床中洗脱下来，特异性结合的抗mpl配体 的抗体用免疫纯化温和抗原/抗体洗脱缓冲液(ImmunoPure Gentle Ag/Ab Elution Buffer，Pierce Chemical Co.)洗脱下来。回收的抗 体用PBS透析，更换几次透析液后，抗体溶液用Amicon搅拌室超滤单 元(Amicon Stirred Cell Ultrafiltration Unit)浓缩，所得抗体浓缩 液为随后用于孔包被和酶结合物制备的特异性抗mpl配体的抗体。

ELISA试剂：Immulon 4 Removawell Strips (Dynatech Laboratories，Inc.)以亲和纯化的兔抗mpl配体的抗体包被。亲和纯化 的抗体以0.1M碳酸氢钠(新鲜配制的，pH约为8.2)稀释至浓度为 2.5μg/ml。每孔中加入100μl抗体，酶联板在密闭的湿盒中于室温下温 育24小时。然后每孔中加入200μl含1％胎牛血清、5％蔗糖的TEN 液(TEN液：50mM Tris 7.4/10mM  EDTA/150mM NaCl)的封 闭液，酶联板再置于密闭的湿盒中室温下温育24小时。弃去孔中的包被 液和封闭液。再包被/封闭步骤包括：每孔中加入300μl溶于PBS的超封 闭(SuperBlock)封闭缓冲液(Pierce Chemical Co.)。室温下保持 大约5分钟，弃去该溶液，室温下风干24小时。包被好的酶联板放置于 密闭的塑料袋中于4-8℃保存，以供mpl配体ELISA之用。

由收集的兔抗血清中亲和纯化的抗mpl配体的抗体共价联结于辣根 过氧化物酶(HRPO)上用作信号产生抗体。亲和纯化的抗体用亚胺硫 杂戊烷盐酸(iminothiolane HCl Fluka Chemical Corp.)处理。另 外，HRPO用6-马来酰亚胺己酸-N-琥珀酰亚胺酯(Fluka Chemical Corp.)处理。将这两种活化的蛋白质混合以使它们共价结合。 然后将反应混合物用FPLC Superose 6(Pharmacia)柱层析，以分离 出所需分子量(即大约200kD)的抗体：HRPO结合物。合并含所需结 合物的部分，用Centricon 30(Amicon Division，W.R.Grace & Co.) 浓缩，以50％的甘油溶液保存于-20℃。该抗mpl配体抗体：HRPO 浓缩物以含2％胎牛血清的PBS稀释以供ELISA之用。用于ELISA的结 合物的最终浓度为250-500ng/ml。

用大肠杆菌产生的重组人mpl配体1-163作标准物。该mpl配体 以含2％胎牛血清(Sigma Chemical Co.)、0.05％乙汞硫代水杨酸 钠的TEN缓冲液稀释后保存。制备的标准物含mpl配体分别为1.0、 0.5、0.25、0.125和0.062ng/ml。

检测：板孔中加入100μl mpl配体标准物或样品，然后置于密闭的 湿盒中于室温下温育18-24小时。弃去孔中内含物和残液，用洗液(含 0.05％吐温20的TEN缓冲液)洗一次。每孔中加入抗mpl配体的抗体： HRPO结合物溶液(100μl)，然后置于密闭的湿盒中于室温下温育2 小时。弃去各孔中内含物，用含0.05％吐温20的TEN缓冲液洗4次。

进行显色反应时，加入100μl TMB/过氧化物底物溶液(Kirkegaard & Perry溶液A和B1∶1混合)，室温下温育20分钟。加入100μl终止 液(0.5N硫酸)终止反应。在微量板检测仪上读取450nm的吸收值。样 品中mpl配体的浓度根据曲线拟合程序产生的标准曲线来计算。

                    实施例8

        mpl配体1-174类似物在短期液体培养

            巨核细胞检测法中的生物活性

按上述方法制备mpl配体1-174类似物，并检测它们刺激液体培 养的巨核细胞生长的能力。分离自人白细胞提取单元(Nichol等，《干 细胞》(Stem Cells)12卷494-505页(1994))的CD34选择细 胞以2×105/ml接种于培养基(IMDM/1％普鲁卡因青霉素谷氨酰胺/1 ％非必需氨基酸/1％MEM丙酮酸钠/1％MEM维生素/10％去离子 BSA/10％正常人AB血浆/10μM α-thiacylglycerol/20μg/ml L- 天冬酰胺)上。此外每孔中加入1.5μl含有mpl配体(1-174)或mpl 配体1-174类似物的COS-1条件培养基。在Terasaki式微量组织培 养板(Vangard International)上的终体积为15μl。细胞在含5％CO2的湿盒中于37℃温育8天，用1％戊二醛直接固定于培养孔上，然后与 含有抗GPIb、抗GPIIb(Biodesign)和抗GPIb(Dako，Carpinteria， CA)的单克隆抗体合剂一起温育。以链霉抗生物素蛋白-β-半乳糖苷 酶检测系统(HistoMark，Kirkegaard and Perry)使免疫反应显色。 巨核细胞在图8中以暗色(实际图片中为蓝色)表示。

图8中A部分和D部分分别为阳性和阴性对照。A组孔接受了 37.5pg野生型mpl配体1-174 COS-1条件培养基，可见有明显的巨 核细胞生长。D组孔接受了1.5μl COS-1模拟条件培养基，未见生 长。图8中B部分和C部分分别为mpl配体1-174类似物N7和N10。 B组孔接受了9.0pg mpl配体COS-1条件培养基，而C组孔接受了 27pg，两者均显示出良好的巨核细胞生长。

该试验表明，所试的mpl配体类似物能够在体外刺激人巨核细胞的 生长。

                    实施例9

Mpl配体1-174类似物在体外细胞增殖检测法中的生物活性

按以上介绍的方法制备mpl配体1-174类似物，并检测它们刺激 32D-mpl细胞增殖的能力。为构建32D-mpl细胞，全长人mpl受体 序列(Vigon，I.，等，PNAS 89卷5640-5644(1992))亚克隆至 含莫洛尼氏小鼠肉瘤病毒转录启动子的表达载体上。6μl该构建体和6μl 双嗜性逆转录病毒包装的构建体(Landau，N.R.，Littman，D.R.， 《病毒学杂志》(Journal of Virology)66卷5110-5113页 (1992))用CaPO4哺乳动物转染试剂盒(Stratagene)转染到3×106 293细胞中。2天及4天后再次转染这些细胞。最后一次转染次日，293 细胞与IL-3依赖的鼠细胞系(32D，克隆23；Greenberger等，PNAS 80卷2931-2936页(1983))共孵。24小时后，32D细胞在BSA 梯度(Path-o-cyte；Miles Inc.)上回收并成带。细胞在1ng/ml 鼠源IL-3中扩大培养，然后在20％APK9血清(Bartley等，《细胞》 (Cell)77卷1117-1124页(1994))中选择生长。用多克隆兔抗 肽(MPL)血清进行FACS，根据细胞表面表达的受体对细胞分类。这 些细胞因子依赖的鼠32D-mpl细胞对mpl配体有反应。32D-MPL 细胞在含10％胎克隆II血清(Hyclone Laboratories)和1.0ng/ml muIL3的MEM培养基生长至细胞密度为1×106细胞/ml。细胞通过离 心(大约500×G)收集，用缺少muIL3的生长培养基洗两次，重新悬 浮为1×105细胞/ml。

用mpl配体1-163制得包含12个点的mpl配体标准曲线，范围为 5000-1pg/ml。100μl每一稀释度的标准mpl配体或检测样品加至含 100μl重新悬浮细胞的96孔微量组织培养板(10000细胞/孔)的合适孔 中，在37℃、10％CO2的加湿培养箱中温育。48小时后，每孔加入 40μl MTS试剂(水相非放射性细胞增殖试剂盒，Promega)，14- 18小时后在细胞板读数仪上读取490nM的光密度。每一样品的体外活性 根据样品的剂量反应曲线计算。一个单位定义为产生50％最大刺激所需 的每一样品mpl配体的量。以单位/ml表示的生物活性除以mpl配体 ELISA确定的以ng/ml表示的mpl配体的浓度计算出特异活性。

在COS细胞中转染和表达的mpl配体类似物的特异生物活性示于表 4。氨基酸的置换对碳水化合物加入的影响也进行了总结。纯化人序列 mpl配体的体外活性按上述检测法测定为200-300单位/ng。由表4也 可清楚地看出，含有额外N-型碳水化合物的mpl配体类似物(如N4 和N10)同天然序列mpl配体一样表达良好，即使它们含有额外的碳水 化合物链(如实施例6中A部分中所测定的)。这两种类似物也保持了 全部体外生物活性。因而，含N-型碳水化合物的mpl配体类似物可在 哺乳动物细胞中正常表达，并且它们具有正常或升高的体外生物活性。

                       表4  Mpl配体形式  序列  N-型链的数目 Elisa(ng/ml) 体外活性 特异活性 (氨基酸长度)                                  (单位/m) (单位/ng)                            (a)      (b)          (c)       (d)   模拟的     NCNE           0       ＜0.08      ＜10      ＜125  N1(174)     天然的         NA      25          5375      215  N1(174)     天然的         0       31.4        8800      280  N1(174)     天然的         0       31.75       NA        NA  N2(174)     N22            0       NA          NA        NA  N3(174)     N25            NA      1.85        636       344  N4(174)     N30T32         1       38          8830      232  N4(174)     N30T32         1       24          NA        NA  N5(174)     N38T40         0       1.2         ＜10      ＜8  N6(174)     N86            0       0.44        ＜10      ＜22  N7(174)     N82A83         0 to 1  6           2660      443  N7(174)     N82A83         0 to 1  4.7         3080      655  N9(174)     N92            0       10.5        1970      188  N10(174)    N120T122       1       20.4        5943      291  N10(174)    N120T122       1       33.7        9690      288  N11(174)    S36N38T40      NA      ＜0.625     ＜10      ＜16  N11(174)    S36N38T40      0       1.3         ＜10      ＜8  N13(174)    N53T55         0 to 1  67          18000     269  N14(174)    N58T60         0 to 1  17.9        4850      271  N15(174)    N30T32N120T122 0 to 2  26          6420      247

                    注意

(a)额外的N-型链的数目按实施例6中所述根据类似物多肽在SDS 凝胶中的运动性估计。

(b)CHO细胞上清中mpl配体类似物的量按本实施例所介绍的ELISA 检测法确定。

(c)体外活性根据对依赖mpl配体生长的32D细胞的胸腺嘧啶摄入的 刺激来计算。

(d)根据增殖试验测得的mpl配体类似物的体外活性与根据mpl配体 ELISA测得的mpl配体类似物的量的比率。

N.A.未得到

                     实施例10

Mpl配体1-174、N4和N15在CHO细胞中的表达和纯化

含mpl配体1-174、N4和N15 cDNA的pDSRα2转染DHFR- 缺陷的CHO细胞，所用方法为实施例2中所述的方法作以下改进。

每一类似物进行一次转染。转染后三周，采用mpl配体ELISA筛选 mpl配体表达。各种形式的三个表达克隆低温冻存。每一类似物的最高 表达的克隆以转瓶生产扩大培养。N4产生了7.4升条件培养基(50％ D-MEM、50％HAMS-F12、1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺、1％ 非必需氨基酸(Gibco))，N15产生了4.6升条件培养基。

来自转瓶接种有表达mpl配体1-174(2.9L)N4(7.4L)、 N15(4.4L)的CHO细胞的无血清条件培养基采用S1Y10(截留10000 道尔顿分子量)Amicon螺旋超滤柱分别浓缩12、19和12倍。150毫 升浓缩的条件培养基以0.3ml/min流速直接加样于3.3ml hu-Mpl-X(受 体)亲和柱上。此亲和柱是按生产商推荐的方法每毫升Pharmacia CNBr 活化的Sepharose树脂偶联1.0-1.5毫克Mpl-X(可溶性的Mpl受体 细胞外结构域)而构建的。上样后，以30ml磷酸盐缓冲液(PBS；10mM NaPO4 pH6.8/150mM NaCl)洗柱，再以60ml 10mM Tris，pH 8.0/1M NaCl/1mM CHAPS洗柱。Mpl配体1-174用30ml 20mM CAPS(3-[环己胺]-1丙磺酸)pH10.5/1M  NaCl/1mM  CHAPS(3 -[3-胆酰胺丙基)二甲胺]-1-丙磺酸)洗脱出来。

各洗脱组分加入0.6ml 1M Tris pH7.0进行中和。SDS-PAGE 分析表明10mM Tris，pH8.0/1M NaCl 1mM CHAPS洗脱时1- 174mpl配体有明显的“伤流”。洗脱组分以SDS-PAGE进行分析。 收集含有mpl配体1-174的组分。此亲和纯化进行如下调整后重复一 次：0.5ml/min上样和洗脱，除去10mM Tris，pH8.0/1M NaCl/1mM CHAPS的洗脱。

含单一mpl配体带的所有组分用YM 10(截留10000道尔顿分子量) 膜在centricon装置上的50ml搅拌室中进行浓缩。该0.5ml浓缩液直接加 样于PBS平衡的Pharmacia Superdex 200 HR 10/30凝胶过滤柱上，流速 为0.25ml/min，每一组分收集0.25ml。合并所有含单一mpl配体带(根 据SDS-PAGE分析)的洗脱组分。

CHO细胞表达的其它形式(N4和N15)的mpl配体以类似方式(合 并两次亲和纯化，在Superdex 200凝胶过滤柱上分离)纯化。

                      实施例11

CHO细胞表达的N4和N15中碳水化合物加入的测定

为确定CHO细胞中表达的mpl配体形式是否含有N-型碳水化合 物，如例6中所述方法用SDS-PAGE Western印迹对条件培养基进行 分析，所用方法进行以下改进。

使用来自转瓶的CHO D-条件培养基。样品加样至Centricon-10 离心浓缩器中(Amicon，Beverly，MA)，在Beckman J2-HS离 心机上使用固定角转头(JA 20.1)以6000 RPM离心1小时。含大约 100ng mpl配体类似物的浓缩样品与同体积的SDS样品缓冲液(如实施 例6中所述)加样至SDS PAGE凝胶上。大肠杆菌表达的、不含碳水 化合物的mpl配体MK 1-174也同时加样。图9示出运动性的差异， 它与预期的碳水化合物数量一致。运动最快的种类为Met-Lys(1- 174)大肠杆菌mpl配体，其后依次为mpl配体1-174(CHO)、N4 (CHO)和N15(CHO)。参见图9。相对于未糖基化的mpl配体的 分子增大最可能的解释是mpl配体1-174(CHO)上有额外的O- 型碳水化合物，N4(CHO)上有额外的O-型碳水化合物和一个额外 的N-型寡糖，N15(CHO)上有额外的O-型碳水化合物和两个额 外的N-型寡糖。

为了证实分子量的增加确实是由于N-型碳水化合物链的加入，样 品按实施例6中所述用N-聚糖酶处理以除去所有的N-型碳水化合 物。每一样品中含有由条件培养基中纯化的大约100ng mpl配体类似物。

N-聚糖酶处理后N4(CHO)和N15(CHO)的运动性降至与 mpl配体1-174(CHO)相同。以N-聚糖酶处理mpl配体MK1- 174(大肠杆菌)或mpl配体1-174(CHO)不影响运动性，因为根 据预计这两种形式都不含任何N-型碳水化合物。比较N-聚糖酶处理 与否的情况表明N4的大小差别相当于一个N-型碳水化合物链的大 小，而N15的大小差别相当于两个碳水化合物链的大小。因而，当这两 种mpl配体形式在CHO细胞中表达时，它们的N-型糖基化位点增加 会导致N-型碳水化合物增加。参见图10。

                        实施例12

CHO细胞中生产的Mpl配体类似物的体外生物活性

CHO细胞或大肠杆菌细胞表达和纯化的纯mpl配体和类似物用因子 依赖性细胞系32D-Mpl和例9所述检测法分析其体外生物活性，其活 性根据以CHO细胞产生的mpl配体1-332为标准物获得的曲线来计 算。几种形式的mpl配体的特异体外生物活性示于表5。从表中可明显 看出CHO细胞中表达的、含有额外的碳水化合物的mpl配体类似物具有 体外生物活性。

                       表5

                MPL配体的体外活性

MPL配体形式       N-型链的数目       体外活性     

                                     U/mg×10E6

MK174(E.coli)          0                13

1-163(CHO)             0                86

1-174(CHO)             0                85

N4(CHO)                1                60

N15(CHO)               2                92

1-332(CHO)             6                41

                      实施例13

            Mpl配体类似物的体内生物活性

检测以几种形式mpl配体处理的小鼠的血小板数，结果示于图11。 CHO来源的mpl配体1-332、1-174、N4和N15以mpl受体亲和 层析进行纯化。大肠杆菌来源的Met-Lys-mpl配体1-174以常规层析 进行纯化。所示浓度的每种形式给于正常雌性Balb/c小鼠皮下注射，每 日一次，连用5天。最后一次注射后24小时，由尾静脉侧面切一小口收 集血样。用Sysmex血细胞电子分析仪(Baxter Diagnostics，Inc. Irvine，CA)进行血细胞分析。数据以4只动物测定结果的平均值和平 均值的+/-标准差表示。其它血细胞参数，如白细胞数或红细胞数不受 这些处理的影响(数据未引出)。

所有形式的mpl配体均刺激血小板数增加。然而，不同形式的活性 有所不同。相对体内活性为mpl配体MK1-174(大肠杆菌)＜mpl配 体1-174(CHO)＜N4(CHO)＜mpl配体1-332(CHO)＜N15 (CHO)。这些结果表明加入非天然存在的N-型碳水化合物导致体内 活性增加，而且增加碳水化合物的量使体内活性成比例增加。

                      实施例14

通过重叠PCR构建Mpl配体类似物和截短物N16-N40

类似物N16到N40(这些类似物结构见表6)通过重叠PCR(聚合 酶链反应)构建，所用方法根据Cheng等，PNAS 91卷5695页(1994) 介绍的方法加以改进。一般在每一构建物中引入1到2个突变。

合成以下寡核苷酸引物用于制备类似物N16-N40：

5′F CCCTCTAGACCACCATGGAACTGACTGAATTGCTCCTC    SEQ ID NO.：18

3′R(1-174)CCCGTCGACTCAGAGCTCGTTCAGTGTG        SEQ ID NO.：19

N16 - 3′R  CCCGTCGACTCACTCCAACAATCCAGAAG      SEQ ID No.：20

N17 - 3′R  CCCGTCGACTTATCTGGCTGAGGCAGTGA      SEQ ID NO.：21

N18 - F  CACGTCCTTAACAGCAGCCTGAGCCAGTG         SEQ ID NO.：22

N18 - R  CACTGGCTCAGGCTGCTGTTAAGGACGTG         SEQ ID NO.：23

N19 - F  CCCTTTGCCTAACGGTTCCCTGCTGCCTGCTGT     SEQ ID NO.：24

N19 - R  ACAGCAGGCAGCAGGGAACCGTTAGGCAAAGGG     SEQ ID NO.：25

N20 - F   TGCCTACACCTAACCTGTCGCCTGCTGTGGA          SEQ ID NO.：26

N20 - R    TCCACAGCAGGCGACAGGTTAGGTGTAGGCA         SEQ ID NO.：27

N21 - F   GGAAAACCAATATGTCGGAGACCAAGGCACA          SEQ ID NO.：28

N21 - R   TGTGCCTTGGTCTCCGACATATTGGTTTTCC          SEQ ID NO.：29

N22 - F   TGGGAGAATGGAACACCACGATGGAGGAGACC         SEQ ID NO.：30

N22 - R   GGTCTCCTCCATCGTGGTGTTCCATTCTCCCA         SEQ ID NO.：31

N23 - F   AAAACCCAGATGAACGAGACGACCAAGGCACA         SEQ ID NO.：32

N23 - R    TGTGCCTTGGTCGTCTCGTTCATCTGGGTTTT        SEQ ID NO.：33

N24 - F   CCCAGATGGAGAACACCTCGGCACAGGACAT          SEQ ID NO.：34

N24 - R   ATGTCCTGTGCCGAGGTGTTCTCCATCTGGG          SEQ ID NO.：35

N25 - F   CACGGGGACAAAACGGAACCACTTGCCTCTCA         SEQ ID NO.：36

N25 - R   TGAGAGGCAAGTGGTTCCGTTTTGTCCCCGTG         SEQ ID NO.：37

N26 - F   CAGGGCAGGAACACATCTCACAAGGATCCCA          SEQ ID NO.：38

N26 - R   TGGGATCCTTGTGAGATGTGTTCCTGCCCTG          SEQ ID NO.：39

N27 - F  GGGCAGGACCAACGCTAGCAAGGATCCCAAT           SEQ ID NO.：40

N27 - R   ATTGGGATCCTTGCTAGCGTTGGTCCTGCCC          SEQ ID NO.：41

N29 - F pair1 CAGTGCAACGAGTCCCACCCTTGG             SEQ ID NO.：42

N29 - R pair1  CAAAGGGTGGGACTCGTTGCACTG            SEQ ID NO.：43

N29 - F pair2 GACCACAAATCACTCCGATCCCAA             SEQ ID NO.：44

N29 - R pair2 TTGGGATCGGAGTGATTTGTGGTC             SEQ ID NO.：45

N30 - F GTCCCCACCAACACCTCTCTAGTCCTC                SEQ ID NO.：46

N30 - R GAGGACTAGAGAGGTGTTGGTGGGGAC                SEQ ID NO.：47

N31 - 3′ R CCCGTCGACTCACTTCAGAAGCCCAGAGCCAGT      SEQ ID NO.：48

N36(1) -  F GAAAACCCAGAACGAGACCACCAAGGCACAG        SEQ ID NO.：49

N36(1) -  R CTGTGCCTTGGTGGTCTCGTTCTGGGTTTTC        SEQ ID NO.：50

N36(2) -  F CACCAAGGCACAGGACATTCTGGGAG             SEQ ID NO.：51

N36(2) -  R CTCCCAGAATGTCCTGTGCCTTGGTG             SEQ ID NO.：52

N37 - F GAAAACCCAGATGAACGAGACCAAGGCACAG            SEQ ID NO.：53

N37 - R CTGTGCCTTGGTCTCGTTCATCTGGGTTTTC            SEQ ID NO.：54

N38 - F GTCCCCACCAACACCACTCTAGTCCTC                SEQ ID NO.：55

N38 - R  GAGGACTAGAGTGGTGTTGGTGGGGAC               SEQ ID NO.：56

F＝正向

R＝反向

构建体引入一个新的糖基化位点分两步连续进行。第一步用4个不 同的寡核苷酸进行两个反应。这些寡核苷酸包括一个5′正向引物、一个 反向诱变引物、一个正向诱变引物(通常与反向诱变引物互补)和一个 反向3′引物。反向3′引物含有终止密码子和SalI限制酶切位点的序列。 终止密码子在175、184、192和200位引入。因此，可获得长度为1 -174、1-183(N16)、1-191(N17)和1-199(N31)的 形式。PCR1使用模板DNA(含有mpl配体1-174序列或全长mpl 配体1-332序列的pDSRα2)、5′正向引物和反向诱变引物。PCR2 使用模板DNA、3′反向引物和正向诱变引物。然后进行两个PCR反应， 扩增的DNA片段通过琼脂糖凝胶电泳分离。含有合适大小的DNA片段 的琼脂糖小块由凝胶中切下。

来自PCR1和PCR2的DNA片段合并在一起，用5′正向引物和3′反 向引物进行第3个PCR反应。因而，扩增出含有插入所需突变的mpl配 体的全长DNA片段。

扩增的片段再通过琼脂糖凝胶电泳分离，合适大小的DNA片段用 GenecleanTM试剂盒纯化，所用方法由生产商提供(Bio 101，Inc.)。纯 化的DNA以XbaI和SalI消化，然后再以GenecleanTM试剂盒纯化。该片 段连接到XbaI和SalI切下的pDSRα2上。连接的DNA在载体tRNA存 在下以含0.3M NaOAc(pH5.2)的2倍体积乙醇沉淀并转化大肠杆 菌。采用限制酶切分析和琼脂糖凝胶电泳对克隆进行检测，以鉴别出含 有合适大小的DNA插入片段的克隆。然后制备纯化的质粒DNA，对mpl 配体插入片段进行测序，以证实存在所需的突变并确信没有引入额外的 氨基酸变化。

在有些情况下，同时存在两个或多个突变，可参见N29、N33、 N34、N35、N39和N40。这可以通过向已含有一个改变的DNA引入 一个新的置换而完成。例如，N33是通过向N15引入N23的改变而获得 的。在这种情况下，用N23诱变引物和N15模板DNA重复上述过程即 可。

另一种方案可向模板DNA中同时引入两个改变。模板DNA可含有 天然序列或编码已含有改变的mpl配体的序列。在此情况下，步骤1包 括3个PCR反应和6个寡核苷酸。这些寡核苷酸包括一个5′正向引物、 2对正向和反向诱变引物和一个反向3′引物。每对引物彼此互补并且含有 预设的引入一个新的糖基化位点的序列。

PCR1包括模板DNA、5′正向引物和第1对中的反向诱变引物。 PCR2包括模板DNA、第1对中的正向诱变引物和第2对中的反向诱变 引物。其中第2对引物位于第1对引物的3′位。PCR3包括模板DNA、 第2对中的正向诱变引物和反向3′引物。

每一PCR反应的DNA片段按前述方法用琼脂糖凝胶电泳分离并切 出胶块。然后将3个DNA片段合并在一起，再用5′正向和3′反向引物进 行PCR扩增。

按前述方法纯化编码完整目的基因并含有两个新的糖基化位点的序 列的DNA片段，XbaI和SalI进行酶切，并将其连接到XbaI和SalI切开 的pDSRα2上。

用已含有突变的模板进行PCR反应也可合并多个突变。例如，向 N15模板DNA中引入N36和N38的变化获得N39。这可通过使用不同 于N36(N36(1))引物的一套引物(N36(2))而完成。参见前 面列出的引物。两套引物都引入相同的突变。

也可产生较长的mpl配体形式。因而，可以类似于N39的方式产生 N40，不同之处在于PCR3的3′反向引物(步骤1)和步骤2中的PCR 引物为用来产生N31的引物。这一引物在200位引入了一个终止密码子， 其下游为一个SalI限制位点。除此之外，用于PCR3的模板DNA含有编 码全长mpl配体(1-332)的序列。

典型PCR反应混合物包括：正向和反向引物(5pm/μl)各4μl、 1μl模板(50ng)、10μl 5×LP缓冲液(100mM N-三(羟甲基) 甲基甘氨酸)pH 8.7/25％甘油/425mM KOAc)、10μl dNTP贮存 液(dATP、dTTP、dCTP、dGTP各1mM)、0.8μl rtTh聚合酶 (Perkin Elmer；2.5U/βl)和2μl Vent聚合酶(NEB；0.01U/μl， 以1×LP缓冲液1∶100新鲜稀释的溶液)。加水使终体积为50μl。各 成分按所列顺序加入，第1循环温度升至60℃以上时，加入1μl 50mM MgOAc启动PCR。反应条件为：前2个循环：94℃，10秒/45℃，1 分钟/68℃，5分钟；再进行25个循环：94℃，10秒/55℃，1分钟/68 ℃，5分钟。

这些通用程序用来构建表6中所列的mpl配体类似物和截短物N16 到N40。各种形式的DNA序列变化也已列出。

                       表6

      有N-型碳水化合物链加入位点的MPL配体类似物

类似物/                                      序列变化

种类序号               氨基酸置换

N16      (1-183)；Tnr184→Gly332      缺失   ACA→TGA(stop codon)

N17      (1-191)；Thr192→Gly332      缺失   ACT→TAA(stop codon)

N18      His23，Arg25→Asn23，Ser25       CAC，AGA→AAC，AGC

N19      Thr37，Pro38，Val39→             ACA，CCT，GTC

         Asn37，Gly38，Ser39               →AAC，GGT，TCC

N20      Val39，Leu41→Asn39，Ser41       GTC，CTG→AAC，TCG

N21      Gln54，Glu56→Asn54，Ser56       CAG，GAG→AAT，TCG

N22      Lys52，Gln54→Asn52，Thr54       AAA，CAG→AAC，ACG

N23      Glu57→Asn55′(i)，Thr57            GAG→AAC(i)，ACG

N24      Glu57，Lys59→Asn57，Ser59       GAG，AAG→AAC，TCG

N25      Leu81，Pro83→Asn81，Thr83       CTG，CCC→AAC，ACC

N26      Thr118，Ala120→Asn118，Ser120    ACC，GCT→AAC，TCT

N27      Thr119，His121→Asn119，Ser121    ACA，CAC→AAC，AGC

N29      Pro30，Val32，Ala120，Lys122→   CCA，GTT，GCT，AAG→

         Asn30，Ser32，Asn120，Ser122     AAC，TCC，AAT，TCC

N30      Ser163，Arg164→Thr163，Asn164    AGC，AGA→ACC，AAC

N31     (1-199)；Trp200→Gly332  缺失            TGG→TGA(stop codon)

N33     Pro30，Val32，Glu57，Ala120，Lys122    CCA，GTT，GAG，GCT，AAG

                       →                                 →

        Asn30，Thr32，Asn55′(i)，Thr57         AAC，TCC，AAC(i)，ACG，

               Asn120，Thr122                         AAT，TCC

N34     Pro30，Val32，Glu57，Ser163，Arg164   CCA，GTT，GAG，AGC，AGA

                       →                                 →

        Asn30，Thr32，ASn55′(i)，Thr57，       AAC，TCC，AAC(i)，ACG，

               Thr163，ASn164                         ACC，AAC

N35     N4+N23+N30+N31(1-199)                             --

N36     Met55，Glu57→Asn55，Thr57             ATG，GAG→AAC，ACC

N37            Glu56→Asn56                           GAG→AAC

N38     Ser163，Arg164，Ser166                   AGC，AGA，TCT

        →Thr163，Asn164，Thr166                 →ACC，AAC，ACT

N39     N4+N10+N36+N38(1-174)                              --

N40     N4+N10+N36+N38+N31(1-199)                          --

上表中“(i)”表示插入的氨基酸。例如，Glu57→Asn55′(i)，Thr57 (表6中的类似物23)表示57位的Glu被Thr取代，并且，除此之外， 还有一个Asn插入55位Met和56位之间。Asn编号为55′以使后面的氨 基酸保留它们原来的编号。

包括前面实施例中所有变化的实例以“+”连接特定的类似物序号 来表示。见类似物N35、N39和N40。这些类似物的氨基酸链长度在括 号中标出。因而，类似物N35包含了类似物N4、N24、N30和N31中 产生的所有变化。N31中标出的改变表示类似物N35长为199个氨基 酸。表6中所有类似物长度均为174个氨基酸，只有已标明不同长度的 是例外(或当有氨基酸插入时总长度会增加所插入的氨基酸数)。

                     实施例15

       Mpl配体类似物和截短物N16到N40的鉴定

A.mpl配体类似物的表达水平和体外生物活性的测定

N16到N40采用电穿孔法(实施例5)或CaPO4法(哺乳动物细胞 转染试剂盒；特制培养基)转染COS细胞。3-4天后收集无细胞条件 培养基，分装成小份，在-70℃保存。按实施例7所述采用ELISA检测 法测定表达水平。按改进的实施例9的检测法检测上清的生物活性。但 对例9中方法进行一点改进。以纯化的CHO细胞表达的mpl配体1- 332为标准物制备的标准曲线计算活性。

所得结果列于表7。由表7可见，大多数mpl配体类似物有表达和 分泌。某些类似物似乎分泌有所增加。对这些样品的生物检测表明大多 数样品的特异活性与未修饰的形式相当。某些类似物含有多个N-型碳 水化合物链(见下文)。这表明碳水化合物的加入会导致类似物的分泌 增加，而体外活性正常。

                           表7 Mpl配体形式   序列          N-型链的  Elisa    体外活性   特异活性 (氨基酸长度)                 数目     (ng/ml)  (单位/ml) (单位/ng)                               (a)     (b)         (c)        (d) N1(174)    天然的             0        28       3991        143 N15(174)    N30T32N120T122    0-2      45       7003        156 N16(183)    1-183             0        85       9276        NA N17(191)    1-191             NA       ＜0.3    11          NA N18(174)    N23S25            0        2        5           2.5 N19(174)    N37G38S39         NA       ＜0.3    NA          NA N20(174)    N39S41            NA       ＜0.3    ＜10        NA N21(174)    N54S56            0-1      30       4380        146 N22(174)    N52T54            0-1      2        856         428 N23(174)    N55′(i)T57       1        11       1059        96 N24(174)    N57S59            0        5.3      458         86 N25(174)    N81T83            NA       0.22     123         559 N26(174)    N118S120          NA       0.9      96          106 N27(174)    N119S121          0        4.5      338         75 N29(174)    N30S32N120S122    0-2      15       1627        108 N30(174)    T163N164          0-1      128      15592       122 N31(199)    1-199             至少1    156      19000       122 N33(174)    4+10+23           3        78       10057       129 N34(174)    4+23+30           至少2    112      13536       120 N35(199)    34+31             4或4以上 172      13112       76 N36(174)    N55T57            0-1      48       5808        121 N37(174)    N56               1        32       4504        141 N38(174)    T163N164T166      0-1      25       3904        156 N39(174)   N4+N10+N36+N38     3到4     127      17661       139 N40(199)   N4+N10+N36+N38+N31 至少5    134      19735       147

                          注意

(a)加入的N-型链的数目根据类似物多肽在SDS凝胶中的运动性来 估计。

(b)COS细胞上清中的mpl配体类似物的量通过EIA测定。

(c)通过测定依赖mpl配体生长的32D-MPL细胞的增殖来确定体外 活性。

(d)增殖检测法测得的mpl配体类似物的体外活性与mpl配体ELISA 测得的mpl配体类似物的量的比率。

i-插入

NA：未得到

B.碳水化合物加入的测定。

使用实施例6中所述方法对表6中列出的类似物进行检测以确定其 中是否有N-型碳水化合物加入。

也用改进的方法对某些类似物(N21、N22、N30、N33和N36) 进行检测。这是必要的，因为用来进行Western印迹的单克隆抗体是用 包括氨基酸残基47到62的一种肽而产生的，表6中所列的某些类似物 (如N21)含有某些置换，因而影响它们与此抗体的免疫反应活性。因 此，为分析这些类似物，用大肠杆菌细胞表达的mpl配体1-163产生 的小鼠单克隆抗体免疫沉淀上清。

一般用15μg抗体免疫沉淀50ng mpl配体类似物。按实施例6所述 方法对免疫沉淀物进行Western印迹，但免疫沉淀带的显色是以兔抗mpl 配体多克隆抗体(通常为1μg/ml；用大肠杆菌细胞表达的mpl配体1- 163产生)和抗兔ECL试剂盒(Amersham)与印迹物一起温育。各种 试验的结果见表7。一些类似物的大小增加，表明存在N-型碳水化合 物(N21、N22、N23、N29、N30、N31、N33、N34、N35、 N36、N38、N39和N40)。这些类似物中有一些有不止1个N-型链， 如N29、N33、N34、N35、N39和N40。这些类似物以正常或更高 的水平分泌，它们的体外生物活性与mpl配体1-174相当。这表明多 功能N-型糖基化位点可以被引入mpl配体而对其表达或生物活性没有 不利影响。

为证实mpl配体上可加入多个寡糖链，COS细胞中表达的各种类似 物按实施例6中所述方法进行Western印迹分析。图12表明随着加入的 N-型糖基化位点的增加，类似物的运动性下降。图中有4个新位点的 类似物为N39和N40。N-型位点最多的类似物运动最慢。这一结果在 1-174和1-199形式的mpl配体中均可见到。这表明至少4个类似物 可以合并在一起，产生有多个N-型碳水化合物链的新类似物。

                    实施例16

            含Asn-X-Ser的糖基化位点与含

            Asn-X-Thr的糖基化位点的比较

N-型糖基化位点包括Asn-X-Thr或Asn-X-Ser，其中X可为 除Pro之外的20种天然氨基酸中的任何一种。我们想确定第三位是优选 Ser还是Thr。因此，对两套均含有mpl配体糖基化类似物、sequon的 第3位分别为Ser或Thr的类似物进行了测定以确定是否影响N-型糖 基化位点的占有百分率。N15含有2个Asn-X-Thr位点，而N29在同 一位置含有2个Asn-X-Ser。同样，N30含有一个Asn-X-Ser，而 N38在同一位置含有Asn-X-Thr。

为了比较这两套类似物，让它们在COS细胞中进行表达，分泌的 mpl配体进行Western分析，方法同实施例6中所述。图13列出了这些 结果。与N29相比，N15中糖基化mpl配体的比例显著增加。相反，对 N30和N38进行比较时，糖基化和未糖基化的mpl配体的比例相差甚小。 这些结果表明Asn-X-Ser和Asn-X-Thr均可引入mpl配体并且它们均 可作为N-型碳水化合物的加入位点。除此之外，某些情况下优选Asn- X-Thr sequon(即它可以更有效地进行糖基化)。

尽管本发明以优选实施方案的方式进行了叙述，但并不受公开的实 施方案的限制，相反，本发明意在包括所附权利要求的精神和范围之内 的各种改进和等效的方案，本发明的范围根据最广义的解释来确定，以 使其覆盖所有改进和等效的方案。

                       序列表

(1)一般信息：

  (i)申请人：Elliott，Steven G.

  (ii)发明名称：MPL配体类似物

  (iii)序列数：56

  (iv)通信地址：

     (A)联系人：AMGEN INC

     (B)街道：1840 Dehavilland Drive

     (C)城市：Thousand Oaks

     (D)州：CA

     (E)国家：USA

     (F)邮政编码：91320-1789

  (v)计算机可读形式：

     (A)介质类型：软盘

     (B)计算机：IBM PC兼容

     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

     (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30

  (vi)本申请数据：

     (A)申请号：

     (B)申请日：

     (C)分类号：

(2)SEQ ID NO：1信息

  (i)序列特征

     (A)长度：1342碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

     (A)名称/键：CDS

     (B)位置：36..1094

(ix)特征：

   (A)名称/键：信号肽

   (B)位置：1..98

(ix)特征：

   (A)名称/键：成熟肽

    (B)位置：99..1094

(xi)序列表述：SEQ ID NO：1：

CAGGGAGCCA CGCCAGCCAA GACACCCCGG CCAGA ATG GAG CTG ACT GAA TTG     53

                                       Met Glu Leu Thr Glu Leu

                                       -21 -20

CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACT GCA AGG CTA ACG CTG TCC AGC    101

Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser

15                  -10                 -5                  1

CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT    149

Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg

            5                   10                  15

GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC    197

Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His

        20                  25                  30

CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA    245

Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly

    35                  40                  45

GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA    293

Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly

50                  55                  60                  65

GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG    341

Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu

                70                  75                  80

GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC    389

Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val

            85                  90                  95

CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT    437

Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro

        100                 105                 110

CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG    485

Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu

    115                 120                 125

AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA    533

Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val

130                 135                 140                 145

GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC    581

Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val

                150                 155                 160

CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACA CTG AAC GAG CTC CCA AAC AGG        629

Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu Asn Glu Leu Pro Asn Arg

            165                 170                 175

ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTC ACT GCC TCA GCC AGA ACT ACT        677

Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr Ala Ser Ala Arg Thr Thr

        180                 185                 190

GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAG GGA TTC AGA GCC AAG ATT CCT        725

Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly Phe Arg Ala Lys Ile Pro

    195                 200                 205

GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCC CTG GAC CAA ATC CCC GGA TAC        773

Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu Asp Gln Ile Pro Gly Tyr

210                 215                 220                 225

CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AAT GGA ACT CGT GGA CTC TTT CCT        821

Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly Thr Arg Gly Leu Phe Pro

                230                 235                 240

GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCC CCG GAC ATT TCC TCA GGA ACA        869

Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro Asp Ile Ser Ser Gly Thr

            245                 250                 255

TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AAC CTC CAG CCT GGA TAT TCT CCT        917

Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu Gln Pro Gly Tyr Ser Pro

        260                 265                 270

TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAG TAT ACG CTC TTC CCT CTT CCA        965

Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr Thr Leu Phe Pro Leu Pro

    275                 280                 285

CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAG CTC CAC CCC CTG CTT CCT GAC       1013

Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu His Pro Leu Leu Pro Asp

290                 295                 300                 305

CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACC AGC CCT CTT CTA AAC ACA TCC       1061

Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser Pro Leu Leu Asn Thr Ser

                310                 315                 320

TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAG GAA GGG TAAGGTTCTC AGACACTGCC     1114

Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu Gly

            325                 330

GACATCAGCA TTGTCTCGTG TACAGCTCCC TTCCCTGCAG GGCGCCCCTG GGAGACAACT     1174

GGACAAGATT TCCTACTTTC TCCTGAAACC CAAAGCCCTG GTAAAAGGGA TACACAGGAC     1234

TGAAAAGGGA ATCATTTTTC ACTGTACATT ATAAACCTTC AGAAGCTATT TTTTTAAGCT     1294

ATCAGCAATA CTCATCAGAG CAGCTAGCTC TTTGGTCTAT TTTCTGCA                  1342

(2)SEQ ID NO：2信息

  (i)序列特征

    (A)长度：353氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：蛋白质

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：2：

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20                 -15                 -10

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

 5              1                   5                   10

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

            15                  20                  25

Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

        30                  35                  40

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys

    45                  50                  55

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

60                  65                  70                  75

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

                80                  85                  90

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu

            95                  100                 105

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

        110                 115                 120

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val

    125                 130                 135

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

140                 145                 150                 155

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

                160                 165                 170

Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn Phe Thr

            175                 180                 185

Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln Gln Gly

        190                 195                 200

Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg Ser Leu

    205                 210                 215

Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu Asn Gly

220                 225                 230                 235

Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly Ala Pro

                240                 245                 250

Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro Asn Leu

            255                 260                 265

Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly Gln Tyr

        270                 275                 280

Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val Gln Leu

    285                 290                 295

His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro Thr Ser

300                 305                 310                 315

Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser Gln Glu

                320                 325                 330

Gly

(2)SEQ ID NO：3信息

  (i)序列特征

    (A)长度：600碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

    (A)名称/键：CDS

    (B)位置：12..596

  (ix)特征：

    (A)名称/键：信号肽

    (B)位置：12..74

  (ix)特征：

    (A)名称/键：成熟肽

    (B)位置：75..96

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：3：

TCTAGACCAC C ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC        50

             Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu

             -21 -20                 -15                 -10

CTA ACT GCAAGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC          98

Leu Thr Ala Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp

                5                   1               5

CTC CGA GTC CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAC GTC CTT CAC AGC         146

Leu Arg Val Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Vai Leu His Ser

       10                  15                  20

AGA CTG AGC CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG         194

Arg Leu Ser Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu

25                  30                  35                  40

CTG CCT GCT GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG         242

Leu Pro Ala Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu

                45                  50                  55

GAG ACC AAG GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG         291

Glu Thr Lys Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu

            60                  65                  70

GGA GTG ATG GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC         331

Gly Val Met Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser

        75                  80                  85

CTC CTG GGG CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG         386

Leu Leu Gly Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu

    90                  95                  100

CAG AGC CTC CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT         434

Gln Ser Leu Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala

105                 110                 115                 120

CAC AAG GAT CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA         482

His Lys Asp Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg

                125                 130                 135

GGA AAG GTG CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC         530

Gly Lys Val Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val

            140                 145                 150

AGG CGG GCC CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC         578

Arg Arg Ala Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val

        155                 160                 165

CTC ACA CTG AAC GAG CTC TAGG                                            600

Leu Thr Leu Asn Glu Leu

    170

(2)SEQ ID NO：4信息

  (i)序列特征

    (A)长度：195氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：蛋白质

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：4：

Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu Thr Ala

-21 -20                 -15                 -10

Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu Arg Val

 5                   1               5                  10

Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg Leu Ser

            15                  20                  25

Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu Pro Ala

        30                  35                  40    

Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu Thr Lys

    45                  50                  55

Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly Val Met

60                  65                  70                  75

Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu Leu Gly

                80                  85                  90

Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln Ser Leu

            95                  100                 105

Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His Lys Asp

        110                 115                 120

Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly Lys Val

    125                 130                 135

Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg Arg Ala

140                 145                 150                 155

Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu Thr Leu

                160                 165                 170

Asn Glu Leu

(2)SEQ ID NO：5信息

  (i)序列特征

    (A)长度：22碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：5：

CCCATGTCAA TCACAGCAGA CT                                                    22

(2)SEQ ID NO：6信息

  (i)序列特征

    (A)长度：22碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：6：

CTTCACAGCA ACCTGAGCCA GT                                                  22

(2)SEQ ID NO：7信息

  (i)序列特征

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：7：

CAGTGCAACG AGACCCACCC TTTG                                         24

(2)SEQ ID NO：8信息

  (i)序列特征

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：8：

GCCTACAAAT GTCACGCTGC CTGCT                                                25

(2)SEQ ID NO：9信息

  (i)序列特征

    (A)长度：21碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：9：

CCCACTTGTA ACTCATCCCT C                                                    21

(2)SEQ ID NO：10信息

  (i)序列特征

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：10：

CAACTGAACG CCACTTGTCT CTCA                                                 24

(2)SEQ ID NO：11信息

  (i)序列特征

    (A)长度：26碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：11：

ACTTGTCTCA ACTCCACCCT GGGGGA                                        26

(2)SEQ ID NO：12信息

  (i)序列特征

    (A)长度：21碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desC＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：12：

CTCCTGGGGA ACCTTTCTGG A                                                   21

(2)SEQ ID NO：13信息

  (i)序列特征

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：13：

GACCACAAAT CACACCGATC CCAAT                                                 25

(2)SEQ ID NO：14信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：14：

ACCCTTTGTC TACAAATGTC ACGCTGCCTG CT                                        32

(2)SEQ ID NO：15信息

  (i)序列特征

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：15：

TCTCTCAAAC CTCACGGGGG AGCTT                                                 25

(2)SEQ ID NO：16信息

  (i)序列特征

    (A)长度：23碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：16：

TGGAAAAATC AGACGGAGGA GAC                                                   23

(2)SEQ ID NO：17信息

  (i)序列特征

    (A)长度：25碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：17：

TGGAGGAGAA CAAGACACAG GACAT                                                 25

(2)SEQ ID NO：18信息

  (i)序列特征

    (A)长度：38碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：18：

CCCTCTAGAC CACCATGGAA CTGACTGAAT TGCTCCTC                                   38

(2)SEQ ID NO：19信息

  (i)序列特征

    (A)长度：28碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..28)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：19：

GTGTGACTTG CTCGAGACTC AGCTGCCC                                        28

(2)SEQ ID NO：20信息

  (i)序列特征

    (A)长度：29碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..29)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：20：

GAAGACCTAA CAACCTCACT CAGCTGCCC                                       29

(2)SEQ ID NO：21信息

  (i)序列特征

    (A)长度：29碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..29)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：21：

AGTGACGGAG TCGGTCTATT CAGCTGCCC                                      29

(2)SEQ ID NO：22信息

  (i)序列特征

    (A)长度：29碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：22：

CACGTCCTTA ACAGCAGCCT GAGCCAGTG                                      29

(2)SEQ ID NO：23信息

  (i)序列特征

    (A)长度：29碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..29)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：23：

GTGCAGGAAT TGTCGTCGGA CTCGGTCAC                                             29

(2)SEQ ID NO：24信息

  (i)序列特征

    (A)长度：33碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：24：

CCCTTTGCCT AACGGTTCCC TGCTGCCTGC TGT                                        33

(2)SEQ ID NO：25信息

  (i)序列特征

    (A)长度：33碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..33)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：25：

GGGAAACGGA TTGCCAAGGG ACGACGGACG ACA                                        33

(2)SEQ ID NO：26信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：26：

TGCCTACACC TAACCTGTCG CCTGCTGTGG A                                          31

(2)SEQ ID NO：27信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：27：

ACGGATGTGG ATTGGACAGC GGACGACACC T                                          31

(2)SEQ ID NO：28信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：28：

GGAAACCAA TATGTCGGAG ACCAAGGCAC A                                           31

(2)SEQ ID NO：29信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：29：

CCTTTTGGTT ATACAGCCTC TGGTTCCGTG T                                          31

(2)SEQ ID NO：30信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：30：

TGGGAGAATG GAACACCACG ATGGAGGAGA CC                                         32

(2)SEQ ID NO：31信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：  -

    (B)位置：互补(1..32)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：31：

ACCCTCTTAC CTTGTGGTGC TACCTCCTCT GG                                      32

(2)SEQ ID NO：32信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：32：

AAAACCCAGA TGAACGAGAC GACCAAGGCA CA                                      32

4(2)SEQ ID NO：33信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..32)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：33：

TTTTGGGTCT ACTTGCTCTG CTGGTTCCGT GT                                        32

(2)SEQ ID NO：34信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：34：

CCCAGATGGA GAACACCTCG GCACAGGACA T                                         31

(2)SEQ ID NO： 35信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：35：

GGGTCTACCT CTTGTGGAGC CGTGTCCTGT A                                         31

(2)SEQ ID NO：36信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：36：

CACGGGGACA AAACGGAACC ACTTGCCTCT CA                                        32

(2)SEQ ID NO：37信息

  (i)序列特征

    (A)长度：32碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..32)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：37：

GTGCCCCTGT TTTGCCTTGG TGAACGGAGA GT                                        32

(2)SEQ ID NO：38信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：38：

CAGGGCAGGA ACACATCTCA CAAGGATCCC A                                         31

(2)SEQ ID NO：39信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：39：

GTCCCGTCCT TGTGTAGAGT GTTCCTAGGG T                                         31

(2)SEQ ID NO：40信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：40：

GGGCAGGACC AACGCTAGCA AGGATCCCAA T                                         31

(2)SEQ ID NO：41信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：41：

CCCGTCCTGG TTGCGATCGT TCCTAGGGTT A                                         31

(2)SEQ ID NO：42信息

  (i)序列特征

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：42：

CAGTGCAACG AGTCCCACCC TTGG                                                 24

(2)SEQ ID NO：43信息

  (i)序列特征

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..24)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：43：

GTCACGTTGC TCAGGGTGGG AAAC                                                 24

(2)SEQ ID NO：44信息

  (i)序列特征

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：44：

GACCACAAAT CACTCCGATC CCAA                                                 24

(2)SEQ ID NO：45信息

  (i)序列特征

    (A)长度：24碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..24)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：45：

CTGGTGTTTA GTGAGGCTAG GGTT                                                 24

(2)SEQ ID NO：46信息

  (i)序列特征

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：46：

GTCCCCACCA ACACCTCTCT AGTCCTC                                              27

(2)SEQ ID NO：47信息

  (i)序列特征

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..27)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：47：

CAGGGGTGGT TGTGGAGAGA TCAGGAG                                              27

(2)SEQ ID NO：48信息

  (i)序列特征

    (A)长度：33碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..33)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：48：

TGACCGAGAC CCGAAGACTT CACTCAGCTG CCC                                       33

(2)SEQ ID NO：49信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：49：

GAAAACCCAG AACGAGACCA CCAAGGCACA G                                         31

(2)SEQ ID NO：50信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：50：

CTTTTGGGTC TTGCTCTGGT GGTTCCGTGT C                                         31

(2)SEQ ID NO：51信息

  (i)序列特征

    (A)长度：26碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：51：

CACCAAGGCA CAGGACATTC TGGGAG                                               26

(2)SEQ ID NO：52信息

  (i)序列特征

    (A)长度：26碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..26)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：52：

GTGGTTCCGT GTCCTGTAAG ACCCTC.                                              26

(2)SEQ ID NO：53信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：53：

GAAAACCCAG ATGAACGAGA CCAAGGCACA G                                         31

(2)SEQ ID NO：54信息

  (i)序列特征

    (A)长度：31碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..31)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：54：

CTTTTGGGTC TACTTGCTCT GGTTCCGTGT C                                         31

(2)SEQ ID NO：55信息

  (i)序列特征

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：55：

GTCCCCACCA ACACCACTCT AGTCCTC                                              27

(2)SEQ ID NO：56信息

  (i)序列特征

    (A)长度：27碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑形状：线状

  (ii)分子类型：其它核酸

    (A)表述：/desc＝“核酸”

  (ix)特征：

    (A)名称/键：-

    (B)位置：互补(1..27)

  (xi)序列表述：SEQ ID NO：56：

CAGGGGTGGT TGTGGTGAGA TCAGGAG                                         27