鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物与方法
阅读：636发布：2023-02-14
专利汇可以提供鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物与方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了鉴定番茄品种真实性和 种子 纯度的成套引物与方法。本发明公开的鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物的48对引物的序列依次如 序列表 中序列1‑96所示，序列2n与序列2n‑1组成一个引物对，n为1‑24中的一个自然数；鉴定番茄品种真实性和种子纯度的方法包括利用本发明的成套引物对待测番茄DNA进行PCR扩增，根据待测番茄PCR产物的差异确定待测番茄的品种真实性和种子纯度。实验证明本发明的成套引物不仅可以用来鉴定番茄品种真实性，还可以鉴定番茄的种子纯度，且具有准确性高、结果稳定、不受环境条件及发育时期的影响、统计简便等优势。，下面是鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物与方法专利的具体信息内容。
1.鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物为成套引物1和成套引物2，所述成套引物1由Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13和Sol_SSR96的引物组成；
所述成套引物2由Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300组成；
所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR308、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR315、所述Sol_SSR69、所述Sol_SSR266、所述Sol_SSR317、所述Sol_SSR283、所述Sol_SSR321和所述Sol_SSR300的两条引物的序列依次为序列表中序列1-96所示的96条序列；
其中序列表中序列2n与序列2n-1组成一个引物对，n为1-24中的一个自然数。
2.根据权利要求1所述的成套引物，其特征在于：所述成套引物中的各引物对均由荧光物质标记。
3.根据权利要求2所述的成套引物，其特征在于：所述荧光物质为FAM、NED、PET或VIC。
4.鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法，包括：利用权利要求1-3中任一所述成套引物对两个或两个以上待测番茄基因组DNA 进行PCR扩增，分别得到各待测番茄的PCR产物；
根据各待测番茄的PCR产物的差异确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种。
5.鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法，包括：利用权利要求1-3中任一所述成套引物对待测番茄样品基因组DNA 进行PCR扩增，分别得到各待测番茄样品的PCR产物；根据所述待测番茄样品间PCR产物的差异确定所述待测番茄样品的种子纯度。
6.鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度的系统，包括权利要求1-3中任一所述成套引物。
7.权利要求1-3中任一所述成套引物在下述X1）-X5）中任一种中的应用：
X1）在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
X2）在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
X3）在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
X4）在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
X5）在番茄育种中的应用。
8.权利要求6所述系统在下述X1）-X5）中任一种中的应用：
X1）在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
X2）在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
X3）在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
X4）在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
X5）在番茄育种中的应用。
9.番茄SSR指纹图谱构建方法，包括利用权利要求1-3中任一所述成套引物对供试番茄DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物构建供试番茄的SSR指纹图谱。
10.权利要求9所述方法在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度中的应用。
鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物与方法
技术领域
背景技术
[0002] 番茄(Lycopersicon esculentum L.)是世界上重要的蔬菜作物之一，具有极高的营养价值。由于番茄及其制品的独特食用、保健及辅助治疗的功效，在世界农业生产和贸易中占有重要的地位。根据世界加工番茄理事会(WPTC)发布的统计数据：2013年全球加工番茄产量为3,301.2万吨。伴随着我国番茄种业的优势发展，市场上出现了一些套牌品种，以次充好，影响了种植户的产量和收入；甚至人非法盗取育种材料进行繁种，严重影响了我国育种单位的利益及我国番茄种业的健康发展，因此，优良番茄品种真实性的快速、准确鉴定以服务于种子执法单位的监管检测及育种单位种子质量内部控制，成为番茄生产中迫切需要解决的问题之一。
[0003] 传统鉴定番茄品种真实性的方法主要有形态学田间小区鉴定法。田间小区鉴定方法主要是对番茄的子叶、叶片、第一束花的形成时间和果实的颜色、果实室数、果实表面构造和抗病特性等主要园艺性状进行鉴别，从而判断品种真实性及种子纯度(吕书文,李海涛,许文奎,王永成,金秀玲(2004)浅谈利用苗期标志性状检测番茄杂交种的纯度.种子23(4):74-75.)。这种方法较费时、费工，占用大量的土地，需要经过3-5个月的生长成熟期；有时可用于品种鉴定的形态特征数目有限，且多数形态性状易受环境因素的影响，所以仅靠形态特征来鉴别品种真实性及种子纯度的准确率会受到影响。快速测定法中有一些是生化技术，特别是聚丙烯酰胺电泳法，用于检测种子中贮藏蛋白和同工酶遗传组成的差异，是目前使用较多的室内检测方法。用于番茄品种纯度鉴定的同工酶主要有POD，EST，ACP，ADH，MDH等，但由于栽培番茄遗传变异小、多态性较低、可利用的酶种类少，且酶的表达量与组织发育状况及发育时期有关，难以用于一些F1代杂种的品种鉴定与纯度检测。
[0004] 以DNA为基础的分子标记如RFLP、RAPD、SSR、AFLP与ISSR等，具有检测位点数量多、多态性高、遗传稳定、不受环境条件影响等优点，已开始应用于蔬菜作物品种真实性鉴定与纯度检测中。SSR(Simple Sequence Repeat)标记是近年来发展起来的一种新型分子标记，属于显性标记，在基因组中分布平均、多态性高、实验程序简单而逐渐被重视，与其他分子标记(RFLP、RAPD、AFLP等)相比，具有所需样品DNA量少、结果准确、操作简便、易于推广等特点，已在许多农作物遗传连锁图谱的构建、遗传多样性研究、标记和定位基因以及分子标记辅助选择等方面得到广泛应用。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是如何鉴定番茄品种真实性与种子纯度。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明首先提供了鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物。
[0007] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物为成套引物1和/或成套引物2，所述成套引物1为名称分别为Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13和Sol_SSR96的引物对中的至少一种；
[0008] 所述成套引物2为名称分别为Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300的引物对中的至少一种；
[0009] 所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR308、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR315、所述Sol_SSR69、所述Sol_SSR266、所述Sol_SSR317、所述Sol_SSR283、所述Sol_SSR321和所述Sol_SSR300的两条引物的序列依次为如下c1)、c2)、c3)或c4)：
[0011] c2)在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的96条序列；
[0012] c3)与c1)或c2)限定的序列具有85％以上的同一性的序列；
[0013] c4)在严格条件下与c1)或c2)限定的序列杂交的序列；
[0014] 其中序列表中序列2n与序列2n-1组成一个引物对(表1)，序列2n为下游引物，序列2n-1为上游引物，n为1-24中的一个自然数。序列表中序列1-96中，各序列的第1位均为相应引物的5’端。
[0015] c2)所述在c1)的5′端和/或3′端添加一个或几个核苷酸得到的序列为在序列表中序列1-96所示的96条序列中的至少一条的5′端和/或3′端添加一至十个核苷酸得到的序列。
[0016] 这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的序列1-96所示的96条序列中的至少一条的核苷酸序列具有85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
[0017] 所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。
[0018] 上述85％以上同一性，可为85％、90％或95％以上的同一性。
[0019] 上述成套引物中的各引物对均可由荧光物质标记。所述荧光物质具体可为FAM(如6-FAM)、NED、PET或VIC。所述荧光物质具体均可标记在各引物对上游引物的5’端。
[0020] 在本发明的实施例中，所述Sol_SSR19、所述Sol_SSR120、所述Sol_SSR125、所述Sol_SSR101、所述Sol_SSR225、所述Sol_SSR68、所述Sol_SSR190、所述Sol_SSR304、所述Sol_SSR23、所述Sol_SSR313、所述Sol_SSR239、所述Sol_SSR266和所述Sol_SSR321均由6-FAM标记；
[0021] 所述Sol_SSR3、所述Sol_SSR146、所述Sol_SSR117、所述Sol_SSR184、所述Sol_SSR272、所述Sol_SSR96、所述Sol_SSR24、所述Sol_SSR201、所述Sol_SSR126、所述Sol_SSR224、所述Sol_SSR315和所述Sol_SSR283均由NED标记；
[0022] 所述Sol_SSR305、所述Sol_SSR132、所述Sol_SSR110、所述Sol_SSR233、所述Sol_SSR254、所述Sol_SSR318、所述Sol_SSR302、所述Sol_SSR148、所述Sol_SSR76、所述Sol_SSR308和所述Sol_SSR300均由PET标记；
[0023] 所述Sol_SSR18、所述Sol_SSR218、所述Sol_SSR97、所述Sol_SSR185、所述Sol_SSR169、所述Sol_SSR13、所述Sol_SSR303、所述Sol_SSR45、所述Sol_SSR306、所述Sol_SSR312、所述Sol_SSR69和所述Sol_SSR317均由VIC标记。
[0024] 上述成套引物中的各对引物可以单独使用分别进行单独的PCR扩增。各对引物单独使用时，这引物对间的配比没有要求。每种引物对中的两条单链DNA的摩尔比均可为1：1。
[0025] 所述成套引物中的各引物对均可独立包装，各单链DNA也均可独立包装。
[0026] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法。
[0027] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法，包括：利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对两个或两个以上待测番茄基因组DNA进行PCR扩增，分别得到各待测番茄的PCR产物；根据各待测番茄的PCR产物的差异确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种。
[0028] 上述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法中，所述差异具体是指各待测番茄的各个引物对的PCR产物中DNA片段个数和/或长度在不同待测番茄间的差异。所述差异可通过DNA分析仪和/或DNA分析软件和/或模块进行确定。所述DNA分析仪具体可为ABI 3730xl DNA分析仪。所述DNA分析软件可为GENEMAPPER。
[0029] 上述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法中，确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种的具体方法可为：在两个待测番茄的所述番茄SSR引物对的PCR产物中，如两个待测番茄的PCR产物的差异个数≥2，这两个待测番茄为“不同品种”；如两个待测番茄的PCR产物的差异个数＝1，这两个待测番茄为“近似品种”；如两个待测番茄的PCR产物的差异个数＝0，这两个待测番茄为“极近似或相同品种”。
[0030] 对利用48对SSR引物仍未检测到≥2个差异位点数的待测番茄，如果相关品种存在特定标记，必要时增加其特定标记进行检测。
[0031] 上述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的方法中，利用每个引物对进行PCR扩增的反应体系中各引物对的上下游引物在反应体系中的浓度均可为10pM。利用每个引物对进行PCR扩增的退火温度均可为56℃。
[0032] 利用每个引物对进行PCR扩增的10μL反应体系均可为：2×Taq PCR Mix 5μL，上下游引物(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM)，待测DNA样品，补水到终体积为10μL。其中2×Taq PCR Mix具体可为北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0718M。
[0033] 利用每个引物对进行PCR扩增的反应条件均可为：95℃预变性5min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0034] 在利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物鉴定番茄品种真实性时，可先利用所述成套引物1进行鉴定，并按照上述确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种的方法确定待测番茄样品是否为同一品种；在利用所述成套引物1鉴定的结果为“近似品种”或“极近似或相同品种”时，再利用所述成套引物2进行进一步检测，并按照上述确定所述两个或两个以上待测番茄是否为同一品种的方法最终确定待测番茄样品是否为同一品种。在仅利用所述成套引物1进行检测时，利用所述成套引物1得到的结果即为最后结果，在先后利用所述成套引物1和所述成套引物2进行检测时，利用所述成套引物2得到的结果即为最终结果。
[0035] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法。
[0036] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法，包括：利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对待测番茄样品基因组DNA进行PCR扩增，分别得到各待测番茄样品的PCR产物；根据所述待测番茄样品间PCR产物的差异确定所述待测番茄样品的种子纯度。
[0037] 所述根据所述待测番茄样品间PCR产物的差异确定所述待测番茄样品的种子纯度具体可为根据公式1和公式2计算待测番茄种子纯度；
[0038] 种子纯度p＝(NT-ND)/NT×100％(公式1)，其中p表示利用一对番茄SSR引物对得到的种子纯度，所述番茄SSR引物对为所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物中的引物对，NT表示供检种子数目，ND表示利用一对番茄SSR引物对得到的杂种子数目；
[0039] 种子纯度P＝利用所用的所述番茄SSR引物对得到的种子纯度之和/n(公式2)，其中n表示所用的所述番茄SSR引物对数目。
[0040] 上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中，所述待测番茄样品的样品数可大于等于10，如大于等于94。
[0041] 上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中，所述差异具体是指各待测番茄样品的各个引物对的PCR产物中DNA片段个数和/或长度在不同待测番茄样品间的差异。所述差异可通过DNA分析仪和/或DNA分析软件和/或模块进行确定。所述DNA分析仪具体可为ABI 3730xl DNA分析仪。所述DNA分析软件可为GENEMAPPER。
[0042] 上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中，利用每个引物对进行PCR扩增的反应体系中各引物对的上下游引物在反应体系中的浓度均可为10pM。利用每个引物对进行PCR扩增的退火温度均可为56℃。
[0043] 利用每个引物对进行PCR扩增的10μL反应体系均可为：2×Taq PCR Mix 5μL，上下游引物(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM)，待测DNA样品，补水到终体积为10μL。其中2×Taq PCR Mix具体可为北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0718M。
[0044] 利用每个引物对进行PCR扩增的反应条件均可为：95℃预变性5min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0045] 上述鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度的方法中，再利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物鉴定种子纯度时，可先利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对待测样本进行测试选出有利于鉴定所述待测样本种子纯度的引物对，选出的引物对可为1-48对，利用选出的引物对进行进一步的检测。
[0046] 为解决上述技术问题，本发明还提供了鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度的系统。
[0047] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度的系统，包括所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物。
[0048] 所述系统可仅为鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物，也可由所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物与进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器组成，也可由所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物与进行DNA分析所需的仪器和/或软件和/或模块组成，也可由所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物与所述进行PCR扩增所需的试剂和/或仪器以及所述进行DNA分析所需的仪器和/或软件和/或模块组成。所述进行PCR扩增所需的试剂可为2×Taq PCR Mix，2×Taq PCR Mix可为北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0718M。所述进行PCR扩增所需的仪器可为PCR仪。所述进行DNA分析所需的仪器可为DNA分析仪，如ABI 3730xl DNA分析仪。所述进行DNA分析所需的软件可为GENEMAPPER。
[0049] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物在下述X1)-X5)中任一种中的应用：
[0050] X1)在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
[0051] X2)在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
[0052] X3)在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
[0053] X4)在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
[0054] X5)在番茄育种中的应用。
[0055] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述系统在下述X1)-X5)中任一种中的应用：
[0056] X1)在制备鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性产品中的应用；
[0057] X2)在制备鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度产品中的应用；
[0058] X3)在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性中的应用；
[0059] X4)在鉴定或辅助鉴定番茄种子纯度中的应用；
[0060] X5)在番茄育种中的应用。
[0061] 为解决上述技术问题，本发明还提供了番茄SSR指纹图谱构建方法。
[0062] 本发明所提供的番茄SSR指纹图谱构建方法，包括利用所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物对供试番茄DNA进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；检测所述PCR扩增产物构建供试番茄的SSR指纹图谱。
[0063] 上述番茄SSR指纹图谱构建方法中，所述检测所述PCR扩增产物可通过DNA分析仪和/或DNA分析软件进行检测。所述DNA分析仪具体可为ABI 3730xl DNA分析仪。所述DNA分析软件具体可为GENEMAPPER。
[0064] 上述番茄SSR指纹图谱构建方法中，利用所述DNA分析仪进行检测可包括：将不同荧光物质标记的PCR产物分别进行稀释混合后再利用所述DNA分析仪进行电泳。其中，6-FAM(蓝色)和VIC(绿色)荧光标记的PCR产物均可稀释30倍，NED(黑色)和PET(红色)荧光标记的PCR产物均可稀释10倍。各稀释后的PCR产物可等体积混合。利用所述DNA分析仪进行电泳前还可包括将稀释混合得到的液体95℃变性5min然后于冰上冷却10min。
[0065] 上述番茄SSR指纹图谱构建方法中，利用每个引物对进行PCR扩增的反应体系中各引物对的上下游引物在反应体系中的浓度均可为10pM。利用每个引物对进行PCR扩增的退火温度均可为56℃。
[0066] 利用每个引物对进行PCR扩增的10μL反应体系均可为：2×Taq PCR Mix 5μL，上下游引物(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM)，待测DNA样品，补水到终体积为10μL。其中2×Taq PCR Mix具体可为北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0718M。
[0067] 利用每个引物对进行PCR扩增的反应条件均可为：95℃预变性5min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0068] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述番茄SSR指纹图谱构建方法在鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性或种子纯度中的应用。
[0069] 为解决上述技术问题，本发明还提供了所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物或所述系统的制备方法。
[0070] 本发明所提供的所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物或所述系统的制备方法，包括A1)或A2)：
[0071] A1)将所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物中各单链DNA单独包装；
[0072] A2)将所述鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物中各单链DNA包装在一起。
[0073] 实验证明，本发明的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物不仅可以用来鉴定番茄品种真实性，还可以鉴定番茄的种子纯度，且具有准确性高、结果稳定、不受环境条件及发育时期的影响、统计简便等优势。本发明还建立了番茄SSR指纹图谱及品种真实性鉴定方法与种子纯度鉴定，用于番茄品种真实性的鉴定和种子纯度的鉴定。利用本发明的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和/或种子纯度的成套引物在鉴定种子纯度时，不仅可以鉴定同一父母本的杂交后代的纯度，还可以从一批种子中检测是否纯在杂种子及该批种子的纯度。
[0074] 本发明立足于我国番茄育种产业发展，建立了精确、快速、高通量和高度自动化的基于SSR标记的番茄品种真实性鉴定及种子纯度鉴定技术体系，为保护我国番茄育种单位产权利益、维护我国番茄育种产业健康快速发展提供技术支撑，对规范、监管种子市场、保护种植户的产量和收入具有重要的现实意义。附图说明
[0075] 图1为100份番茄品种的聚类分析结果。
具体实施方式
[0076] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
[0077] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
[0078] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0079] 实施例1、鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物的制备[0080] 本发明所提供的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物为成套引物1和成套引物2，成套引物1为名称分别为Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13和Sol_SSR96的24对引物；成套引物2为名称分别为Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300的24对引物。
[0081] 每对引物的上游引物的5’端均由荧光物质标记，每对引物对的序列及标记的荧光物质如表1所示，其中序列表中序列2n与序列2n-1组成一个引物对，序列2n为下游引物，序列2n-1为上游引物，n为1-24中的一个自然数。
[0082] 鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物中的成套引物1和成套引物2均独立包装，成套引物1中的各单链DNA均独立包装，成套引物2中的各单链DNA均独立包装。
[0083] 表1、鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物
[0084]
[0085]
[0086] 实施例2、利用鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物进行番茄品种真实性鉴定
[0087] (1)构建图谱的番茄材料由北京农林科学院蔬菜中心李常保老师提供，从402份材料中，随机选取100份品种材料(表2)。所选杂交种如表3所示。
[0088] 表2、100份供试番茄品种
[0089]
[0090]
[0091] 表3、12份代表性番茄杂交品种材料
[0092]品种名称 类别 特征性状 备注
京番104 大粉 粉色超大果类 杂交种
京番203 大粉 粉色中大果类 杂交种
京番501 大红 红色中大果类 杂交种
京番601 大红 红色大果类 杂交种
京番701 大黄 黄色大果类 杂交种
京番彩星1号 小彩 黑彩色短椭圆樱桃类 杂交种
京番红罗1号 小红 红色罗曼型樱桃类 杂交种
京番黄星1号 小黄 黄色长椭圆樱桃类 杂交种
京番绿星1号 小绿 绿色正圆型樱桃类 杂交种
京番紫星1号 小紫 紫色正圆樱桃类 杂交种
京番相思豆 小红 红色迷你超小果樱桃类 杂交种
京番中彩1 绿彩 绿彩条纹中等果类 杂交种
京番104 大粉 粉色超大果类 杂交种
京番203 大粉 粉色中大果类 杂交种
京番501 大红 红色中大果类 杂交种
京番601 大红 红色大果类 杂交种
京番701 大黄 黄色大果类 杂交种
京番彩星1号 小彩 黑彩色短椭圆樱桃类 杂交种
京番红罗1号 小红 红色罗曼型樱桃类 杂交种
京番黄星1号 小黄 黄色长椭圆樱桃类 杂交种
京番绿星1号 小绿 绿色正圆型樱桃类 杂交种
京番紫星1号 小紫 紫色正圆樱桃类 杂交种
京番相思豆 小红 红色迷你超小果樱桃类 杂交种
京番中彩1 绿彩 绿彩条纹中等果类 杂交种
[0093] (2)提取供试番茄品种的DNA
[0094] 采用CTAB法提取供试品种的DNA：取番茄幼叶20mg～30mg至2.0mL离心管中，研磨机中研磨10min；加入750μL预热的CTAB提取液后，充分摇匀，65℃水浴45min；加入750μL氯仿，上下混匀3min，12000g离心5min；吸取500μL上清液至另一只2.0mL离心管中，加入0.7倍体积预冷的异丙醇，颠倒离心管数次，12000g离心10min，弃上清液；加入75％乙醇漂洗2次，离心后弃上清液，自然风干；加入100μL 1.0×TE缓冲液，充分溶解后得到供试番茄品种DNA，4℃保存备用。
[0095] 其中，CTAB提取液的配制方法为：称取20g CTAB和81.816g NaCl溶于适量水中，然后加入1mol/L Tris-HCl(pH＝8.0)100mL，0.5mol/L EDTA溶液(pH＝8.0)40mL，定容至1000mL，在103.4kPa(121℃)条件下灭菌20min。于4℃贮存。
[0096] (3)PCR扩增
[0097] 用实施例1的成套引物1中的每对引物分别对供试番茄品种DNA进行单重PCR扩增，每个引物对的PCR扩增均采用如下10μL的反应体系：2×Taq PCR Mix(北京康为世纪生物科技有限公司产品，货号为CW0718M)5μL，上下游引物各0.04μL(上下游引物在反应体系中的浓度均为10pM)，浓度为50ng/μL的供试番茄品种DNA 1μL，补水到终体积为10μL。
[0098] 每个引物对的PCR扩增的条件均为：95℃预变性5min；95℃变性40s，56℃退火30s，72℃延伸45s，共35个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
[0099] (4)PCR产物检测：
[0100] 每种供试番茄品种DNA的PCR产物均按照如下方法经ABI 3730xl DNA分析仪进行检测：首先将6-FAM(蓝色)和VIC(绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，NED(黑色)和PET(红色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液；吸取1μL混合液加入到ABI 3730xl DNA分析仪专用96深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出后立即置于冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到ABI 3730xlDNA分析仪上进行电泳，用GENEMAPPER进行图像分析及数据采集。
[0101] (5)数据记录：
[0102] 将每一位点的待测样品间的扩增片段的带型(即PCR产物电泳条带数目)和移动位置(即PCR产物电泳条带大小)进行比较，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X，Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0；多个位点的数据整合在一起形成不同番茄品种的SSR指纹图谱库。
[0103] 将成套引物1替换为成套引物2，按照步骤(3)-(5)的方法进行PCR扩增、检测及数据记录，最终得到的本发明的100份番茄品种的SSR指纹数据如表4所示。
[0104] 表4、100份番茄品种的指纹数据(1)
[0105]
[0106]
[0107]
[0108] 表4、100份番茄品种的指纹数据(2)
[0109]
[0110]
[0111] 表4、100份番茄品种的指纹数据(3)
[0112]
[0113]
[0114] 表4、100份番茄品种的指纹数据(4)
[0115]
[0116]
[0117]
[0118] 表4、100份番茄品种的指纹数据(5)
[0119]
[0120]
[0121]
[0122] 注：表4的100份番茄品种的指纹数据(1)-(5)中，SSR19、SSR120、SSR305、SSR18、SSR132、SSR3、SSR110、SSR146、SSR125、SSR117、SSR101、SSR218、SSR225、SSR97、SSR185、SSR233、SSR184、SSR254、SSR318、SSR272、SSR68、SSR169、SSR13、SSR96、SSR190、SSR303、SSR302、SSR148、SSR304、SSR45、SSR24、SSR76、SSR306、SSR308、SSR201、SSR23、SSR126、SSR312、SSR224、SSR313、SSR239、SSR315、SSR69、SSR266、SSR317、SSR283、SSR321和SSR300分别表示Sol_SSR19、Sol_SSR120、Sol_SSR305、Sol_SSR18、Sol_SSR132、Sol_SSR3、Sol_SSR110、Sol_SSR146、Sol_SSR125、Sol_SSR117、Sol_SSR101、Sol_SSR218、Sol_SSR225、Sol_SSR97、Sol_SSR185、Sol_SSR233、Sol_SSR184、Sol_SSR254、Sol_SSR318、Sol_SSR272、Sol_SSR68、Sol_SSR169、Sol_SSR13、Sol_SSR96、Sol_SSR190、Sol_SSR303、Sol_SSR302、Sol_SSR148、Sol_SSR304、Sol_SSR45、Sol_SSR24、Sol_SSR76、Sol_SSR306、Sol_SSR308、Sol_SSR201、Sol_SSR23、Sol_SSR126、Sol_SSR312、Sol_SSR224、Sol_SSR313、Sol_SSR239、Sol_SSR315、Sol_SSR69、Sol_SSR266、Sol_SSR317、Sol_SSR283、Sol_SSR321和Sol_SSR300。
[0123] 依据鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物中的48对核心SSR引物PCR产物的检测结果确定待测番茄是否为同一品种：当两个番茄样品的各个位点的PCR产物的差异个数(位点数)≥2，判定这两个样品为“不同品种”；当两个番茄样品的各个位点的PCR产物的差异个数(位点数)＝1，判定这两个样品为“近似品种”；当两个番茄样品的各个位点的PCR产物的差异个数(位点数)＝0，判定这两个样品为“极近似或相同品种”。在利用鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物鉴定番茄品种真实性时，可先利用成套引物1进行鉴定，并按照上述确定待测番茄是否为同一品种的方法确定待测番茄样品是否为同一品种；在利用成套引物1鉴定的结果为“近似品种”或“极近似或相同品种”时，再利用成套引物2进行进一步检测，并按照上述确定待测番茄是否为同一品种的方法最终确定待测番茄样品是否为同一品种。在仅利用成套引物1进行检测时，利用成套引物1得到的结果即为最后结果，在先后利用成套引物1和成套引物2进行检测时，利用成套引物2得到的结果即为最终结果。
[0124] 结果分析：通过以上检测，获得100份番茄品种的指纹数据，进行比较后发现，每两个品种间的差异位点数都大于2，说明鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性的成套引物可以有效的把这些番茄品种鉴别开(表4)；利用NTSYS软件进行品种聚类，分析品种间的遗传关系，从图中可以看出可以把这100份番茄品种全部区别开(图1)。
[0125] 实施例3、利用鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物对番茄杂交种子的纯度进行鉴定
[0126] 实验重复三次，每次重复实验的具体步骤如下：
[0127] (1)样品
[0128] 从送检的JF101番茄品种(北京市农林科学院)的种子中随机选取100-200粒番茄种子进行培育，获得不少于94个番茄单株，连同以及该品种的父本与母本Y15-013\Y15-049(父本与母本作为对照样品，北京市农林科学院)植株，共获得96个样品。
[0129] (2)提取供试番茄品种的DNA：采用CTAB法提取上述96个样品的DNA，具体提取方法同实施例2步骤(2)。
[0130] (3)PCR扩增
[0131] 用实施例1的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物对步骤(2)得到的96份DNA进行PCR扩增，PCR扩增体系与条件均同实施例2步骤(3)。
[0132] (4)PCR产物检测
[0133] 每种DNA的PCR产物均按照如下方法经ABI 3730xl DNA分析仪进行检测：首先将6-FAM(蓝色)和VIC(绿色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释30倍，NED(黑色)和PET(红色)荧光标记的PCR产物用超纯水稀释10倍；分别取等体积的上述4种稀释后溶液混合形成混合液；吸取1μL混合液加入到ABI 3730xl DNA分析仪专用96深孔板孔中。板中各孔分别加入0.1μL LIZ500分子量内标和8.9μL去离子甲酰胺。将样品在PCR仪上95℃变性5min，取出后立即置于冰上，冷却10min以上。瞬时离心10s后置放到ABI 3730xl DNA分析仪上进行电泳，用GENEMAPPER进行图像分析及数据采集。
[0134] (5)数据记录：
[0135] 将每一位点待测样品和父本(P1)与母本(P2)扩增片段的带型(即PCR产物电泳条带数目)和移动位置(即PCR产物电泳条带大小)进行比较，根据父本与母本的移动位置和扩增片段大小，确定待测样品该位点的等位变异大小，纯合位点的等位变异记录为X/X，杂合位点的等位变异记录为X/Y，其中X，Y分别为该位点上两个等位变异，小片段数据在前，大片段数据在后；缺失位点基因型数据记录为0/0。其中Sol_SSR3、Sol_SSR266和Sol_SSR218的结果如表5所示。
[0136] 表5、番茄种子的指纹数据
[0137]
[0138]
[0139] 指纹数据中与其他种子不一致的种子即为杂种子，利用Sol_SSR3得到的杂种子数目为0，即利用该引物对得到的种子纯度为100％，利用Sol_SSR266得到的杂种子数目为0，即利用该引物对得到的种子纯度为100％，利用Sol_SSR218得到的杂种子数目为1，即利用该引物对得到的种子纯度为1/94×100％＝98.9％。其余45对引物的结果显示待测的94粒种子均为父本与母本Y15-013\Y15-049的后代，即纯度为100％。
[0140] (6)数据计算：
[0141] 利用公式1与公式2计算种子纯度：
[0142] 种子纯度p＝(NT-ND)/NT×100％(公式1)，其中p表示利用一对番茄SSR引物对得到的种子纯度，番茄SSR引物对为实施例1的鉴定或辅助鉴定番茄品种真实性和种子纯度的成套引物中的引物对，NT表示供检种子数目，ND表示利用一对番茄SSR引物对得到的杂种子数目；
[0143] 种子纯度P＝利用所用的所述番茄SSR引物对得到的种子纯度之和/n(公式2)，其中n表示所用的所述番茄SSR引物对数目。
[0144] 根据公式1与公式2计算该待测番茄种子的种子纯度为P＝(100％×47+98.9％)/48＝99.98％。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种抑制caspase-3基因表达的siRNA序列 | 2020-05-13 | 298 |
| 人类肝脏中表达的表达序列标签E组 | 2020-05-11 | 628 |
| 在人类肝脏中表达的表达序列标签 | 2020-05-11 | 327 |
| 表位序列 | 2020-05-11 | 612 |
| 牛表皮生长因子的核酸序列和蛋白质序列 | 2020-05-12 | 557 |
| 增强表达的内含子序列 | 2020-05-11 | 103 |
| 表位序列 | 2020-05-11 | 476 |
| PCV3抗原表位的多肽序列筛选方法 | 2020-05-12 | 707 |
| 增强表达的内含子序列及其用途 | 2020-05-12 | 905 |
| 使三维对象的表示序列化 | 2020-05-13 | 957 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈