[0001] 本发明涉及一种色素合成微生物操纵子，尤其涉及一种色素合成副球菌属微生物操纵子，更具体的是涉及一种虾青素合成操纵子及其在合成虾青素中的应用。

[0002] 类胡萝卜素是一种天然色素，是由8个类异戊二烯单位组成的一类碳氢化合物及其氧化衍生物的总称(J.Biotech.，1998，59，169)。

[0003] 类胡萝卜素可分为四个亚族，包括胡萝卜素，如：α-、β-、γ-胡萝卜素，番茄红素；胡萝卜醇，如：叶黄素，玉米黄素，虾青素；胡萝卜醇的酯类，如：β-阿朴-8’-胡萝卜酸酯；胡萝卜酸，如：藏红素，胭脂树橙。类胡萝卜素的基本结构是番茄红素，其它类胡萝卜素是由其氧化、氢化、脱氢、环化以及碳架重排、降解而衍生。一般类胡萝卜素是C40分子，但也存在高分子类胡萝卜素(如：C45和C500)和降解的类胡萝卜素(如：C30)(Plant Cell，1995，7，1015)。类胡萝卜素在自然界中广泛存在，总数达600多种，而其中有50余种能形成维生素A。β-胡萝卜素、番茄红素和虾青素都是类胡萝卜素家族中对人类健康十分重要的三个主要成员(Nutr.Cancer.，1991，16，93)。

[0004] 美国商业情报机构(Global Industry Analysts(GIA))公司发表了一份研究报告——《虾青素：全球战略经营报告》，据该报告预测，随着含天然营养成分的保健品在消费市场呈现出良好发展势头，到2010年，全球类胡萝卜素市场的规模预计将达到10.6亿美元。据调查，对类胡萝卜素这种抗氧化剂的需求之所以不断增长，主要原因是消费者对自身健康的日益关切以及老龄化人口的不断增加。GIA公司的研究报告对类胡萝卜素市场进行了全面分解，以弄清楚哪些类别的类胡萝卜素将可能在今后几年里获得最大的发展。

[0005] 在类胡萝卜素的国际市场上，β-胡萝卜素是规模最大的一类产品。2006年，欧洲在β-胡萝卜素上占据的市场份额高达43.3％。研究报告预测，美国β-胡萝卜素市场的增长速度将超过欧洲。2007-2010年，美国市场的增速将略高于欧洲市场，其市场价值预计将增加859万美元。到2010年，β-胡萝卜素的市场将达到2.2亿美元。此外，预计到2010年，全球类胡萝卜素市场的规模将达到2.19亿美元；预计到2010年，全球虾青素市场的规模将达到4.5亿美元。此外，从2007年-2010年，叶黄素和角黄素的总销售额将增加
2880万美元，叶黄素在欧洲市场的增长最为强劲。

[0006] 所有类胡萝卜素都是通过类异戊二烯化合物或萜类化合物途径合成的。它是一类从乙酰CoA开始生物合成的次生代谢产物，合成过程为：3个乙酰CoA分子通过失去1个分子的羧基而缩合成3，5-二羟-3-甲基戊酸(MVA)，在酶的作用下磷酸化形成焦磷酸酯并经脱羧后形成异戊二烯焦磷酸(IPP)，IPP在IPP异构酶作用下异构为二甲基丙烯基二磷酸(DMAPP)，DMAPP依次与3分子的IPP在GGPS(GGPP合成酶)的作用下，缩合生成二甲基辛烯焦磷(GPP)、法尼基二磷酸(FPP)、二甲基辛烯二甲基辛烯焦磷酸(GGPP)。2个GGPP在八氢番茄红素合成酶(PSY)作用下头对头进行二聚作用形成第1个无色的类胡萝卜素——八氢番茄红素。八氢番茄红素经过连续脱氢反应，共轭双键延长，直至形成链孢红素、番茄红素。番茄红素在不同环化酶的作用下分别生成α-胡萝卜素、β-胡萝卜素，α、β-胡萝卜素经引入、转化、环化、氧化等反应形成结构更复杂的类胡萝卜素、叶黄素、新黄质等(Curr.Opin.Plant Biol.，2001，4，210)。

[0007] 到目前为止，分别从多种细菌、植物、藻类和真菌中克隆了近150个与类胡萝卜素合成有关的基因。1995年Misawa从欧氏杆菌杆菌中克隆获得GGPP合成酶基因(crtE)、玉米黄素转糖激酶(crtX)、番茄红素环化酶基因(crtY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(crtB)和β-胡萝卜素羟化酶基因(crtZ)，将这些基因分别转化到植物中能够使转基因植物合成不同类型的类胡萝卜素或前体物质(US5,429,939)。1996年Ausich等人从欧氏杆菌(Erwinia herbicola)克隆获得了牻牛儿基脚焦磷酸化酶基因、八氢番茄红素合成酶基因、八氢番茄红素脱氢酶基因以及番茄红素环化酶基因并分别将它们与叶绿素转运肽编码序列融合转化到植物中提高了植物类胡萝卜素总量(US5,530,188)。植物中也相继发现了类胡萝卜素合成相关基因。1994年Bird将番茄中克隆到参与类胡萝卜素合成的基因pTOM5(该基因与crtB同源)转化到植物中，并发现该基因能够调控植物中番茄红素的含量(US5,304,478)。1998年Cunningham从拟南芥中克隆到ε-番茄红素环化酶基因、IPP异构酶基因和β-胡萝卜素羟化酶基因，这些基因的功能在大肠杆菌中表达后获得了验证(US5,744,341)。此外Vainstein 1999发现其它与类胡萝卜素相关的蛋白，如黄瓜中的CHRC和CHRD蛋白(US6,551,793)。2002年Busch从烟草中克隆到ζ-胡萝卜素去饱和酶和番茄红素合成酶(EP 1,156,117)。Wang等2006年从枸杞中克隆到与八氢番茄红素合成酶基因(CN1884547)和β-番茄红素环化酶同源基因(CN1884546)。

[0008] 副球菌属(Paracoccus)为革兰阴性非发酵型细菌，存在于海洋等外环境，共有15种，绝大多数的种与人的疾病无关。在副球菌属微生物内富含大量的维生素，但还没有关于副球菌生产虾青素的报道。

[0009] 本发明的一个目的在于提供一种副球菌虾青素合成操纵子，该操纵子源自于副球菌属。

[0010] 本发明的另一个目的在于提供一种含有副球菌虾青素合成操纵子的表达载体。

[0011] 本发明的又一个目的在于提供一种副球菌虾青素合成操纵子及其表达载体，该操纵子与表达载体在生物合成虾青素的应用。

[0012] 本发明的目的是通过如下技术方案实现的：

[0013] 虾青素合成操纵子源自于副球菌属，其核苷酸序列为SEQ ID No：1所示，在其序列中416-1144核苷酸为β胡萝卜素酮酶基因；1141-1629核苷酸为β胡萝卜素羟化酶基因；1626-2786核苷酸为番茄红素β环化酶基因；2783-4288核苷酸为八氢番茄红素去饱和酶基因；4285-5199核苷酸为八氢番茄红素合成酶基因以及5196-6071核苷酸为牻牛儿基焦磷酸合成酶基因。

[0014] SEQ ID No：1所示的虾青素合成操纵子的获取方法为：先将野生菌在LB固体培养基中培养12小时，选择呈红色、黄色或橙黄色的菌落；再将选择出来的菌落置于LB液体培养基中培养12小时以上；之后提取总DNA，再以总DNA为模板，采用长基因PCR扩增和克隆方法(ApplEnviron Microbiol，1997，63，4504)克隆并得到虾青素合成相关的操纵子。

[0015] 一种SEQ ID No：1所示的虾青素合成操纵子的具体获取方法为：

[0016] 菌种分离

[0017] 从上海近海深水区取污泥，稀释10-100倍后涂布在LB固体培养基上(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)，28℃培养24小时，挑取菌落。

[0018] 总DNA提取

[0019] 将分离获得的不同颜色的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物(Invitrogen)，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养过夜(16小时)，菌体培养液以重力加速度6,000g离心5min，得到菌体沉淀。将这些沉淀在-20℃下冷冻1hr，之后使用TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mM EDTA，pH 8.0)清洗一次，加入浓度为10mg/mL溶菌酶的无菌溶液悬浮，在37℃下摇床培养1hr。向培养液中加入0.5M EDTA，10％(w/v)SDS和5M的NaCl溶液，轻轻振荡混匀，再加入20mg/mL蛋白激K，37℃下培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA；水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取，震荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇，震荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA于4℃保存。

[0020] PCR扩增

[0021] 以CAT 1：5’GAATTCTGCAGGCGCTGGCGGCGCCGTTCCACGAC3’和CAT2：5’CATAGGCTAAGCCGCGCCGCCCCGCGGGACTATTCTGGCCGATCA3’为扩增引物对虾青素合成相关的操纵子进行PCR扩增。使用Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃600秒，扩增30个循环。加入rtaq酶，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为6352bp的SEQ ID No 1序列。

[0022] 一种SEQ ID No：1所示的虾青素合成操纵子的基因合成方法(NucleicAcids Research，2004，32，e98)，利用PCR进行虾青素操纵子全长扩增，在Taq DNA聚合酶存在的反应体系中，使用多个扩增引物和2个外侧引物完成。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃延长10min，共25个循环。PCR结束后，0.8％(w/v)琼脂糖胶回收。

[0023] SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入微生物细胞中，能表达β胡萝卜素酮酶(EC：1.13.-.-)、β胡萝卜素羟化酶(EC：1.14.13)、番茄红素β环化酶(EC：1.14.-.-)、八氢番茄红素去饱和酶(EC：1.14.99)、八氢番茄红素合成酶(EC：2.5.1.32)以及牻牛儿基焦磷酸合成酶(EC：2.5.1.29)，从而合成虾青素。

[0024] SEQ ID No：1序列与表达载体相连接后转入原核生物细胞中，能表达β胡萝卜素酮酶、β胡萝卜素羟化酶、番茄红素β环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、八氢番茄红素合成酶以及牻牛儿基焦磷酸合成酶，从而合成虾青素。

[0025] 表达载体应当包含编码与类胡萝卜素合成或代谢有关的一种或多种酶以及至少一个能通过现有技术(J.萨姆布鲁克等，科学出版社，1994)构建的启动子(promoter)。此外，表达载体还可以含有一些调节子(regulatory element)如：抑制子(repressor)、抗生素标记(如：氨苄青霉素、卡那霉素或新霉素等)或荧光标记(如：绿色荧光蛋白GFP)等。

[0026] 一种表达载体，包括虾青素合成操纵子SEQ ID No：1序列。

[0027] 一种SEQ ID No：1序列转入原核生物细胞的方式，将SEQ ID No：1序列直接与T/A克隆载体相连，4℃连接过夜。然后将该载体转化感受态大肠杆菌DH5α。

[0028] 含有虾青素合成操纵子(SEQ ID No：1)的表达载体转入原核生物细胞后，该细胞能表达β胡萝卜素酮酶、β胡萝卜素羟化酶、番茄红素β环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、八氢番茄红素合成酶以及牻牛儿基焦磷酸合成酶，从而能够合成虾青素。将菌液涂布于LB固体培养基，经过培养能获得橘黄色菌落。

[0029] 一种原核生物合成虾青素的方法为，将SEQ ID No：1序列直接与T/A克隆载体相连，4℃连接过夜。然后将该载体转化感受态大肠杆菌DH5α，将菌液涂布于LB固体培养基上，该细胞能表达β胡萝卜素酮酶、β胡萝卜素羟化酶、番茄红素β环化酶、八氢番茄红素去饱和酶、八氢番茄红素合成酶以及牻牛儿基焦磷酸合成酶，经过培养能获得橘黄色菌落。

[0030] 然后挑取呈橘黄色的大肠杆菌菌落于LB液体培养基中，37℃振荡培养12小时。采用甲醇抽提细菌细胞中的虾青素，使用分光光度计在470nm下的吸光值。根据标准曲线计算样品中虾青素含量。

[0031] 本发明技术方案实现的有益效果

[0032] 副球菌是一类安全、非致病性且对环境污染很小的微生物。通过培养、提取总DNA和PCR扩增后得到的SEQ ID No 1的序列可以应用于虾青素的生产。附图说明

[0033] 图1为PCR扩增所得序列为SEQ ID No：1的虾青素操纵子电泳图，其中泳道1为DNA分子量标记(Marker)；泳道2为从大肠杆菌扩增的对照组；泳道3为从副球菌扩增虾青素的操纵子。；

[0034] 图2为含有序列为SEQ ID No 1大肠杆菌和不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌在LB培养基上培养结果图，其中图的左半边为含有序列为SEQ IDNo：1大肠杆菌菌落，呈橘黄色；图的右半边为不含SEQ ID No：1序列大肠杆菌菌落，呈乳白色；

[0035] 图3为虾青素在470nm附近的吸收光谱。

[0036] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

[0037] 本发明所用的试剂若未经说明，均购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司。

[0038] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书(J.萨姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，科学出版社，1994)。该书及其后续出版版本是本领域技术人员在进行与分子生物学相关的实验操作时最常用的具有指导性的参考书籍。

[0039] 实施例1菌种分离

[0040] 从上海近海深水区取污泥，稀释10-100倍后涂布在LB固体培养基上(15g/L琼脂，5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)，28℃培养24小时。挑取红色菌株，该菌落呈圆形，隆起，表面光滑，湿润，边缘整齐，无色，不产生荧光色素，革兰氏染色反应为阴性的菌株；进一步通过显微镜筛选无鞭毛，无芽孢的杆状菌株。将获得的菌株稀释104后反复在LB固体平板培养基上纯合。

[0041] 实施例2总DNA的提取

[0042] 将实施例1中分离获得的细菌单株在10ml液体LB培养基(5g/L酵母提取物(Invitrogen)，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中培养16小时，菌体培养液以6,000g速度离心5min，得到菌体沉淀。这些沉淀在-20℃下冷冻1hr。之后使用TE(10mM Tris-HCl，1mMEDTA，pH 8.0)溶液清洗一次。加入含有20μl浓度为10mg/mL溶菌酶(Sigma-Aldrich)的无菌水悬浮，在37℃下摇床培养1hr。加入50μL 0.5MEDTA，50μl10％(w/v)SDS和50μl浓度为5M的NaCl轻轻振荡混匀。再加入10μl浓度为20mg/mL蛋白激K(Takara日本)，反应物在37℃下培养1hr。用与培养菌液液体体积相当(1倍体积)的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取DNA。水相用与相当水相体积1/2(0.5倍体积)的氯仿∶异戊醇(24∶1)萃取。振荡混匀后离心5min。水相中加入与水相体积相当(1倍体积)的异戊醇。振荡混匀后离心15min。取沉淀，用70％(v/v)酒精冲洗DNA，干燥，之后在TE缓冲液中重悬浮。所得总DNA储存于4℃下备用。

[0043] 实施例3副球菌菌株同源性分析

[0044] 以实施例2抽提的总DNA为模板，利用16s rRNA两端引物进行扩增。扩增的引物为16SR1：5’CAGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’和16SF：5’TACGGCTACCTTGTTACGACTTC3’。以KOD Plus(Toyobo日本)为Taq DNA聚合酶，扩增条件依次为：94℃30秒，55℃30秒，72℃120秒，扩增30个循环。循环结束后，加入2个单位的rtaq酶(宝生物工程(大连)有限公司)，72℃延伸300秒，扩增片段长1408bp(如下)。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。再将该载体转化入DH5α感受态中。利用ABI Prism Big Dye的ABI3700毛细管自动化测序仪测序，测得的序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行对比分析，得到菌株与Paracoccus属中的许多种菌的16s rRNA有98％的同源性(NCBI)。菌株系统发育地位上属于副球菌属(Paracoccus)。

[0045] 1 cagagtttga tctggcttca ggcttaacac atgcaagtcg agcgagacct tcgggtctag[0046] 61 cggcggacgg gtgagtaacg cgtgggaacg tgcccttctc tacggaatag ccccgggaaa[0047] 121 ctgggagtaa taccgtatac gccctttggg ggaaagattt atcggagaag gatcggcccg[0048] 181 cgttggatta ggtagttggt ggggtaatgg cccaccaagc cgacgatcca tagctggttt[0049] 241 gagaggatga tcagccacac tgggactgag acacggccca gactcctacg ggaggcagca[0050] 301 gtggggaatc ttagacaatg ggggcaaccc tgatctagcc atgccgcgtg agtgatgaag[0051] 361 gccttagggt tgtaaagctc tttcagctgg gaagataatg acggtaccag cagaagaagc[0052] 421 cccggctaac tccgtgccag cagccgcggt aatacggagg gggctagcgt tgttcggaat[0053] 481 tactgggcgt aaagcgcacg tgggcggact ggaaagtcag aggtgaaatc ccagggctca[0054] 541 accttggaac tgcctttgaa actatcagtc tggagttcga gagaggtgag tggaattccg[0055] 601 agtgtagagg tgaaattcgt agatattcgg aggaacacca gtggcgaagg cggctcactg[0056] 661 gctcgatact gacgctgagg tgcgaaagcg tggggagcaa acaggattag ataccctggt[0057] 721 agtccacgcc gtaaacgatg aatgccagac gtcggcaagc atgcttgtcg gtgtcacacc[0058] 781 taacggatta agcattccgc ctggggagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg[0059] 841 acgggggccc gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gcagaacctt[0060] 901 accaaccctt gacatggcag gaccgctgga gagattcagc tttctcgtaa gagacctgca[0061] 961 cacaggtgct gcatggctgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttcggtta agtccggcaa[0062] 1021 cgagcgcaac ccacgtccct agttgccagc attcagttgg gcactctatg gaaactgccg[0063] 1081 atgataagtc ggaggaaggt gtggatgacg tcaagttctc atggccctta cgggttgggc[0064] 1141 tacacacgtg ctacaatggt ggtgacagtg ggttaatccc caaaagccat ctcagttcgg[0065] 1201 attgtcctct gcaactcgag ggcatgaagt tggaatcgct agtaatcgcg gaacagcatg[0066] 1261 ccgcggtgaa tacgttcccg ggccttgtac acaccgcccg tcacaccatg ggagttggtt[0067] 1321 ctacccgacg acgctgcgct aaccttcggg gggcaggcgg ccacggtagg atcagcgact[0068] 1381 ggggtgaagt cgtaacaagg tagccgta

[0069] 实施例4虾青素合成操纵子的扩增

[0070] 以CAT 1：5’GAATTCTGCAGGCGCTGGCGGCGCCGTTCCACGAC3’和CAT2：5’CATAGGCTAAGCCGCGCCGCCCCGCGGGACTATTCTGGCCGATCA3’为扩增引物，以实施例2中制得的总DNA为模版，对虾青素合成相关的操纵子进行PCR扩增。使用KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)，扩增条件依次为：94℃30秒，68℃30秒，72℃600秒，30个循环。然后加入2单位rtaq(宝生物工程(大连)有限公司)，在72℃延伸30分钟。PCR结束后，1％(w/v)琼脂糖凝胶回收，获得长度为6352bp的SEQ ID No：1核苷酸(见图1)。

[0071] 取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)。4℃连接过夜，高效转化DH5α感受态中。37℃培养后，获得橘黄色菌落(见图2)。图2左半边为含有SEQ ID No 1序列的大肠杆菌菌落，呈橘黄色)；右半边为不含SEQ ID No 1序列大肠杆菌菌落，呈乳白色)。

[0072] 实施例5虾青素合成操纵子基因的合成

[0073] 以基因合成方法(Nucleic Acids Research，2004，32，e98)将虾青素操纵子(SEQ ID No：1)克隆。设计的引物如下：

[0074] 1.EMPII-1：

[0075] GAA，TTG，ACT，GCA，GGA，ACT，GGC，AGC，GCC，GAT，CCA，CGA，CTG，GAG，CAT，CCC，CAC，GAC，CGC，GTC

[0076] 2.EMPII-2：

[0077] ACC，CGG，TCC，CGC，CCC，ATC，ATC，GGC，GCT，GTG，GCG，CGC，AGC，GAC，GCG，GTC，GTG，GGG，ATG，CTC

[0078] 3.EMPII-3：

[0079] GAT，GAT，GGG，GCG，GGA，CCG，GGT，TCT，GAC，CGG，GTC，GGG，CGG，GCT，GCG，TCA，CGG，GAA，GGA，CAC

[0080] 4.EMPII-4：

[0081] TGC，CCC，ACG，AGG，TCC，GCG，CCA，TCG，CGG，ATG，GAT，TTC，GCG，GTG，TCC，TTC，CCG，TGA，CGC，AGC

[0082] 5.EMPII-5：

[0083] TGG，CGC，GGA，CCT，CGT，GGG，GCA，AGC，GGC，GCG，CGC，TTT，GCC，CGC，CGC，GGG，CCA，CAG，CGC，CTT

[0084] 6.EMPII-6：

[0085] AGC，TGC，CTC，ACG，ACG，TGG，GAC，AGG，TGA，TCG，AAC，AGG，GCC，AAG，GCG，CTG，TGG，CCC，GCG，GCG

[0086] 7.EMPII-7：

[0087] GTC，CCA，CGT，CGT，GAG，GCA，GCT，GCG，CAT，GGC，CAT，GTA，CTG，CAC，CGG，ATC，CGC，CGA，CCT，TGC

[0088] 8.EMPII-8：

[0089] CCA，GGC，CGT，GGC，ACC，AGC，ACC，GGC，GCG，CTG，CGC，AGC，GCC，GCA，AGG，TCG，GCG，GAT，CCG，GTG

[0090] 9.EMPII-9：

[0091] GGT，GCT，GGT，GCC，ACG，GCC，TGG，TGG，CCA，ATG，GTC，GCA，AAG，AAC，GGG，GAT，GGA，CCC，CGG，CGC

[0092] 10.EMPII-10：

[0093] TCC，CCC，GGA，GTC，GCG，ATC，GGC，GCA，GAG，TAC，AGT，CCC，GCG，GCG，CCG，GGG，TCC，ATC，CCC，GTT

[0094] 11.EMPII-11：

[0095] GCC，GAT，CGC，GAC，TCC，GGG，GGA，CAA，GAT，GAG，CGC，ACA，TGC，CCT，GCC，CAA，GGC，AGT，TCT，GAC

[0096] 12.EMPII-12：

[0097] GCG，GCG，TTG，ATG，CCG，TTC，GAG，ACG，ATC，AGG，CTT，GTG，GCG，GTC，AGA，ACT，GCC，TTG，GGC，AGG

[0098] 13.EMPII-13：

[0099] CTC，GAA，CGG，CAT，CAA，CGC，CGC，ATG，GCT，TGC，AAT，GCA，TGT，GCA，TGC，GCT，GTG，GTT，TCT，GGA

[0100] 14.EMPII-14：

[0101] AGG，TGA，CCC，GCG，ACC，GGC，AGG，ATG，CCA，TGG，GCC，GCC，GCG，TCC，AGA，AAC，CAC，AGC，GCA，TGC

[0102] 15.EMPII-15：

[0103] CCT，GCC，GGT，CGC，GGG，TCA，CCT，GGC，CCT，GGC，CTG，GCT，GTT，GGT，CGG，ATT，GTT，CAT，CAT，CGC

[0104] 16.EMPII-16：

[0105] GCA，CGC，GCC，GGC，ACG，TCC，GAC，CCG，TGC，ATC，GCG，CCA，TGC，GCG，ATG，ATG，AAC，AAT，CCG，ACC

[0106] 17.EMPII-17：

[0107] GTC，GGA，CGT，GCC，GGC，GCG，TGC，GCG，CGG，CAA，TGC，GCC，GAT，GCC，CCA，GCA，TGT，CCT，GAT，ACT

[0108] 18.EMPII-18：

[0109] TGC，TTG，ACG，ATC，ATC，TTG，CGC，CAC，GAA，AAT，CCG，GCA，AAG，AGT，ATC，AGG，ACA，TGC，TGG，GGC

[0110] 19.EMPII-19：

[0111] GCG，CAA，GAT，GAT，CGT，CAA，GCA，CAT，GGC，CGA，TCA，CCG，CCA，TGC，TGG，AAC，AAA，CGA，CGA，GCC

[0112] 20.EMPII-20：

[0113] CGC，GCG，TAC，CAG，CGG，ACC，GCG，GCG，CCA，TGG，TCG，AAA，TCT，GGC，TCG，TCG，TTT，GTT，CCA，GCA

[0114] 21.EMPII-21：

[0115] CGC，GGT，CCG，CTG，GTA，CGC，GCG，CTT，CAT，CGG，CAC，CTG，TTT，CGG，CTG，GCG，CGA，CCG，GGT，GCT

[0116] 22.EMPII-22：

[0117] CCC，AGC，ATC，AGC，GCA，TAC，AAC，GTC，ACG，TTG，ACG，GGC，AGC，AGC，ACC，CGG，TCG，CGC，CAG，CCG

[0118] 23.EMPII-23：

[0119] GTT，GTA，TGC，GCT，GAT，GCT，GGG，AAA，TCG，CTG，CAT，GTA，CGT，GGT，CAA，CTG，GCC，GAT，GCC，GTC

[0120] 24.EMPII-24：

[0121] CAA，GTG，GGG，AAC，ACG，CAC，AGC，CGG，ATC，GAC，GGG，AGG，ATC，GAC，GGC，ATC，GGC，CAG，TTG，ACC

[0122] 25.EMPII-25：

[0123] GCT，GTG，CGT，GTT，CCC，CAC，TTG，GCT，GCG，GCA，CCG，GGC，CGG，CCA，CGA，CGC，TAT，CCC，GGA，CCG

[0124] 26.EMPII-26：

[0125] GAC，ACA，GGG，TCG，CTG，ATC，CGC，GAC，GAG，CGC，GCA，TTA，TGG，CGG，TCC，GGG，ATA，GCG，TCG，TGG

[0126] 27.EMPII-27：

[0127] GCG，GAT，CAG，CGA，CCC，TGT，GTC，GCT，GCT，GAG，CTG，CTA，TCA，AAT，TGG，CCG，TTA，TCA，TCA，CGT

[0128] 28.EMPII-28：

[0129] CGC，AGG，CGC，AAC，CAC，GGC，ACC，GTC，GGG，TGC，CGG，TGG，TGA，ACG，TGA，TGA，TAA，CGG，CCA，ATT

[0130] 29.EMPII-29：

[0131] GGT，GCC，GTG，GTT，GCG，CCT，GCG，CAG，CAC，CCG，CAC，CAA，GGT，GGC，CAC，CGC，ATG，ACG，AAT，TTG

[0132] 30.EMPII-30：

[0133] CGT，CAA，CTC，CAT，CAC，CAG，CAC，GGT，GGC，GAC，GAC，GAT，CAG，CAA，ATT，CGT，CAT，GCG，GTG，GCC

[0134] 31.EMPII-31：

[0135] GTG，CTG，GTG，ATG，GAG，TTG，ACG，AAG，TAT，TCC，GTC，CAA，CGC，TGG，ATA，CAG，CAC，GGA，AGG，CTG

[0136] 32.EMPII-32：

[0137] GTC，GTG，TTC，CTC，GTG，GTG，GGA，CGG，GTG，CCA，GCC，CAA，GCG，CAG，CCT，TCC，GTG，CTG，TAT，CCA

[0138] 33.EMPII-33：

[0139] TCC，CAC，CAC，GAG，GAA，CAC，GAC，CAC，GGG，CTG，GAA，GAG，AAC，GAG，GTG，TAC，GGC，CTG，GTA，CCC

[0140] 34.EMPII-34：

[0141] GAT，CCA，GCG，GAC，CGT，GCA，CAG，CAG，CGT，GGC，GAT，CAC，CGC，GGG，TAC，CAG，GCC，GTA，CAC，CTC

[0142] 35.EMPII-35：

[0143] CTG，TGC，ACG，GTC，CGC，TGG，ATC，TAA，ACG，CCG，GTC，CTG，TGG，TGG，ATC，GGG，TTG，GGC，ATG，ACC

[0144] 36.EMPII-36：

[0145] CAC，AAA，ATC，ATG，CAG，GAC，GCC，ATA，GAT，CAG，CCA，ATA，GAC，GGT，CAT，GCC，CAA，CCC，GAT，CCA

[0146] 37.EMPII-37：

[0147] GGC，GTC，CTG，CAT，GAT，TTT，GTG，GTT，CAT，CAG，CGC，TGG，CCA，ATC，CGC，TAC，ATC，CCG，CGC，GGC

[0148] 38.EMPII-38：

[0149] CTG，CAG，GCG，GTC，TTC，CTG，ATA，CAG，GCG，TCT，GCG，ATA，GCC，GCC，GCG，CGG，GAT，GTA，GCG，GAT

[0150] 39.EMPII-39：

[0151] TAT，CAG，GAA，GAC，CGC，CTG，CAG，CAT，GCG，GTC，GAG，CCG，CGC，CCG，CAT，TGC，GTC，AGC，TTC，GGC

[0152] 40.EMPII-40：

[0153] GTC，CTG，CTG，CAG，CTT，GTC，GAC，GAG，GCC，CGC，ATA，GAA，GAA，GCC，GAA，GCT，GAC，GCA，ATG，CGG

[0154] 41.EMPII-41：

[0155] GTC，GAC，AAG，CTG，CAG，CAG，GAC，GTG，AAG，ACG，TCA，AGC，GTA，CTG，CGG，GCC，GAC，CCG，GAG，GAG

[0156] 42.EMPII-42：

[0157] GGC，TCG，AGG，CTG，CCA，GCA，GCA，CGT，CAT，CCG，TCA，CGT，GGG，CTC，CTC，CGG，GTC，GGC，CCG，CAG

[0158] 43.EMPII-43：

[0159] TGC，TGC，TGG，CAG，CCT，CGA，GCC，TTG，CGA，ACG，CCC，TGA，TCG，CCC，TCG，CGC，TGC，GAC，CGG，CGC

[0160] 44.EMPII-44：

[0161] CCG，CCG，CAT，GGT，CCA，GCA，GCA，GCA，CGG，GCA，GGT，CGC，CCC，GCG，CCG，GTC，GCA，GCG，CGA，GGG

[0162] 45.EMPII-45：

[0163] TGC，TGC，TGG，ACC，ATG，CGG，CGG，GAC，CGT，CAG，AAG，GGG，ATA，CCT，GGT，CAT，GCC，ACG，AGG，GCG

[0164] 46.EMPII-46：

[0165] GCC，GGG，GCT，TCA，GGC，GCG，GGA，GGG，AGT，GCG，GCG，ACA，GAT，CGC，CCT，CGT，GGC，ATG，ACC，AGG

[0166] 47.EMPII-47：

[0167] TCC，CGC，GCC，TGA，AGC，CCC，GGC，GCC，GCG，CCA，ACT，GGC，GGG，ACC，AGG，AGG，TGC，GCT，TTC，GGG

[0168] 48.EMPII-48：

[0169] CCA，GCG，AGC，CGT，AAC，CGG，TTG，CCA，GCC，GCC，TTG，CAT，GGC，CCC，GAA，AGC，GCA，CCT，CCT，GGT

[0170] 49.EMPII-49：

[0171] CAA，CCG，GTT，ACG，GCT，CGC，TGG，ACG，AGG，CGG，GGC，TGG，CGG，ATG，CGG，TGG，TCA，GGT，CGG，GCG

[0172] 50.EMPII-50：

[0173] CAT，CCA，GCA，AGG，CGA，TGT，CGC，TGT，GGG，AGC，GGA，TCT，CCC，CGC，CCG，ACC，TGA，CCA，CCG，CAT

[0174] 51.EMPII-51：

[0175] GCG，ACA，TCG，CCT，TGC，TGG，ATG，CGC，CGG，GCC，GGA，CAC，TGT，CCT，GGG，GCA，CCC，CCA，TCG，AGG

[0176] 52.EMPII-52：

[0177] GGG，ACT，TGT，GCG，GGC，GGG，GCC，CGT，CCA，GGA，GGG，AGC，CGG，CCT，CGA，TGG，GGG，TGC，CCC，AGG

[0178] 53.EMPII-53：

[0179] GGC，CCC，GCC，CGC，ACA，AGT，CCC，GGC，AAC，TGA，CCT，TCC，GTT，TCC，ACT，CCA，TCC，TGG，GTG，TCG

[0180] 54.EMPII-54：

[0181] CCG，GCC，CCG，GCA，CGG，CGT，GGT，TGC，CGT，CGG，TCT，CGA，TCT，CGA，CAC，CCA，GGA，TGG，AGT，GGA

[0182] 55.EMPII-55：

[0183] ACC，ACG，CCG，TGC，CGG，GGC，CGG，TGA，TCA，TGG，ACG，GGA，CAG，TCA，CCC，AGC，CCG，ACG，GGT，ACG

[0184] 56.EMPII-56：

[0185] GGA，TGC，GCG，TCC，GAA，AGA，ACC，GCA，GCA，GAT，AAT，GAA，AGC，CGT，ACC，CGT，CGG，GCT，GGG，TGA

[0186] 57.EMPII-57：

[0187] GGT，TCT，TTC，GGA，CGC，GCA，TCC，TGA，TCG，AGG，GCA，CGC，GCT，ATT，CCG，ATT，GCG，GCG，ATC，TCG

[0188] 58.EMPII-58：

[0189] CCG，CAT，AGT，CTT，GGG，ACG，CCG，GGG，CCA，GCG，CGT，CGT，CGT，CGA，GAT，CGC，CGC，AAT，CGG，AAT

[0190] 59.EMPII-59：

[0191] CGG，CGT，CCC，AAG，ACT，ATG，CGG，GCC，AGC，AGG，GTT，GAA，CCC，CGG，CCG，AGG，TCC，GGC，GCG，AAC

[0192] 60.EMPII-60：

[0193] TCG，CTT，CGT，CAT，GGG，CCA，ACG，CAA，TAG，GCT，GGA，TGC，CCC，GTT，CGC，GCC，GGA，CCT，CGG，CCG

[0194] 61.EMPII-61：

[0195] CGT，TGG，CCC，ATG，ACG，AAG，CGA，CCT，TCT，GGC，CCG，ATC，ACG，CGG，AGG，CCC，CTG，TTC，GGG，TGG

[0196] 62.EMPII-62：

[0197] AAT，AGC，CCG，TGA，CCG，TTT，GAA，AGA，ACC，GGG，CGC，GCA，TTT，CCA，CCC，GAA，CAG，GGG，CCT，CCG

[0198] 63.EMPII-63：

[0199] TTC，AAA，CGG，TCA，CGG，GCT，ATT，CGC，TGC，GGT，ATG，CGG，GGC，AGG，TGG，CGG，ACG，CGG，TGG，CGG

[0200] 64.EMPII-64：

[0201] CGG，GGC，GCA，GCG，CGT，CGG，TGC，CGC，CCG，GCC，CGG，ACA，GCG，CCG，CCA，CCG，CGT，CCG，CCA，CCT

[0202] 65.EMPII-65：

[0203] GCA，CCG，ACG，CGC，TGC，GCC，CCG，CCA，TCC，GCG，ATC，ACG，CGA，TCG，ACC，CAG，CAC，GCC，GCG，ACC

[0204] 66.EMPII-66：

[0205] AGC，GGC，GGA，ACA，CCA，TCC，GGT，TCA，GCA，GGC，GCA，GGA，AGC，GGT，CGC，GGC，GTG，CTG，GGT，CGA

[0206] 67.EMPII-67：

[0207] ACC，GGA，TGG，TGT，TCC，GCC，GCT，GCG，CGA，ACG，ACC，CCC，GCT，ATA，CCC，TGC，TGC，AGC，GGG，TAT

[0208] 68.EMPII-68：

[0209] CGG，CAT，AGA，CCC，GTT，CGA，TCA，GTC，CAT，GCG，GCA，TGC，GGT，ATA，CCC，GCT，GCA，GCA，GGG，TAT

[0210] 69.EMPII 69：

[0211] TGA，TCG，AAC，GGG，TCT，ATG，CCG，GCC，CGC，TGA，AGG，TGG，CGC，AAC，AGC，TGC，GCA，TCG，TGA，CAG

[0212] 70.EMPII-70：

[0213] GGC，AGC，GTA，TGC，GGG，TGC，CAA，CGC，GAA，TGC，CTG，GCT，TGC，CTG，TCA，CGA，TGC，GCA，GCT，GTT

[0214] 71.EMPII-71：

[0215] TTG，GCA，CCC，GCA，TAC，GCT，GCC，TGG，CGG，AAC，GAC，CGG，TGC，ATG，AAG，AAA，ACG，CAT，GAA，CGC

[0216] 72.EMPII-72：

[0217] GCG，CCG，ATC，ACG，ATG，GCG，GTT，TTG，GCC，GCG，GGC，GAA，TGG，GCG，TTC，ATG，CGT，TTT，CTT，CAT

[0218] 73.EMPII-73：

[0219] AAC，CGC，CAT，CGT，GAT，CGG，CGC，TGG，CTT，TGG，CGC，GCA，GGG，CCT，GGC，CAT，CCG，CCT，GCA，GTC

[0220] 74.EMPII-74：

[0221] TTG，TCG，CGG，GCC，TCG，ACA，AGG，GTG，GTG，GCG，ATG，TGC，GCG，GAC，TGC，AGG，CGG，ATG，GCC，AGG

[0222] 75.EMPII-75：

[0223] CCT，TGT，CGA，GGC，CCG，CGA，CAA，GCC，CGG，CCA，GCG，CGC，CTA，TGT，CAG，CCA，CGA，TCA，GGA，CCA

[0224] 76.EMPII-76：

[0225] CCG，GTT，TCG，GTG，ATG，ACA，GTC，GGG，GGC，GCG，TCG，GGG，ACA，TGG，TCC，TGA，TCG，TGG，CTG，ACA

[0226] 77.EMPII-77：

[0227] GAC，TGT，CAT，CAC，CGA，AAC，CGG，TGC，GGT，CAA，GGA，GCT，GTG，AGC，GCT，GAA，CGG，GCA，GGA，CAT

[0228] 78.EMPII-78：

[0229] TAG，AAG，CCC，GAC，AGC，GGC，ATC，AGC，GTC，ACC，TCG，CGC，GAA，ATG，TCC，TGC，CCG，TTC，AGC，GCT

[0230] 79.EMPII-79：

[0231] GAT，GCC，GCT，GTC，GGG，CTT，CTA，TCG，GCT，GTT，GTG，GCC，GGG，CCC，CAA，GTT，CTA，CGA，TTA，CGT

[0232] 80.EMPII-80：

[0233] AAC，TTT，TCG，AAA，TGG，CGT，TCC，TGC，TGA，TCG，GGC，TCG，TTC，ACG，TAA，TCG，TAG，AAC，TTG，GGG

[0234] 81.EMPII-81：

[0235] GGA，ACG，CCA，TTT，CGA，AAA，GTT，CAA，CCC，GGA，CAA，CCT，GGA，AGG，AGA，CCG，TCG，CAT，CCG，TGA

[0236] 82.EMPII-82：

[0237] AGC，TTG，ACG，TAG，GGG，TCC，TGG，TAC，ACG，GGC，TCA，GCG，TGA，TCA，CGG，ATG，CGA，CGG，TCT，CCT

[0238] 83.EMPII-83：

[0239] CCA，GGA，CCC，CTA，CGT，CAA，GCT，GGG，CAC，CGT，GGC，CTT，CCT，CAA，GCT，GGG，CCA，AAT，GCT，CAA

[0240] 84.EMPII-84：

[0241] GAA，TTG，TAT，GCC，TCA，AGC，TTC，ATC，AGC，GCG，CCC，GCG，GCC，TTG，AGC，ATT，TGG，CCC，AGC，TTG

[0242] 85.EMPII-85：

[0243] GAA，GCT，TGA，GGC，ATA，CAA，TTC，CGT，CCA，TGC，CAA，GGT，CGC，GAC，CTT，CAT，CAA，GGA，CCC，CTA

[0244] 86.EMPII-86：

[0245] CCC，ACC，AGC，AGC，GTC，TGA，TAC，GAA，GCG，GCT，TGC，CGC，AGA，TAG，GGG，TCC，TTG，ATG，AAG，GTC

[0246] 87.EMPII-87：

[0247] GTA，TCA，GAC，GCT，GCT，GGT，GGG，CGG，GAA，TTA，TTT，CTC，GCA，CAG，CTC，GAT，CTA，TGC，GCT，GAT

[0248] 88.EMPII-88：

[0249] TTG，GCG，AAC，CAG，ACG，GCG，GCG，CGC，CGC，GCC，AGC，GCG，TGG，ATC，AGC，GCA，TAG，ATC，GAG，CTG

[0250] 89.EMPII-89：

[0251] CGC，CGC，CGT，CTG，GTT，CGC，CAA，CCC，CAA，CAC，CAA，CCA，GCT，GGT，CGC，CCG，CAT，GGT，CGC，GCT

[0252] 90.EMPII-90：

[0253] TTG，GCG，TTC，AGC，ATC，ATC，TGG，CCG，CCT，GGG，CGT，TCG，AAC，AGC，GCG，ACC，ATG，CGG，GCG，ACC

[0254] 91.EMPII-91：

[0255] CCA，GAT，GAT，GCT，GAA，CGC，CAA，GGT，CGC，CCG，CAT，CGA，GAC，CGA，GCC，CGC，GCG，CAC，TAC，CCG

[0256] 92.EMPII-92：

[0257] ATG，TCG，CCG，GTC，ATT，GAC，CGC，CCG，TCC，GCC，AGG，GTG，ACG，CGG，GTA，GTG，CGC，GCG，GGC，TCG

[0258] 93.EMPII-93：

[0259] GCG，GTC，AAT，GAC，CGG，CGA，CAT，GGA，CGC，CAG，CAA，CTG，CGA，CGT，CAT，GCA，CAA，CTA，TCG，CGA

[0260] 94.EMPII-94：

[0261] CCC，GCG，TCG，CTC，TGC，GCG，CGG，GCC，GTG，TGG，CGC，AAC，AGG，TCG，CGA，TAG，TTG，TGC，ATG，ACG

[0262] 95.EMPII-95：

[0263] CCG，CGC，GCA，GAG，CGA，CGC，GGG，ATC，GCT，CCA，CCG，CAA，GCG，CTG，GTC，GAT，GTC，GTT，GTT，CGT

[0264] 96.EMPII-96：

[0265] GCG，ATG，TCC，TTC，GCC，GCC，TCG，CCC，AGA，CCG，AAT，TGC，AGC，ACG，AAC，AAC，GAC，ATC，GAC，CAG

[0266] 97.EMPII-97：

[0267] CGA，GGC，GGC，GAA，GGA，CAT，CGC，GCA，TCA，CAC，CAT，CCT，GTT，CGG，CCC，CGG，CTA，CAA，GGA，GCC

[0268] 98.EMPII-98：

[0269] TCC，TCG，GCC，AGC，TCC，GGG，CGT，TTG，AAT，ATC，TCG，TTG，ACC，GGC，TCC，TTG，TAG，CCG，GGG，CCG

[0270] 99.EMPII-99：

[0271] ACG，CCC，GGA，GCT，GGC，CGA，GGA，TTT，CTC，GCG，GTA，TCG，GCA，TTC，GCC，CTG，CAC，CAC，CGA，TCC

[0272] 100.EMPII-100：

[0273] AGC，ACG，TAA，GGC，GTG，GAC，ATG，CCC，GGA，GCC，GCC，ATG，TCC，GGA，TCG，GTG，GTG，CAG，GGC，GAA

[0274] 101.EMPII-101：

[0275] CAT，GTC，CAC，GCC，TTA，CGT，GCT，GGG，CGC，GGT，GCC，GCA，TCT，GAG，CCG，CGC，CGA，GAT，CGA，TTG

[0276] 102.EMPII-102：

[0277] GCC，AGG，ATG，CGG，TCG，GCA，TAG，CGC，GGG，CCC，TCG，ACC，GCC，CAA，TCG，ATC，TCG，GCG，CGG，CTC

[0278] 103.EMPII-103：

[0279] CTA，TGC，CGA，CCG，CAT，CCT，GGC，ATT，CCT，CCA，GGA，GCG，GCT，GAT，CCC，GAA，CTT，GGG，CGC，CAA

[0280] 104.EMPII-104：

[0281] GCG，AAT，TCG，GCG，CCC，GTG，AAA，ATG，CGC，GTC，CTG，CTC，AGG，TTG，GCG，CCC，AAG，TTC，GGG，ATC

[0282] 105.EMPII-105：

[0283] TTT，CAC，GGG，CGC，CGA，ATT，CGC，CAG，TGA，ACT，GAA，CCG，GCA，TCA，CGG，CAG，CGC，TTT，CCC，GGT

[0284] 106.EMPII-106：

[0285] TGC，GGC，CGG，AAC，CAC，GCG，GAT，TGC，GTC，AGG，ATC，GGC，TCG，ACC，GGG，AAA，GCG，CTG，CCG，TGA

[0286] 107.EMPII-107：

[0287] ATC，CGC，GTG，GTT，CCG，GCC，GCA，CAA，CCG，CCA，CAA，GAC，GAT，CCG，CAA，CCC，CTA，TCT，GGT，CGG

[0288] 108.EMPII-108：

[0289] ACG，ACG，CCG，GGA，ATT，TCC，GCC，GGC，GGA，TGG，GTG，GGC，GCG，CCG，ACC，AGA，TAG，GGG，TTG，CGG

[0290] 109.EMPII-109：

[0291] GGC，GGA，AAT，TCC，CGG，CGT，CGT，GGG，CTC，GGC，CAA，AGC，CAC，GGC，CCA，GGT，GAT，GCT，GTC，CGA

[0292] 110.EMPII-110：

[0293] CCT，CGA，GGT，CAG，GAG，CAG，ATC，GCT，CAT，GCC，CTC，GCC，AAG，TCG，GAC，AGC，ATC，ACC，TGG，GCC

[0294] 111.EMPII-111：

[0295] GAT，CTG，CTC，CTG，ACC，TCG，AGG，GAA，GCG，ATC，ACC，CAA，GGG，TCG，CGA，AGC，TTT，GGC，ACG，GCG

[0296] 112.EMPII-112：

[0297] CAC，CGT，GTC，GTC，GCC，GAT，ACC，CGG，CGG，CAT，CAG，CTT，CCG，CGC，CGT，GCC，AAA，GCT，TCG，CGA

[0298] 113.EMPII-113：

[0299] GGT，ATC，GGC，GAC，GAC，ACG，GTG，ATG，CTC，TAT，GCC，TGG，TGC，CGG，GAC，GCG，GAT，GAC，GTG，ATC

[0300] 114.EMPII-114：

[0301] GTT，CAC，CGC，CTC，CGG，CCT，TCT，GCC，CAC，CGC，CTG，ACC，GTC，GAT，CAC，GTC，ATC，CGC，GTC，CCG

[0302] 115.EMPII-115：

[0303] AGA，AGG，CCG，GAG，GCG，GTG，AAC，GAG，GAA，CAG，GCG，CGG，CTG，GAC，GGC，CTG，CGT，GCC，GAC，ACG

[0304] 116.EMPII-116：

[0305] GGG，CCG，CGT，CAC，CGG，ACC，GTC，GCC，CTG，CAC，CGC，CGC，CAG，CGT，GTC，GGC，ACG，CAG，GCC，GTC

[0306] 117.EMPII-117：

[0307] GAC，GGT，CCG，GTG，ACG，CGG，CCC，TTT，GCG，GCC，CTG，CGC，GCG，GTG，GCG，CGC，AGG，CAT，GAT，TTC

[0308] 118.EMPII-118：

[0309] CGC，AAA，GCC，TTC，GAT，CAG，GTC，CAT，GGG，CCA，GGG，CTG，CCC，GAA，ATC，ATG，CCT，GCG，CGC，CAC

[0310] 119.EMPII-119：

[0311] GAC，CTG，ATC，GAA，GGC，TTT，GCG，ATT，GAT，GAA，GAG，GCG，CGC，GAC，TAT，CGC，AGG，CTG，GAT，GAC

[0312] 120.EMPII-120：

[0313] GGC，GAG，GAT，ATG，CGC，GAC，GTG，ATA，GGA，ATT，TTC，CAG，CAC，GTC，ATC，CAG，CCT，GCG，ATA，GTC

[0314] 121.EMPII-121：

[0315] CAC，GTC，GCG，CAT，ATC，CTC，GCC，GTG，ATG，ATG，GCC，CGC，GTG，ATG，GGC，GTG，CGC，GAC，CAT，CTT

[0316] 122.EMPII-122：

[0317] CTG，GAA，CGC，CAG，GGG，CAG，GTC，GCA，GGG，CCG，GTC，CAG，GAC，AAG，ATG，GTC，GCG，CAC，GCC，CAT

[0318] 123.EMPII-123：

[0319] GAC，CTG，CCC，CTG，GCG，TTC，CAG，CTG，ACC，CAC，ATC，GCG，CGC，GAC，GTG，ATC，GAC，TAT，GCC，CGC

[0320] 124.EMPII-124：

[0321] GTG，GTC，CAG，CCA，GTC，CCC，CGG，CAG，ATA，GCA，CGG，CGG，GAT，GCG，GGC，ATA，GTC，GAT，CAC，GTC

[0322] 125.EMPII-125：

[0323] CCG，GGG，GAC，TGG，CTG，GAC，CAC，GCG，GGC，GCG，CGG，GTC，CAC，GGG，CCG，GTG，GCC，TCA，CCC，GAA

[0324] 126.EMPII-126：

[0325] TTC，CGC，GGC，ATC，CAG，CAG，CCG，CAG，GAT，CAC，GGT，GTA，CAG，TTC，GGG，TGA，GGC，CAC，CGG，CCC

[0326] 127.EMPII-127：

[0327] CGG，CTG，CTG，GAT，GCC，GCG，GAA，GGC，TAT，TAC，CCG，TCC，GCG，CCC，GTC，CGT，CTG，GCG，GAT，CTG

[0328] 128.EMPII-128：

[0329] CCG，AAA，CGC，GGC，CCG，GAT，GTT，CCA，GGC，GCA，GCG，AGG，CGG，CAG，ATC，CGC，CAG，ACG，GAC，GGG

[0330] 129.EMPII-129：

[0331] AAC，ATC，CGG，GCC，GCG，TTT，CGG，ATC，TAT，CGC，GGG，ATC，CCG，CTG，CCC，ATC，GGC，AAG，GGC，CCG

[0332] 130.EMPII-130：

[0333] GCC，CTT，GGA，CGT，GCT，GAT，CGG，TTG，GCG，ATA，GGC，CTC，CGG，CGG，GCC，CTT，GCC，GAT，GGG，CAG

[0334] 131.EMPII-131：

[0335] CCG，ATC，AGC，ACG，TCC，AAG，GGC，GCC，AAA，ATC，GCT，CTG，CTC，CGC，AAC，GGC，CCC，TGG，GAT，GTC

[0336] 132.EMPII-132：

[0337] CTG，CCG，TGA，CAC，GCC，CGA，CGG，CCG，GCA，GGC，GTG，ATC，GGC，GAC，ATC，CCA，GGG，GCC，GTT，GCG

[0338] 133.EMPII-133：

[0339] CCG，TCG，GGC，GTG，TCA，CGG，CAG，GAC，TCC，TGG，ACG，GGC，CCG，CAT，CAC，GGC，TAG，GCG，CGC，GCG

[0340] 134.EMPII-134：

[0341] GGA，AAT，TGA，GGC，TGT，GCT，GGA，ACC，CGC，GTT，GCC，TTA，CGG，CGC，GCG，CGC，CTA，GCC，GTG，ATG

[0342] 135.EMPII-135：

[0343] TCC，AGC，ACA，GCC，TCA，ATT，TCC，GGA，GGG，TGA，AGG，CGC，TTG，CTG，GGC，ACC，ATC，CCA，TTC，AGC

[0344] 136.EMPII-136：

[0345] GCA，GAA，AGT，GTG，CGG，CCA，GTA，TGA，GGC，CAG，CCG，CGG，GCA，GCT，GAA，TGG，GAT，GGT，GCC，CAG

[0346] 137.EMPII-137：

[0347] TAC，TGG，CCG，CAC，ACT，TTC，TGC，AGG，TCT，GAC，ACG，GCG，AGA，ACC，CCT，CGC，CAC，GCG，CCG，GAC

[0348] 138.EMPII-138：

[0349] GGC，GGC，GCT，GGG，CAA，GGA，TAC，GGG，TCG，CGA，TGC，GGC，TTG，GTC，CGG，CGC，GTG，GCG，AGG，GGT

[0350] 139.EMPII-139：

[0351] GTA，TCC，TTG，CCC，AGC，GCC，GCC，TGG，TCG，CCC，AGA，ACT，TCC，AGC，AGG，TCG，TCA，TAG，GAC，TGA

[0352] 140.EMPII-140：

[0353] CCA，GAT，GCT，TGA，TTT，TCG，CCG，TCA，GCT，GGG，CCG，GGT，GTT，TCA，GTC，CTA，TGA，CGA，CCT，GCT

[0354] 141.EMPII-141：

[0355] CGG，CGA，AAA，TCA，AGC，ATC，TGG，ATC，TGC，TTC，TCG，GCG，TCG，ACC，TCT，TTG，ATC，ACG，GCC，AGC

[0356] 142.EMPII-142：

[0357] CCT，GAG，GAC，CGG，CGT，GTT，GTT，CAT，CGA，GGG，ACT，GAA，GAT，GCT，GGC，CGT，GAT，CAA，AGA，GGT

[0358] 143.EMPII-143：

[0359] AAC，AAC，ACG，CCG，GTC，CTC，AGG，TCC，TGT，TCC，TGG，TCG，ACC，CCC，GCG，CCG，TTC，TTG，TCC，GCA

[0360] 144.EMPII-144：

[0361] GCC，GCA，GCG，CCT，GTG，CGC，CGG，CCA，GGA，CCT，GGA，CTT，GCA，TGC，GGA，CAA，GAA，CGG，CGC，GGG

[0362] 145.EMPII-145：

[0363] CCG，GCG，CAC，AGG，CGC，TGC，GGC，CCC，AGG，GAC，CGC，GAC，TGG，ATC，CGC，ACC，AGC，TGC，GCC，CGC

[0364] 146.EMPII-146：

[0365] GTG，GCT，GCT，GGC，CGG，TGC，GCG，CGG，CGC，GTC，GGG，CAC，GGT，GCG，GGC，GCA，GCT，GGT，GCG，GAT

[0366] 147.EMPII-147：

[0367] CGC，GCA，CCG，GCC，AGC，AGC，CAC，ATC，GCC，TCG，GTG，ATC，AAA，GCG，ATG，CCA，AGC，AGC，ACG，GCG

[0368] 148.EMPII-148：

[0369] CGG，CCA，GCT，GGC，GAC，CCA，TCT，GGC，GCA，TGT，CGA，TAG，CCT，CGC，CGT，GCT，GCT，TGG，CAT，CGC

[0370] 149.EMPII-149：

[0371] AGA，TGG，GTC，GCC，AGC，TGG，CCG，CCG，CGC，AGG，GCG，GCA，TCG，TGC，ATG，CAG，CCC，AGG，TCG，TCG

[0372] 150.EMPII-150：

[0373] TTG，CGC，CCT，CGA，GAT，TGT，GCA，TGC，CGC，ATC，GCT，GAT，CGT，CGA，CGA，CCT，GGG，CTG，CAT，GCA

[0374] 151.EMPII-151：

[0375] TGC，ACA，ATC，TCG，AGG，GCG，CAA，GCC，GCG，TCG，ACG，ATC，GTG，TAG，CAG，ACC，GGG，CCC，GAA，GCC

[0376] 152.EMPII-152：

[0377] CAA，GCG，TCC，CCG，CGG，CAT，GCT，GAT，GCT，GCT，TGC，GGG，CGA，GGC，TTC，GGG，CCC，GGT，CTG，CTA

[0378] 153.EMPII-153：

[0379] AGC，ATG，CCG，CGG，GGA，CGC，TTG，CGG，GAG，GAC，AGC，GCC，GCC，AAA，GCG，GCG，CCA，AGC，GGC，TGC

[0380] 154.EMPII-154：

[0381] CAG，AAT，TGA，GGA，GAT，CCG，CCA，GCC，ATT，CGG，TGC，TGC，GTT，GCA，GCC，GCT，TGG，CGC，CGC，TTT

[0382] 155.EMPII-155：

[0383] TGG，CGG，ATC，TCC，TCA，ATT，CTG，GTC，TGC，GGA，AGG，GTG，GCG，TGG，ATC，GCC，TTG，ACG，TCT，CGT

[0384] 156.EMPII-156：

[0385] AAC，GCC，AGG，TCA，GAA，CCC，AAG，CGC，GAA，GGC，ACT，GAT，GAG，ACG，AGA，CGT，CAA，GGC，GAT，CCA

[0386] 157.EMPII-157：

[0387] CTT，GGG，TTC，TGA，CCT，GGC，GTT，ATG，GCC，TGG，CCC，GCC，GTG，GTA，TCG，GGC，AGA，CGG，TCA，TCC

[0388] 158.EMPII-158：

[0389] ATC，GGC，GTG，AAC，CGT，TCT，AAC，ATC，CGG，ACT，GTT，GAC，GGT，GGA，TGA，CCG，TCT，GCC，CGA，TAC

[0390] 159.EMPII-159：

[0391] GTT，AGA，ACG，GTT，CAC，GCC，GAT，TGC，CGA，CCC，AAT，TCG，ACG，ACG，ACG，CGC，CTT，CGC，GCG，GCT

[0392] 160.EMPII-160：

[0393] ACC，ATC，GGC，GTG，CCG，GTC，CAC，TGA，CTT，TGT，TGG，ACA，AAT，AGC，CGC，GCG，AAG，GCG，CGT，CGT

[0394] 161.EMPII-161：

[0395] GCG，CGG，GTG，AAT，CCG，GCC，AAG，GAT，GCA，TGA，CTG，CCC，GCA，ACC，ATC，GGC，GTG，CCG，GTC，CAC

[0396] 利用PCR进行虾青素操纵子全长扩增，在100μl反应体系中，EMPII-2-EMPII-160共159个扩增引物的添加量为2ng，2个外侧引物EMPII-1和EMPII-161添加量为30ng。扩增条件依次为：94℃预热1min；94℃30秒，50℃30秒，72℃10min，共25个循环。扩增所使用的Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶(Toyobo公司，日本)。

[0397] PCR结束后，用0.8％(w/v)琼脂糖胶回收，取10μl直接与T/A克隆载体相连(宝生物工程(大连)有限公司)，4℃连接过夜。之后高效转化入大肠杆菌DH5α感受态中，获得阳性克隆。

[0398] 实施例6虾青素合成操纵子在大肠杆菌中表达并合成虾青素

[0399] 挑取实施例4中呈橘黄色的大肠杆菌菌落于20ml LB液体培养基(5g/L酵母提取物，5g/L NaCl，10g/L胰蛋白胨，磷酸缓冲液pH7.5)中，37℃振荡培养12小时。培养液在5,000g重力加速度下离心5min，无菌水清洗1次。所得的细胞沉淀用2mL浓度为1M磷酸缓冲液(113g/L K2HPO4，47g/LKH2PO4)重悬浮，然后将其转移到微量离心管中，以12,000g再次离心5min。沉淀用浓度为5ml/g的甲醇重悬浮后，以12,000g再次离心5min，去除上清液于铝箔中保存。再用甲醇抽提四次，每次的上清液分别装入试管中保存。对每个样品测定其在470nm下的吸光值。将各部分收集到一起混匀，0.22μm膜过滤灭菌，测定混合液在
470nm下的吸光值(根据虾青素吸收光谱确定，见图3)。根据标准曲线计算样品中虾青素含量为每克湿重细胞含有虾青素182μg。

[0400] 序列表

[0401] <110>上海市农业科学院

[0402] <120>副球菌虾青素合成操纵子及其表达载体与应用

[0403] <130>0911005

[0404] <160>1

[0405] <170>PatentIn version 3.3

[0406] <210>SEQ ID No 1

[0407] <211>6352

[0408] <212>DNA

[0409] <213>副球菌虾青素合成操纵子

[0410] <400>1

[0411] gaattgactg caggaactgg cagcgccgat ccacgactgg agcatcccca cgaccgcgtc 60[0412] gctgcgcgcc acagcgccga tgatggggcg ggaccgggtt ctgaccgggt cgggcgggct 120[0413] gcgtcacggg aaggacaccg cgaaatccat ccgcgatggc gcggacctcg tggggcaagc 180[0414] ggcgcgcgct ttgcccgccg cgggccacag cgccttggcc ctgttcgatc acctgtccca 240[0415] cgtcgtgagg cagctgcgca tggccatgta ctgcaccgga tccgccgacc ttgcggcgct 300[0416] gcgcagcgcg ccggtgctgg tgccacggcc tggtggccaa tggtcgcaaa gaacggggat 360[0417] ggaccccggc gccgcgggac tgtactctgc gccgatcgcg actccggggg acaagatgag 420[0418] cgcacatgcc ctgcccaagg cagttctgac cgccacaagc ctgatcgtct cgaacggcat 480[0419] caacgccgca tggcttgcaa tgcatgtgca tgcgctgtgg tttctggacg cggcggccca 540[0420] tggcatcctg ccggtcgcgg gtcacctggc cctggcctgg ctgttggtcg gattgttcat 600[0421] catcgcgcat ggcgcgatgc acgggtcgga cgtgccggcg cgtgcgcgcg gcaatgcgcc 660[0422] gatgccccag catgtcctga tactctttgc cggattttcg tggcgcaaga tgatcgtcaa 720[0423] gcacatggcc gatcaccgcc atgctggaac aaacgacgag ccagatttcg accatggcgc 780[0424] cgcggtccgc tggtacgcgc gcttcatcgg cacctgtttc ggctggcgcg accgggtgct 840[0425] gctgcccgtc aacgtgacgt tgtatgcgct gatgctggga aatcgctgca tgtacgtggt 900[0426] caactggccg atgccgtcga tcctcccgtc gatccggctg tgcgtgttcc ccacttggct 960[0427] gcggcaccgg gccggccacg acgctatccc ggaccgccat aatgcgcgct cgtcgcggat 1020[0428] cagcgaccct gtgtcgctgc tgagctgcta tcaaattggc cgttatcatc acgttcacca 1080[0429] ccggcacccg acggtgccgt ggttgcgcct gcgcagcacc cgcaccaagg tggccaccgc 1140[0430] atgacgaatt tgctgatcgt cgtcgccacc gtgctggtga tggagttgac gaagtattcc 1200[0431] gtccaacgct ggatacagca cggaaggctg cgcttgggct ggcacccgtc ccaccacgag 1260[0432] gaacacgacc acgggctgga agagaacgag gtgtacggcc tggtacccgc ggtgatcgcc 1320[0433] acgctgctgt gcacggtccg ctggatctaa acgccggtcc tgtggtggat cgggttgggc 1380[0434] atgaccgtct attggctgat ctatggcgtc ctgcatgatt ttgtggttca tcagcgctgg 1440[0435] ccaatccgct acatcccgcg cggcggctat cgcagacgcc tgtatcagga agaccgcctg 1500[0436] cagcatgcgg tcgagccgcg cccgcattgc gtcagcttcg gcttcttcta tgcgggcctc 1560[0437] gtcgacaagc tgcagcagga cgtgaagacg tcaagcgtac tgcgggccga cccggaggag 1620[0438] cccacgtgac ggatgacgtg ctgctggcag cctcgagcct tgcgaacgcc ctgatcgccc 1680[0439] tcgcgctgcg accggcgcgg ggcgacctgc ccgtgctgct gctggaccat gcggcgggac 1740[0440] cgtcagaagg ggatacctgg tcatgccacg agggcgatct gtcgccgcac tccctcccgc 1800[0441] gcctgaagcc ccggcgccgc gccaactggc gggaccagga ggtgcgcttt cggggccatg 1860[0442] caaggcggct ggcaaccggt tacggctcgc tggacgaggc ggggctggcg gatgcggtgg 1920[0443] tcaggtcggg cggggagatc cgctcccaca gcgacatcgc cttgctggat gcgccgggcc 1980[0444] ggacactgtc ctggggcacc cccatcgagg ccggctccct cctggacggg ccccgcccgc 2040[0445] acaagtcccg gcaactgacc ttccgtttcc actccatcct gggtgtcgag atcgagaccg 2100[0446] acggcaacca cgccgtgccg gggccggtga tcatggacgg gacagtcacc cagcccgacg 2160[0447] ggtacggctt tcattatctg ctgcggttct ttcggacgcg catcctgatc gagggcacgc 2220[0448] gctattccga ttgcggcgat ctcgacgacg acgcgctggc cccggcgtcc caagactatg 2280[0449] cgggccagca gggttgaacc ccggccgagg tccggcgcga acggggcatc cagcctattg 2340[0450] cgttggccca tgacgaagcg accttctggc ccgatcacgc ggaggcccct gttcgggtgg 2400[0451] aaatgcgcgc ccggttcttt caaacggtca cgggctattc gctgcggtat gcggggcagg 2460[0452] tggcggacgc ggtggcggcg ctgtccgggc cgggcggcac cgacgcgctg cgccccgcca 2520[0453] tccgcgatca cgcgatcgac ccagcacgcc gcgaccgctt cctgcgcctg ctgaaccgga 2580[0454] tggtgttccg ccgctgcgcg aacgaccccc gctataccct gctgcagcgg gtataccgca 2640[0455] tgccgcatgg actgatcgaa cgggtctatg ccggcccgct gaaggtggcg caacagctgc 2700[0456] gcatcgtgac aggcaagcca ggcattcgcg ttggcacccg catacgctgc ctggcggaac 2760[0457] gaccggtgca tgaagaaaac gcatgaacgc ccattcgccc gcggccaaaa ccgccatcgt 2820[0458] gatcggcgct ggctttggcg cgcagggcct ggccatccgc ctgcagtccg cgcacatcgc 2880[0459] caccaccctt gtcgaggccc gcgacaagcc cggccagcgc gcctatgtca gccacgatca 2940[0460] ggaccatgtc cccgacgcgc ccccgactgt catcaccgaa accggtgcgg tcaaggagct 3000[0461] gtgagcgctg aacgggcagg acatttcgcg cgaggtgacg ctgatgccgc tgtcgggctt 3060[0462] ctatcggctg ttgtggccgg gccccaagtt ctacgattac gtgaacgagc ccgatcagca 3120[0463] ggaacgccat ttcgaaaagt tcaacccgga caacctggaa ggagaccgtc gcatccgtga 3180[0464] tcacgctgag cccgtgtacc aggaccccta cgtcaagctg ggcaccgtgg ccttcctcaa 3240[0465] gctgggccaa atgctcaagg ccgcgggcgc gctgatgaag cttgaggcat acaattccgt 3300[0466] ccatgccaag gtcgcgacct tcatcaagga cccctatctg cggcaagccg cttcgtatca 3360[0467] gacgctgctg gtgggcggga attatttctc gcacagctcg atctatgcgc tgatccacgc 3420[0468] gctggcgcgg cgcgccgccg tctggttcgc caaccccaac accaaccagc tggtcgcccg 3480[0469] catggtcgcg ctgttcgaac gcccaggcgg ccagatgatg ctgaacgcca aggtcgcccg 3540[0470] catcgagacc gagcccgcgc gcactacccg cgtcaccctg gcggacgggc ggtcaatgac 3600[0471] cggcgacatg gacgccagca actgcgacgt catgcacaac tatcgcgacc tgttgcgcca 3660[0472] cacggcccgc gcgcagagcg acgcgggatc gctccaccgc aagcgctggt cgatgtcgtt 3720[0473] gttcgtgctg caattcggtc tgggcgaggc ggcgaaggac atcgcgcatc acaccatcct 3780[0474] gttcggcccc ggctacaagg agccggtcaa cgagatattc aaacgcccgg agctggccga 3840[0475] ggatttctcg cggtatcggc attcgccctg caccaccgat ccggacatgg cggctccggg 3900[0476] catgtccacg ccttacgtgc tgggcgcggt gccgcatctg agccgcgccg agatcgattg 3960[0477] ggcggtcgag ggcccgcgct atgccgaccg catcctggca ttcctccagg agcggctgat 4020[0478] cccgaacttg ggcgccaacc tgagcaggac gcgcattttc acgggcgccg aattcgccag 4080[0479] tgaactgaac cggcatcacg gcagcgcttt cccggtcgag ccgatcctga cgcaatccgc 4140[0480] gtggttccgg ccgcacaacc gccacaagac gatccgcaac ccctatctgg tcggcgcgcc 4200[0481] cacccatccg ccggcggaaa ttcccggcgt cgtgggctcg gccaaagcca cggcccaggt 4260[0482] gatgctgtcc gacttggcga gggcatgagc gatctgctcc tgacctcgag ggaagcgatc 4320[0483] acccaagggt cgcgaagctt tggcacggcg cggaagctga tgccgccggg tatcggcgac 4380[0484] gacacggtga tgctctatgc ctggtgccgg gacgcggatg acgtgatcga cggtcaggcg 4440[0485] gtgggcagaa ggccggaggc ggtgaacgag gaacaggcgc ggctggacgg cctgcgtgcc 4500[0486] gacacgctgg cggcggtgca gggcgacggt ccggtgacgc ggccctttgc ggccctgcgc 4560[0487] gcggtggcgc gcaggcatga tttcgggcag ccctggccca tggacctgat cgaaggcttt 4620[0488] gcgattgatg aagaggcgcg cgactatcgc aggctggatg acgtgctgga aaattcctat 4680[0489] 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cggcgaaaat caagcatctg gatctgcttc tcggcgtcga cctctttgat cacggccagc 5520[0503] atcttcagtc cctcgatgaa caacacgccg gtcctcaggt cctgttcctg gtcgaccccc 5580[0504] gcgccgttct tgtccgcatg caagtccagg tcctggccgg cgcacaggcg ctgcggcccc 5640[0505] agggaccgcg actggatccg caccagctgc gcccgcaccg tgcccgacgc gccgcgcgca 5700[0506] ccggccagca gccacatcgc ctcggtgatc aaagcgatgc caagcagcac ggcgaggcta 5760[0507] tcgacatgcg ccagatgggt cgccagctgg ccgccgcgca gggcggcatc gtgcatgcag 5820[0508] cccaggtcgt cgacgatcag cgatgcggca tgcacaatct cgagggcgca agccgcgtcg 5880[0509] acgatcgtgt agcagaccgg gcccgaagcc tcgcccgcaa gcagcatcag catgccgcgg 5940[0510] ggacgcttgc gggaggacag cgccgccaaa gcggcgccaa gcggctgcaa cgcagcaccg 6000[0511] aatggctggc ggatctcctc aattctggtc tgcggaaggg tggcgtggat cgccttgacg 6060[0512] tctcgtctca tcagtgcctt cgcgcttggg ttctgacctg gcgttatggc ctggcccgcc 6120[0513] gtggtatcgg gcagacggtc atccaccgtc aacagtccgg atgttagaac ggttcacgcc 6180[0514] gattgccgac ccaattcgac gacgacgcgc cttcgcgcgg ctatttgtcc aacaaagtca 6240[0515] 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