已知血管内皮是在血管紧张或血栓形成过程中起着重要作用的部 位。1980年首次报道了存在着内皮细胞舒血管因子(EDRF)。此后，在 1987年，EDRF的身份被证实是一氧化氮(NO)。NO是在L-精氨酸通 过NG-羟基-L-精氨酸被氧化成L-瓜氨酸时产生的。该反应被称作NO 合酶(NOS)的酶所催化。NOS存在于多种器官如血管内皮、神经系统、 肾、血小板、心肌和平滑肌中。所产生的NO具有多种作用，并且在 控制全身循环中起着重要的作用。
编码NOS的基因已被克隆而且进行了结构分析。结果发现NOS 不仅具有与辅酶如钙调蛋白(CaM)、黄素和NADPH的结合位点，而 且还具有与(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(在下文当中被称作 “BH4”)的结合位点，该化合物落入作为本发明的活性成分的式(I)中。 而且，还提示BH4实际上参与对NOS功能的调控。也就是说，NOS 在有BH4存在的条件下通过偶联形成二聚体，从而使NOS能够产生 NO(Kekkan(Blood Vessel)2001：24(2)，63-67)。到目前为止，公开号为 10-338637的日本专利公开了BH4能够激活NOS的功能从而提供了针 对由于NOS功能减低而引起的疾病的预防或治疗作用。同样，公开号 为11-246410的日本专利公开了BH4能够激活NOS的功能从而提供 了针对伴有与胰岛素抵抗相关的血管功能异常的疾病的预防或治疗作 用。WO99/43324也公开了BH4能够激活NOS的功能从而提供了针 对药物肾病的预防或治疗作用。
因此，在多种疾病如动脉硬化、高脂血症、心衰、高血压和糖尿 病中，内皮依赖性血管舒张反应减弱。已经清楚NO通过降低心肌局 部缺血的发生危险或通过逆转由这些疾病引起的运动耐受力降低而在 改善这些疾病中发挥作用。而且，已经发现，由于NO的多种作用， NO与血管构造的维持并进一步与血管重建有着密切的关联。已经提 出了NO有可能作为生物体内的抗动脉硬化因子。例如，据报道作为 动脉粥样硬化动物模型的内皮NO合酶(eNOS)基因-缺陷小鼠 (ApoE-KO/eNOS-KO)不能足量产生NO，而且在这种小鼠中动脉硬化 进一步加快(Kuhlencordt PJ等，载脂蛋白E/内皮氧化氮合酶双敲除小 鼠体内加快的动脉粥样硬化、主动脉动脉瘤形成和缺血性心脏病， Circulation 2001；104：448-454)。
然而，另一方面，  已发现了动脉粥样硬化在ApoE-KO/eNOS-Tg (eNOS超表达小鼠)体内也进一步加速(美国心脏协会的科学会议，2001 年11月16日。文摘号1312，内皮氧化氮合酶的超表达加快了ApoE- 缺陷小鼠体内动脉粥样硬化损伤发生)。
而且，已经发现cNOS(构成型NO合酶)在患有遗传性高脂血症的 兔子(Watanabe可遗传性高血脂兔WHHL)的动脉粥样硬化血管的内 皮细胞中的表达不但没有在mRNA和蛋白质水平降低，反而增加。由 此认为在动脉粥样硬化血管中内皮-依赖性血管舒张反应减弱的机理 不是由NOS本身的减少而造成的(NO to Byotai/Chiryo(NO和病理状 况/治疗)，第36页，1995，Kawashima)。而且，据报道在动脉粥样硬 化血管中减弱的内皮-依赖性血管舒张反应可伴有NO在其中产生增加 (Harrison等，JCI 86：2109-2116，1990)。因此，还没有弄清eNOS 的增加与NO之间的关系以及eNOS的增加与病理状况之间的关系。
对于以下药物来说，据说这些药物通过增加eNOS基因的表达或 稳定eNOS mRNA而增加eNOS：用于治疗高脂血症的他丁(statin)药 物(Laufs U等，通过HMG Co A还原酶抑制剂上调内皮氧化氮合酶， Circulation 1998；97：1129-1135)、用于治疗高血压和心衰的ACE抑制 剂、AT1拮抗剂(Onozato ML等，大鼠糖尿病肾病中的氧化应激和氧 化氮合酶：ACEI和ARB的作用.Kidney Int.2002；61：186-194)、Ca 拮抗剂(Ding Y等，硝苯地平和地尔硫而不是维拉帕米上调了内皮氧 化氮合酶的表达.J Pharmacol Exp Ther.2000；292：606-609)等药物。 然而，这些药物分别通过以下作用来显示其药效：他丁药物抑制3-羟 基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A(HMG-CoA)，ACE抑制剂抑制血管紧张 素转化酶，AT1拮抗剂拮抗血管紧张素受体以及Ca拮抗剂控制Ca 离子通过Ca通道流入细胞内。因此，这些药物针对目标疾病或病理 状况的效力不能归因于通过增加eNOS基因表达或稳定eNOS mRNA 而增加eNOS的机制。
近几年来，已经进行了将eNOS基因引入生物体内，从而恢复或 增强在血管中的NO产生能力的尝试。Channon等显示了将eNOS基 因或nNOS基因引入兔体内导致NO在动脉粥样硬化血管中产生血管 舒张作用(Channon等，Circulation 98：1905-1911，1998)。
而且，Qian等显示了当eNOS基因被引入采用高胆固醇饮食喂养 的兔子体内时，细胞粘附因子的表达和炎症细胞在颈动脉血管中的浸 润被降低(Qian等，Circulation 99：2979-2982，1999)。然而，有关这 些发现的一些评论综述指出，提出的只是短期和局部的效应，而没有 进行长期和全身效果的研究。而且，Kawashima等已经发现eNOS基 因的过量表达进一步加重动脉粥样硬化(美国心脏协会的科学会议， 2001年11月16日，文摘号1312)。他们的发现表明存在着不可否认 的可能性，即如果实施eNOS基因疗法来实现其治疗效应，eNOS基 因的长期表达或局部过量表达可能会使疾病进一步恶化。
发明概述
本发明的目的是提供一种不良作用可忽略不计的安全的治疗剂， 该治疗剂激活增加的eNOS的功能，由此治疗或预防由eNOS基因的 表达产物不展示其固有功能的条件而引起的疾病或病理状况。
此外，本发明的另一个目的是提供一种不良作用可忽略不计的安 全的治疗剂，该治疗剂可被用作在治疗多种疾病的方法中的第二种药 物，所述方法包括通过施用药剂或基因疗法使eNOS基因进行表达或 促进eNOS基因的表达或稳定eNOS mRNA来增加eNOS，通过其能 力激活被表达的或被增加表达的eNOS的功能。
而且，本发明的另一个目的是提供一种不良作用可忽略不计的安 全的治疗剂，该治疗剂可被用作在治疗多种疾病的方法中的第二种药 物，所述方法包括使eNOS基因进行表达或促进eNOS基因的表达， 通过其能力长期和/或持久地维持由表达或增加的表达所提供的疗效。
就是说，本发明致力于提供一种不良作用可忽略不计的安全的治 疗剂，该治疗剂有效地预防或改善与下列状况有关的疾病或病理状况： 其中eNOS不展示其固有功能，或者当eNOS蛋白的量是过量或足量 时病理状况进展，或者所述治疗剂在通过增加eNOS而治疗疾病或病 理状况的过程中将eNOS产生NO的功能维持在良好状况，从而所述 治疗剂提高了患者的日常生活质量。
附图的简要描述
图1显示在eNOS转基因ApoE-缺陷小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)体 内eNOS的过量表达；
图2显示ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠扩大的损伤面积；
图3显示通过施用BH4减小了ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠的损伤面 积；
图4显示通过施用BH4，降低了用高胆固醇饮食饲养的 ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠的斑块区域中超氧化物的产生；和
图5显示通过施用BH4，显著减少了ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠体 内NO的产生。

生物体内的eNOS通过产生NO在多种类型的调节中起作用。本 发明人发现eNOS发挥作用需要的条件是生物体内NO和活性氧的浓 度被维持在良好的状态。他们还发现一旦失去这种良好状态，eNOS 不能充分地发挥其适当的酶作用，或者即使其发挥了作用，生物体内 活性氧增加，而增加的活性氧加重处于治疗当中的疾病或导致新的疾 病。就是说，本发明人已经发现即使eNOS基因的表达和NO的产生 是过量或充足的，过量的活性氧在疾病或病理状况(例如动脉硬化)加 重的状态下产生。
为了治疗和/或预防上述疾病，本发明人已经将注意力集中在NOS 当处于非偶联形式(在该状态下NOS不形成二聚体)时产生活性氧的事 实上。然后，本发明人做了以下假设：偶联反应(二聚体的形成)中所涉 及的最重要因素BH4是一种能够解决上述问题的物质。当由于eNOS 基因的过量或额外表达或eNOS mRNA的稳定化而造成大量eNOS存 在的时候，BH4的供给将出现短缺，即BH4的量变得不足。因此认为， 在这种条件下，NOS处于非偶联形式并且产生活性氧。因此，本发明 人认为eNOS的功能可以通过施用BH4来恢复正常。
作为深入研究的结果，本发明人惊奇地发现当将BH4施用给由 eNOS基因过量表达而引起的动脉硬化或血管动脉粥样化的实验动物 模型时，阻止了这些疾病的进展。他们由此发现BH4对增加的eNOS 的功能的激活作用可用于治疗和预防由eNOS的增加而引起的疾病或 病理状况，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及一种用于治疗或预防由eNOS的增加而引起的 疾病或病理状况的药物，该药物含有一种由下式(I)表示的化合物或其 药用盐作为活性成分：

其中R1和R2各自代表一个氢原子，或R1和R2共同形成一个单 键，当R1和R2各自同时代表一个氢原子时，R3代表 -CH(OH)CH(OH)CH3、-CH(OCOCH3)CH(OCOCH3)CH3、-CH3、 -CH2OH或一个苯基，而当R1和R2共同形成一个单键时，R3代表 -COCH(OH)CH3。
由于eNOS的增多而导致eNOS不展示其固有功能的情形所引起 的疾病或病理状况的实例可包括：(1)由于eNOS基因的异常表达而造 成eNOS的过量表达所引起的疾病或病理状况；(2)当在基因治疗过程 中eNOS基因被从外引入时所观察到的状况(例如，当对心血管疾病或 动脉硬化进行治疗时)，并且在这种情况下，eNOS被过量表达或被表 达的eNOS不展示其固有功能，因而不能得到预期的治疗效果或病理 状况加重；和(3)当通过施用他丁药物、ACE抑制剂、AT1拮抗剂或 Ca拮抗剂而增加的eNOS不展示预期的功能，从而不能得到治疗效果 或病理状况加重时所观察到的状况。
本发明的药物被用于治疗性或预防性施用BH4来治疗由于eNOS 的增多而导致eNOS不展示其固有功能的状况、其中eNOS基因过量 表达的状况或预计上述状况会发生的情况；或者被用于与引入eNOS 基因相联合施用BH4。当与引入eNOS基因相联合施用该药物时，该 药物可在引入基因之前，基本上同时或之后施用。该药物的施用可以 在引入基因后持续很长的时间。
由于eNOS的增多或eNOS基因过量表达而引起eNOS不展示其 固有功能从而需要本发明药物的状况形式将是心血管疾病、动脉硬化、 肺动脉高血压等。对于这些疾病，为了诊断在生物体内eNOS是否过 量表达或其是否发挥固有功能，可以采用组织化学的方法测定组织(例 如，血管组织)中的活性氧含量。
为了与增加eNOS的药物如他丁药物、ACE抑制剂、AT1拮抗剂 或Ca拮抗剂相结合施用本发明的药物，可以在施用这些药物之前、 过程中或之后施用本发明的药物，或者本发明药物也可以作为与这些 药物的混合物施用。例如他丁药物包括atrovastatin、flavastatin、 simbastatin、米法斯丁等。ACE抑制剂包括阿拉普利、米达普利、依 那普利、卡托普利、喹那普利、群多普利、培哚普利、雷米普利等。 AT1拮抗剂包括氯沙坦等，以及Ca拮抗剂包括硝苯地平、地尔硫 等。这些药物被用来抑制诸如动脉硬化、高脂血症、高血压、心衰和 缺血性心脏病这些疾病中的血管重建并且被用来治疗糖尿病肾病。
作为本发明治疗剂的活性成分的上述式(I)所示的化合物是已知 的。已知它们用作恶性高苯丙氨酸血症、抑郁症、帕金森病以及其它 疾病的治疗剂。为了获得进一步的信息，参见例如日本专利公开号 59-25323、59-76086、61-277618和63-267781。所述化合物能作为合 适的盐来使用。这种盐的实例可包括药理学上无毒的酸的盐，所述药 理学上无毒的酸包括无机酸如盐酸、磷酸、硫酸或硼酸，以及有机酸 如乙酸、甲酸、马来酸、富马酸或甲磺酸。
作为本发明的活性成分的式(I)所示的化合物的具体实例包括下列 化合物和其药用盐：
(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氢生物蝶呤(BH4)

(6R，S)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤，
1’，2’-二乙酰基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤，

墨蝶呤，

6-甲基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤，

6-羟甲基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤，和

6-苯基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤，

在上述化合物中，优选的化合物是5，6，7，8-四氢生物蝶呤及其盐。 而且，在它们当中，最优选的化合物是BH4或其盐。
本发明的治疗剂是通过常规技术将式(I)所示的化合物与用于普通 药物制剂的载体混合，从而将其转化成适于口、直肠和肠胃外(包括静 脉内和脊柱内)给药的药剂而制得的。
用于药物制剂的载体可以随着剂型的不同而不同，但是这种载体 的普通实例可以包括赋形剂、粘合剂和崩解剂。
赋形剂的典型实例包括淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和纤 维素，粘合剂的实例包括聚乙烯吡咯烷酮、淀粉、蔗糖、羟丙基纤维 素和阿拉伯胶。崩解剂的实例包括淀粉、琼脂、明胶粉、纤维素和CMC。 然而，也可以使用除上述以外的其它赋形剂、粘合剂和崩解剂，只要 它们是常用的。
除上述载体之外，本发明的治疗剂优选地含有用于稳定活性成分 的抗氧化剂。所使用的抗氧化剂可以适当地选自药物制剂通常使用的 那些抗氧化剂。所述抗氧化剂的实例可以包括抗坏血酸、N-乙酰半胱 氨酸、L-半胱氨酸、dl-α-生育酚和天然生育酚。它们可以以稳定所述 活性成分(一种或多种类型)所必需的量来使用。通常，抗氧化剂优选地 以相对于所述活性成分0.2至2.0∶1的重量比来使用。
适于口服的本发明药物可以片剂、舌下片剂、胶囊、粉剂、粉状 药物、颗粒剂或丸剂的形式来提供，或者以糖浆、乳液或在非水液体 中的混悬剂如饮剂的形式来提供。
例如颗粒剂可以通过以下步骤来制备：将一种或多种活性成分与 一种或多种辅助成分如上述的载体、抗氧化剂均匀地混合在一起，将 得到的混合物制粒并利用筛子调节粒径。片剂可以通过对一种或多种 活性成分与必要的一种或多种辅助成分一起进行压片或模压来制得。 胶囊可以通过以下步骤来制备：将一种或多种活性成分与必要的一种 或多种辅助成分均匀混合，从而获得粉剂或颗粒剂，然后利用填充机 等将该粉剂或颗粒剂填充到合适的胶囊中。适于直肠用药的制剂可通 过以下步骤来制备：将活性成分与常用载体如可可脂混合，以便能够 以栓剂的形式来提供。肠胃外用药的制剂可以通过将干燥固体形式的 一种或多种活性成分包封到用氮清洁的无菌容器中来制备。这种干燥 固体制剂可以分散或溶解在任意给定量的无菌水当中以便对患者进行 肠胃外给药。
在生产这些药剂的过程中，上述抗氧化剂可以优选地被添加到活 性成分和常用载体当中。而且，如果需要，还可以向其中添加选自缓 冲液、香味添加剂、表面活性剂、增稠剂、润滑脂和润滑剂中的一种 或多种辅助成分。
有待施用的活性成分(即由式(I)所示的化合物)的量自然取决于用 药途径、待治疗的症状和待治疗的患者，但是在任何情况下，用药量 将由医师来确定。
例如，合适的剂量在0.1至50mg/kg(体重)/天范围内，通常优选 的剂量是在0.5至10mg/kg(体重)/天范围内。
所需剂量的上述活性成分可以每天用药一次，或者可以以适当的 间隔每天分成两次至四次用药。
用药周期可以适当地听从医嘱，同时观察采用本发明药物治疗的 症状。当本发明的药物与被认为增加eNOS的药物如他丁药物、ACE 抑制剂、AT1拮抗剂或Ca拮抗剂共同施用时，本发明药物的施用周 期几乎与这些药剂的使用周期相同。然而，施用周期也可以被设置成 比上述施用周期更长或更短，并且该周期也包括在本发明的保护范围 内。
所述活性成分可以单一施用而不与其它成分混合。然而，为了容 易地控制剂量或因为其它原因，还可以根据待治疾病，将其它活性成 分作为药物施用。
而且，本发明的药物可以含有选自L-精氨酸、黄素(例如FAD， FMN等)和钙中的至少一种作为辅助活性成分，所述物质是NOS的底 物、辅酶或辅因子，以及作为活性成分的式(I)化合物。通过将这些活 性成分进行混合，可以预计能够得到比单一使用式(I)化合物更为优异 的治疗效果。对含在本发明药物当中的上述各种活性成分的比例没有 特别的限制。例如，选自L-精氨酸、黄素和钙中的至少一种物质与式 (I)化合物的重量比可以是0.1至10，优选地是0.5至2。
当这种混合制剂被用于治疗时，其合适的剂量范围是0.1至50 mg/kg(体重)/天的活性成分总量，并且优选地是0.5至10mg/kg(体重)/ 天。
对于治疗，考虑到年龄、症状等因素，医师将适当地选择使用哪 种制剂；该制剂只含有式(I)化合物作为活性成分，或者该制剂含有上 述化合物和其它活性成分。
本发明使用的活性成分最优选地是(6R)-L-赤型-5，6，7，8-四氢生物 蝶呤(BH4)或其盐。然而，还可以使用其类似物如(6R，S)-5，6，7，8-四氢 生物蝶呤、1’，2’-二乙酰基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤、墨蝶呤、6-甲基 -5，6，7，8-四氢生物蝶呤、6-羟甲基-5，6，7，8-四氢生物蝶呤、6-苯基-5，6，7，8- 四氢生物蝶呤或其盐。然而，不用说，作为存在于生物体内的天然物 质的BH4是优选的。BH4二盐酸盐在大鼠中的急性毒性是对于口服而 言2g/kg(体重)或者更高，因此，几乎没有发现毒性。另外，从日本专 利公开号59-25323中对于治疗帕金林病的描述中可以清楚看到， (6R，S)-5，6，7，8-四氢生物蝶呤即非旋光纯物质的毒性非常弱。因此，在 本发明当中也可使用该化合物用于治疗。除了上述化合物之外的其他 式(I)化合物几乎不具有急性毒性。
本发明将在下列实施例中进行进一步的描述。然而，所述实施例 的意图并不在于限制本发明的保护范围。
实施例
实施例1(颗粒剂，丸剂)
将1份(重量份)的聚乙烯吡咯烷酮(Coridon 30)溶于无菌纯净水 中。然后，向其中加入10份的抗坏血酸和5份的L-半胱氨酸盐酸盐， 从而获得一种均相溶液。接着再向其中加入10份的BH4二盐酸盐从 而得到一种均相溶液。
将所获得的溶液加入59份的赋形剂(甘露醇或乳糖)和15份的崩 解剂[玉米淀粉或羟丙基纤维素(LH-22)]。对该混合物进行揉捏、制粒 并干燥，然后用筛子分大小。
实施例2(片剂)
将58份的乳糖和15份的微晶纤维素混合到实施例1中所述活性 成分的均相溶液中。然后，再向其中加入1份的硬脂酸镁，接着进行 混合，并将该混合物制成片剂。
实施例3(胶囊)
将作为润滑剂的0.2％硬脂酸镁混合到实施例1中所制备的颗粒剂 中，然后将该颗粒剂填充到胶囊中。
实施例4(注射剂)
BH4二盐酸盐         1.5g
抗坏血酸            1.5g
L-半胱氨酸盐酸盐    0.5g
甘露醇              6.5g
将上述组分溶于无菌纯净水中从而制得100ml的溶液。对该溶液 进行灭菌，并将各1或2ml的溶液装入小瓶或安瓿中，接着进行冻干 和密封。
实施例5(注射剂)
在无氧条件下将2.0g的BH4二盐酸盐溶于无菌纯净水中从而制 得100ml的溶液。对该溶液进行灭菌，并以与实施例4相同的方式对 该溶液进行密封。
实施例6(栓剂)
BH4二盐酸盐         150份
抗坏血酸            150份
L-半胱氨酸盐酸盐    50份
将上述成分混合从而制得均质粉状物。然后将该粉状物分散到 9950份的可可脂中。
实施例7(颗粒剂)
BH4二盐酸盐         5份
抗坏血酸            5份
L-半胱氨酸盐酸盐    2份
将上述成分混合从而制得均相溶液。
将55份的甘露醇、1份的聚乙烯吡咯烷酮、14份的羟丙基纤维素 和5份的L-精氨酸或钙均匀地混合，并向其中加入上述溶液。对由此 获得的混合物进行揉捏、制粒并干燥，然后用筛子分大小。
实施例8(颗粒剂)
BH4二盐酸盐                   5份
抗坏血酸                      5份
L-半胱氨酸盐酸盐              5份
甘露醇                        52份
聚乙烯吡咯烷酮(Coridon 30)    1份
羟丙基纤维素(LH-22)           12份
L-精氨酸或钙                  10份
以与实施例7相同的方式使用上述成分，并进行制粒和通过筛分 类分大小。
实施例9(颗粒剂)
BH4二盐酸盐         5份
抗坏血酸            5份
L-半胱氨酸盐酸盐    2份
将上述成分混合从而制得均相溶液。
将10份的L-精氨酸或钙、50份的甘露醇、1份的聚乙烯吡咯烷 酮(Coridon 30)和9份的羟丙基纤维素(LH-22)均匀地混合，并向其中 加入上述溶液。对由此获得的混合物进行揉捏、制粒并干燥，然后用 筛子分大小。
实施例10 eNOS表达的证实
使eNOS转基因小鼠与ApoE-缺陷小鼠(ApoE-KO纯合子)进行杂 交，从而产生了一种eNOS转基因ApoE-缺陷小鼠 (ApoE-KO/eNOS-Tg)，该小鼠过量表达eNOS(美国心脏协会科学会 议，2001年11月16日，文摘号1312)。eNOS转基因ApoE-缺陷小鼠 可以通过按照基因扩增方法(PCR方法)扩增eNOS基因并测定扩增的 基因量来进行筛选。从12周龄的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠的主动脉中 提取蛋白质，并通过免疫印迹，利用光密度计来测定eNOS的表达。 结果见图1。在该图中，WT、eNOS-Tg、ApoE-KO和 ApoE-KO/eNOS-Tg分别表示野生型、eNOS转基因、ApoE-缺陷和 eNOS转基因ApoE-缺陷小鼠。该图显示6次独立实验的平均值±标准 偏差。星号表示相对于WTp＜0.01，十字符号表示相对于WTp＜0.05， 以及双十字符号表示相对于ApoE-KOp＜0.05。
结果显示转基因小鼠的eNOS蛋白质的量明显大于野生型小鼠， 转基因小鼠过量表达eNOS。
实施例11主动脉窦的损伤面积(1)
使实施例10中产生的37只小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)在4周龄时 断奶，然后用高胆固醇饮食(1.25％胆固醇，7.5％可可脂，7.5％酪蛋 白和0.5％胆酸钠)喂养12周。
之后，将16周龄的小鼠用戊巴比妥麻醉，用含有10U/ml肝素的 生理盐水灌注主动脉。此后，将对应于从左心室中心至髂动脉分叉部 位的部分的主动脉切除下来并用4％的低聚甲醛固定过夜。将周围组 织从切下来的主动脉的远端(从主动脉弓至髂动脉分叉部位)除去。将 主动脉纵向切开并固定在涂有硅酮的平皿上，然后用苏丹III染色。 利用NIH 1.61 Imaging软件对所获得的光学显微镜图像进行分析。损 伤形成面积表示为损伤面积/主动脉的总面积。结果见图2。在该图中， *代表相对于ApoE-KO雄性小鼠p＜0.0001，十字符号代表相对于 ApoE-KO雌性小鼠p＜0.001。
发现在eNOS转基因ApoE-KO小鼠体内损伤面积增大而且由此 促进了动脉硬化。
实施例12主动脉窦的硬化损伤面积(2)
每组使用6至8只实施例10中产生的小鼠(ApoE-KO/eNOS-Tg)。 BH4非施用组采用高胆固醇饮食来饲养(参照实施例10)，而BH4施用 组采用其中加入了10mg/kg/天的BH4的高胆固醇饮食来饲养。进行 与实施例11相同的实验，切除主动脉并进行同样的图像分析。结果见 图3。在该图中，*代表相对于没有施用BH4的雄性ApoE-KO/eNOS-Tg 小鼠p＜0.05，十字符号代表相对于没有施用BH4的雌性 ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.01。
在施用了BH4的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠中，损伤面积减小，而 且动脉硬化得到了抑制。
实施例13超氧化物的产生
分组，每组由6至8只小鼠(12周龄，ApoE-KO/eNOS-Tg)组成， 其中按照与实施例12相同的方式用添加了BH4或没有添加BH4的高 胆固醇饮食将所述小鼠喂养8周。从这些小鼠身上切下主动脉，去除 周围组织，将剩余部分放置在充满了pH为7.4的PBS的黑硅酮平皿 上。所述样品被放在避光盒子中以避免外部光线的干扰，然后向盒腔 内加入MCLA直至终浓度达到20μm/L。接着，对MCLA(2-甲基-6-(4- 甲氧基苯基)-3，7-二氢咪唑[1，2-a]吡嗪-3-酮-盐酸盐)与超氧化物阴离子 间反应所产生的光发射进行5分钟的测量。将该测量重复3次。
将光发射数据输入计算机中，所获得的非线性灰度图像被转化成 伪彩色图像。利用WinLight 32软件对由超氧化物所致的化学发光强 度进行分析。斑块区域定义为被苏丹III染色的区域。从每只小鼠随机 选出约10个斑块区域和10个非斑块区域(0.0012-0002cm2)，接着进行 测量。从每个化学发光信号强度中减去本底水平。图4显示通过将野 生型小鼠的测量值设置在1.0而计算得到的结果，该结果显示为相对 值。该图显示了每组的6至10只小鼠的平均值±标准偏差。在该图中， *代表相对于没有施用BH4的ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.01。
在BH4施用组中，在以高胆固醇饮食饲养的ApoE-KO/eNOS-Tg 小鼠中，斑块区域中的超氧化物产生被显著降低，因此表明BH4具有 超氧化物抑制作用。
实施例14 NO的产生
从每只用高胆固醇饮食喂养了8周的12周龄小鼠 (ApoE-KO/eNOS-Tg)身上切下包含从主动脉弓至髂动脉分叉部位的 部分的主动脉。然后立即在pH为7.4的PBS中去除周围部分。将该 样品放置在充满了含1.5mmol/L氯化钙的磷酸盐缓冲液(pH为7.4) 的黑色平皿上，然后将该平皿放置在避光的盒子中从而避免外部光线 的干扰。
向其中加入二氨基荧光素-2二乙酸酯(DAF-2DA)直至终浓度达 到10μmol/L。然后，将样品置于室温下5分钟，接着用485nm的蓝 光进行激发。利用装备了中心为532nm的带通滤波器的发光扫描仪 检测由DAF-2 DA与NO之间的反应所产生的荧光，在515nm波长 的强度下进行1秒钟的测量。为了检测由主动脉内皮产生的NO，将 样品在1μmol/L乙酰胆碱溶液中放置5分钟，然后测定荧光图像。完 成每个实验后，为了确定被测定样品是斑块区域还是非斑块区域，将 该样品进行苏丹III染色并观察。将测量数据输入到计算机中，并利用 由NightOWL-显像系统提供的WinLight32软件对非斑块区域进行分 析。为了消除主动脉的胶原纤维的非特异性光发射或反射，从DAF反 应后的测量值中减去本底测量值。随机选取了至少10个非斑块区域 (0.0005至0.001cm2)，测定由于与NO反应所产生的荧光。产生NO 的量被表示为皮瓦/cm2。由内皮产生的NO量通过以下方式来获得： 从将样品置于乙酰胆碱溶液后获得的测量值中减去在样品没有被置于 乙酰胆碱溶液中的条件下获得的测量值。结果见图5。该图显示6次 独立实验的平均值±标准偏差。在图中，*表示相对于没有施用BH4的 ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠p＜0.01。
在ApoE-KO/eNOS-Tg小鼠中，在被分析区域(非斑块区域)中NO 的产生明显增加，因此表明BH4具有促进NO产生的作用。
本发明的效果
本发明提供了一种预防性或治疗性药物，该药物有效对抗其中由 于eNOS的增多而使得eNOS不发挥其原有功能的状况、其中eNOS 基因过量表达的状况或由这种状况引起的多种疾病。