一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针
阅读：629发布：2023-02-16
专利汇可以提供一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供一组用于 牛 源性实时 荧光 PCR检测的特异性引物和探针，核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：（1）、上游引物：5'‑TCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACA‑3'，下游引物：5'‑CGAAGAATCGGGTAAGGGTTGC‑3'，探针：5'‑CTGAGGAGCAACAGTCATCACCAACC‑3'所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为 序列表 中SEQ ID No.3；（2）、与（1）所述序列互补的序列。本发明所提供的引物和探针可对牛肉和动物 饲料 中的牛源性含量进行定性、定量分析，对判断牛肉和动物饲料中牛源性含量具有重要意义，本发明将在食品检测领域发挥重要作用。，下面是一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针专利的具体信息内容。
1.一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，其特征在于：所述特异性引物和探针的核苷酸序列为：
上游引物：5'-TCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACA -3'
下游引物：5'-CGAAGAATCGGGTAAGGGTTGC -3'
探针：5'-CTGAGGAGCAACAGTCATCACCAACC -3'
所述引物和探针扩增的目标核苷酸序列为序列表中SEQ ID No.3。
2.根据权利要求1所述的引物和探针，其特征在于：所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。
3.牛源性的PCR检测试剂盒，所述试剂盒为牛源性的定性或定量检测试剂盒；其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物和探针。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将牛源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有牛源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述牛源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2。
5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述牛源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：
上游引物：5'- CGATACATACACGCAAACGG -3'
下游引物：5'- TGTTGGGTTGTTGGAGCCT -3'。
6.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述PCR扩增的条件为：94℃预变性
5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min。
7.权利要求1或2所述的特异性引物和探针在制备定性或定量检测牛源性的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述实时荧光定量PCR的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
10.牛源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，其特征在于：步骤如下：
（1）制备标准品：将牛源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有牛源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述牛源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2；
（2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
（3）标准曲线绘制；
（4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行牛源性的快速定量检测。
11.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述牛源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：
上游引物为5'-CGATACATACACGCAAACGG -3'；
下游引物为5'-TGTTGGGTTGTTGGAGCCT -3'。
12.根据权利要求11所述的检测方法，其特征在于： PCR扩增所述牛源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min。
13.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl。
14.根据权利要求10所述的检测方法，其特征在于：步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
15.牛源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，其特征在于：步骤如下：
（1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；
（2）通过待测样品的Ct值对牛源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性。
16.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl。
17.根据权利要求15所述的检测方法，其特征在于：步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针
技术领域
[0001] 本发明属于食品检测技术领域，具体涉及一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针。
背景技术
[0002] 牛海绵状脑病(又称疯牛病)是牛的一种神经性、渐进性和致死性疾病。研究表明，它是由朊病毒所引发的。疯牛病自发生以来已给全球畜牧业带来了巨大的损失，已成为一种严重危害人类生命安全的传染病。流行病学证明，疯牛病、羊痒病和人的克雅氏病及库鲁病都是由该变性蛋白通过食物链传播引起的。其中，人的克雅氏病就是由于食入患有疯牛病牛的牛肉及其制品、牛脑、脊髓、扁桃体和小肠等引发的感染。因此，建立起有效的饲料中牛源性成分的检测方法，避免带病毒的动物和饲料在市场和国际间流通显得刻不容缓。
[0003] 目前许多国家已颁布法令禁止将牛和羊源性成分作为蛋白质添加到饲料中。为避免此类事件的发生，人们开始用多种方法检测肉骨粉中的牛和羊源性成分，其中主要包括显微镜检法、近红外光镜法、ELISA法和PCR方法。但随着PCR技术的不断发展，我们发现，科学研究中普遍使用的实时荧光定量PCR方法和普通PCR相比，在牛和羊源的检测工作中无论是在操作简便性还是反应灵敏度方面都具有更大的优势。
[0004] 采用免疫学方法可以对不同的生鲜肉进行鉴定，但是对于热加工处理的肉类制品，由于其中的蛋白质成分或免疫原性物质遭破坏而无法对其来源进行准确检定。因此，建立一种对肉类制品准确、特异和灵敏度高的鉴定方法，对食品监督部门而言迫在眉睫。随着研究技术的发展，食品中的肉类成分的鉴定与分析已逐步形成了分别以蛋白质和核酸检测为基础的方法体系，其鉴别精度可达属或亚属水平，检测灵敏度也达到了纳克级，以PCR技术为基础的种属检测技术最为突出。因此，本研究根据牛特异性线粒体DNA片段，设计合成一对引物，利用引物建立一种运用PCR技术鉴定真假牛羊肉的方法，并对大量市售牛肉制品进行牛源性成分检测，为保护广大消费者的利益和进一步落实食品质量安全市场准入制度提供了技术保障，也更好地为食品监管部门提供强有力的技术支持。
发明内容
[0005] 本发明目的在于设计一组牛源性特异性引物和探针序列，建立一种能广泛应用于牛肉和动物饲料中牛源性成分检测的快速、灵敏、特异性好的荧光定量PCR检测的方法。本发明采用基因克隆技术，将牛源性DNA的cytb基因种内保守片段插入到载体pMD18-T中，获得含有cytb基因片段的重组质粒，以此作为标准品。根据牛源性cytb的基因片段编码基因序列设计并合成一组特异性引物和探针，优化PCR反应条件，建立以实时荧光定量聚合酶链反应为平台的检测方法，并对所建立的方法进行评估。
[0006] 本发明的第一个目的是提供一组用于牛源性实时荧光PCR检测的特异性引物和探针，所述特异性引物和探针的核苷酸序列为（1）或（2）中的一种：
[0007] （1）、上游引物：5'-TCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACA -3'
[0008] 下游引物：5'-CGAAGAATCGGGTAAGGGTTGC -3'
[0009] 探针：5'-CTGAGGAGCAACAGTCATCACCAACC -3'
[0011] （2）、与（1）所述序列互补的序列。
[0012] 作为优选，所述探针的5’端荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。
[0014] 作为优选，所述定量检测试剂盒还包括标准品，所述标准品的制备方法为：将牛源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有牛源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述牛源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2；
[0015] 作为进一步优选，所述牛源性保守基因片段是以序列表中SEQ ID No.1的核苷酸序列为模板，使用下述引物进行PCR扩增获得的：
[0016] 上游引物：5'- CGATACATACACGCAAACGG -3'
[0017] 下游引物：5'- TGTTGGGTTGTTGGAGCCT -3'；
[0018] 作为优选，所述PCR扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min。
[0019] 本发明的第三个目的是提供上述特异性引物和探针在制备定性或定量检测牛源性的试剂盒中的应用。
[0020] 作为优选，所述应用是分别以标准品和待测样品DNA为模板，利用特异性引物和探针进行实时荧光定量PCR，通过标准曲线和待测样品的Ct值判定结果。
[0022] 本发明的第四个目的是提供牛源性的实时荧光定量PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：
[0023] （1）制备标准品：将牛源性保守基因片段插入到载体pMD18-T中，转化至大肠杆菌中进行诱导表达，获得含有牛源性保守基因片段的重组质粒，以此作为标准品；所述牛源性保守基因片段为序列表中SEQ ID No.2；
[0024] （2）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品和标准品采用相同的反应体系进行实时荧光PCR扩增；
[0025] （3）标准曲线绘制；
[0026] （4）通过标准曲线和待测样品的Ct值进行牛源性的快速定量检测。
[0027] 作为优选，步骤（1）中所述牛源性保守基因片段是通过以下引物扩增得到的：
[0028] 上游引物为5'-CGATACATACACGCAAACGG -3'；
[0029] 下游引物为5'-TGTTGGGTTGTTGGAGCCT -3'；
[0030] 作为优选，PCR扩增所述牛源性保守基因片段的条件为：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min；
[0031] 作为优选，步骤（2）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；
[0032] 作为优选，步骤（2）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0033] 本发明的第五个目的是提供牛源性的定性PCR检测方法，所述检测方法不以有生命的人体或动物体为直接实施对象，步骤如下：
[0034] （1）使用权利要求1所述的特异性引物和探针对待测样品进行实时荧光PCR扩增；
[0035] （2）通过待测样品的Ct值对牛源性进行定性检测：当Ct值小于38时，为阳性；否则，为阴性；
[0036] 作为优选，步骤（1）中所述引物和探针的用量均为1.6μl；
[0037] 作为优选，步骤（1）中所述实时荧光PCR扩增的反应条件为：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。
[0038] 本发明提供用于对牛源性进行定性、定量检测的引物和探针，通过提取待检测样品的DNA结合实时荧光定量PCR检测技术和所制备的标准品，可达到准确定量待测牛肉和动物饲料中牛源性含量的目的。本发明所提供的引物和探针可对牛肉和动物饲料中的牛源性含量进行定性、定量分析，对判断牛肉和动物饲料中牛源性含量具有重要意义，本发明将在食品检测领域发挥重要作用。附图说明
[0040] 图1为引物和探针体系优化实验结果；其中，a代表引物为1.6μl，探针为1.6μl；b代表引物为1.0μl，探针为1.6μl；c代表引物为1.0μl，探针为0.8μl；d代表引物为2.0μl，探针为0.8μl；e代表引物为1.6μl，探针为0.8μl；f代表引物为2.0μl，探针为1.0μl；g代表引物为1.0μl，探针为0.8μl；h代表引物为1.0μl，探针为1.0μl；i代表引物为2.0μl，探针为1.6μl；
[0041] 图2为灵敏度实验结果；其中，a代表质粒浓度为1.00×108copies/ml、b代表质粒浓度为1.00×107copies/ml、c代表质粒浓度为1.00×106copies/ml、d代表质粒浓度为1.00×105copies/ml、e代表质粒浓度为1.00×104copies/ml、f代表质粒浓度为1.00×103copies/ml、g代表质粒浓度为1.00×102copies/ml，h代表阴性对照；
[0042] 图3为特异性实验结果；其中出现标准扩增曲线的为牛，未出现标准扩增曲线的为猪、羊、狗、鱼、鸡、鸭、鹅、兔、驴、蛙、鼠、阴性对照；
[0043] 图4为牛源性标准曲线。
具体实施方式
[0044] 下面结合附图及具体实施方案对本发明做更详细阐述。以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用引物、探针和所用序列测定工作均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成和完成。
[0045] 实施例1 cytb基因标准品的制备
[0046] 要建立实时荧光定量PCR方法，首先必须制备方法所需的外部标准品，标准品应包含高度保守、特异的序列，要保证反应的高特异性。动物线粒体DNA具有分子量小、结构保守、热稳定性好、不易降解的结构特点和母系遗传、拷贝数多、进化速度快、不发生重组的遗传特点，其中线粒体细胞色素b（cytb）基因序列最为保守型。cytb基因检测牛源性，有较高的敏感性和特异性。本部分主要采用PCR技术扩增牛源性cytb基因，利用基因重组技术将其连接到质粒载体pMD18-T中，构建出重组质粒pMD18-T-cattlecytb，并进行相应的PCR鉴定和测序鉴定，最后经定量作为待建立方法的标准品，为下一步的方法及评估奠定基础。
[0047] 一、模板DNA的制备
[0048] 提取牛肝脏组织基因组DNA，用作cytb基因PCR扩增的模板，提取基因组DNA的试剂盒为细胞/组织基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），采购自百泰克生物技术有限公司；
[0050] （2）吸取上清，4℃ 12000 r/min离心20min，弃上清，收集沉淀；
[0051] （3）加入400μl Buffer Digestion，震荡混匀。65℃水浴1-3h至细胞完全裂解 （注意：1、水浴过程中，每10分钟颠倒混匀一次，可促进样品裂解。混合液变澄清透明为裂解完全。如溶液未变澄清，说明细胞裂解不彻底，应当延长水浴时间，否则将可能降低DNA的得率或导致提取的DNA不纯。2、如需得到无RNA的DNA，可在水浴后加入20μl的Rnase A，室温放置2-5分钟）加入200μl Buffer PA，充分颠倒混匀，置于-20℃冰箱放置5min；
[0052] （4）4℃ 10000rpm离心5分钟，将上清转移至新管中；
[0053] （5）加入等体积的异丙醇，颠倒5-8次使之充分混匀-20℃，放置20min。
[0054] （6）4℃ 10000rpm离心10分钟，弃上清。
[0055] （7）加入1ml预冷的75%的乙醇，漂洗1-3min，4℃ 10000rpm离心2分钟，弃上清。
[0056] （8）开盖室温倒置10-20min，至残留的乙醇完全挥发。得到的DNA用30-50μl纯净水溶解。
[0057] （9）提取的DNA可进行下一步实验或-20℃保存。
[0058] 二、cytb基因片段的PCR扩增
[0059] 1、引物的设计与合成
[0060] 本发明通过对NCBI数据库中牛cytb全序列进行生物信息学比对分析，选取适合设计引物和探针的保守片段序列（序列表SEQ ID No.2中序列）为靶目标，应用Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针以及一组相关序列的外围引物。
[0062] 5’-ATGACTAACATTCGAAAGTCCCACCCACTAATAAAAATTGTAAACAATGCATTCATCGACCTTCCAGCCCCATCAAACATTTCATCATGATGAAATTTCGGTTCCCTCCTGGGAATCTGCCTAATCCTACAAATCCTCACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTACACATCCGACACAACAACAGCATTCTCCTCTGTTACCCATATCTGCCGAGACGTGAACTACGGCTGAATCATCCGATACATACACGCAAACGGAGCTTCAATGTTTTTTATCTGCTTATATATGCACGTAGGACGAGGCTTATATTACGGGTCTTACACTTTTCTAGAAACATGAAATATTGGAGTAATCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACAGCATTTATAGGATACGTCCTACCATGAGGACAAATATCATTCTGAGGAGCAACAGTCATCACCAACCTCTTATCAGCAATCCCATACATCGGCACAAATTTAGTCGAATGAATCTGAGGCGGATTCTCAGTAGACAAAGCAACCCTTACCCGATTCTTCGCTTTCCATTTTATCCTTCCATTTATCATCATAGCAATTGCCATAGTCCACCTACTATTCCTCCACGAAACAGGCTCCAACAACCCAACAGGAATTTCCTCAGACGTAGACAAAATCCCATTCCACCCCTACTATACCATTAAGGACATCTTAGGGGCCCTCTTACTAATTCTAGCTCTAATACTACTAGTACTATTCGCACCCGACCTCCTCGGAGACCCAGATAACTACACCCCAGCCAATCCACTCAACACACCCCCTCACATCAAACCCGAGTGATACTTCTTATTTGCATACGCAATCTTACGATCAATCCCCAACAAACTAGGAGGAGTACTAGCCCTAGCCTTCTCTATCCTAATTCTTGCTCTAATCCCCCTACTACACACCTCCAAACAACGAAGCATAATATTCCGACCACTCAGCCAATGCCTATTCTGAGCCCTAGTAGCAGACCTATTGACACTCACATGAATTGGAGGACAACCAGTCGAACACCCATATATCACCATCGGACAACTAGCATCTGTCCTATACTTTCTCCTCATCCTAGTGCTAATACCAACGGCCGGCACAATCGAAAACAAATTACTAAAATGAAGA-3’
[0063] 该外围引物序列如下：
[0064] 上游引物：cattlecytb238F：5'-CGATACATACACGCAAACGG-3'
[0065] 下游引物：cattlecytb609R：5'-TGTTGGGTTGTTGGAGCCT-3'
[0066] 扩增片段大小为：390bp。
[0067] 2、PCR反应体系和反应条件
[0068] 以DNA为模板，以上述外围引物cattlecytb238F / cattlecytb609R为扩增引物，采用下述体系和反应条件进行PCR扩增。
[0069] PCR反应体系：
[0070] 10×PCR buffer 5μl
[0071] dNTP（2.5μM） 2μl
[0072] 引物F（10μM） 2μl
[0073] 引物R（10μM） 2μl
[0074] 模板 2.4μl
[0075] Taq酶（5U） 1.6μl
[0076] ddH2O 35μl
[0077] 总体积 50μl。
[0078] 其中引物采用cattlecytb238F/cattlecytb609R，Taq酶采用北京百泰克Power Taq Plus DNA Polymerse，PCR扩增仪为北京百泰克iCycling系列96梯度PCR仪。
[0079] 扩增程序/反应条件：
[0080] 94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃30s，35个循环；72℃ 10min。取5μL扩增产物进行1%琼脂糖电泳，检测PCR产物大小，然后采用Axygen公司生产的DNA凝胶回收试剂盒纯化回收剩余的PCR扩增产物。
[0081] 三、重组质粒pMD18-T-cattlecytb的构建和转化
[0082] 1、连接反应：将上述纯化得到的PCR扩增产物与pMD18-T（大连宝生物公司）进行连接，采用如下连接体系进行配制：
[0083] pMD18-T vector 1μL
[0084] 回收DNA 2μL
[0085] Solution1 5μL
[0086] ddH2O 2μL
[0087] 总体积 10μL。
[0088] 配制完成后置于16℃过夜，进行连接反应。
[0089] 2、pMD18-T-cattlecytb质粒的转化以及PCR鉴定
[0090] （1）从-70℃的超低温冰箱中取出冻存的DH5α感受态细胞，置于冰盒上使其自然解冻；
[0091] （2）取连接产物10μL加入50μL的DH5α感受态细胞中，轻轻摇匀后置冰浴30分钟；
[0092] （3）42℃水浴中热休克90秒，热休克后立即置冰上冷却2min；
[0093] （4）向1.5ml EP管中加入预冷的400μl的LB液体培养基（不含氨苄青霉素）混匀后，37℃ 200转/分轻摇培养1h；
[0094] （5）将上述培养液摇匀后取100μl涂布于含Amp、IPTG、X-gal的LB平板上，正面向上放置30min，待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿37℃恒温箱培养过夜；
[0095] （6）次日观察，从平板上挑取白色单克隆菌落于100μL LB液体培养基（含氨苄青霉素）的PCR管中，37℃振荡培养2-3小时。吸取2μL作为模板进行PCR鉴定，剩余的菌液加入到20ml的LB液体培养基中进行扩摇；
[0096] （7）用载体通用引物RV-M/M13-47扩增上述稀释菌液，PCR产物采用1%琼脂糖凝胶电泳，通过检测PCR产物大小鉴定阳性转化子。
[0097] 引物RV-M/M13-47序列如下：
[0098] 引物 RV-M: 5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’
[0099] 引物 M13-47: 5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’
[0100] PCR反应体系如下：
[0101] 10×PCR buffer 2.5μL
[0102] dNTP（2.5μM） 0.5μL
[0103] 引物F（10μM） 0.5μL
[0104] 引物R（10μM） 0.5μL
[0105] 模板 2μL
[0106] Taq 酶（5U） 0.5μL
[0107] ddH2O 18.5μL
[0108] 总体积 25μL。
[0109] 扩增程序/反应条件：94℃预变性5min；94℃ 30s、55℃ 30s、72℃ 1min，35个循环；72℃ 10min。
[0110] （8）采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取阳性重组质粒，测定浓度和纯度，同时吸取一部分纯化质粒送至上海生物工程有限公司进行测序，确定插入片段的基因序列与目的序列一致。
[0111] 四、标准品的获取和定量
[0112] 1、将步骤三得到的含有重组质粒pMD18-T-cattlecytb的大肠杆菌DH5α100μL转种于5mL的LB液体培养基，37℃ 200rpm过夜摇培；
[0113] 2、取1ml培养过夜的菌液转种于30ml LB液体培养基，200rpm 增菌培养2-3小时，然后采用Axygen公司生产的质粒制备试剂盒提取质粒；
[0114] 3、利用北京百泰克生物科技有限公司超微量紫外可见分光光度计（ND5000）对提取的质粒进行测定，测定A260、A280，根据A260/A280判断质粒的纯度；
[0115] 4、质粒pMD18-T-cattlecytb浓度（拷贝数）计算
[0116] （1）质粒的分子量=3082bp×660（每对碱基的平均分子量）
[0117] （2）测得质粒浓度为103.45ng/μl，质粒纯度A260/A280=2.01，A260/A230=2.05。因在进行实时荧光定量PCR时，需要以“拷贝数”为单位，因此需要将单位转换成copies/ml。
[0118] 质粒 copies/ml=阿伏伽德罗常数×质粒摩尔数
[0119] 其中阿伏伽德罗常数=6.02×1023copies/mol。
[0120] 因此提取的质粒浓度copies/ml=103.45×10-9g/ml×6.02×1023copies/mol÷（3082bp×660g/bp•mol）=3.1×1010copies/ml
[0121] 10μl质粒+21μl的无菌水就得到浓度为1.00×1010copies/ml的质粒，再将该质粒进行10倍比稀释就可得到一系列浓度的质粒，并于-20℃保存备用。
[0122] 实施例2 实时荧光定量PCR牛源性方法的建立
[0123] 一、特异性引物和探针的设计与合成
[0124] 以上述选取的牛的cytb基因的保守片段为靶目标，应用Primer express 3软件、Primer Premier 5软件以及Oligo 7软件，设计了一组实时荧光定量PCR引物和探针。
[0125] 作为本发明的核心，一组用于牛源性实时荧光PCR检测的引物和探针核苷酸序列如下：
[0126] 上游引物：cattlecytb353F：5’-TCCTTCTGCTCACAGTAATAGCCACA-3’
[0127] 下游引物：cattlecytb517R: 5’-CGAAGAATCGGGTAAGGGTTGC-3’
[0128] 探针：cattlecytb420P: 5’-CTGAGGAGCAACAGTCATCACCAACC-3’
[0129] 该引物和探针扩增目标核苷酸序列为：
[0130] 5’-ACACGATTCTTCGCCTTTCACTTTATCCTGCCATTCATCATTACCGCCCTCGCAGCCGTACATCTCCTATTCCTGCACGAAACCGGATCCAACAACCCTACCGGAATC-3’。
[0131] 探针5’端的荧光报告基团是FAM，3’端标记的是荧光淬灭基团TAMRA。
[0132] 二、待测样本的制备
[0133] 1、牛肉中牛源DNA的制备
[0134] 牛肉中的牛源DNA提取采取的是牛肝脏部位，具体见实施例1步骤一“模板DNA的制备”，提取牛肝脏组织基因组DNA，用作cytb基因PCR扩增的模板。
[0135] 2、动物饲料中牛源DNA的提取
[0136] 1.称取0.5-2g肉骨粉样品于10ml离心管中，加入适量含10%SDS(采购自百泰克生物技术有限公司)和10μg/ml蛋白酶K（蛋白酶K采购自百泰克生物技术有限公司）的裂解液，37℃保温过夜；
[0137] 2.2000g离心5min。取离心上清液，加等体积酚/氯仿/异戊醇（三者的体积比为25/24/1）(采购自大连宝生生物技术有限公司)混匀，静置5min；
[0138] 3.8000g离心5min。取离心上清液加0.65倍体积的异丙醇（异丙醇含量≥99%，采购自国药集团化学试剂有限公司），混匀，12000g 4℃离心10min；
[0139] 4.弃上清液，加500μL 70%冰乙醇（采购自国药集团化学试剂有限公司）；
[0140] 5.12000g 4℃离心5min。取沉淀，吹干。加50μL TE或ddH2O溶解白色沉淀，此即为DNA提取物。
[0141] 三、实时荧光定量PCR条件优化
[0142] 以浓度为1.00×106copies/ml的阳性质粒为模板，采用百泰克公司生产的2×real-time PCR Premixture（probe）实时荧光定量PCR试剂盒进行实验，实验采用的实时荧光定量PCR仪为苏州百源基因技术有限公司生产的ASA-9600实时荧光定量PCR仪。反应体系采用20μl 体系，其中引物和探针的量采用表1组合进行反应。
[0143] 表1 PCR反应体系中引物和探针不同用量
[0144]
[0145] 反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。结果参照图1，数据显示20μl 体系时，引物（5μM）和探针（5μM）分别加入1.6μl，Ct值最小，荧光信号最强。
[0146] 四、方法评估
[0147] 1、灵敏度实验
[0148] 将上述制备得到的质粒进行10倍比稀释得到一系列浓度的质粒，选取浓度为1.00×108copies/ml、1.00×107copies/ml、1.00×106copies/ml、1.00×105copies/ml、1.00×104copies/ml、1.00×103copies/ml、1.00×102copies/ml等作为梯度模板。反应体系如下：
[0149] 2×premix 10μl
[0150] Primer F（5μM） 1.6μl
[0151] Primer R（5μM） 1.6μl
[0152] Probe（5μM） 1.6μl
[0153] 模板 2μl
[0154] ddH2O补至 20μl。
[0155] 反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，结果参照图2，数据显示当质粒浓度达到1.00×103copies/ml时依然有荧光信号，但质粒浓度达到
1.00×102copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×103copies/ml。
1.00×102copies/ml时未检测到荧光信号，因此该方法的灵敏度为1.00×103copies/ml。
[0156] 2、特异性实验
[0157] 为了证实本发明对牛源性检测的特异性，我们选取了常见的11种动物做特异性实验，选取的动物包括：猪、羊、狗、鱼、鸡、鸭、鹅、兔、驴、蛙、鼠。
[0158] 该特异性试验包括用上述样本的基因组DNA为模板进行的试验。反应体系如下：
[0159] 2×premix 10μl
[0160] Primer F（5μM） 1.5μl
[0161] Primer R（5μM） 1.5μl
[0162] Probe（5μM） 1.5μl
[0163] 模板 2μl
[0164] ddH2O补至 20μl。
[0165] 反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。根据仪器所检测到的荧光信号经软件处理获得荧光曲线，观察荧光曲线的信号，分析特异性。结果参考图3，从图3可以看出：仅牛组织检测为阳性，其余动物均为阴性，表明本发明具有很好的特异性。检测结果如表2所示。
[0166] 表2 特异性实验结果
[0167]
[0168] 3、标准曲线制备
[0169] 以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中到达荧光阈值的初始循环数（Ct）为纵坐标，得到牛源性的标准曲线，作为待测样品定量测定的参照标准，结果参考图4。
[0170] 4、待测样品的定量检测
[0171] 以待测样品DNA和标准品的DNA为模板，用牛的特异性引物，以相同的体系同时进行牛cytb的基因片段的荧光定量PCR扩增。
[0172] PCR反应体系如下：
[0173] 2×premix 10μl
[0174] Primer F（5μM） 1.6μl
[0175] Primer R（5μM） 1.6μl
[0176] Probe（5μM） 1.6μl
[0177] 模板 2μl
[0178] ddH2O补至 20μl。
[0179] 反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。通过标准曲线和待测样品的Ct值进行动物饲料和牛肉中牛源性的快速定量检测。
[0180] 5、待测样品的定性检测
[0181] 以待测样品DNA为模板，用牛的特异性引物，对待测样品DNA进行牛cytb的基因片段的荧光定量PCR扩增。
[0182] PCR反应体系如下：
[0183] 2×premix 10μl
[0184] Primer F（5μM） 1.6μl
[0185] Primer R（5μM） 1.6μl
[0186] Probe（5μM） 1.6μl
[0187] 模板 2μl
[0188] ddH2O补至 20μl。
[0189] 反应条件：94℃ 预变性2分钟，94℃ 15秒、60℃ 40s并收集荧光信号，40个循环。通过待测样品的Ct值对动物饲料和牛肉中牛源性进行定性判断：当Ct值小于38时，为阳性；
否则，为阴性。
否则，为阴性。
[0190] 最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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