一般的癌症检测
在美国，每年发现130,000位新患者患有结肠直肠癌，甚至在尝试 手术切除后，有55,000位患者死于转移性疾病。尽管存在广泛的关于 该疾病的形态学和分子生物学的信息，仅仅少数患者实际上从该知识 获益。现在不可能将治疗校准到肿瘤的分子状态。现在，医师主要依 赖于形成预后和配方治疗的组织学和临床标准。对于确定100位患者 的平均结果，这些预测是相当可靠的。但是，患者个体之间存在如此 大的变差，非常难以得到有意义的个体预测和治疗分层。
因而，患者面临下述真实的可能性，即辅助性化疗治疗的标准过 程是不够的，或对于它们的疾病过于强烈。不是所有的息肉都会发展 成肿瘤，也不是每种癌都发展成转移性疾病。
因此，迫切需要改变从形态学到分子特征的肿瘤分类的基础。这 样的分类能成功地鉴别具有良好或不良预后的那些患者，他们不能通 过传统方法区分开。最终的目标是，发现可靠的用于检测、诊断、预 测和治疗癌症的分子标记或靶。
开发用于鉴别发展危险的分子方法，可能允许医师将最强烈的疗 法分配给必需它的那些患者。相反地，可以给具有注定不会发展的肿 瘤的患者、或可能对辅助性化疗更敏感的肿瘤的患者，分配不太强烈 的、不太有毒的用药方案。
微阵列技术的发展已经允许描绘数千个mRNA表达水平，最近， 已经允许评价DNA和蛋白水平的改变。这样的高度平行地分析数百个 至数千个基因和它们的产物的新能力，可能有助于更深地理解相互作 用、产生癌症的分子途径。这些新鉴别的基因产物可能变成新疗法的 靶，允许最终开发个别患者的个体化治疗。
尽管微阵列能成功地描绘表达，存在显著的例外，它们在预测患 者结果或辅助鉴别新的候选癌基因方面没有成功。例如，基因表达阵 列经常不会检测到已知的癌基因中的重要的DNA改变(突变，甲基化， 基因拷贝数，等位基因失衡，LOH)。迄今为止，单个基因中的DNA 改变、杂合子丢失(LOH)或微卫星不稳性(MSI)，已经成为预测结肠癌 的最有力的预报因子。
因而，迫切需要描绘同一肿瘤上的DNA和RNA改变。另外，已 经在DNA和RNA水平发生改变的基因，更可能是肿瘤发展的原因。 最后，新候选物的RNA表达特征的复杂的数学开发，可能需要根据已 知癌基因中的DNA改变对肿瘤分层。
实体瘤的遗传分析
癌症源自细胞周期、DNA修复和生长信号传递基因中的遗传的和/ 或散发的突变的积累。这些分子改变的知识，可以影响患者管理。例 如，某些种族的成员具有更高的携带癌基因的SNP的危险，如 BRCA1，BRCA2或APC。这些SNP产生增高的形成乳腺癌、卵巢癌、 前列腺癌或结肠癌的危险(Abeliovich，D.，等，Am J Hum Genet，60(3)： 505-14(1997)；Beller，U.，等，Gynecol Oncol，67(2)：123-6(1997)； Berman，D.B.，等，Cancer Res，56(15)：3409-14(1996)；Laken， S.J.，等，Nat Genet，17(1)：79-83(1997)；Oddoux，C.，等，Nat Genet， 14(2)：188-90(1996)；Roa，B.B.，等，Nat Genet，14(2)：185-7(1996)； Struewing，J.P.，等，Nat Genet，11(2)：198-200(1995)；和Struewing， J.P.，等，N Engl J Med，336(20)：1401-8(1997))，并会从测试中提 高的警觉获益。散发的突变，如p53基因中的那些，会影响临床结果 和对治疗的响应(Broll，R.，等，Eur J Cancer，35(7)：1083-8(1999)； Bunz，F.，等，J Clin Invest，104(3)：263-9(1999)；Dameron，K.M.， 等，Science，265(5178)：1582-4(1994)；Heide，I.，等，Eur J Cancer， 33(8)：1314-22(1997)；Prives，C.，等，J Pathol，187(1)：112-26 (1999)；Tortola，S.，等，J Clin Oncol，17(5)：1375-81(1999)；和 Zou，Z.，等，J Biol Chem，275(9)：6051-4(2000))。因此，p53突 变的精确本性，可以改变治疗方案和其它临床考虑(Aurelio，O.N.，等， Cancer Res，58(10)：2190-5(1998)；Aurelio，O.N.，等，Mol Cell Biol， 20(3)：770-8(2000)；Foster，B.A.，等，Science，286(5449)：2507 -10(1999)；Wang，Y.，等，Oncogene，17(15)：1923-30(1998)； 和Webley，K.M.，等，J Pathol，191(4)：361-7(2000))。在这里， 将发生在来自肿瘤样品的基因中的突变的编译，定义为“突变基因组 (mutagenome)”。由于迄今为止，DNA已经成为预测结肠癌的最有力 的预报因子，突变基因组对于结果的更精确的预报因子可能是至关重 要的。另外，它可以指导表达的评价，以鉴别候选癌基因，产生癌症 治疗的新靶。
在它的应用的背景下，需要考虑任何给定检测技术的效用。例如， 与种系分析相比，实体瘤中的突变检测更困难。因为实体瘤含有肿瘤 细胞和间质(即，非肿瘤的)细胞的混合物，存在于肿瘤样品中的突变可 能仅占总DNA的小部分(小至15％)。相反地，当存在种系SNP时，至 少一半测试的样品含有该变体。作为结果，实体瘤样品需要更高灵敏 度的检测策略。
多态性检测技术
存在许多可得到的多态性检测技术，它们的效用依赖于研究人员 的实验目的(和体会)。用于评价特定技术的最有用的标准包括处理量， 灵敏度/特异性，定量能力，样品要求和成本。
许多参数可以增加处理量，如多路化和样品汇合。多路化指在同 一试管中同时进行多个反应的测定能力。具有非常高的多路化能力的 测定，可以平行地处理数千个反应(例如，DNA微阵列)。相反地，具 有低多路化能力的测定通过同时处理非常多的分开的反应进行补偿(例 如，Taqman测定)。当个别地查询种系样品时，不太可能发现人群中 低频率的SNP。在这样的情况下，汇合样品可以提高有效的处理量， 也可以提高每个反应中鉴别出低频率SNP的机会。
在临床应用中，将灵敏度(疾病的阳性)定义为，当患者确实患有疾 病时，产生阳性发现的实验能力{灵敏度＝100×(真阳性)/(真阳性+假阴 性)}。如所述的，用于检测来自单个对象的样品中的种系多态性的技 术，需要比用于检测实体瘤样品中的散发突变的技术低得多的灵敏 度。汇合的种系样品可能需要比上面的任一种更高的灵敏度。因此， 不太的应用可能具有不太的灵敏度要求。
将特异性(疾病的阴性)定义为，当患者没有疾病时，产生阴性发现 的实验能力{特异性＝100×(真阴性)/(真阴性+假阳性)}。作为结果，具 有低特异性的测定更易于得到假阳性结果。尽管假阴性和假阳性结果 通常都是不希望的，假阳性倾向于更有害。这是因为，假阴性仅仅将 样品从它的适当组中去除，而假阳性不仅将样品从它的适当组中去 除，还将它置于错误组中；这是双重错误。作为结果，有时为了更高 的特异性而牺牲灵敏度(Patil，N.，等，Science，294(5547)：1719-23. (2001))。
可以操作的基因型总数受到可得到的样品数的限制。当有限地供 给样品DNA时，可以PCR扩增它。但是，PCR步骤可以产生交叉污 染假象，影响总特异性和灵敏度，且可以产生改变的多路化结果，限 制测定的处理量。由于大多数方法使用PCR扩增，希望开发用于将小 量DNA样品(如来自肿瘤活组织检查)高处理量地基因分型的替代方 法。
鉴别未知多态性的技术
SNP在人群内经常是低频率的，所以绝大多数单独查询的种系样 品会是阴性的。为了解决该挑战，可以汇合未知样品，条件是使用高 灵敏度的技术(Halushka，M.K.，等，Nat Genet，22(3)：239-47(1999)； Li，W.H.，等，Genetics，129(2)：513-23(1991)；和Wang，D.G.， 等，Science，280(5366)：1077-82(1998))(表1)。汇合会提高处理量 水平，导致每个反应更高的阳性比率，并提高单个反应是有价值的机 会(Shaw，S.H.，等，Genome Res，8(2)：111-23(1998))。
表1：用于鉴别未知多态性和突变的技术的对比
  技术   优点   现有的局限性   Sanger双脱氧-测序   改变检测阵列(VDA)   SSCP   DGGE，CDGE，   DHPLC   ddF，REF   Cleavase   化学剪切(CCM)   T4endoVII，MutY   热稳定的内切核酸酶V-DNA连接酶   1)检测最高达600碱基对的任何突变/反应。   2)与SSCP和DGGE一样快，但是更精确。   1)高处理量筛选；使用直接的杂交。   2)可以筛选大序列块。   1)检测低水平突变。   2)快速，不需要额外的酶步骤。   1)检测低水平多态性。   2)快速，不需要额外的酶步骤。   1)真实地检测所有可能的突变。   1)不需要异双链。   1)鉴别突变的近似位置。   2)高灵敏度。   1)鉴别大多数突变的近似位置。   2)鉴别错义、移码和无义突变。   1)鉴别突变的近似位置，鉴别98％多态性。   2)鉴别错义、移码和无义突变，最高达1,750bp/反应。   3)检测低水平突变；1/20。   4)与测序相组合，直接鉴别突变的最快速的筛选。   1)难以检测低水平突变。   2)大基因存在多重反应。   1)在大规模筛选中，假阳性率为11-21％。   2)难以检测单核苷酸重复中的多态性。   3)不能检测移码突变。   1)错过30％可能的突变。   2)不能区分错义和沉默多态性。   3)不能定位多态性的位置。   4)会错过普通多态性附近的突变。   1)大规模筛选错过13％多态性。   2)不能区分错义和沉默多态性。   3)再现结果的技术挑战。   4)需要GC夹；限于小片段。   5)不能定位多态性的位置。   1)难以检测低水平突变。   2)不能区分错义和沉默多态性。   1)高背景。   2)不能定位多态性的位置。   3)需要优化每个突变。   1)劳动密集。   2)化学危害。   1)难以检测低水平突变。   2)观察到的高背景依赖于序列。   1)不能检测GGCG或RCGC序列中的转换突变。   2)新技术。
直接测序
Sanger双脱氧测序代表着未知多态性检测的一种方法，其中它可 以检测任意的多态性和它的位置。不幸地，由于低灵敏度，直接测序 对于实体瘤或汇合的DNA样品的分析仅具有有限的效用(Yan，H.， 等，Science，289(5486)：1890-2(2000))。但是，一旦已知样品在特 定区域含有多态性，直接测序特别适用于鉴别多态性和它的特定位 置。另外，由于许多能鉴别多态性位置的技术不能提供序列信息， Sanger测序可以用作定位和鉴别以前鉴别为多态的基因区域中改变的 准确碱基的第二步骤。
电泳迁移率测定
传统方法通过观察同源双链和异双链DNA的不同电泳迁移行为， 检测未知的多态性。这些方法包括单链构象多态性(SSCP)(Hayashi， K.，PCR Methods Appl，1(1)：34-8(1991)；Korn，S.H.，等，J Clin Pathol，46(7)：621-3(1993)；Makino，R.，等，PCR Methods Appl， 2(1)：10-3(1992)；和Suzuki，Y.，等，Oncogene，5(7)：1037-43(1990))， 变性-梯度凝胶电泳(DGGE)(Fodde，R.，等，Hum Mutat，3(2)：83 -94(1994)；Guldberg，P.，等，Nucleic Acids Res，22(5)：880-1(1994)； Ridanpaa，M.，等，Hum Mol Genet，2(6)：639-44(1993)；和Ridanpaa， M.，等，Mutat Res，334(3)：357-64(1995))，持续变性毛细管电泳 (CDCE)(Chen，J.，等，Environ Health Perspect，3(227-9(1994)和 Khrapko，K.，等，Nucleic Acids Res，22(3)：364-9(1994))，双脱氧指 纹法(ddF)(Sarkar，G.，等，Genomics，13(441-443(1992))，和限制 性内切核酸酶断裂(REF)(Liu，B.，等，Nat Med，1(4)：348-52(1995)) (见表1)。一种简单的方法，变性高效液相色谱(DHPLC)，也可以区分 同源双链和异双链DNA，但是是基于在烷基化的无孔的(苯乙烯二乙烯 基苯)颗粒上的离子对反相液相色谱分离(Underhill，P.A.，等，Genome Res，7(10)：996-1005(1997))。尽管这些技术含有一些非常希望的特 征，都可总结为希望的SNP关联研究和实体瘤的突变分析的处理量或 灵敏度。可以鉴别多态性的位置的技术(ddF和REF)的灵敏度不足以可 靠地检测汇合的或实体瘤样品中的低水平多态性。其它技术更快速， 且可以检测低水平多态性，但是不能鉴别多态性的近似位置。作为结 果，可能需要多个轮回的双脱氧测序来鉴别多态性的序列。这会极大 地降低处理量能力。另外，这些技术缺少区分错义和沉默多态性(这是 肿瘤分析的基本区别)的能力。
微阵列
DNA微阵列技术的最新发展已经建立的空前水平的处理量。改变 检测阵列(VDA)使用该新技术来扫描大序列块，并鉴别含有未知多态性 的区域(Halushka，M.K.，等，Nat Genet，22(3)：239-47(1999)；Hacia， J.G.，等，Nature Genetics，14(4)：441-7(1996)；和Ahrendt，S.， 等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(7382-7387(1999))。
微阵列的优点是，能同时记录数百至数千个信号。但是，在现有 的组成中，当未知位置时，改变检测阵列会错过高百分比的SNP和突 变。尽管认为它是一种高处理量技术，当未知突变的位置时，需要层 叠大序列空间，这会将这些阵列限制为每次仅一个基因。在鉴别移码 突变时，这些芯片是特别有缺陷的(Ahrendt，S.，等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，96(7382-7387(1999)；Hacia，J.G.，等，Nature Genetics， 14(4)：441-7(1996)；和Hacia，J.G.，Nat Genet，21(1Suppl)：42 -7(1999))，所述移码突变高频率地发生在重要的肿瘤抑制基因如p53 (10-15％)和APC(70％)中(Beroud，C.，等，Nucleic Acids Res，26(1)： 200-4(1998)和Beroud，C.，等，Nucleic Acids Res，24(1)：121-4 (1996))。另外，由于通过阵列杂交检测突变已经具有过高的假阴性信 号与种系突变比率(Ahrendt，S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，96(7382 -7387(1999))，阵列太不可靠，不能精确地记录其中间质污染变成问 题的肿瘤样品中的新突变。
该方法存在与在已知多态性分析中观察到的相同的制造和设计限 制，但是在SNP和肿瘤分析的未知多态性检测的背景下，已经证实大 的多的成功。例如，在原理实验的证据中，使用GeneChip(Affymetrix) 来检测肺肿瘤样品的p53突变，所述p53是在所有癌症的约50％中突 变的基因。实验以模仿的未知发现模式进行，且能鉴别88％已知错义 突变和80％全部已知多态性(Ahrendt，S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci. USA，96：382-7387(1999))。这些结果与更传统的双脱氧测序方法相 对比，后者检测76％现在已知的突变。关于SNP分析，染色体21的 最新研究成功地鉴别了真个染色体的估计数目的普通SNP的约一半 (10％-50％的频率)(Patil，N.，等，Science，294(5547)：1719-23 (2001))。为了使假阳性最消化，实验设计需要牺牲灵敏度。这解释了 当与前面提及的肺肿瘤研究相对比时，染色体21SNP分析的成功鉴别 从80％下降至50％。另外，需要在罕见的SNP(约1％的频率)背景下评 价该方法的效用。由于该方法难以检测到人基因组中的约50％普通 SNP，更完整地鉴别SNP最可能需要替代技术。变体方法的改进，如 动态的等位基因特异性的杂交(DASH)(Prince，J.A.，等，Genome Res， 11(1)：152-62(2001))和微电子芯片阵列(Radtkey，R.，等，Nucleic Acids Res，28(7)：E17(2000)；Sosnowski，R.G.，等，Proc Natl Acad Sci U SA，94(4)：1119-23(1997))，可以增强它的效用。
剪切
通过剪切DNA-DNA异双链中的错配，也可以鉴别未知的多态 性。这可以化学地(化学剪切方法-CCM)(Cotton，R.G.，等，Proc Natl Acad Sci USA，85(12)：4397-401(1988)；Hansen，L.L.，等，PCR Primer：A Laboratory Manual.，275-286(1995)；和Haris，I.I.，等， PCR Methods Appl，3(5)：268-71(1994))、或酶促地(T4内切核酸酶 VII，MutY剪切，或Cleavase)(Giunta，C.，等，Diagn Mol Pathol， 5(4)：265-70(1996)；Xu，J.F.，等，Carcinogenesis，17(2)：321-6 (1996)；和Youil，R.，等，Proc Natl Acad Sci USA，92(1)：87-91(1995)) 实现。典型地，将至少2个样品进行PCR扩增(一个样品可以作为具有 高水平间质污染的实体瘤样品)，变性，然后杂交，产生变体链的DNA -DNA异双链。酶在错配附近剪切，并通过凝胶或毛细管电泳分析产 物。不幸地，剪切酶经常也剪切DNA的互补区。这会增加背景噪音， 降低特异性，并降低测定的汇合能力。
剪切/连接
提高剪切测定中的信噪比的一种方式是，在剪切后安排连接步骤 来密封假切口。图1是示意图，它解释了该现有的标准的Endo V/连接 酶突变扫描测定的方法，其通过凝胶电泳检测片段。使用Tet和6-Fam 标记的PCR引物来PCR扩增突变的和正常的基因(在相同的或不同的 反应中)。合并PCR产物，变性，并再退火，形成G/T和A/C异双链 的DNA(以及G∶C和A∶T同源双链化的DNA，未图解)。使用内切核 酸酶(Endo V)来优先在错配的3’侧一个碱基处切割DNA，并使用连接 酶来重新密封在完美匹配区的背景切口。通过凝胶电泳分离产物，使 用产物的长度来确定突变的位置。不幸地，许多经常用于检测错配的 酶与本方案不相容。MutY等酶不能产生可重新连接的末端(Xu，J.F.， 等，Carcinogenesis，17(2)：321-6(1996))，而T4内切核酸酶VII等 酶或MutH、MutS和MutL的组合会在远离错配处剪切(Giunta，C.， 等，Diagn Mol Pathol，5(4)：265-70(1996)；Youil，R.，等，Proc Natl Acad Sci USA，92(1)：87-91(1995)；和Smith，J.，等，Proc Natl Acad Sci USA，93(9)：4374-9(1996))，所以连接酶会重新密封所有后面的 切口。一种技术通过组合热稳定的内切核酸酶V(Endo V)的识别和剪切 错配DNA的能力、和热稳定的DNA连接酶的抑制在匹配DNA处切 口的高精确度，解决了该问题(Huang，J.，等，Oncogene，21(12)：1909 -21(2002))。Endo V可以剪切错配的任一条链或两条链。与以前提及 的剪切酶不同，Endo V会在错配碱基附近剪切DNA(Yao，M.，等， Journal of Biological Chemistry，269(50)：31390-6(1994))。这允许热 稳定的连接酶有效地辨别完美匹配的和错配的DNA区域(Tong，J.， 等，Nucleic Acids Res，27(3)：788-94.(1999))，并仅仅连接完美匹配 的切口。这导致极大降低的背景噪音。该方法具有非常高的灵敏度， 且可以区分20-倍过量的未改变的DNA中的一个突变序列。另外，由 于它可以定位多态性的近似位置，它可以与补充的双脱氧测序容易地 相容，以鉴别精确的多态性序列。迄今为止，已经鉴别了少数难测的 序列(GGCG和RCGC)，其中R＝嘌呤。尽管如此，SNP数据库的评价 表明，组合的Endo V/连接酶测定能鉴别98％在人基因组中典型地观察 到的多态性(Huang，J.，等，Oncogene，21(12)：1909-21(2002))。由 于通过电泳检测产物，依次处理样品。但是，由于它的使背景噪音最 小化的能力，该技术更适合汇合的样品，优选地提高它的处理量能力。 总之，因为它使相对新的技术，随着它的更广泛的应用，需要确定它 的可靠性和效用。
毛细管电泳的优点是，能快速地检测许多不同大小的片段，这类 似于凝胶电泳。毛细管电泳的一起操作更适合自动化，且比凝胶电泳 更快速。但是，Endo V酶会从PCR产物剪切下5’荧光标记，它们在 毛细管中乱跑，提供产生假信号的潜力。因而，为了成功地将Endo V 反应移植到毛细管电泳读出装置，需要解决该问题。
在没有一些形式的扩增的情况下，几乎没有肿瘤样品会具有足以 进行杂交的物质。也需要从基因组DNA扩增来降低序列空间复杂性。 如果与阵列联合使用Endo V/连接酶测定，聚合酶会延伸与阵列杂交的 任何引物或不完全的PCR延伸产物。作为结果，会产生假阳性信号。 另外，阵列上的单链DNA可以折叠回自身，形成发夹。由于聚合酶可 以延伸发夹，会产生假阳性信号。使用Endo V/连接酶测定的另一个问 题是，Endo V会剪切一些异双链的DNA的两条链。片段会脱离芯片， 而不是作为切口移位的底物，从而丢失信号。Endo V也不会同样强度 地剪切异双链体的两条链。通常不会剪切含有错配的“C ”碱基的链。因 而，在阵列和靶上需要具有两种沃森和克里克链。使用Endo V/连接酶 测定的另一个问题是，密切相关的基因，如K-ras，N-ras，和H- ras，会与同系物位置交叉杂交。这会导致假阳性信号的产生。最后， 由于底物的接近性，固体表面(即微阵列)上的酶反应较困难，造成蛋白 变性问题。
Endo V也会剪切天然发生的多态性。作为结果，它们可以与真正 的新突变区分开。另外，存在可能难以记录的剪接位点变体。逆转录 酶和PCR的累积错误率，会产生高背景信号。这具有造成假阳性的潜 力。由于突变的位置和剪切的强度会影响荧光信号强度，在Endo V/ 连接酶测定中可能难以区分真阳性和假阳性。
本发明指向克服本领域的这些问题。
发明简述
本发明的一个方面涉及鉴别与一种或多种正常的核苷酸靶序列的 差别在于一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核 苷酸靶序列的方法。这包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的 核苷酸靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者。还提供 一组一个或多个一级寡核苷酸引物集合。每个集合包含：(a)第一种一 级寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分和5’上游二级引物-特异 性的部分，和(b)第二种一级寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分 和5’上游二级引物-特异性的部分。组中每个集合的第一种一级寡核 苷酸引物含有相同的5’上游二级引物-特异性的部分，且组中每个集 合的第二种一级寡核苷酸引物含有相同的5’上游二级引物-特异性的 部分。混合样品、一种或多种一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成 一种或多种一级聚合酶链式反应混合物。使一种或多种一级聚合酶链 式反应混合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产 物，其与存在于样品中的正常的核苷酸靶和突变的核苷酸靶序列互 补。还提供一组一个或多个二级寡核苷酸引物集合，每个集合包含：(a) 第一种二级寡核苷酸引物，其包含与第一种一级寡核苷酸引物的5’上 游二级引物-特异性的部分相同的序列，和(b)第二种二级寡核苷酸引 物，其包含与第二种一级寡核苷酸引物的5’上游二级引物-特异性的 部分相同的序列。混合一种或多种一级聚合酶链式反应混合物、一种 或多种二级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种二级聚合酶 链式反应混合物。使一种或多种二级聚合酶链式反应混合物进行一个 或多个聚合酶链式反应循环，形成二级延伸产物，其与一级延伸产物 互补。然后灭活聚合酶，并使一种或多种二级聚合酶链式反应混合物 经历一个过程，该过程将二级延伸产物转化成单链形式，并使单链二 级延伸产物退火，形成可能包含核酸分子的异双链的产物，所述核酸 分子包含来自正常的核苷酸靶序列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸 靶序列的核苷酸序列。提供内切核酸酶，其优先在离错配碱基对一个 碱基以内的位置处切割或剪切异双链的DNA，并混合异双链的产物和 内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切反应混合物。使内切核酸酶剪切反 应混合物进行内切核酸酶剪切反应，以便内切核酸酶优先在离错配碱 基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的产物。提供连接酶， 并混合内切核酸酶剪切反应混合物和连接酶，形成连接酶重新密封反 应混合物。使连接酶重新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应， 在完美匹配的碱基对处密封切割的异双链的产物，但是基本上不在邻 近错配碱基对的位置处重新密封切割的异双链的产物。使连接酶重新 密封反应混合物进行连接酶重新密封反应后，通过大小或电泳迁移率 或杂交分离产物，捕获结合到固体支持物上的探针。通过辨别分离的 产物，检测正常的核苷酸靶序列和一种或多种突变的核苷酸靶序列在 样品中的存在。
本发明的另一个方面涉及鉴别与正常的核苷酸靶序列的差别在于 一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序 列的方法。该方法包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的核苷 酸靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列或这两者。还提供一组一 个或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种寡 核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分，和(b)第二种寡核苷酸引物， 其具有靶-特异性的部分，其中仅为一级寡核苷酸引物之一提供标 记。提供聚合酶，并混合样品、一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形 成一种或多种一级聚合酶链式反应混合物。使一级聚合酶链式反应混 合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其与 存在于样品中的正常的核苷酸靶序列和突变的核苷酸靶序列互补。灭 活聚合酶，并使一级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程将 一级延伸产物转化成单链形式，并使单链一级延伸产物退火，形成可 能包含核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核苷 酸靶序列和突变的核苷酸靶序列的核苷酸序列。提供内切核酸酶，其 优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的 DNA，并混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切反应 混合物。使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸酶剪切反应，以 便内切核酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切 异双链的产物。提供连接酶，并混合内切核酸酶剪切反应混合物和连 接酶，形成连接酶重新密封反应混合物。使连接酶重新密封反应混合 物进行连接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处密封切割的异双 链的产物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处重新密封切割的 异双链的产物。通过大小或电泳迁移率，分离使连接酶重新密封反应 混合物进行连接酶重新密封反应得到的产物。通过辨别分离的来自连 接酶重新密封反应的产物，检测正常的核苷酸靶序列和一个或多个突 变的核苷酸序列在样品中的存在。
本发明的另一个方面涉及鉴别与正常的核苷酸靶序列的差别在于 一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序 列的方法。该方法包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的核苷 酸靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者。这包含提供 一组一个或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第 一种寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分，和(b)第二种寡核苷酸 引物，其具有靶-特异性的部分，其中仅为一级寡核苷酸引物之一提 供标记。提供聚合酶，并混合样品、一级寡核苷酸引物集合和聚合酶， 形成一种或多种一级聚合酶链式反应混合物。使一级聚合酶链式反应 混合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其 与存在于样品中的正常的核苷酸靶序列和突变的核苷酸靶序列互补。 灭活聚合酶，并使一级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程 将二级延伸产物转化成单链形式，并使单链二级延伸产物退火，形成 可能包含核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核 苷酸靶序列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸靶序列的核苷酸序列。 提供内切核酸酶，其优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割 或剪切异双链的DNA，并混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切 核酸酶剪切反应混合物。使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸 酶剪切反应，以便内切核酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位 置处切割或剪切异双链的产物。提供连接酶，并混合内切核酸酶剪切 反应混合物和连接酶，形成连接酶重新密封反应混合物。使连接酶重 新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处 密封切割的异双链的产物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处 重新密封切割的异双链的产物。提供末端转移酶，并混合来自连接酶 重新密封反应混合物的可能切割的或剪切的异双链的产物和末端转移 酶，形成末端转移酶延伸反应混合物。将末端转移酶延伸反应混合物 与单独的dNTP一起温育，在新产生的3’OH基团处延伸切口的或剪 切的异双链的产物，形成末端转移酶延伸产物。提供一种或多种三级 寡核苷酸引物，其适于与新产生的末端转移酶延伸产物杂交，且适于 3’末端延伸。混合末端转移酶延伸产物、三级寡核苷酸引物和聚合酶， 形成三级聚合酶延伸反应混合物。在允许三级寡核苷酸引物与末端转 移酶延伸产物杂交的条件下，将三级聚合酶延伸反应混合物和聚合酶 一起温育，生成三级延伸产物，它们是末端转移酶延伸产物的互补拷 贝，且含有错配位点和邻近的靶-特异性的序列。提供一组一个或多 个四级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种四级寡核 苷酸引物，其具有三级延伸产物-特异性的部分和5’上游五级引物- 特异性的部分，和(b)第二种四级寡核苷酸引物，其具有三级延伸产物 -特异性的部分和5’上游五级引物-特异性的部分。混合三级延伸产 物、四级寡核苷酸引物和聚合酶，形成一种或多种四级延伸反应混合 物。使一种或多种四级聚合酶链式反应混合物进行一个或多个四级聚 合酶链式反应循环，形成四级延伸产物。提供一组一个或多个五级寡 核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种五级寡核苷酸引物， 其具有与第一种四级寡核苷酸引物的5’上游部分相同的序列，和(b) 第二种五级寡核苷酸引物，其含有与第二种四级寡核苷酸引物的5’上 游部分相同的序列。混合四级延伸产物、该组一种或多种五级寡核苷 酸引物集合和聚合酶，形成五级聚合酶链式反应混合物。使五级聚合 酶链式反应混合物进行一个或多个五级聚合酶链式反应循环，形成与 四级延伸产物互补的五级延伸产物。通过大小或电泳迁移率或杂交， 分离使连接酶重新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应得到的产 物，以便捕获结合到固体支持物上的探针。通过辨别分离的来自连接 酶重新密封反应的产物，检测正常的核苷酸靶序列和一种或多种突变 的核苷酸靶序列在样品中的存在。
本发明的另一个方面涉及鉴别与正常的核苷酸靶序列的差别在于 一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序 列的方法。这包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的核苷酸靶 序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者。还提供一组一个 或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种寡核 苷酸引物，其具有靶-特异性的部分，和(b)第二种寡核苷酸引物，其 具有靶-特异性的部分。仅为一级寡核苷酸引物之一提供标记。提供 聚合酶，并混合样品、一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或 多种一级聚合酶链式反应混合物。使一级聚合酶链式反应混合物进行 一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其与存在于样 品中的正常的核苷酸靶序列和突变的核苷酸靶序列互补。灭活聚合 酶，并使一级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程将一级延 伸产物转化成单链形式，并使单链一级延伸产物退火，形成可能包含 核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核苷酸靶序 列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸序列的核苷酸序列。提供内切核 酸酶，其优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双 链的DNA，并混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切 反应混合物。使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸酶剪切反 应，以便内切核酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割 或剪切异双链的产物。提供连接酶，并混合内切核酸酶剪切反应混合 物和连接酶，形成连接酶重新密封反应混合物。使连接酶重新密封反 应混合物进行连接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处密封切割 的异双链的产物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处重新密封 切割的异双链的产物。提供一种或多种三级寡核苷酸引物，其适合与 已经密封的切割的异双链体产物的一条链的5’末端杂交，并混合重新 密封后的连接酶重新密封反应混合物、三级寡核苷酸引物和聚合酶， 形成三级聚合酶延伸反应混合物。在允许三级寡核苷酸引物与已经密 封的切割的异双链体产物的一条链杂交的条件下，将三级聚合酶延伸 反应混合物与聚合酶一起温育，生成三级延伸产物。提供平端连接物 和具有平端活性的连接酶。混合三级延伸产物、平端连接物和具有平 端活性的连接酶，形成平端连接酶反应混合物。在能有效地将平端连 接物连接到三级延伸产物上、并生成平端连接产物的条件下，温育平 端连接酶反应混合物。提供许多四级寡核苷酸引物集合，每个集合的 特征在于：(a)第一种四级寡核苷酸引物，其具有平端连接产物-特异 性的部分和5’上游五级引物-特异性的部分，和(b)第二种四级寡核 苷酸引物，其具有连接物-特异性的部分。混合平端连接产物、四级 寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种四级聚合酶链式反应混 合物。使一种或多种四级聚合酶链式反应混合物进行一个或多个聚合 酶链式反应循环，形成四级延伸产物。提供五级寡核苷酸引物，其具 有与第一种四级寡核苷酸引物的5’上游部分相同的序列，并混合五级 寡核苷酸引物、四级聚合酶延伸产物和聚合酶，形成五级聚合酶链式 反应混合物。使一种或多种五级聚合酶链式反应混合物进行一个或多 个聚合酶链式反应循环，形成五级延伸产物。通过大小或电泳迁移率 或杂交，分离使一种或多种五级聚合酶链式反应混合物进行一个或多 个聚合酶链式反应循环得到的产物，以便捕获结合到固体支持物上的 探针。通过区分从五级聚合酶链式反应得到的分离的产物，检测正常 的核苷酸靶序列和一种或多种突变的核苷酸靶序列在样品中的存在。
当检测肿瘤样品中的突变时，Endo V/连接酶突变扫描测定的优点 是最显然的(Huang，J.，等，Oncogene，21(12)：1909-21(2002)，其 在这里整体引作参考)。该技术不仅可以容易的识别移码突变，而且可 以检测过量野生型DNA(准确地，用大多数实体瘤样品观察到的状况) 中存在的突变。但是，因为通过电泳可以检测产物，依次地处理基因。
有数百个已知的肿瘤抑制基因和数十个已知的癌基因可能在肿瘤 发展过程中经历突变。现有的技术不足以迅速地识别这些基因，以鉴 别使点突变或移码突变灭活的关键肿瘤抑制基因、或激活突变的关键 癌基因。另外，就临床诊断和预测而言，该技术应当是灵敏且特异性 的，即鉴别具有新突变的所有基因，鉴别存在于基因中的所有突变， 并限制未被后续的测序步骤证实的推定突变的数目。因而，迫切需要 准确地鉴别肿瘤样品的“突变基因组”。
与鉴别偶然发生在肿瘤中的新突变有关的是，鉴别会使个体倾向 于在第一位置形成癌症的种系突变。另外，需要快速地描绘数百个候 选基因中普通的和罕见的SNP和突变的存在。
一种方案是，组合Endo V/连接酶突变扫描技术和微阵列技术。该 方法不是必然地鉴别碱基对内的突变的准确性质，而是在微阵列上鉴 别含有潜在突变的基因或外显子，然后使用Endo V/连接酶突变扫描、 电泳分离和最后自动化的测序，准确定位突变。该方法的简单描述是， 取cDNA的样品，并与cDNA芯片杂交。用Endo V在碱基错配位点处 剪切异双链(在连接酶重新密封的完美匹配处具有切口)，使用DNA聚 合酶和荧光dNTP，通过切口移位标记切口的片段。表现出荧光标记的 那些位置会识别含有原始突变的特定cDNA。可以考虑一种类似的方 法，使用样品中的基因组片段，并使它们与已经印迹在微阵列上的互 补片段杂交。
本发明的Endo V反应发生在溶液中，且不会脱离芯片。另外，由 于标记方法不依赖于切口移位，底物的两条链的剪切不会干扰产生正 确的信号。在不同的反应中，独立地分析沃森和克里克链。在本发明 的有些实施方案中，阵列由与要记录的链互补的合成寡核苷酸、cDNA 或PCR片段制成。在其它实施方案中，使用通用阵列来分别记录每个 反应，或在完成PCR步骤后，将它们混合，并与单个阵列杂交，条件 是为每个独立的链反应在阵列上使用不同的地址。
如果突变是在不同的50个碱基对区域，可以容易地将它们区分 开，因为2个位置会发光。如果突变是在相同的50个碱基对区域，肿 瘤和正常的样品会发出不同的信号，或当与2种不同的标记的信号共 杂交时。如果将检测方案与结合到片段的3’末端上的Q-代码 (zipcode)序列一起使用，在延伸引物末端的2个额外的碱基，允许 独特的标记方案。由于查询了沃森和克里克链，可以将大部分突变与 该突变区分开，例外是周围的碱基都相同的罕见情况(平均1/64的情 况)。每种已知多态性的等位基因-特异性的PCR引物，也可以用于记 录现有多态性附近的新突变。
为了记录剪接变体，正常的和剪接位点变体具有用给定引物集合 扩增的区域。
在分开的试管中使用阵列、扩增和混合的不同集合，可以预防密 切相关的基因与同源位置的交叉杂交，导致假阳性信号。
提供了帽化方案，其捕获仅含有全长PCR延伸产物的异双链的产 物。该方法也消除了来自全长自由3’OH末端的假阳性信号的问题。 通常，不完全的PCR扩增不是问题，且不会产生足够的背景噪音。使 用特异性的引物，其比用于产生异双链的产物的原始引物向内偏约20 至60个碱基，PCR扩增指示着突变的存在的标记的产物。
通过使用多个50聚体序列来层叠一个区域，噪音会被用于层叠目 标区域的位置的数目分解。如果需要，校对酶也可以用于进一步降低 噪音。
Q-代码标记会产生同样强度的独立于位置的信号。就通用阵列检 测方案而言，在记录到阵列上之前，PCR扩增产物。这可能有助于平 整强度。
利用本发明，阵列上的单链DNA不会折叠到自身上，并允许聚合 酶延伸发夹。这都会避免产生假阳性信号。
本发明的酶反应在溶液中工作，不是在阵列上。
附图简述
图1是一幅示意图，它解释了Endo V/连接酶突变扫描测定的现有 方法，其通过凝胶电泳检测片段。
图2是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/连接酶突变扫 描测定，其使用λ外切核酸酶降低背景信号。
图3是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/连接酶突变扫 描测定，其减少5’末端剪切。
图4是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/连接酶突变扫 描测定，其使用PCR/PCR来制备异双链的DNA，和标准的变性和复 性处理。
图5是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/连接酶突变扫 描测定，其使用PCR/PCR来制备用于Endo V突变扫描的异双链的 DNA，和分裂标记、变性和复性处理。
图6是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/连接酶突变扫 描测定，其使用PCR/PCR来制备用于Endo V突变扫描的异双链的 DNA，和λ外切核酸酶处理。
图7是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/连接酶突变扫 描测定，其使用PCR/PCR来制备用于Endo V突变扫描的异双链的 DNA，和连接物连接处理。
图8是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/DNA连接酶/ 阵列突变筛选测定，其序列-特异性地检测新产生的3’末端。
图9是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/DNA连接酶/ 阵列突变筛选测定，其检测具有多个外显子的新产生的3’末端。
图10是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/DNA连接酶 /阵列突变筛选测定，其序列-特异性地检测新产生的5’末端。
图11是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/DNA连接酶 /通用阵列突变筛选测定，其检测新产生的3’末端。
图12是一幅示意图，它解释了根据本发明的Endo V/DNA连接酶 /通用阵列突变筛选测定，其检测具有多个外显子的新产生的3’末端 和多态性。
图13是含有p53外显子8R273H突变的异双链的DNA的Endo V/ 连接酶剪切产物的电泳图谱。该图解释了当使用λ外切核酸酶来产生 纯的G/T和A/C异双链时，与产生G/T和A/C异双链错配以及G∶C 和A∶T同源双链匹配的标准热变性/复性相比，信号强度以及信噪比的 提高。使用p53外显子8的Tet-和Fam-标记的PCR引物，单独地 PCR扩增来自野生型和R273H突变细胞系的DNA。混合PCR产物， 允许产生同源双链化的或异双链的底物。就需要λ外切核酸酶消化的 反应而言，在5’末端磷酸化上或下PCR引物。用Endo V/连接酶(Endo V(+)和连接酶(+))或不用Endo V/连接酶(Endo V(-)和连接酶(-))处理 每种PCR混合物，未处理的作为阴性对照。泳道1-4显示了在已经 经历了标准的变性/复性条件(95℃、2分钟，然后经1小时，逐渐从95 ℃冷却至45℃)的DNA底物上进行的Endo V/连接酶反应。泳道5-10 显示了在用λ外切核酸酶变成单链的DNA底物上进行的反应，允许得 到的互补单链再退火和形成异双链。在标准条件下，野生型/突变型 PCR混合物含有具有G/T+A/C错配的异双链(泳道3，4)。野生型PCR 片段用作对照(G∶C匹配，泳道1，2)。在λ外切核酸酶方法下，使两种 不同类型的野生型/突变型PCR混合物进行Endo V反应：上链野生 型：下链突变型的异双链(G/T错配，泳道7，8)，和上链突变型：下链 野生型的异双链(A/C错配，泳道9，10)。野生型PCR混合物用作对照 (G∶C匹配，泳道5，6)。在ABI-377测序仪中，使用过滤器C设置， 在6％变性聚丙烯酰胺凝胶中电泳反应混合物。绿带由剪切Tet-标记 的上链产生，蓝带由剪切Fam-标记的下链产生。
图14显示了与图13的泳道4和10相对应的电泳图谱。这些图谱 提供了定量数据，并使用GeneScan分析软件进行分析。上链和下链 Endo V剪切产物分别用绿和蓝箭头标示。
图15A和B是在含有p53外显子8R273H突变和K-ras G12V突 变的异双链的DNA上得到的Endo V/连接酶剪切产物的电泳图谱。为 了使用变性/复性产生异双链，将Vic-和Ned-标记的通用引物与基因 -特异性的引物联合使用，以分别扩增野生型和突变型p53外显子8 和K-ras外显子1片段。当使用λ外切核酸酶产生单链时，其中互补 的单链再退火产生异双链，将磷酸化的通用引物和Vic-或Ned-标记 的通用引物与基因-特异性的引物联合使用，以分别扩增野生型和突 变型p53外显子8和K-ras外显子1片段。平行地进行标准的热变性 /复性和λ外切核酸酶方法，产生异双链的和(对照)同源双链化的DNA 底物。用Endo V/连接酶(Endo V(+)和连接酶(+))或不用Endo V/连接酶 (Endo V(-)和连接酶(-))处理每种PCR混合物，未处理的作为阴性对 照。在图15A中，显示了当使用VicUniEV1F和NedUniEV2R PCR引 物(内部标记的)、或VicUniEV5F和NedUniEV6R PCR引物(反向连接 -标记的)来PCR扩增野生型和R273H突变时，如指示的(见图4)，在 p53外显子8上得到的结果。关于λ外切核酸酶处理，将标记的通用 引物之一替换为磷酸化的引物，以允许消化该链(见图6)。在标准的变 性/复性条件下，野生型/突变型PCR混合物含有具有G/T+A/C错配的 异双链。野生型PCR片段用作对照(G∶C匹配)。利用λ外切核酸酶方 法，对两种不同类型的野生型/突变型PCR混合物进行Endo V反应： 上链野生型与下链突变型的异双链(G/T错配)，和上链突变型与下链野 生型的异双链(A/C错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。在 图15B中，显示了当使用VicUniEV5F和NedUniEV6R PCR引物时， 在K-ras外显子1G12V突变上得到的结果。关于λ外切核酸酶实验， 将标记的通用引物之一替换为磷酸化的引物，以允许消化该链。在标 准的变性/复性条件下，野生型/突变型PCR混合物含有具有G/A+T/C 错配的异双链。野生型PCR片段用作对照(G∶C匹配)。利用λ外切核 酸酶方法，对两种不同类型的野生型/突变型PCR混合物进行Endo V 反应：上链野生型与下链突变型的异双链(G/A错配)，和上链突变型与 下链野生型的异双链(T/C错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹 配)。在ABI 3730基于荧光的毛细管电泳仪器(Applied Biosystems， Foster City，CA)上，电泳反应混合物。在跑完电泳后，在仪器监视器 上显示出虚拟的凝胶图像，Vic-和Ned-标记的片段分别显示为绿色 和黄色。使用Gene Mapper片段分析软件，进行数据分析。
图16A-B是在含有p53外显子8R273H突变的不同大小的异双 链的DNA片段上得到的Endo V/连接酶剪切产物的电泳图谱。图16显 示了当使用通用PCR引物(VicUniEV5F/NedUniEV6R)和p53外显子8 和外显子8-9片段(R273H突变)作为底物时，不同的异双链方法的对 比：标准的变性/再退火方法(见图4)，λ外切核酸酶方法(见图6)，和“分 裂标记，变性/复性”方法(见图5)。用Endo V/连接酶(Endo V(+)和连接 酶(+))或不用Endo V/连接酶(Endo V(-)和连接酶(-))处理每种PCR 混合物，未处理的作为阴性对照。在图16A中，显示了当使用指示的3 种不同的异双链条件时，在p53外显子8R273H上得到的结果。在标 准条件下，野生型/突变型PCR混合物含有具有G/T+A/C错配的异双 链。野生型PCR片段用作对照(G∶C匹配)。在λ外切核酸酶方法下， 对两种不同类型的野生型/突变型PCR混合物进行Endo V反应：上链 野生型与下链突变型的异双链(G/T错配)，和上链突变型与下链野生型 的异双链(A/C错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。在“分 裂标记，变性/复性”方法下，将两种不同类型的标记的野生型/突变型 PCR混合物变性，再退火，然后进行Endo V反应：上链野生型与下链 突变型的异双链(仅标记G/T错配)，和上链突变型与下链野生型的异双 链(仅标记A/C错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。在图 16B中，显示了当使用指示的标准的和λ外切核酸酶异双链方法时，在 p53外显子8-9R273H上得到的结果。在标准条件下，野生型/突变型 PCR混合物含有具有G/T+A/C错配的异双链。野生型PCR片段用作 对照(G∶C匹配)。在λ外切核酸酶方法下，对两种不同类型的野生型/ 突变型PCR混合物进行Endo V反应：上链野生型与下链突变型的异 双链(G/T错配)，和上链突变型与下链野生型的异双链(A/C错配)。野 生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。在ABI 3730基于荧光的毛细管 电泳仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，电泳反应混合物。 在跑完电泳后，在仪器监视器上显示出虚拟的凝胶图像，Vic-和Ned -标记的片段分别显示为绿色和黄色。使用Gene Mapper片段分析软 件，进行数据分析。
图17是四氢噻吩砜和四亚甲基亚砜的化学结构图。
图18是在有四氢噻吩砜或四亚甲基亚砜存在下，含有p53 R273H 突变的异双链的DNA的Endo V剪切产物的电泳图谱。标识：W是从 含有野生型p53基因外显子8的DNA模板扩增的PCR片段；M是50％ 野生型p53外显子8PCR片段和50％从含有外显子8的R273H突变的 DNA模板扩增的PCR片段的混合物。在“标准条件”下，在95℃将混 合物变性2分钟，然后经1小时将温度从95℃逐渐降低至45℃，以允 许再退火。在65℃，在20ml混合物中进行Endo V反应40分钟，所 述混合物含有10mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，7ml双链DNA，1 mM Endo V，和化学添加剂。标准的添加剂是5％DMSO和1.5M甜 菜碱。如图18所示，在电泳图谱上面的数字(1-10)指示着如下的标准 反应条件的不同改变：
条件1：用于产生异双链(95℃，2分钟，经1小时缓慢冷却至45 ℃)和Endo V反应(5％DMSO和1.5M甜菜碱)的标准条件；
条件2：在异双链体形成温育步骤中，加入4mM EDTA(终浓度)；
条件3：在Endo V剪切步骤中，加入5％四亚甲基亚砜；
条件4：在异双链体形成温育步骤中，加入4mM EDTA。在Endo V剪切步骤中，加入5％四亚甲基亚砜；
条件5：在Endo V剪切步骤中，加入5％四氢噻吩砜；
条件6：在异双链体形成温育步骤中，加入4mM EDTA，在Endo V剪切步骤中，加入5％四氢噻吩砜；
条件7：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四亚甲基亚砜。 Endo V剪切步骤中，存在5％四亚甲基亚砜；
条件8：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四亚甲基亚砜和 4mM EDTA。在Endo V反应混合物中，存在终浓度为5％的四亚甲基 亚砜；
条件9：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四氢噻吩砜。在 Endo V剪切步骤中，存在终浓度为5％的四氢噻吩砜；
条件10：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四氢噻吩砜和4 mM EDTA。在Endo V剪切步骤中，存在终浓度为5％的四氢噻吩砜；
用箭头指示着R273H突变的上链和下链的剪切产物。用(+)显示不 同泳道的不同添加剂。W：野生型。M：突变型。Tfx：四亚甲基亚砜。 Tfo：四氢噻吩砜。
图19A-C显示了由含有不同修饰的PCR引物产生的p53外显子 8(R273H突变)片段的Endo V剪切产物的毛细管电泳结果。如图3所 示，将片段进行PCR扩增、变性和复性。电泳后，在ABI 3730中， 观察用不同的修饰的引物扩增的异双链PCR片段的Endo V剪切产 物。在图19A中，通过将Endo V抗性的序列“CGCCGC”添加到每个 引物的5’末端，修饰用于扩增p53外显子8的引物。在图19B中， 通过将标记经抗性序列CGCCGC前面的2个2’O甲基-C碱基结合 到5’末端，修饰引物。在图19C中，通过经位于引物5’末端第5个 位置处的C-c6-Vic(或Ned)连接结合标记，修饰引物(见图19的底 部)。
在图19A-C各自上面的图像是凝胶图像的顶部的放大图。箭头指 示着从R273H突变/野生型异双链的模板产生的剪切产物。每种样品具 有3个泳道。第一个泳道是对照，其中没有加入Endo V。第二个和第 三个泳道是Endo V的剪切产物。在第二个泳道中，没有加入用于终止 Endo V反应的EDTA。在第三个泳道中，在Endo V反应的末尾，加 入10mM EDTA(终浓度)来终止反应。WT：野生型，Mut：含有50％ p53外显子8突变R273H和50％野生型PCR片段的异双链。
图20A-B显示了PCR产生的p53外显子6(Q192Ter，Y205F)片段 的Endo V剪切产物的毛细管电泳结果。该实验对比了内部标记的通用引 物(图20A)和反向连接标记的通用引物(图20B)对标记免受Endo V剪切的 保护。如图4所示，对片段进行PCR扩增、变性和复性。W：野生型同 源双链PCR产物。M：50％突变型PCR产物和50％野生型PCR产物的 异双链。样品1的突变：p53外显子6 Q192Ter。样品2的突变：p53 外显子6Y205F。由于该实验用于确定是否能在高背景下区分突变剪切产 物，省略了连接步骤。在图20A中，标记能耐受Endo V剪切，但是在约 600碱基处观察到高分子量伪迹的迁移。在图20B中，没有观察到伪迹， 但是如低分子量片段所指示的，剪切掉了真实的标记。
图21是当使用内部标记的PCR引物时，用于检测k-ras外显子1 和p53基因外显子5，6，7，和8中的突变的Endo V剪切产物的电泳 图谱。如图3所示，对片段进行PCR扩增、变性和复性。WT：野生 型。用内部标记的引物，扩增来自临床样品的野生型DNA和突变型 DNA的PCR产物。在标准反应条件下，对DNA双链体进行Endo V 剪切反应。由于该实验用于确定是否能在高背景下区分突变剪切产 物，省略了连接步骤。还进行了阴性对照的反应(没有Endo V)。在ABI 3730测序仪中，电泳剪切产物。用GeneMapper分析结果，并用 GelRender观察。通过将来自野生型DNA的剪切产物与来自突变型 DNA的剪切产物相对比，可以鉴别k-ras外显子1中的突变G12V、 p53外显子5中的H179Y、p53外显子6中的Q192Ter和Y205F、p53 外显子7中的R248Q、和p53外显子8中的R273H的剪切产物。用箭 头指示突变的剪切产物。
图22是在不同的缓冲条件下得到的含有p53外显子8R273H突变 的异双链的DNA的Endo V/连接酶剪切产物的电泳图谱。使用具有p -UniEV2R的VicUniEV1F或具有p-UniEV1F的NedUniEV2R，与 基因-特异性的引物相结合，PCR扩增野生型和突变型片段，产生具 有一条标记链和一条未标记链的片段。如图5所示，使用“分裂标记， 变性/复性”，使混合物异双链，以便仅标记G/T或A/C异双链。在下 面和表6中，列出了缓冲条件I至IV，以及标准条件。
标准条件： [40分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝20mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，1mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
           [30分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝20mM Tris pH8.5，1.25mM MgCl2，50mM
                    KCl，10mM DTT，20μg/ml BSA，含有3nM连接酶+1mM NAD
条件I-E：  [60分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝20mM Tricine pH8，5mM MgCl2，1mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
           [60分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，10mM
                    DTT，20μg/ml BSA，含有6nM连接酶+5mM NAD
条件II-H： [60分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝20mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V+6nM
                    连接酶+5mM NAD
           [60分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25mM
                    DTT，20μg/ml BSA
条件III-E：[60分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，1mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
           [60分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，10mM
                    DTT，20μg/ml BSA，含有6nM连接酶+5mM NAD
条件IV-H： [60分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V+6nM
                    连接酶+5mM NAD
           [60分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25mM
                    DTT，20μg/ml BSA
在这些实验中，将两种不同类型的野生型/突变型PCR混合物进行 “分裂标记、变性/复性”，然后进行Endo V反应：上链野生型与下链 突变型的异双链(G/T错配)，和上链突变型与下链野生型的异双链(A/C 错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。进行Endo V/连接酶 反应，作为“经典的”两步方法(条件I和III：首先与Endo V一起温育， 然后与连接酶一起温育)，或作为在第一个温育步骤中组合两种酶的两 步方法(条件II和IV：首先与[Endo V+连接酶]一起温育，然后与连接 酶缓冲液一起温育)。在条件I和III中，测试了几项子条件：
-A：首先与Endo V一起温育60分钟，没有第二次温育
-B：首先与Endo V一起温育60分钟，其次只与连接酶缓冲液一 起温育30分钟
-C：首先与Endo V一起温育60分钟，其次与连接酶缓冲液+连 接酶一起温育30分钟
-D：首先与Endo V一起温育60分钟，其次只与连接酶缓冲液一 起温育60分钟
-E：首先与Endo V一起温育60分钟，其次与连接酶缓冲液+连 接酶一起温育60分钟
同样地，测试了条件II和IV中的几项子条件：
-F：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，没有第二次温育
-G：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，其次与连接酶缓 冲液一起温育30分钟
-H：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，其次与连接酶缓 冲液一起温育60分钟。
在ABI 3730基于荧光的毛细管电泳仪器(Applied Biosystems， Foster City，CA)上，电泳反应混合物。在跑完电泳后，在仪器监视器 上显示出虚拟的凝胶图像，Vic-和Ned-标记的片段分别显示为绿色 和黄色。使用Gene Mapper片段分析软件，进行数据分析。
图23是含有p53外显子8R273H突变的异双链的DNA的Endo V/ 连接酶剪切产物的电泳图谱，显示了一步和两步温育条件的对比。使 用含有p-UniEV2R的VicUniEV1F或含有p-UniEV1F的 NedUniEV2R，与基因-特异性的引物相联合，PCR扩增野生型和突 变型片段，产生具有一条标记链和一条未标记链的片段。如图5所示， 使用“分裂标记，变性/复性”，使混合物异双链，以便仅标记G/T或A/C 异双链。在下面和表7中，列出了缓冲条件V和VI，以及标准条件。
标准条件：[40分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝20mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，1mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
          [30分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝20mM Tris pH8.5，1.25mM MgCl2，50mM
                   KCl，10mM DTT，20μg/ml BSA，含有3nM连接酶+1mM NAD
条件V-H： [60分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM Endo V+6nM
                   连接酶+5mM NAD
          [60分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25
                   mM DTT，20μg/ml BSA
条件VI-J：[120分钟]1x Endo V/连接酶缓冲液＝80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM Endo V+6
                   nM连接酶+5mM NAD
在这些实验中，将两种不同类型的野生型/突变型PCR混合物进行 “分裂标记、变性/复性”，然后进行Endo V反应：上链野生型与下链 突变型的异双链(G/T错配)，和上链突变型与下链野生型的异双链(A/C 错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。进行Endo V/连接酶 反应，作为在第一个温育步骤中组合两种酶的两步方法(条件V：首先 与[Endo V+连接酶]一起温育，其次与连接酶缓冲液一起温育)，或作为 单步骤方法(条件VI：与[Endo V+连接酶]一起温育)。另外，进行标准 的两步方法(标准条件：首先与一起温育Endo V，其次与一起温育连接 酶)。在条件V中，测试了几项子条件：
-F：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，没有第二次温育
-H：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，其次与连接酶缓 冲液一起温育60分钟
同样地，测试了条件VI内的几项子条件：
-I：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，没有第二次温育
-J：首先与Endo V+连接酶一起温育120分钟，没有第二次温育
在ABI 3730基于荧光的毛细管电泳仪器(Applied Biosystems， Foster City，CA)上，电泳反应混合物。在跑完电泳后，在仪器监视器 上显示出虚拟的凝胶图像，Vic-和Ned-标记的片段分别显示为绿色 和黄色。使用Gene Mapper片段分析软件，进行数据分析。
图24显示了在K-ras外显子1G12V上进行Endo V/连接酶突变 扫描测定的灵敏度。使用含有p-UniEV2R的VicUniEV1F或含有p -UniEV1F的NedUniEV2R，与基因-特异性的引物相联合，PCR扩 增野生型和突变型片段，产生具有一条标记链和一条未标记链的片 段。如图5所示，使用“分裂标记，变性/复性”，使混合物异双链，以便 仅标记G/T或A/C异双链。在下面的单步骤条件下，进行Endo V/连 接酶温育：1-或2-小时温育，在65℃，在80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，2％甘油，5％DMSO，1.5M甜菜碱，1mM NAD 中，使用1μM Endo V和12nM连接酶。将含有G12V突变的PCR片 段与野生型PCR片段以下述突变型/野生型比混合：1∶1，1∶5，1∶10， 1∶20，1∶50，和1∶100。这适用于两种类型的野生型/突变型异双链：上 链野生型与下链突变型的异双链(G/A错配)，和上链突变型与下链野生 型的异双链(T/C错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。在 ABI 3730基于荧光的毛细管电泳仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上，电泳反应混合物。在跑完电泳后，在仪器监视器上显示 出虚拟的凝胶图像，Vic-和Ned-标记的片段分别显示为绿色和黄 色。使用Gene Mapper片段分析软件，进行数据分析。
图25A-B描绘了随突变型/野生型比而变的相对荧光强度的2幅 图，证实了在下述单步骤条件下，在K-ras外显子1G12V突变(G -＞T核苷酸改变)上进行的Endo V/连接酶突变扫描测定的灵敏度：2 小时温育，在65℃，在80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT， 2％甘油，5％DMSO，1.5M甜菜碱，1mM NAD中，使用1μM Endo V 和12nM连接酶。棒指示着在它们各自的突变型/野生型比下的相对荧 光强度：上链剪切产物是蓝色棒，下链剪切产物是粉红色棒。图25A 显示了G/A错配数据，而图25B显示了T/C错配数据。将相对荧光强 度定义为，通过Gene Mapper片段分析软件测得的信号峰下面积(从图 24分析的数据)。
图26显示了在p53外显子8R273H突变上进行Endo V/连接酶突 变扫描测定的灵敏度。使用含有p-UniEV2R的VicUniEV1F或含有p -UniEV1F的NedUniEV2R，与基因-特异性的引物相联合，PCR扩 增野生型和突变型片段，产生具有一条标记链和一条未标记链的片 段。如图5所示，使用“分裂标记，变性/复性”，使混合物异双链，以便 仅标记G/T或A/C异双链。在下面的单步骤条件下，进行Endo V/连 接酶温育：1-或2-小时温育，在65℃，在80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，2％甘油，5％DMSO，1.5M甜菜碱，1mM NAD 中，使用1μM Endo V和12nM连接酶。将含有G12V突变的PCR片段 与野生型PCR片段以下述突变型/野生型比混合：1∶1，1∶5，1∶10，1∶20， 1∶50，和1∶100。这适用于两种类型的野生型/突变型异双链：上链野生 型与下链突变型的异双链(G/T错配)，和上链突变型与下链野生型的异 双链(A/C错配)。野生型PCR混合物用作对照(G∶C匹配)。在ABI 3730 基于荧光的毛细管电泳仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上， 电泳反应混合物。在跑完电泳后，在仪器监视器上显示出虚拟的凝胶 图像，Vic-和Ned-标记的片段分别显示为绿色和黄色。使用Gene Mapper片段分析软件，进行数据分析。
图27A-B描绘了随突变型/野生型比而变的相对荧光强度的2幅 图，证实了在下述单步骤条件下，在p53外显子8R273H突变(G- ＞A核苷酸改变)上进行的Endo V/连接酶突变扫描测定的灵敏度：2小 时温育，在65℃，在80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT， 2％甘油，5％DMSO，1.5M甜菜碱，1mM NAD中，使用1μM Endo V 和12nM连接酶。棒指示着在它们各自的突变型/野生型比下的相对荧 光强度：上链剪切产物是蓝色棒，下链剪切产物是粉红色棒。图27A 显示了G/T错配数据，而图27B显示了A/C错配数据。将相对荧光强 度定义为，通过Gene Mapper片段分析软件测得的信号峰下面积(从图 26分析的数据)。
发明详述
检测DNA序列差异
本发明的一个方面涉及鉴别与正常的核苷酸靶序列的差别在于一 个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序列 的方法。该方法包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的核苷酸 靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列或这两者。还提供一组一个 或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种寡核 苷酸引物，其具有靶-特异性的部分，和(b)第二种寡核苷酸引物，其 具有靶-特异性的部分，其中仅为一级寡核苷酸引物之一提供标记。 提供聚合酶，并混合样品、一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一 种或多种一级聚合酶链式反应混合物。使一级聚合酶链式反应混合物 进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其与存在 于样品中的正常的核苷酸靶序列和突变的核苷酸靶序列互补。灭活聚 合酶，并使一级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程将一级 延伸产物转化成单链形式，并使单链一级延伸产物退火，形成可能包 含核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核苷酸靶 序列和突变的核苷酸靶序列的核苷酸序列。提供内切核酸酶，其优先 在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的DNA，并 混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切反应混合物。 使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸酶剪切反应，以便内切核 酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的 产物。提供连接酶，并混合内切核酸酶剪切反应混合物和连接酶，形 成连接酶重新密封反应混合物。使连接酶重新密封反应混合物进行连 接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处密封切割的异双链的产 物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处重新密封切割的异双链 的产物。通过大小或电泳迁移率，分离使连接酶重新密封反应混合物 进行连接酶重新密封反应得到的产物。通过辨别分离的来自连接酶重 新密封反应的产物，检测正常的核苷酸靶序列和一个或多个突变的核 苷酸序列在样品中的存在。
本发明的第一个步骤是制备异双链核酸片段。在优选的实施方案 中，用标记的寡核苷酸引物，PCR扩增含有野生型和序列变种(例如单 核苷酸突变或多态性，一个或多个核苷酸插入，和一个或多个核苷酸 缺失)的基因组DNA。可以在引物中使用荧光的、红外线的、放射性的 或其它的标记。在优选的实施方案中，灭活Taq DNA聚合酶或其它PCR 酶，例如，通过蛋白酶K的消化。使含有突变或多态性和野生型PCR 片段的混合物变性，然后再退火，形成含有核苷酸错配的异双链PCR 片段。在优选的实施方案中，通过将片段加热至它们的Tm值以上(通 常大于94℃)，实现变性，并通过首先冷却至50-85℃(更优选地65℃)5 -30分钟(更优选地15分钟)，然后冷却至室温5-30分钟(更优选地15 分钟)，实现再退火，形成异双链PCR片段。可以使用变性/复性的替 代方式。如果不知道在原始反应中存在野生型基因组DNA，在同时在 分开的反应中，使用与上面完全相同的引物，PCR扩增野生型基因组 DNA。混合等摩尔量的含有突变的PCR片段和野生型PCR片段，加 热，然后冷却，形成含有核苷酸错配的异双链PCR片段。或者，通过 外切核酸酶的消化，可以实现变性。
第二个步骤使用Tma内切核酸酶V来剪切含有碱基错配的异双链 DNA。该反应优选地在优化的反应缓冲液中在高温(50-65℃)进行30 分钟至1小时。最佳缓冲条件包括中性pH，低或无盐，和存在Mg2+。 可以加入有机溶剂或其它化合物，如DMSO和甜菜碱，来促进Tma Endo V的剪切。也可以使用替代条件或金属辅因子(如Mn2+)来促进剪 切。甚至在次优条件下，Tma内切核酸酶V活性也可以是足够的。确 定剪切位点是在核苷酸错配的3’位置以外1个核苷酸处。
关于下一步，加入补充缓冲液，使缓冲液的含量和浓度达到为热 稳定的DNA连接酶优化的水平。在优选的实施方案中，使用栖热菌物 种(“Tsp.”)AK16D DNA连接酶。该连接反应在45至85℃、优选地65 ℃进行2至60分钟、优选地20分钟，并使用Tsp.AK16D DNA连接 酶的高特异性来重新密封互补的切口，同时使剪切的错配保持不变。 这会极大地降低背景，并因此显著地提高测定的灵敏度。
在第4个步骤中，分离剪切的片段，例如，通过在变性聚丙烯酰 胺凝胶上的电泳或通过毛细管电泳。由于标记了步骤1的PCR引物， 可以用相应的检测装置检测片段。在优选的实施方案中，荧光地标记 引物，并使用自动化的DNA测序或荧光片段分析仪器检测。通过对比 剪切产物和荧光标记的分子大小标准物的迁移率，确定产物的长度。 这允许大致确定突变的位置。
图2是一幅示意图，它解释了根据本发明的一个方面改进的使用 λ外切核酸酶的Endo V/连接酶突变扫描测定方法。使用一种标记的 (F1，左引物)和一种5’磷酸化的PCR引物(p，右引物)来PCR扩增突 变基因(G∶C)，形成一级PCR产物。在具有正常基因(A∶T，p，左引物， F2右引物)的靶上，进行第二个PCR反应，形成二级PCR产物。分 别使用F1-标记的左引物和磷酸化的右引物(对于正常基因)以及磷酸 化的左引物和F2-标记的右引物(对于突变基因)，也可产生第三和第 四组PCR产物。合并前2种PCR产物，用λ外切核酸酶消化磷酸化 的链，产生2条互补的标记的链，其退火形成G/T异双链。(对第三和 第四组PCR产物使用相同的方法，形成相反链A/C异双链)。使用内 切核酸酶(Endo V)来优先在错配的3’侧一个碱基处切割DNA，并使用 连接酶来重新密封在完美匹配区的背景切口。可以在一个步骤中进行 Endo V和连接酶反应。通过毛细管电泳分离产物，并使用产物的长度 来确定突变的位置。用λ外切核酸酶产生的纯的标记的异双链的DNA 的使用，会提高信号以及信噪比(泳道4和6)。
图3是一幅示意图，它解释了使用耐受Endo V剪切的标记的引物 的改进的Endo V/连接酶突变扫描测定方法。使用标记的PCR引物来 PCR扩增突变的和正常的基因(在相同的或不同的反应中)。或者，可 以使用一种标记的和一种未标记的引物来产生PCR产物。合并PCR 产物，变性，并再退火，形成G/T和A/C异双链的DNA(以及G∶C和 A∶T同源双链化的DNA)。或者，可以使用图2所述的λ外切核酸酶方 法来产生异双链的DNA。使用内切核酸酶(Endo V)优先地在错配的3’ 侧一个碱基处切割DNA，并使用连接酶来重新密封在完美匹配区的背 景切口。可以在一个步骤中进行Endo V和连接酶反应。通过毛细管电 泳分离产物，并使用产物的长度来确定突变的位置。对于标准的5’荧 光地标记的寡核苷酸，其任选地在连接中具有2’-o-甲基-修饰的 糖和/或含有5’CCGCC序列，Endo V将标记剪切出PCR片段。该剪 切的标记在毛细管凝胶上不规则地移动，表观大小为约94个(对于Ned) 和102个(对于Vic)碱基(泳道2-5)。荧光标记在引物序列内部的结合 (通过连接结合到离5’末端4或5个碱基的胞嘧啶的C-6位置)，会 赋予引物对Endo V剪切的抗性。但是，出现了表观大小为600个碱基 的伪迹条带迁移(泳道6-7)。荧光标记通过反向连接向引物序列的结 合(即3’-荧光基团-5’-5’引物序列-3’)，会赋予引物对Endo V 剪切更高的抗性(泳道8-9)。
在进行本发明的方法时，样品可以含有靶核苷酸序列，它是基因 组DNA，从肿瘤样品分离的DNA，mRNA的双链cDNA拷贝，或PCR 扩增的DNA片段。在要根据本发明的方法分析的样品中，突变的核苷 酸靶序列与正常的核苷酸靶序列的摩尔比是在1∶100至100∶1的范围 内。
样品可以包含来自多种样品的种系DNA的混合物，来自多种样品 的肿瘤DNA的混合物，或靶区域的混合物。
本发明的方法能区分遗传的或散发的突变或多态性与正常的靶序 列中的多态性。可以在肿瘤抑制基因、癌基因或DNA复制或修复基因 中，进行该区分。这样的基因包括BCl2，Mdm2，Cdc25A，细胞周期 蛋白D1，细胞周期蛋白E1，Cdk4，存活素，HSP27，HSP70，p53， p21Cip，p16Ink4a，p19ARF，p15INK4b，p27Kip，Bax，生长因子，EGFR， Her2-neu，ErbB-3，ErbB-4，c-Met，c-Sea，Ron，c-Ret， NGFR，TrkB，TrkC，IGF1R，CSF1R，CSF2，c-Kit，AXL，Flt -1(VEGFR-1)，Flk-1(VEGFR-2)，PDGFRα，PDGFRβ，FGFR -1，FGFR-2，FGFR-3，FGFR-4，其它蛋白酪氨酸激酶受体，β -连环蛋白，Wnt(s)，Akt，Tcf4，c-Myc，n-Myc，Wisp-1，Wisp -3，K-ras，H-ras，N-ras，c-Jun，c-Fos，PI3K，c-Src，Shc， Raf1，TGFβ，和MEK，E-钙粘蛋白，APC，TβRII，Smad 2，Smad 4，Smad 7，PTEN，VHL，BRCA1，BRCA2，ATM，hMSH2，hMLH1， hPMS1，hPMS2，或hMSH3。
由于参与的有活性的Taq DNA聚合酶可以延伸Endo V剪切的 DNA，可以将PCR反应物与蛋白酶K一起在45至75℃温育5至60 分钟，优选地在70℃温育10分钟。随后，在80℃至95℃灭活蛋白酶 K10至30分钟，优选地在85℃灭活10分钟。扩增和蛋白酶K消化后， 可以通过琼脂糖凝胶电泳分离PCR片段，并通过溴化乙锭染色观察。
靶DNA的大多数生物源(例如，肿瘤样品)会含有变体(突变或多态 性)和野生型DNA。在这些情况下，不需要向异双链杂交步骤外源地添 加野生型PCR片段。例如，如果底物是含有杂合种系突变的基因组 DNA，仅50％PCR片段会含有突变，而另一半会是野生型序列。因此， 不需要添加野生型PCR片段。同样地，对于实体瘤样品，在这些样品 中典型地存在显著量的间质(即野生型)DNA。对于其中不存在显著量的 内源性野生型DNA的底物源，需要加入大约相同量的野生型PCR片 段。最佳的最终突变型/野生型PCR片段比应当是1∶1，尽管该技术与 其它的突变型/野生型PCR片段比是相容的。
标记的寡核苷酸引物优选地在它们的5’末端处被标记。有用的标 记包括生色团，荧光染料，酶，抗原，重金属，磁探针，红外染料，发 磷光的基团，放射性的基团，化学发光的基团，量子染料，量子点， 和电化学检测基团。
在进行本发明的方法时，第一种一级寡核苷酸引物和/或第二种一 级寡核苷酸引物在它们的5’末端被标记。理想地，标记能耐受内切核 酸酶剪切，且通过3’→5’连接结合到第一种一级寡核苷酸引物和/或 第二种一级寡核苷酸引物上，和/或被内部标记它们的5’末端。
聚合酶是来自水生栖热菌，嗜热栖热菌，激烈热球菌，或海栖热袍 菌的天然的或重组的热稳定的聚合酶。
聚合酶链式反应过程完整地记载在H.Erlich，等，“Recent Advances in the Polymerase Chain Reaction，”Science 252：1643-50 (1991)；M.Innis，等，PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press：New York(1990)；和R.Saiki，等， ″Primer-directed Enzymatic Amplification of DNA with a Thermostable DNA Polymerase，″Science 239：487-91(1988)，它们在 这里整体引作参考。通过在65-94℃的温度向聚合酶链式反应混合物 加入聚合酶或金属辅因子，开始聚合酶链式反应。在蛋白酶K存在下， 优选地通过加热至80至105℃、优选地94℃，进行使聚合酶链式反应 延伸产物变性的步骤。通过首先冷却至50-85℃(优选地65℃)5-30 分钟(优选地10分钟)，然后冷却至室温5-30分钟(优选地15分钟)进 行使聚合酶链式反应延伸产物退火的步骤。
为了异双链DNA形成，通过加热至超过95℃(即在95-100℃持续 15秒至5分钟，优选地在95℃持续1分钟)，使含有荧光地标记的突变 型和野生型PCR片段的混合物变性，从而产生DNA单链。随后进行 在45-85℃持续2-60分钟、优选地在65℃持续10分钟的再退火步 骤，随后，在室温温育5-30分钟、优选地15分钟。该过程后，理论 上50％再退火产物是含有碱基-错配的异双链DNA。一个替代再退火 步骤是从95至25℃缓慢冷却，每分钟降低温度低于1℃，优选地从94 ℃至65℃，经30-60分钟。也可以使用DNA的变性/复性的替代方式 (如用碱处理，随后中和)。典型地，聚合酶链式反应延伸产物具有50 碱基对至1,700碱基对的长度。
或者，通过外切核酸酶的消化，进行将一级延伸产物转化成单链 形式的过程。优选地，外切核酸酶是5’→3’外切核酸酶，且最优选 地，是λ外切核酸酶。
内切核酸酶优选地是来自海栖热袍菌，Aquifex aeolicus，激烈热 球菌，Pyrococcus horikoshii，Pyrococcus abyssi，Pyrobaculum aerophilum，闪烁古生球菌，Aeropyrum pernix，丙酮丁醇梭菌，或枯 草芽孢杆菌的内切核酸酶V。内切核酸酶理想地在离错配碱基对一个 碱基的3’侧位置处切割或剪切异双链的产物。内切核酸酶优先剪切选 自A/A，G/G，T/T，A/G，A/C，G/A，G/T，T/G，T/C，C/A，和C/T 的异双链的产物内的错配。或者，内切核酸酶优先切割或剪切为任意 的单碱基突变或多态性形成的异双链的产物中的至少一种，例外是具 有选自gRcg，rcRc，cgYc，和gYgy的序列的那些，其中错配的位置 标有下划线，并以大写显示。内切核酸酶优先切割或剪切异双链的产 物中的1个、2个和3个碱基插入或缺失。
内切核酸酶优选地是热稳定的内切核酸酶，其优先在碱基对错配 的位置处或在离错配一个碱基处切割或剪切异双链的DNA，并产生适 用于在切口完美匹配的DNA处切割DNA时进行连接的末端。
优选地，在浓度为2-7mM的MgCl2或浓度为0.4-1.2mM的 MnCl2存在下，进行内切核酸酶剪切反应。以10∶1至100∶1的内切核 酸酶/异双链的产物重量比，将MgCl2加入内切核酸酶剪切反应混合 物，基本上不存在NaCl或KCl。当内切核酸酶剪切反应混合物中的内 切核酸酶/异双链的产物重量比是在1∶1至1∶10的范围内时，应当加入 MnCl2；在该情况下，存在浓度为25至75mM、优选地50mM的NaCl 或KCl。也可以在有体积百分比范围为2.5％-10％的DMSO(含有2.5 -10体积％的四氢噻吩砜或四亚砜和/或浓度为0.5M-1.5M的甜菜碱 的混合物)存在下，进行内切核酸酶剪切。优选地，在50-65℃进行内 切核酸酶处理1小时。
在本发明的下一个步骤中，用Tma内切核酸酶V剪切异双链的 PCR片段。Tma内切核酸酶V具有使它适用于该过程的独特性质。最 重要的是它的优先剪切错配的3’侧之外一个碱基的能力，和在互补区 的伪切口是DNA连接酶进行重新连接的合适底物的事实。尽管存在能 更有效地识别碱基错配的其它错配修复酶，它们通常不会在错配处剪 切，它们也不会离开适用于重新连接的末端。与适当的连接酶相结合， Tma Endo V的这些性质允许减少由伪切口产生的背景噪音，同时维持 与错配序列有关的剪切位点。
本发明的下一个步骤用热稳定的连接酶密封异双链PCR片段中的 非特异性切口，如栖热菌物种AK16D，水生栖热菌，嗜热栖热菌，激 烈热球菌，或海栖热袍菌。热稳定的连接酶可以源自水生栖热菌。M. Takahashi，等，“Thermophillic DNA Ligase，”J.Biol.Chem.259：10041 -47(1984)，其在这里整体引作参考。或者，可以重组地制备它。适用 于这样的分离以及重组生产栖热水生菌连接酶以及Thermus themophilus连接酶的方法，公开在Barany等的WO 90/17239，和F. Barany，等，“Cloning，Overexpression and Nucleotide Sequence of a Thermostable DNA-Ligase Encoding Gene，”Gene 109：1-11(1991)， 其特此引作参考。这些文献含有该连接酶以及编码DNA的完整序列信 息。优选地，在有50mM KCl存在下，进行连接酶重新密封，以进一 步抑制内切核酸酶剪切。优选地，使用Tsp AK16D连接酶。当在25 ℃测量时，在7.2至7.8的pH值进行连接酶重新密封。理想地，应当 在该步骤中抑制Tma内切核酸酶V的剪切。Tsp AK16D连接酶的最佳 反应缓冲液是20mM Tris-HCl(pH8.5)，5mM MgCl2，25-75mM(优 选地，50mM)KCl，10mM二硫苏糖醇，1mM NAD+，和20mg/ml BSA。见Tong，J.，等，Nucleic Acid Research 27：788-94(1999)， 其在这里整体引作参考。在有50mM KCl存在下，几乎彻底抑制Tma. endo V。
为了得到Tsp AK16D连接酶反应的接近最佳的缓冲条件，向Tma Endo V反应加入补充缓冲液。在一个优选的实施方案中，10x补充缓 冲液由200mM Tris-HCl(pH8.5)，12.5mM MgCl2，500mM KCl， 100mM DTT，和200g/ml BSA组成。典型地，组合15μL来自Tma 内切核酸酶V剪切反应的反应混合物，2μL 10x补充缓冲液，1μL 20 mM NAD+，和2μL 10-100nM Tsp AK16D连接酶(储备酶溶液)。然 后，可以在65℃温育混合物20分钟，并通过加入等体积的GeneScan终 止溶液(50mM EDTA，1％葡聚糖蓝和80％甲酰胺)进行终止。
内切核酸酶剪切和连接酶重新密封反应可以同时进行。作为结 果，连接酶重新密封反应会造成，源自错配剪切/重新密封的产物比源 自匹配剪切/重新密封的产物更迅速地积累，或造成，错配剪切速度减 去错配连接速度大于匹配剪切速度减去匹配连接速度。
本发明的下一个步骤包含反应产物的检测，其可以使用聚丙烯酰 胺凝胶电泳或毛细管凝胶电泳进行。
在优选的实施方案中，使反应混合物在94℃变性仅1分钟(以避免 DNA裂解，其会增加背景信号)，然后在冰上冷却。然后，将2-3μL 混合物装载到6％变性聚丙烯酰胺凝胶上，并电泳1小时。可以使用 ABI 377测序仪(Perkin Elmer)，在1000伏特，60mA电流，200W功 率和45℃的凝胶温度，分离和检测DNA产物，尽管可以使用替代毛细 管或凝胶电泳方案。荧光基团6-Fam和Tet在ABI DNA 377测序仪 中分别产生蓝色和绿色。剪切带的颜色指示着剪切产物源自上链还是 下链。将TAMRA标记的GeneScan分子大小标准物500装载在相同凝 胶上。这允许通过对比剪切产物与大小标准物的相对迁移率，估计剪 切产物的分子量。优选地，使用GeneScan分析软件版本2.1或3.0a(PE -Biosystems)，尽管可以替代地使用任何现有的凝胶分析软件。该分 析允许确定大致的突变位置。
本发明的另一个方面涉及鉴别与一种或多种正常的核苷酸靶序列 的差别在于一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的 核苷酸靶序列的方法。这包含提供一个或多个样品，其可能含有正常 的核苷酸靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者。还提 供一组一个或多个一级寡核苷酸引物集合。每个集合包含：(a)第一种 一级寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分和5’上游二级引物-特 异性的部分，和(b)第二种一级寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部 分和5’上游二级引物-特异性的部分。组中每个集合的第一种一级寡 核苷酸引物含有相同的5’上游二级引物-特异性的部分，且组中每个 集合的第二种一级寡核苷酸引物含有相同的5’上游二级引物-特异性 的部分。混合样品、一种或多种一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形 成一种或多种一级聚合酶链式反应混合物。使一种或多种一级聚合酶 链式反应混合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸 产物，其与存在于样品中的正常的核苷酸靶和突变的核苷酸靶序列互 补。还提供一组一个或多个二级寡核苷酸引物集合，每个集合包含：(a) 第一种二级寡核苷酸引物，其包含与第一种一级寡核苷酸引物的5’上 游二级引物-特异性的部分相同的序列，和(b)第二种二级寡核苷酸引 物，其包含与第二种一级寡核苷酸引物的5’上游二级引物-特异性的 部分相同的序列。混合一种或多种一级聚合酶链式反应混合物、一种 或多种二级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种二级聚合酶 链式反应混合物。使一种或多种二级聚合酶链式反应混合物进行一个 或多个聚合酶链式反应循环，形成二级延伸产物，其与一级延伸产物 互补。然后灭活聚合酶，并使一种或多种二级聚合酶链式反应混合物 经历一个过程，该过程将二级延伸产物转化成单链形式，并使单链二 级延伸产物退火，形成可能包含核酸分子的异双链的产物，所述核酸 分子包含来自正常的核苷酸靶序列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸 靶序列的核苷酸序列。提供内切核酸酶，其优先在离错配碱基对一个 碱基以内的位置处切割或剪切异双链的DNA，并混合异双链的产物和 内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切反应混合物。使内切核酸酶剪切反 应混合物进行内切核酸酶剪切反应，以便内切核酸酶优先在离错配碱 基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双链的产物。提供连接酶， 并混合内切核酸酶剪切反应混合物和连接酶，形成连接酶重新密封反 应混合物。使连接酶重新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应， 在完美匹配的碱基对处密封切割的异双链的产物，但是基本上不在邻 近错配碱基对的位置处重新密封切割的异双链的产物。使连接酶重新 密封反应混合物进行连接酶重新密封反应后，通过大小或电泳迁移率 或杂交分离产物，捕获结合到固体支持物上的探针。通过辨别分离的 产物，检测正常的核苷酸靶序列和一种或多种突变的核苷酸靶序列在 样品中的存在。
图4是一幅示意图，它解释了使用通用引物和变性/复性产生异双 链的DNA的方法。使用低浓度的基因-特异性的/通用的引物和Taq DNA聚合酶，PCR扩增靶DNA的一个或多个片段。在同一个或后续 的反应中，存在高浓度的标记的通用引物，其含有相同的序列和在它 们的3′端的额外的标记碱基。在图4中，F1-标记的通用引物(Un1)含 有3’AC序列，而F2-标记的通用引物含有3’CA序列。PCR反应 在更低的温度继续，且标记的片段占优势。由于两种引物在它们的5’ 末端具有共同的通用序列，引物二聚体不会扩增。在分开的(或相同的) 反应中，使用PCR来扩增正常的DNA，如上所述。使用变性的和复性 的突变型和正常产物来产生G/T和A/C异双链的片段。该方法允许同 时扩增一个或多个片段，以通过毛细管电泳或通过可寻址的阵列格 式，评价片段。在阵列格式中，不需要标记异双链的片段。
图5是一幅示意图，它解释了使用通用引物和分裂标记、变性/复 性产生异双链的DNA的方法。使用低浓度的基因-特异性的/通用的引 物和Taq DNA聚合酶，PCR扩增靶DNA的一个或多个片段。在同一 个或后续的反应中，存在高浓度的一种标记的和一种未标记的通用引 物，其含有相同的序列和在它们的3′端的额外的标记碱基。在图5中， F1-标记的通用引物(Un1)含有3’AC序列，而未标记的通用引物含有 3’CA序列。PCR反应在更低的温度继续，且标记的片段占优势。由 于两种引物在它们的5’末端具有共同的通用序列，引物二聚体不会扩 增。在分开的反应中，如上PCR扩增正常的DNA，但是转换标记的通 用引物(F2和3’CA序列)和未标记的通用引物(未标记的通用引物含有 3’AC序列)。突变型和正常产物的变性的和复性，产生G/T和A/C异 双链的片段，共4条异双链。在该实施例中，仅标记了G/T异双链。 反转引物集合，产生标记的互补的A/C异双链。该方法允许同时扩增 一个或多个片段，以通过毛细管电泳或通过可寻址的阵列格式，评价 片段。
图6是一幅示意图，它解释了使用λ外切核酸酶和通用引物产生 异双链的DNA的方法。使用低浓度的基因-特异性的/通用的引物和 Taq DNA聚合酶，PCR扩增靶DNA的一个或多个片段。在同一个或 后续的反应中，存在一种标记的和一种磷酸化的通用引物，其含有相 同的序列和在它们的3’端的额外的标记碱基。在所示的图中，F1-标 记的通用引物(Un1)含有3’AC序列，而磷酸化的通用引物含有3’CA 序列。PCR反应在更低的温度继续，且标记的片段占优势。由于两种 引物在它们的5’末端具有共同的通用序列，引物二聚体不会扩增。在 分开的反应中，如上PCR扩增正常的DNA，但是转换标记的通用引物 (F2和3’CA序列)和磷酸化的通用引物(磷酸化的通用引物含有3’AC 序列)。混合两种PCR产物，并用λ外切核酸酶处理，允许新产生的单 链的DNA退火，并产生标记的G/T异双链的片段。反转引物集合，产 生标记的互补的A/C异双链。该方法允许同时扩增一个或多个片段， 以通过毛细管电泳或通过可寻址的阵列格式，评价片段。
图7是一幅示意图，它解释了使用通用引物和标记的接头产生异 双链的DNA的方法。使用低浓度的基因-特异性的/通用的引物和Taq 聚合酶，PCR扩增靶DNA的一个或多个片段。在同一个或后续的反应 中，存在高浓度的磷酸化的通用引物，其含有相同的序列和在它们的 3’端的额外的标记碱基。在图7中，左边的磷酸化的通用引物(Un1) 含有3’AC序列，而右边的磷酸化的通用引物含有3’CA序列。PCR 反应在更低的温度继续，且磷酸化的片段占优势。由于两种引物具有 相同的序列，引物二聚体不会扩增。在分开的反应中，使用在它们的 5′末端含有额外碱基的通用引物，如上PCR扩增正常的DNA。如图7 所示，左边的磷酸化的通用引物(Un1)含有5’GG序列和3’AC序列， 而右边的磷酸化的通用引物含有5’GGG序列和3’CA序列。使PCR 产物变性和复性，产生具有不对称的″粘端″的异双链的片段。用T4连 接酶，将具有对应突出(即在左边的2碱基5’GG突出，和在右边的3 碱基5’GGG突出)的连接物仅连接到正确的异双链的末端。可以使用 伴侣连接物，其连接到含有额外3′A的末端，所述额外3’A经常被 Taq DNA聚合酶添加到PCR产物的末端。连接物含有阻断基团，以赋 予异双链的DNA对随后的外切核酸酶消化的抗性。再退火的同源双链 不具有粘端突出，且不受连接物连接的保护。如图7所示，连接物保 护G/T异双链(而不是G∶C或A∶T同源双链)免受外切核酸酶的消化。 分开的反应或同一个反应含有用于保护互补的A/C异双链的连接物。 该方法允许同时扩增一个或多个片段，以通过可寻址的阵列格式评价 片段。
在进行本发明的方法时，使用标记的第一种二级寡核苷酸引物和 未标记的一种或多种第二种二级寡核苷酸引物，进行第一次二级聚合 酶链式反应。使用标记的第二种二级寡核苷酸引物和未标记的一种或 多种第一种二级寡核苷酸引物，进行第二次二级聚合酶链式反应。第 一次二级聚合酶链式反应产生标记的二级延伸产物，且其与第二次二 级聚合酶链式反应的标记的二级聚合酶延伸产物互补。第一次和第二 次二级聚合酶链式反应后，混合它们的二级聚合酶链式反应混合物， 产生异双链体产物。第一次二级聚合酶链式反应的二级聚合酶链式反 应混合物可能包含包括来自突变的核苷酸靶序列的核苷酸序列的核酸 分子。第二次二级聚合酶链式反应的二级聚合酶链式反应混合物包含 包括来自正常的核苷酸靶序列的核苷酸序列的核酸分子。第一次二级 聚合酶链式反应的二级聚合酶链式反应混合物可能包含包括来自第一 种样品中的第一种突变核苷酸靶序列的核苷酸序列的核酸分子，而第 二次二级聚合酶链式反应的二级聚合酶链式反应混合物包含包括来自 第二种样品中的不同突变核苷酸靶序列的核苷酸序列的核酸分子。
或者，本发明的方法可以包含，用标记的第一种二级寡核苷酸引 物和未标记的一种或多种第二种二级寡核苷酸引物，进行第一次和第 二次二级聚合酶链式反应。用未标记的一种或多种第一种二级寡核苷 酸引物和标记的第二种二级寡核苷酸引物，进行第三次和第四次二级 聚合酶链式反应。第一次和第二次二级聚合酶链式反应产生标记的二 级延伸产物，且其与第三次和第四次聚合酶链式反应的标记的二级聚 合酶延伸产物互补。第一次和第二次二级聚合酶链式反应后，混合它 们的二级聚合酶链式反应混合物，产生第一种异双链体产物，且在第 二次和第三次聚合酶链式反应后，混合它们的二级聚合酶链式反应混 合物，产生第二种异双链体产物。第一次和第三次聚合酶链式反应的 二级聚合酶链式反应混合物可能包含包括来自突变的核苷酸靶序列的 核苷酸序列的核酸分子，而第二次和第四次聚合酶链式反应的二级聚 合酶链式反应混合物包含包括来自正常的核苷酸靶序列的核苷酸序列 的核酸分子。第一次和第三次聚合酶链式反应的二级聚合酶链式反应 混合物可能包含包括来自第一种样品中的第一种突变核苷酸靶序列的 核苷酸序列的核酸分子。第二次和第四次聚合酶链式反应的二级聚合 酶链式反应混合物可能包含包括来自第二种样品中的不同突变核苷酸 靶序列的核苷酸序列的核酸分子。
本发明的方法也包含使用许多二级聚合酶链式反应混合物，后者 包含标记的第一种二级寡核苷酸引物和未标记的一种或多种第二种二 级寡核苷酸引物。许多二级聚合酶链式反应混合物包含标记的第二种 二级寡核苷酸引物和未标记的一种或多种第一种二级寡核苷酸引物。 用许多第一种二级聚合酶链式反应混合物进行二级聚合酶链式反应， 生成标记的二级延伸产物，且其与来自用许多第二种二级聚合酶链式 反应混合物进行的二级聚合酶链式反应的二级延伸产物互补。用许多 第一种和第二种二级聚合酶链式反应混合物进行二级聚合酶链式反应 后，混合许多第二种二级聚合酶链式反应混合物，产生许多一级异双 链体产物。混合许多第二种二级聚合酶链式反应混合物和许多第一种 二级聚合酶链式反应混合物，产生二级异双链体产物。许多第一种二 级聚合酶链式反应混合物可能包含包括来自许多样品中的突变核苷酸 靶序列的核苷酸序列的核酸分子，而许多第二种二级聚合酶链式反应 可能包含包括来自许多样品中的突变核苷酸靶序列的核苷酸序列的核 酸分子，第一种和第二种二级聚合酶链式反应混合物生成标记的互补 的二级延伸产物。
理想地，在第一种或第二种二级寡核苷酸引物之一上提供标记。 或者，在第一种或第二种二级寡核苷酸引物上都提供标记。或者，未 标记的二级寡核苷酸引物可以含有5’磷酸基。
对于特定的二级寡核苷酸引物集合，第一种二级寡核苷酸引物和 第二种二级寡核苷酸引物具有在5’末端基本上类似、但是在它们的3’ 末端含有差异的核苷酸序列。
本发明的另一个方面涉及鉴别与正常的核苷酸靶序列的差别在于 一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序 列的方法。该方法包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的核苷 酸靶序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者。这包含提供 一组一个或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第 一种寡核苷酸引物，其具有靶-特异性的部分，和(b)第二种寡核苷酸 引物，其具有靶-特异性的部分，其中仅为一级寡核苷酸引物之一提 供标记。提供聚合酶，并混合样品、一级寡核苷酸引物集合和聚合酶， 形成一种或多种一级聚合酶链式反应混合物。使一级聚合酶链式反应 混合物进行一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其 与存在于样品中的正常的核苷酸靶序列和突变的核苷酸靶序列互补。 灭活聚合酶，并使一级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程 将二级延伸产物转化成单链形式，并使单链二级延伸产物退火，形成 可能包含核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核 苷酸靶序列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸靶序列的核苷酸序列。 提供内切核酸酶，其优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割 或剪切异双链的DNA，并混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切 核酸酶剪切反应混合物。使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸 酶剪切反应，以便内切核酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位 置处切割或剪切异双链的产物。提供连接酶，并混合内切核酸酶剪切 反应混合物和连接酶，形成连接酶重新密封反应混合物。使连接酶重 新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处 密封切割的异双链的产物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处 重新密封切割的异双链的产物。提供末端转移酶，并混合来自连接酶 重新密封反应混合物的可能切割的或剪切的异双链的产物和末端转移 酶，形成末端转移酶延伸反应混合物。将末端转移酶延伸反应混合物 与单独的dNTP一起温育，在新产生的3’OH基团处延伸切口的或剪 切的异双链的产物，形成末端转移酶延伸产物。提供一种或多种三级 寡核苷酸引物，其适于与新产生的末端转移酶延伸产物杂交，且适于 3’末端延伸。混合末端转移酶延伸产物、三级寡核苷酸引物和聚合酶， 形成三级聚合酶延伸反应混合物。在允许三级寡核苷酸引物与末端转 移酶延伸产物杂交的条件下，将三级聚合酶延伸反应混合物和聚合酶 一起温育，生成三级延伸产物，它们是末端转移酶延伸产物的互补拷 贝，且含有错配位点和邻近的靶-特异性的序列。提供一组一个或多 个四级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种四级寡核 苷酸引物，其具有三级延伸产物-特异性的部分和5’上游五级引物- 特异性的部分，和(b)第二种四级寡核苷酸引物，其具有三级延伸产物 -特异性的部分和5’上游五级引物-特异性的部分。混合三级延伸产 物、四级寡核苷酸引物和聚合酶，形成一种或多种四级延伸反应混合 物。使一种或多种四级聚合酶链式反应混合物进行一个或多个四级聚 合酶链式反应循环，形成四级延伸产物。提供一组一个或多个五级寡 核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种五级寡核苷酸引物， 其具有与第一种四级寡核苷酸引物的5’上游部分相同的序列，和(b) 第二种五级寡核苷酸引物，其含有与第二种四级寡核苷酸引物的5’上 游部分相同的序列。混合四级延伸产物、该组一种或多种五级寡核苷 酸引物集合和聚合酶，形成五级聚合酶链式反应混合物。使五级聚合 酶链式反应混合物进行一个或多个五级聚合酶链式反应循环，形成与 四级延伸产物互补的五级延伸产物。通过大小或电泳迁移率或杂交， 分离使连接酶重新密封反应混合物进行连接酶重新密封反应得到的产 物，以便捕获结合到固体支持物上的探针。通过辨别分离的来自连接 酶重新密封反应的产物，检测正常的核苷酸靶序列和一种或多种突变 的核苷酸靶序列在样品中的存在。
图8是一幅示意图，它解释了用基因-特异性的阵列检测进行 Endo V/连接酶突变扫描测定的改进方法。如图4-7所述，产生一个 或多个片段的异双链的DNA。使用内切核酸酶(Endo V)优先地在错配 的3’侧一个碱基处切割DNA，并使用连接酶来重新密封在完美匹配 区的背景切口。可以在一个步骤中进行Endo V和连接酶反应。使用末 端转移酶和dGTP，延伸新产生的3’OH。退火含有在3’末端的2个 独特碱基(例如AT)、C8、编码序列(例如E1)和在5’末端的通用序列 (Un1)的引物，并用Taq DNA聚合酶延伸。使用含有在5’末端的通用 序列(Un2)的基因-特异性的上游引物、磷酸化的Un2引物和荧光地- 标记的Un1引物，使用Taq DNA聚合酶和含有低浓度的dUTP的 dNTP，PCR扩增片段。然后，使用内切核酸酶V，在尿嘧啶碱基的3’ 侧的一个碱基处，切口PCR产物。使用λ外切核酸酶，消化切口的PCR 产物。只会剩下5’标记的单链片段，其含有邻近错配位点的约20至 50个碱基的基因-特异性的序列，且包含错配位点。然后，在含有基 因序列层叠的阵列上，杂交标记的片段，以识别近似的错配位点。在 含有互补序列的阵列上，用相反链引物进行单独的方法，以确定互补 链上错配的存在。如图8所示，与碱基150-200相对应的荧光信号指 示着在外显子1的中央存在突变。通过用基因-特异性的引物和含有 独特的编码序列(例如E1)和通用Un1序列的引物进行再次扩增，个别 地对来自PCR产物的含有突变的片段进行测序。
图9是一幅示意图，它解释了用基因-特异性的阵列检测进行多 个外显子的Endo V/连接酶突变扫描测定的改进方法。如图4-7所述， 产生一个或多个含有多个外显子的片段的异双链的DNA。使用内切核 酸酶(Endo V)优先地在错配的3’侧一个碱基处切割DNA，并使用连接 酶来重新密封在完美匹配区的背景切口。可以在一个步骤中进行Endo V和连接酶反应。使用末端转移酶和dGTP，延伸新产生的3’OH。 退火含有在3’末端的2个独特碱基(例如AC，GT)、C8、编码序列(例 如E1，E2)和在5’末端的通用序列(Un1)的引物，并用Taq DNA聚合 酶延伸。使用含有在5’末端的通用序列(Un2)的基因-特异性的上游 引物、磷酸化的Un2引物和荧光地-标记的Un1引物，使用Taq DNA 聚合酶和dNTP′s，PCR扩增片段。阻断寡核苷酸寡核苷酸的存在，会 确保希望的PCR产物优势。使用λ外切核酸酶消化PCR产物。只会 剩下5’标记的单链片段，其含有邻近错配位点的基因-特异性的序 列，且包含错配位点。然后，在含有外显子序列层叠的阵列上，杂交 标记的片段，以识别含有错配的外显子。在含有互补序列的阵列上， 用相反链引物进行单独的方法，以确定互补链上错配的存在。如图9 所示，在外显子1和外显子2基因-特异性的位置处的荧光信号指示 着在外显子1和外显子2中存在突变(或多态性)。通过用外显子-特异 性的引物和含有独特的编码序列(例如E1，E2)和通用Un1序列的引物 进行再次扩增，个别地对来自PCR产物的含有突变的片段进行测序。
图11是一幅示意图，它解释了用通用阵列检测进行Endo V/连接 酶突变扫描测定的改进方法。如图4-7所述，产生一个或多个片段的 异双链的DNA。使用内切核酸酶(Endo V)优先地在错配的3’侧一个碱 基处切割DNA，并使用连接酶来重新密封在完美匹配区的背景切口。 可以在一个步骤中进行Endo V和连接酶反应。使用末端转移酶和 dGTP，延伸新产生的3’OH。退火含有在3’末端上的2个独特碱基 (例如AT)、C8、编码序列(例如E1)和在5’末端上的通用序列(Un1) 的引物，并用Taq DNA聚合酶延伸。使用含有代码序列和在5’末端 的通用序列(Un2)的基因-特异性的上游引物、磷酸化的Un2引物和荧 光地-标记的Un1引物，使用Taq DNA聚合酶和dNTP′s，PCR扩增 片段。可以得到许多具有不同代码的引物，但是最短的PCR产物占优 势。使用λ外切核酸酶，将PCR产物转化成单链形式。只会剩下5’ -标记的单链片段，其含有邻近错配位点的基因-特异性的序列的碱 基，且包含错配位点。随后，在含有代码序列的通用阵列上，杂交标 记的片段，以识别近似的错配位置。在该图中，在位置Zp2处的荧光 信号指示着在外显子1的中央存在突变。用相反链引物进行单独的方 法，以确定互补链上错配的存在。通过用特异性的代码引物和含有独 特的编码序列E1和通用Un1序列的引物进行再扩增，个别地对来自 PCR产物的含有突变的片段进行测序。
图12是一幅示意图，它解释了用通用阵列检测进行多个外显子的 Endo V/连接酶突变扫描测定的改进方法。如图4-7所述，产生一个 或多个含有多个外显子的片段的异双链的DNA。使用内切核酸酶(Endo V)优先地在错配的3’侧一个碱基处切割DNA，并使用连接酶来重新 密封在完美匹配区的背景切口。可以在一个步骤中进行Endo V和连接 酶反应。使用末端转移酶和dGTP，延伸新产生的3’OH。退火含有 在3’末端上的2个独特碱基(例如AC，GT)、C8、编码序列(例如E1， E2)和在5’末端上的通用序列(Un1)的引物，并用Taq DNA聚合酶延 伸。使用含有代码序列和在5’末端的通用序列(Un2)的基因-特异性 的上游引物、磷酸化的Un2引物和荧光地标记的Un1引物，用Taq DNA 聚合酶和dNTP′s，PCR扩增片段。可以得到许多具有不同代码的引物， 以确保与特定的多态性有关的突变的扩增。阻断寡核苷酸寡核苷酸的 存在，会确保希望的PCR产物优势。使用λ外切核酸酶，将PCR产 物转化成单链形式。只会剩下5’-标记的单链片段，其含有邻近错配 位点的基因-特异性的序列的碱基，且包含错配位点。随后，在含有 代码序列的通用阵列上，杂交标记的片段，以识别近似的错配位置。 如图12所示，在位置Zp2处的荧光信号指示着在外显子1的G-等位 基因上存在突变，而在位置Zp3处的荧光信号指示着在外显子2上存 在突变。用相反链引物进行单独的方法，以确定互补链上错配的存在。 通过用特异性的代码引物和含有独特的编码序列(例如E1，E2)和通用 Un1序列的引物进行再扩增，个别地对来自PCR产物的含有突变的片 段进行测序。
末端转移酶是一种聚合酶，其以独立于模板的方式工作，且将脱 氧核苷酸添加到DNA的3’羟基末端。它可以作用于5’突出，3’突 出，平端，或具有未阻断寡核苷酸的3’末端的单链分子。它可以在商 业上从New England Biolabs(Beverly，MA，USA)得到，这时该酶是 分离自携带来自小牛胸腺的克隆的末端转移酶基因的大肠杆菌菌株 (Chang等，CRC Crit Rev Biochem.21(1)：27-52(1986)；Roychoudhury 等，Nucl.Acids Res.3：101-116(1976)；Tu等，Gene 10：177-183 (1980)；和Boule等，J.Biol.Chem.276，31388-31393(2001)，它们 在这里整体引作参考)。添加末端转移酶的目的是，产生单核苷酸的尾 巴(在该情况下，G(n))，该尾巴随后可以与引物杂交，并用于PCR扩 增由Endo V剪切突变或多态性位点的3’产生的独特片段。
三级寡核苷酸引物含有额外的独特突变识别序列，其与它们的3’ 末端上的2个独特碱基相对应。
本发明的该方面允许检测固体支持物(例如，使用阵列格式)，如 Cornell Research Foundation，Inc.等的WO 97/31256所述，其在这里 整体引作参考。更具体地，提供固体支持物，其具有固定在该固体支 持物上的不同位点的不同捕获寡核苷酸，其中捕获寡核苷酸具有与三 级延伸产物-特异性的部分互补的核苷酸序列。在允许五级延伸产物 以碱基-特异性的方式与捕获寡核苷酸杂交的条件下，使五级聚合酶 链式反应混合物接触固体支持物。检测使用三级延伸产物-特异性的 部分捕获的且固定在固体支持物的特定位点上的五级延伸产物的存 在。这指示着一种或多种突变的靶核苷酸序列在样品中的存在。
在本发明的一个特别优选的实施方案中，提供两种固体支持物。 第一种支持物含有第一个集合的固定在该第一种固体支持物的不同位 点处的不同的捕获寡核苷酸，其中第一个集合的捕获寡核苷酸与三级 延伸产物的一条链互补。第二种支持物含有第二个集合的固定在该第 二种固体支持物的不同位点处的不同的捕获寡核苷酸，其中第二个集 合的捕获寡核苷酸具有与三级延伸产物的互补链互补的核苷酸序列。 在本发明的该方面，捕获寡核苷酸的长度是20至1,500个碱基，且与 靶基因的外显子和邻近核苷酸序列相对应。
三级寡核苷酸引物可以含有额外的独特突变识别序列，其与它们 的3’末端上的2个独特碱基相对应。提供一对标记的六寡核苷酸引物， 其与独特的突变识别序列和/或5’上游五级引物-特异性的部分互 补。使标记的寡核苷酸引物与固定在固体支持物上的核酸分子杂交， 以允许区分固定的核酸分子。
本发明的另一个方面包含，提供一个或多个六级寡核苷酸集合， 其包含：(a)第一种六级寡核苷酸引物，其含有三级延伸产物-特异性 的序列，和(b)第二种六级寡核苷酸引物，其含有来自四级寡核苷酸引 物集合中的对应的第二种寡核苷酸引物的独特的突变识别序列和/或 5’上游五级引物-特异性的部分的序列。混合五级延伸产物、该一个 六级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种六级聚合酶链式反 应混合物。使六级聚合酶链式反应混合物进行2个或多个聚合酶链式 反应循环，形成与五级延伸产物互补的六级聚合酶链式反应延伸产 物。对一种或多种六级聚合酶链式反应产物测序，其中存在一个或多 个突变。
三级寡核苷酸引物可以含有在它们的3’末端的2个独特碱基，后 面是与在末端转移酶延伸反应中使用的dNTP互补的单核苷酸重复序 列，和5’上游二级引物-特异性的部分。
可以断裂五级延伸产物，产生含有平均长度为20-50个碱基的独 特的靶-特异性的序列的片段。在实施本实施方案时，在有dUTP存 在下，进行五级聚合酶链式反应循环。作为结果，尿嘧啶整合在五级 延伸产物中，平均每隔20至50个碱基。可以用内切核酸酶V或DNA 酶I，进行断裂。可以用外切核酸酶消化五级延伸产物的所有非5’末 端片段，以得到富集量的片段，其含有约20至50个邻近错配位点的 碱基，且包含错配位点。用标记或5’末端阻断基团保护含有约20至 50个邻近错配位点的碱基、且包含错配位点的5’片段免受外切核酸 酶消化。
本发明的另一个方面涉及鉴别与正常的核苷酸靶序列的差别在于 一个或多个单碱基改变、插入或缺失的一种或多种突变的核苷酸靶序 列的方法。这包含提供一个或多个样品，其可能含有正常的核苷酸靶 序列、一种或多种突变的核苷酸靶序列、或这两者。还提供一组一个 或多个一级寡核苷酸引物集合，每个集合的特征在于：(a)第一种寡核 苷酸引物，其具有靶-特异性的部分，和(b)第二种寡核苷酸引物，其 具有靶-特异性的部分。仅为一级寡核苷酸引物之一提供标记。提供 聚合酶，并混合样品、一级寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或 多种一级聚合酶链式反应混合物。使一级聚合酶链式反应混合物进行 一个或多个聚合酶链式反应循环，形成一级延伸产物，其与存在于样 品中的正常的核苷酸靶序列和突变的核苷酸靶序列互补。灭活聚合 酶，并使一级聚合酶链式反应混合物进行一个过程，该过程将一级延 伸产物转化成单链形式，并使单链一级延伸产物退火，形成可能包含 核酸分子的异双链的产物，所述核酸分子包含来自正常的核苷酸靶序 列的核苷酸序列和来自突变的核苷酸序列的核苷酸序列。提供内切核 酸酶，其优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割或剪切异双 链的DNA，并混合异双链的产物和内切核酸酶，形成内切核酸酶剪切 反应混合物。使内切核酸酶剪切反应混合物进行内切核酸酶剪切反 应，以便内切核酸酶优先在离错配碱基对一个碱基以内的位置处切割 或剪切异双链的产物。提供连接酶，并混合内切核酸酶剪切反应混合 物和连接酶，形成连接酶重新密封反应混合物。使连接酶重新密封反 应混合物进行连接酶重新密封反应，在完美匹配的碱基对处密封切割 的异双链的产物，但是基本上不在邻近错配碱基对的位置处重新密封 切割的异双链的产物。提供一种或多种三级寡核苷酸引物，其适合与 已经密封的切割的异双链体产物的一条链的5’末端杂交，并混合重新 密封后的连接酶重新密封反应混合物、三级寡核苷酸引物和聚合酶， 形成三级聚合酶延伸反应混合物。在允许三级寡核苷酸引物与已经密 封的切割的异双链体产物的一条链杂交的条件下，将三级聚合酶延伸 反应混合物与聚合酶一起温育，生成三级延伸产物。提供平端连接物 和具有平端活性的连接酶。混合三级延伸产物、平端连接物和具有平 端活性的连接酶，形成平端连接酶反应混合物。在能有效地将平端连 接物连接到三级延伸产物上、并生成平端连接产物的条件下，温育平 端连接酶反应混合物。提供许多四级寡核苷酸引物集合，每个集合的 特征在于：(a)第一种四级寡核苷酸引物，其具有平端连接产物-特异 性的部分和5’上游五级引物-特异性的部分，和(b)第二种四级寡核 苷酸引物，其具有连接物-特异性的部分。混合平端连接产物、四级 寡核苷酸引物集合和聚合酶，形成一种或多种四级聚合酶链式反应混 合物。使一种或多种四级聚合酶链式反应混合物进行一个或多个聚合 酶链式反应循环，形成四级延伸产物。提供五级寡核苷酸引物，其具 有与第一种四级寡核苷酸引物的5’上游部分相同的序列，并混合五级 寡核苷酸引物、四级聚合酶延伸产物和聚合酶，形成五级聚合酶链式 反应混合物。使一种或多种五级聚合酶链式反应混合物进行一个或多 个聚合酶链式反应循环，形成五级延伸产物。通过大小或电泳迁移率 或杂交，分离使一种或多种五级聚合酶链式反应混合物进行一个或多 个聚合酶链式反应循环得到的产物，以便捕获结合到固体支持物上的 探针。通过区分从五级聚合酶链式反应得到的分离的产物，检测正常 的核苷酸靶序列和一种或多种突变的核苷酸靶序列在样品中的存在。
图10是一幅示意图，它解释了用基因-特异性的阵列检测进行 Endo V/连接酶突变扫描测定的改进方法。如图4-7所述，产生一个 或多个片段的异双链的DNA。使用内切核酸酶(Endo V)优先地在错配 的3’侧一个碱基处切割DNA，并使用连接酶来重新密封在完美匹配 区的背景切口。可以在一个步骤中进行Endo V和连接酶反应。将下游 基因-特异性的引物退火成变性的片段，并延伸，产生具有新产生的 5’磷酸基的平端。用T4连接酶，将含有通用Un1序列的连接物连接 到该新产生的平端上。使用含有在5’末端的通用序列(Un2)的基因- 特异性的下游引物、磷酸化的Un2引物和荧光地标记的Un1引物，使 用Taq DNA聚合酶和含有低浓度的dUTP的dNTP，PCR扩增片段。 然后，使用内切核酸酶V，在尿嘧啶碱基的3’侧的一个碱基处，切口 PCR产物。使用λ外切核酸酶，消化切口的PCR产物。只会剩下5’ -标记的单链片段，含有邻近错配位点的约20至50个碱基的基因- 特异性的序列的碱基。随后，在含有基因序列层叠的阵列上，杂交标 记的片段，以识别近似的错配位置。用相反链引物在含有互补序列的 阵列上进行单独的方法，以确定互补链上错配的存在。如图10所示， 与碱基200-250相对应的荧光信号指示着在外显子1的中央存在突 变。
有几种表现出平端连接活性的连接酶。T4连接酶具有强平端活 性，且这可以通过添加分子拥挤剂(如PEG)来增强(Maniatis，T.， Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(第2版)，section 1.53-1.73 (1989)；Weiss，B.等，J.Biol.Chem.，243：4543-4555(1968)，它们 在这里整体引作参考)。需要平端活性来将连接物连接到通过在突变或 多态性位点的3’的Endo V剪切释放出的新产生的磷酸化的5’末端 上，然后通过延伸与该链杂交的引物，赋予平端。
在本发明的该实施方案中，将阻断寡核苷酸引物加入五级聚合酶 链式反应混合物，以抑制全长或会干扰所述检测的其它扩增产物的扩 增。阻断寡核苷酸引物包含三级延伸产物-特异性的部分，其在一种 或多种第一种四级寡核苷酸引物的三级延伸产物-特异性的部分的上 游。合适的阻断寡核苷酸引物包含，PNA，2’-o-甲基基团，和/或 含有5-丙炔基-dU和5-丙炔基-dC的寡核苷酸。
实施例
实施例1-标准方法：用在它们的5’-末端以Tet和Fam荧光地标 记的引物进行PCR扩增
所有常规化学试剂都购自Sigma Chemicals(St.Louis，MO，USA) 或Fisher Scientific(FairLawn，NJ，USA)。GeneScan-500(TAMRA) 大小标准物，GeneScan-500LIZTM大小标准物，Hi-Di甲酰胺，聚 合物POP7和PCR试剂盒购自Perkin-Elmer Corporation的Applied Biosystems分部(Foster City CA)。脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)，牛血 清白蛋白(BSA)，ATP，购自Boehringer-Mannheim(Indianapolis，IN， USA)。蛋白酶K购自QIAGEN(Valencia，CA，USA)。脱氧寡核苷酸 购自Integrated DNA Technologies Inc.(Coralville，IA，USA)和Perkin -Elmer Corporation的Applied Biosystems分部(Foster City，CA)。 如(Huang等，Biochemistry 40(30)：8738-48(2001)；Tong等，Nucleic Acids Res.27(3)：788-94(1999)，它们在这里整体引作参考)所述，纯 化海栖热袍菌内切核酸酶V和栖热菌物种AK16D DNA连接酶。如 (Khanna等，Oncogene 18(1)：27-38(1999)，其在这里整体引作参考) 所述，从细胞系提取基因组DNA。细胞系HT29含有野生型K-ras。 为了检测K-ras突变，如(Khanna等，Oncogene 18(1)：27-38(1999)， 其在这里整体引作参考)所述，从细胞系提取基因组DNA。SW620和 SW480含有K-ras G12V(G-＞T)突变。
荧光基团6-Fam是(3′，6′-双特戊酰基萤光素基)-6-甲酰-氨 基己基)-1-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺。Vic和 Ned是由ABI(Applied Biosystems，Foster，CA)开发的专利未决染料。
从在p53基因的外显子8中含有突变R273H(G-＞A)的细胞系 (HT-29，SW480或SW620细胞系)，以及含有野生型p53基因的细胞 系(LoVo细胞系)，提取基因组DNA。p53外显子8的PCR扩增使用 正向和反向基因-特异性的引物，它们分别用Tet和6-Fam在5’- 末端荧光地标记。在表2中列出了这些引物的DNA序列，分别称作 Tet-p53ex811F和Fam-p53ex8 12R。在含有20mM Tricine pH8.7， 16mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，250μM每种dNTP，0.2μM基因 -特异性的引物对，5单位的AmpliTaq Gold(Applied Biosystems， Foster City，CA)，和150ng基因组DNA的50-μl反应混合物中， PCR扩增野生型和突变型基因组DNA。p53外显子8的PCR热循环 条件如下：95℃持续10分钟，35个94℃持续20秒、60℃持续30秒、 72℃持续1分钟的循环，然后是在72℃持续7分钟的最后延伸步骤。当 在ABI-377DNA测序仪上观察时，两种荧光基团Tet和6-Fam分别 显示为绿色和蓝色。独立地使用上链和下链的差示标记，来区分剪切 产物和每条链。
表2.用于ABI-377测序仪上的分析的PCR引物
  基因   p53  外显子  外显子8   引物名称   Tet-p53ex811F   Fam-p53ex812R   p-p53ex811F   p-p53ex812R   引物序列   5′Tet-CCCCGGACAGGTAGGACCT   GATTTCCTTAC-3′(SEQ ID NO：1)   5′Fam-CCCCGCTTCTTGTCCTGCTT   GCTTAC-3′(SEQ ID NO：2)   5′p-CCCCGGACAGGTAGGACCTG   ATTTCCTTAC-3′(SEQ ID NO：3)   5′p-CCCCGCTTCTTGTCCTGCTTGC   TTAC-3′(SEQ ID NO：4)
F＝正向引物
R＝反向引物
实施例2-标准的变性/复性方法：制备荧光地标记的异双链DNA底 物
在2％琼脂糖凝胶上分析p53外显子8PCR产物的等分试样(4 μl)，并使用配备Quantity One软件的Gel-Doc 2000图像仪(BioRad， Hercules，CA)进行定量。混合12μl终体积的大约等比例的野生型PCR 扩增子和突变型(R273H，G-＞A)PCR扩增子，以及共约1500ng DNA。野生型对照由在12μl终体积中的单独的野生型DNA PCR产物 组成(约1500ng总DNA)。为了灭活Taq DNA聚合酶，将1μl蛋白酶 K(20mg/ml，Qiagen，Valencia，CA)加入每种PCR混合物，包括野 生型对照，并在65℃温育30分钟。然后在80℃温育10分钟，以灭活 蛋白酶K。然后在95℃加热PCR混合物2分钟，并使用下面的PCR 方案，在GeneAmp PCR System 960热循环机器(Applied Biosystems/Perkin-Elmer，Foster City，CA)中，逐渐冷却至室温：95 ℃持续2分钟，95℃持续15秒，然后每隔15秒将温度降低0.2℃，降 至45℃，最后在25℃持续10分钟。从而，野生型+突变型(R273H， G-＞A)p53外显子8PCR混合物的变性/再退火，产生50％异双链(G/T 和A/C错配)以及50％G∶C同源双链，而野生型对照的变性/再退火导 致形成100％G∶C同源双链。类似地，野生型+突变型(G12V，G-＞T) K-ras外显子1PCR混合物的变性/再退火，产生50％异双链(G/A和 T/C错配)以及50％G-C同源双链，而野生型对照的变性/再退火导致 形成100％G∶C同源双链。该步骤后进行Endo V/连接酶剪切/重新密封 反应。在图3中解释了本实施例的步骤。
实施例3-在标准条件下进行Endo V/连接酶突变扫描测定-在ABI -377测序仪上的分析
如下所述，在标准的两步反应条件下(+Endo V，+连接酶反应)， 进行Endo V/连接酶测定：
1.在65℃，在含有20mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，1mM DTT，2％甘油，5％DMSO，1.5M甜菜碱和1μM endoV的20-μl反 应混合物中，温育-半体积(约6.5μl)的每种异双链混合物(包括野生型 同源双链对照)40分钟。
2.然后，在65℃温育30分钟的过程中，使15μl每种Endo V剪 切反应混合物在20-μl终体积中进行连接酶反应。这通过添加2μl 10x 补充缓冲液(200mM Tris pH8.5，12.5mM MgCl2，500mM KCl，10mM DTT，200μg/ml BSA)，1μl 20mM NAD，和2μl 30nM连接酶来实现。
平行地，对每种异双链混合物(包括野生型同源双链对照)进行相同 的操作，例外是，用水替代Endo V和连接酶(-Endo V，-连接酶对 照反应)。
为了终止每种连接酶反应，将4-μl等分试样与等体积的由75％ 甲酰胺和25％(3％葡聚糖蓝，50mM EDTA)组成的终止溶液相混合， 在95℃变性1分钟，并置于冰上。最后，将2.5-μl等分试样装载到 6％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(19∶1)和含有6M脲的0.2mm厚变性凝胶 上，在45℃，在TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐，pH8.3，2mM EDTA) 中，在ABI-377测序仪中，在1500V电泳2小时。使用GeneScan分 析软件版本3.1(Applied Biosystems，Foster City，CA)，分析数据。在 跑完电泳后，在仪器监视器上显示凝胶图像，Tet-和Fam-标记的片 段分别显示为绿色和蓝色。
实施例4-λ外切核酸酶方法：用5’-末端(Tet-或Fam-)荧光地 标记的引物和5’-磷酸化的引物进行PCR扩增
使用λ外切核酸酶方法来产生DNA异双链，它属于仅一种类型， 即G/T或A/C。这会导致Endo V/连接酶突变扫描测定的信噪比背景的 降低。如前所述，从含有p53基因的外显子8中的突变R273H(G-＞A) 的细胞系(HT-29，SW480或SW620细胞系)，以及含有野生型p53基 因的细胞系(LoVo细胞系)，提取基因组DNA。对野生型和突变型 (R273H)基因组DNA进行2个平行的PCR扩增。p53外显子8的第一 个PCR扩增使用正向5’-末端Tet-标记的引物和反向5’-磷酸化 的引物。平行地，p53外显子8的第二个PCR扩增使用正向5’-磷 酸化的引物和反向5’-末端Fam-标记的引物。这些引物的DNA序 列分别称作Tet-p53ex811F，p-p53ex812R，p-p53ex811F，和Fam -p53ex812R，如表2(上面)所示。在图2中解释了这些步骤。
PCR反应混合物(50μl)含有20mM Tricine pH8.7，16mM (NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，250μM每种dNTP，0.2μM基因-特异 性的引物对，5单位的AmpliTaq Gold(Applied Biosystems，Foster City，CA)，和150ng基因组DNA。p53外显子8的PCR热循环条件 如下：95℃持续10分钟，35个94℃持续20秒、60℃持续30秒、72 ℃持续1分钟的循环，然后是在72℃持续7分钟的最后延伸步骤。
通过在含有1x T4多核苷酸激酶缓冲液(70mM Tris-HCl pH7.6， 10mM MgCl2，和5mM DTT)和1mM ATP的25μl反应混合物中，在 37℃，将200pmol每种引物(即，p-p53ex811F或p-p53ex812R)与 10单位的T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)一起 温育1小时，在PCR扩增之前将引物的5’-末端磷酸化。
然后，在65℃，热灭活酶20分钟，并在-20℃保藏磷酸化反应的 小等分试样。当在ABI-377DNA测序仪上观察时，两种荧光基团Tet 和Fam分别显示为绿色和蓝色。独立地使用上链和下链的差示标记来 区分来自每条链的剪切产物。
实施例5-λ外切核酸酶方法：制备荧光地-标记的异双链DNA底 物
在2％琼脂糖凝胶上，分析p53外显子8PCR产物的等分试样(4 μl)，并使用配备Quantity One软件的Gel-Doc 2000图像仪(BioRad， Hercules，CA)进行定量。混合12μl终体积的大约等比例的Tet-标记 的野生型p53外显子8PCR产物和Fam-标记的突变型p53外显子8 (R273H G-＞A)PCR产物，以及共约1500ng DNA(PCR混合物1)。 同样地，在另一个12-μl反应中，混合Tet-标记的突变型p53外显 子8PCR产物和Fam-标记的野生型p53外显子8PCR产物(PCR混 合物2)。野生型对照由在12μl终体积中的Tet-标记的野生型p53外 显子8PCR产物和Fam-标记的野生型p53外显子8PCR产物的混合 物组成(约1500ng总DNA)。
为了灭活Taq DNA聚合酶，将1μl蛋白酶K(20mg/ml，Qiagen， Valencia，CA)加入每种PCR混合物，包括野生型对照，并在65℃温 育30分钟。然后在80℃温育10分钟，以灭活蛋白酶K。然后在37℃， 将PCR混合物与1单位的λ外切核酸酶一起温育1小时，所述λ外切 核酸酶会降解5’-磷酸化的DNA。然后，通过在75℃温育反应物10 分钟，热灭活λ外切核酸酶。从而，使用λ外切核酸酶对磷酸化的链 的消化，来产生2条互补的标记链，后者退火形成100％异双链DNA 片段。PCR混合物1含有具有G/T错配的异双链，而PCR混合物2 含有具有A/C错配的异双链。野生型对照导致100％G∶C同源双链的 形成。该步骤以后是Endo V/连接酶反应。
当使用荧光基团Vic和Ned分别替代Tet和Fam时，如上所述为 p53外显子8(R273H，G-＞A)和K-ras外显子1(G12V，G-＞T)PCR 扩增子制备异双链DNA底物。结果，使用适合K-ras外显子1(G12V， G-＞T)PCR扩增子的λ外切核酸酶方法来产生PCR混合物1中的具 有G/A错配的异双链、和PCR混合物2中的具有T/C错配的异双链， 而野生型对照导致100％G∶C同源双链的形成。在图2中解释了该实施 例的步骤。
实施例6-使用在Endo V/连接酶反应之前的λ外切核酸酶方法，提 高p53外显子8R273H突变的检测中的信噪比
在标准条件下，p53的外显子8已经产生高水平的背景剪切。因此， 使用该基因作为模型系统，来测试会提高Endo V/连接酶反应的信噪比 的条件。
如实施例1所述，用Tet-和Fam-标记的基因-特异性的引物， PCR扩增p53基因的外显子8。然后使用标准方法，混合野生型和突 变型(R273H)PCR产物，以允许形成异双链DNA底物，如实施例2所 述，且解释在图3中。平行地，用荧光引物和5’-磷酸化的引物(反 之亦然)PCR扩增p53外显子8，如实施例4所述。然后使用λ外切核 酸酶方法，混合野生型和突变型(R273H)PCR产物，以允许形成异双链 DNA底物，如实施例5所述，且解释在图2中。如实施例3所述，进 行Endo V/连接酶反应。在图13中显示了从这些实验得到的凝胶图像： 标准条件是在泳道1至4上运行，包括在泳道1和2上的野生型对照 (G∶C匹配)，而λ外切核酸酶条件是在泳道5至10上运行，包括在泳 道5和6上的野生型对照。分别用绿色和蓝色箭头指示上链和下链剪 切产物。在有Endo V和连接酶存在下，和在没有Endo V和连接酶(作 为阴性对照)存在下，使每种PCR混合物平行地进行Endo V/连接酶反 应。在泳道的顶部标记了野生型G∶C匹配，以及G/T和A/C错配(即[野 生型+突变型]混合物)。在图14中解释了与泳道4和10相对应的定量 数据(源自GeneScan分析的电泳图谱)。数据分析证实，与标准条件相 比，剪切产物(A/C错配)的Tet和Fam信号的信号强度分别增加了3.1 -倍和6.9-倍。另外，Tet和Fam信噪比分别增加了3.1-和2.3-倍。 因而，这些数据证实，λ外切核酸酶方法会显著提高信号强度和信噪 比。
实施例7-使用在它们的5’-末端用Vic和Ned荧光地-标记的通 用引物进行PCR扩增
从在K-ras基因的外显子1(密码子12)或p53基因的外显子8(密 码子273)中含有突变的细胞系，提取基因组DNA。HT-29细胞系含 有野生型K-ras基因，而SW480和SW620含有纯G12V(G-＞T)突 变。LoVo细胞系含有野生型p53基因，而HT-29SW480和SW620 细胞系含有R273H(G-＞A)突变。
使用2个引物对，进行K-ras外显子1的PCR扩增：1-正向和 反向通用引物VicUniEV5F和NedUniEV6R，它们分别在它们的5’- 末端被Vic和Ned荧光地-标记；2-正向和反向未标记的基因-特异 性的引物F161和R162，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅 短3个碱基对。在表3中列出了这些引物的DNA序列。通用引物 VicUniEV5F和NedUniEV6R具有反向连接标记，即3’-荧光基团- 5’-通用引物序列-3’。在下述条件下，将野生型和突变型基因组 DNA分别在50-μl混合物中进行“通用”PCR。
表3.用于在ABI-3730DNA分析仪上的分析的PCR引物
  基因   外显子   引物名称   引物序列   通用   通用   通用   通用   通用   通用   通用   通用   K-ras      p53 外显子1    外显子6    外显子8    外显子8-9   VicUniEV1F   NedUniEV2R   p-UniEV1F   p-UniEV2R   VicUniEV5F   NedUniEV6R   p-UniEV5F   p-UniEV6R   F161   R162   F167   R168   F173   R174   p53ex8F   p53ex9R   5′CGC(C-c6-Vic)GTCACGACACGAAAAC-3′(SEQ ID NO：5)   5′CGC(C-c6-Ned)GTCACGACACGAAACA-3′(SEQ ID NO：6)   5′p-CGCCGTCACGACACGAAAAC-3′(SEQ ID NO：7)   5′p-CGCCGTCACGACACGAAACA-3′(SEQ ID NO：8)   3′-Vic-5′-5′-CCGCCGTCACGACACGAAAAC-3′(SEQ ID NO：9)   3′-Ned-5′-5′-CCGCCGTCACGACACGAAACA-3′(SEQ ID NO：10)   5′p-CCGCCGTCACGACACGAAAAC-3′(SEQ ID NO：11)   5′p-CCGCCGTCACGACACGAAACA-3′(SEQ ID NO：12)   5′CGTCACGACACGAAAACATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATGTT   C-3′(SEQ ID NO：13)   5′CGTCACGACACGAAACACAAAATGGTCAGAGAAACCTTTATCTGTA   TC-3′(SEQ ID NO：14)   5′CGTCACGACACGAAAACCTCTGATTCCTCACTGATTGCTCTTA-3′   (SEQ ID NO：15)   5’CGTCACGACACGAAACAGGCCACTGACAACCACCCTTAAC-3′   (SEQ ID NO：16)   5′CGTCACGACACGAAAACCAGGGTGGTTGGGAGTAGATG-3′   (SEQ ID NO：17)   5′CGTCACGACACGAAACAGGTGATAAAAGTGAATCTGAGGCATAAC-3′   (SEQ ID NO：18)   5′CGTCACGACACGAAAACTGTGGCTTCTCCTCCACCTAC-3′   (SEQ ID NO：19)   5′CGTCACGACACGAAACAGCCCCAATTGCAGGTAAAAC-3′   (SEQ ID NO：20)
F＝正向引物
R＝反向引物
类似于K-ras扩增，使用正向和反向通用引物VicUniEV5F和 NedUniEV6R，和正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173和 R174，进行p53外显子8的PCR扩增。或者，使用正向和反向通用引 物VicUniEV1F和NedUniEV2R，和正向和反向未标记的基因-特异性 的引物F173和R174，进行p53外显子8的PCR扩增。用结合在第4 个碱基(胞嘧啶4)的C6上的荧光基团(Vic或Ned)，内部标记 VicUniEV1F和NedUniEV2R。与CG-富集的5’-末端结合的内在 标记，会使Endo V对染料的非特异性剪切最小化。在表3中列出了这 些引物的DNA序列。使野生型和突变型基因组DNA分别进行50-μl “通用”PCR。“通用”PCR反应混合物含有20mM Tricine pH8.7，16 mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，250μM每种dNTP，0.2μM通用引 物对，0.02μM基因-特异性的引物对，5单位的AmpliTaq Gold (Applied Biosystems，Foster City，CA)，和150ng基因组DNA。“通 用”PCR的热循环条件如下：95℃持续10分钟，20个94℃持续30秒、 65℃持续1分钟、72℃持续1分钟的循环(基因-特异性的扩增)，30 个94℃持续30秒、55℃持续1分钟、72℃持续1分钟的循环(通用扩 增)，然后是在72℃持续7分钟的最后延伸步骤。当在ABI 3730基于荧 光的DNA分析仪上观察时，两种荧光基团Vic和Ned分别显示为绿色 和黄色。使用上链和下链的差示标记来区分来自每条链的剪切产物。
实施例8-用通用引物进行PCR扩增：一种5’-末端(Vic或Ned) 荧光地标记的引物和一种5’-磷酸化的引物
从在K-ras基因的外显子1(密码子12)或p53基因的外显子8(密 码子273)中含有突变的细胞系，提取基因组DNA。HT-29细胞系含 有野生型K-ras基因，而SW480和SW620含有纯G12V(G-＞T)突 变。LoVo细胞系含有野生型p53基因，而HT-29SW480和SW620 细胞系含有R273H(G-＞A)突变。
对于K-ras外显子1扩增，使野生型和突变型(G12V，G-＞T) 基因组DNA平行地进行2个“通用”PCR扩增，其中的每个使用2个 引物对：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV5F 和p-UniEV6R，前者在它的5’-末端被Vic荧光地-标记，后者被 5’-磷酸化；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F161和 R162，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV5F 和NedUniEV6R，前者被5’-磷酸化，后者在它的5’-末端被Ned 荧光地-标记，2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F161和 R162。
在表3中列出了这些引物的DNA序列。通用引物VicUniEV5F和 NedUniEV6R具有反向连接标记，即3’-[荧光基团]]-5’-[通用引 物序列]-3’。“通用”PCR条件与在实施例7中所述的那些相同。
类似于K-ras PCR扩增，在2个分开的“通用”PCR中，扩增p53 外显子8，其中的每个使用2个引物对：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV5F 和p-UniEV6R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV5F 和NedUniEV6R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174。
或者，在2个其它的分开的“通用”PCR中，扩增p53外显子8：
第一个使用正向和反向通用引物VicUniEV1F和p-UniEV2R，和 正向和反向引物F173和R174，
第二个使用正向和反向通用引物p-UniEV1F和NedUniEV2R， 和正向和反向引物F173和R174。
用结合在第4个碱基(胞嘧啶4)的C6上的荧光基团(Vic或Ned)， 内部标记VicUniEV1F和NedUniEV2R。与CG-富集的5’-末端结 合的内在标记，会使Endo V对染料的非特异性剪切最小化。在表3中 列出了这些引物的DNA序列。使野生型和突变型基因组DNA分别在 50-μl混合物中进行“通用”PCR。“通用”PCR条件与在实施例7 中所述的那些相同。
通过在含有1x T4多核苷酸激酶缓冲液(70mM Tris-HCl pH 7.6，10mM MgCl2，和5mM DTT)和1mM ATP的25μl反应体积中， 在37℃，将200pmol每种引物(即，p-UniEV5F，p-UniEV6R，p- UniEV1F，或p-UniEV2R)与10单位的T4多核苷酸激酶(New England Biolabs，Beverly，MA)一起温育1小时，在PCR扩增之前将引物的5’ -末端磷酸化。然后，在65℃，热灭活酶20分钟，并在-20℃保藏磷 酸化反应的小等分试样。当在ABI-377DNA测序仪上观察时，两种 荧光基团Vic和Ned分别显示为绿色和黄色。独立地使用上链和下链 的差示标记来区分来自每条链的剪切产物。
实施例9-在标准条件下进行Endo V/连接酶突变扫描测定-在ABI 3730DNA分析仪上分析
在标准的两步反应条件下，进行Endo V/连接酶测定：Endo V剪 切反应，然后是连接酶反应(+Endo V，+连接酶反应)，如下所述：
1.在65℃，在含有20mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，1mM DTT，2％甘油，5％DMSO，1.5M甜菜碱和1μM endoV的20-μl反 应混合物中，温育一半体积(约6.5μl)的每种PCR混合物(包括野生型 对照)40分钟。
2.然后，在65℃温育30分钟的过程中，使15μl每种Endo V剪 切反应混合物在20-μl终体积中进行连接酶反应。这通过添加2μl 10 x补充缓冲液(200mM Tris pH8.5，12.5mM MgCl2，500mM KCl，10 mM DTT，200μg/ml BSA)，1μl 20mM NAD，和2μl30nM连接酶来 实现。
平行地，对每种PCR混合物(包括野生型对照)进行相同的操作， 例外是，用水替代Endo V和连接酶(-Endo V，-连接酶对照反应)。 最后，通过加入EDTA至10mM的终浓度，终止反应。这会抑制毛细 管中的任何其它的Endo V剪切活性。在95℃，将反应混合物的1-μl 等分试样的在9μl Hi-Di甲酰胺和0.4μl GeneScan-500LIZ大小标 准物(按大小电泳35-500碱基对范围内的DNA片段所必需的)中变性2 分钟，并在ABI 3730基于荧光的毛细管电泳仪器(Applied Biosystems，Foster City，CA)上电泳。在60℃，在POP-7聚合物中， 在15kV电泳1200秒。在跑完电泳后，用ABI收集软件v1.0显示虚拟 的凝胶图像，Vic-和Ned-标记的片段分别显示为绿色和黄色，而LIZ -标记的大小标准片段为橙色。使用Gene Mapper片段分析软件v3.0 (Applied Biosystems，Foster City，CA)，进行数据分析。最后，用我 们实验室开发的Gel Render软件，进行虚拟的凝胶图像上的泳道次序 的重新对齐和重新排列。
实施例10-使用“分裂标记，变性/复性”方法，制备纯Vic-/Ned-标 记的异双链DNA底物
如实施例7和8所述，根据“通用”PCR策略，使用2个引物对， 进行p53外显子8的PCR扩增。在2％琼脂糖凝胶上分析p53外显 子8PCR产物的等分试样(4μl)，并使用配备Quantity One软件的Gel -Doc 2000图像仪(BioRad，Hercules，CA)进行定量。混合12μl终体 积的大约等比例的Vic-标记的野生型p53外显子8PCR产物和Ned -标记的突变型p53外显子8(R273H G-＞A)PCR产物，以及约1500 ng DNA(PCR混合物1)。同样地，在另一个12-μl反应中，混合Vic -标记的突变型p53外显子8PCR产物和Ned-标记的野生型p53外 显子8PCR产物(PCR混合物2)。野生型对照由在12μl终体积中的Vic -标记的野生型p53外显子8PCR产物和Ned-标记的野生型p53外 显子8PCR产物的混合物组成(约1500ng总DNA)。为了灭活Taq DNA 聚合酶，将1μl蛋白酶K(20mg/ml，Qiagen)加入每种PCR混合物， 包括野生型对照，并在65℃温育30分钟。然后在80℃温育10分钟， 以灭活蛋白酶K。然后在95℃加热PCR混合物2分钟，并使用下面的 PCR方案，在GeneAmp PCR System 960热循环机器(Perkin-Elmer) 中逐渐冷却至室温：95℃持续2分钟，95℃持续15秒，然后每隔15 秒将温度降低0.2℃，降至45℃，最后在25℃持续10分钟。从而，使 用[野生型+突变型]p53外显子8PCR混合物的变性/再退火，来产生2 条互补的标记的链，它们退火形成100％异双链DNA片段：PCR混 合物1含有具有G/T错配的异双链，而PCR混合物2含有具有A/C错 配的异双链。野生型对照导致形成100％G∶C同源双链。该步骤以后 是Endo V/连接酶反应。在图5中解释了本实施例的步骤。
实施例11-使用使用PCR通用策略，在作为底物的p53外显子8和 K-ras外显子1PCR片段上进行λ外切核酸酶方法
如实施例7和8所述，根据“通用”PCR策略，使用2个引物对， 进行K-ras外显子1和p53外显子8的PCR扩增。简而言之，使用 实施例7详细描述的通用策略，用Vic-和Ned-标记的通用引物，PCR 扩增K-ras外显子1和p53外显子8。2个片段分别是约300和350 bp。然后，对于每个基因，使用标准方法，混合野生型和突变型PCR 产物，以允许形成异双链DNA底物，如实施例2所述，且如图4所示。 平行地，用荧光通用引物和5’-磷酸化的引物(反之亦然)PCR扩增K -ras外显子1和p53外显子8，如实施例8所述。然后使用λ外切核 酸酶方法，混合野生型和突变型PCR产物，以允许形成异双链DNA 底物，如实施例5所述。如实施例9所述且如图6所示的，进行Endo V/ 连接酶反应。
图15A显示了当使用2个不同集合的通用引物时，从p53外显子 8数据得到的凝胶图像。图15B显示了当使用引物集合UniEV5F/EV6R 时，K-ras外显子1凝胶图像。分别用绿色和蓝色箭头指示上链和下 链剪切产物。如前图所示，在泳道的上面，标记了p53外显子8(R273H， G-＞A)的野生型G∶C匹配，以及G/T和A/C错配(来自野生型+突变型 混合物)；在泳道的上面，标记了K-ras外显子1(G12V，G-＞T)的 野生型G∶C匹配，G/A和T/C错配(来自野生型+突变型混合物)。如在 p53和K-ras凝胶图像上观察到的，与标准条件相比，λ外切核酸酶 条件中的背景剪切急剧降低，这独立于使用UniEV1F/EV2R还是 UniEV5F/EV6R引物集合。
实施例12-适用于通过PCR通用策略扩增的p53外显子8和p53 外显子8-9片段的λ外切核酸酶方法
如实施例7所述，根据“通用”PCR策略，使用2个引物对，扩 增p53外显子8：1-正向和反向通用引物VicUniEV5F和 NedUniEV6R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173和 R174。然后，使用如实施例2所述的标准变性/复性方法，制备异双链 DNA底物。
平行地，在2个分开的“通用”PCR中，扩增p53外显子8，其 中的每个使用2个引物对，如实施例8所述：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV5F 和p-UniEV6R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV5F 和NedUniEV6R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174。
使用如实施例5所述且如图6所示的λ外切核酸酶方法，制备异 双链DNA底物。或者，按照实施例10所述且如图5所示的“分裂标 记，变性/复性”方法，制备异双链DNA片段。
类似于p53外显子8扩增，使用基因-特异性的引物的新集合： p53ex8F和p53ex9R(表3)，PCR扩增包含p53外显子8-9的片段， 产生含有R273H突变的591-bp PCR片段。使用标准的和λ外切核酸 酶方法，制备异双链DNA底物。在实施例9所述的标准条件下，进行 Endo V/连接酶测定。
结果显示在图16中。分别用绿色和蓝色箭头指示上链和下链剪切 产物。在泳道的上面，标记野生型G∶C匹配的碱基，以及G/T和A/C错 配(即[野生型+突变型]混合物)。如图16A所示，与标准条件相比，在 λ外切核酸酶条件下，背景噪音显著减弱。另外，对于G/T和A/C错 配，在λ外切核酸酶方法中检测到了上链和下链剪切产物，而在标准 条件下，仅上链剪切产物是可见的。这些数据再次证实，在Endo V/ 连接酶突变扫描测定的突变检测中，λ外切核酸酶方法比标准方法更 有效。在图16B中，对比了3种不同的制备p53外显子8PCR(R273H) 异双链的片段的方法：(i)标准方法，(ii)λ外切核酸酶方法，和(iii)“分 裂标记变性/复性”方法。令人惊奇地，数据表明，“分裂标记，变性/ 复性”方法不会产生比λ外切核酸酶方法更高的背景剪切。这表明，λ 外切核酸酶方法中的非特异性剪切的减少，主要是由于使用了一半数 量的标准方法中的荧光地标记的分子。同样地，交替的“变性/复性” 方法的优点是，一次仅形成一种标记的异双链。最后，当在同一个反 应中同时使用Vic和Ned标记的引物PCR扩增片段时(如在标准方法中 所进行的)，在PCR产物泳道中观察到更多数量的背景片段，它们会增 加Endo V剪切后观察到的总背景，尽管它们与Endo V剪切步骤无关 (图16A和图16B的前4个泳道)。
实施例13-测试作为有机溶剂的添加剂四亚甲基亚砜和四氢噻吩砜 增强Endo V剪切反应
使用来自含有纯合的p53外显子8突变R273H的细胞系SW620 的基因组DNA作为突变型模板。使用来自含有p53外显子8的野生型 DNA的细胞系Lovo的基因组DNA作为野生型DNA对照。用((3′，6′- 双特戊酰基萤光素基)-6-甲酰-氨基己基)-1-O-(2-氰乙基)- (N，N-二异丙基)-亚磷酰胺(6-Fam)或4，7，2′，7′-四氯-(3′，6′-双特 戊酰基-萤光素基)-6-甲酰氨基己基-1-O-(2-氰乙基)-(N，N- 二异丙基)-亚磷酰胺(Tet)标记PCR引物。
引物序列如下：
p53外显子8正向序列：TET-5′-TETCCCGGACAGGTAGGA CCTGATTTCCTTAC-3′(SEQ ID NO：21)
p53外显子8反向序列：6FAM-5′-CCCCGCTTCTTGTCCTGCT TGCTTAC-3′(SEQ ID NO：22)
在含有10mM Tris-HCl，pH8.3，50mM KCl，2.5mM MgCl2， 0.25mM dNTP，10pmol每种引物，150ng野生型基因组DNA，5U AmpliTaq DNA聚合酶的50ml混合物中，进行PCR反应。PCR方案如 下：95℃持续1分钟，然后加入5U AmpliTaq DNA聚合酶，随后是35 个94℃持续20秒、68℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环，最后在72℃ 延伸7分钟。
通过野生型PCR产物的变性和再退火，产生对照同源双链DNA。 通过50％野生型PCR产物和50％突变型PCR产物的混合物的变性和再 退火，产生异双链DNA。在PCR仪中温育混合物，PCR方案是，在95 ℃持续2分钟，以使DNA变性，然后从95℃逐渐冷却至45℃1小时，使 链再退火。在图3中解释了该方法的步骤。
在65℃，在含有10mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，7ml双链 DNA，1mM Endo V，化学添加剂的20ml反应混合物中，进行Endo V反应40分钟。标准的添加剂是5％DMSO和1.5M甜菜碱。在图18 的条件3，4，7，和8中，加入5％四亚甲基亚砜来替代Endo V反应 缓冲液中的DMSO和甜菜碱。在条件5，6，9，和10中，加入5％四 氢噻吩砜来替代PCR反应混合物中的DMSO和甜菜碱。在条件7和8 中，将10％四亚甲基亚砜加入异双链体形成混合物中，而在条件9和 10中，在形成异双链之前，将10％四氢噻吩砜加入混合物。在该实验 中，省略连接步骤。反应条件如下：
条件1：产生异双链(95℃，2分钟，经1小时缓慢冷却至45℃)和 Endo V反应(5％DMSO和1.5M甜菜碱)的标准条件。
条件2：在异双链体形成温育步骤中，加入4mM EDTA(终浓度)。
条件3：在Endo V剪切步骤中，加入5％四亚甲基亚砜。
条件4：在异双链体形成温育步骤中，加入4mM EDTA。在Endo 剪切步骤中，加入5％四亚甲基亚砜。
条件5：在Endo V剪切步骤中，加入5％四氢噻吩砜。
条件6：在异双链体形成温育步骤中，加入4mM EDTA，在Endo V剪切步骤中，加入5％四氢噻吩砜。
条件7：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四亚甲基亚砜。在 Endo V剪切步骤中，存在5％四亚甲基亚砜。
条件8：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四亚甲基亚砜和4 mM EDTA。在Endo V反应混合物中，存在5％终浓度的四亚甲基亚 砜。
条件9：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四氢噻吩砜。在 Endo V剪切步骤中，存在5％终浓度的四氢噻吩砜。
条件10：在异双链体形成温育步骤中，加入10％四氢噻吩砜和4 mM EDTA。在Endo V剪切步骤中，存在5％终浓度的四氢噻吩砜。
通过加入等体积的GeneScan终止溶液(50mM EDTA，1％葡聚 糖蓝和80％甲酰胺)，终止Endo V反应。在94℃变性1分钟侯，将3ml 混合物装载到6％丙烯酰胺/双丙烯酰胺(19∶1)和含有6M脲的0.2mm 厚变性凝胶上，在45℃，在TBE缓冲液(90mM Tris-硼酸盐，pH8.3， 2mM EDTA)中，在ABI-377测序仪中，在1000V电泳1小时。使用 GeneScan分析程序(Applied Biosystems)分析结果。
从凝胶图像(见图18)可以看出，对于偶数条件，即2，4，6，8， 和10，在异双链体形成温育步骤中，在混合物中存在4mM EDTA。在 偶数条件中观察到的剪切产物的量总是高于它们在奇数条件(其中没有 EDTA)中的对应产量。该结果表明，在异双链体形成过程中加入4mM EDTA会增强突变信号的强度。
电泳图谱结果也表明，与没有甜菜碱和DMSO的标准条件相比， 在没有甜菜碱和DMSO的Endo V反应混合物中加入5％四亚甲基亚砜 或四氢噻吩砜，会产生合理的信号(图18，条件3-6)。在异双链体形 成混合物中加入10％四亚甲基亚砜或四氢噻吩砜，和在Endo V反应 混合物中的2％四亚甲基亚砜或四氢噻吩砜，也会产生合理的突变信 号(图18，条件8-10)。结果，5％四亚甲基亚砜或四氢噻吩砜可以用 作添加剂，以替代在Endo V反应中的1.5M甜菜碱和5％DMSO。
实施例14-测试不同的5’修饰的引物，以评价对Endo V剪切的抗 性
使用来自含有纯合的p53外显子8突变R273H的细胞系SW620 的基因组DNA作为突变型模板。从Lovo细胞系分离的基因组DNA含 有p53外显子8的野生型DNA，并用作野生型DNA对照模板。通过 ABI(Applied Biosystems，Foster，CA)合成p53外显子8的内部标记的 引物。在表5中列出了每种引物的序列。
荧光基团6-Fam是(3′，6′-双特戊酰基萤光素基)-6-甲酰-氨 基己基)-1-O-(2-氰乙基)-(N，N-二异丙基)-亚磷酰胺。Vic和 Ned是通过ABI(Applied Biosystems，Foster City，CA)开发的染料。
使用修饰的引物来从野生型细胞系基因组DNA和含有纯p53外显 子8R273H的细胞系基因组DNA扩增p53外显子8。
在野生型DNA和含有R273H突变的DNA上，分开地进行每组 PCR反应。
在含有20mM Tricine pH8.7，16mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2， 0.25mM dNTP，10pmol VICp53Ex8-F72和NED p53Ex8-R74，100 ng来自Lovo细胞系或SW620的基因组DNA，5U AmpliTaq DNA聚 合酶的50ml反应混合物中，进行第一组PCR反应。在95℃，在PCR 仪中温育混合物2分钟，然后加入AmpliTaq DNA聚合酶。PCR方案 是，35个94℃持续20秒、68℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环， 最后在72℃延伸7分钟。
除了使用10pmol引物Vic p53Ex8-F76和Ned p53Ex8-R78以 外，在相同的混合物和条件下，进行第二组PCR反应。
除了使用10pmol引物Vic p53Ex8-F92和Ned p53Ex8-R94以 外，在相同的混合物和条件下，进行第三组PCR反应。
表4.p53外显子8的引物上的不同修饰。
  引物名称   引物序列   VIC p53Ex8-F72   NED p53Ex8-R74   VIC p53Ex8-F76   NED p53Ex8-R78   VIC p53Ex8-F92   NED p53Ex8-R94   5′VIC-(2′0MeC)(2′0MeC)CGCCGCAGGGTGGTTGG   GAGTAGATG-3′(SEQ ID NO：23)   5′NED(2′0MeC)(2′0MeC)CGCCGCGGTGATAAAAGTG   AATCTGAGGCATAAC-3′(SEQ ID NO：24)   5′VIC-CGCCGCAGGGTGGTTGGGAGTAGATG-3′   (SEQ ID NO：25)   5′NED-CGCCGCGGTGATAAAAGTGAATCTGAGG   CATAAC-3′(SEQ ID NO：26)   5′CCGC(C-c6-VIC)GCAGGGTGGTTGGGAGTAG   ATG-3′(SEQ ID NO：27)   5′CCGC(C-c6-NED)GCGGTGATAAAAGTGAATC   TGAGGCATAAC-3′(SEQ ID NO：28)
在65℃，向每种12ml PCR产物中加入1ml蛋白酶K(20mg/ml) (QIAGEN，Valencia，CA)30分钟，以灭活AmpliTaq DNA聚合酶。 通过在85℃温育15分钟，灭活蛋白酶K。
通过变性和再退火单独的野生型PCR产物，产生同源双链DNA 对照。通过变性和再退火含有50％野生型PCR产物和50％含有纯合 的p53R273H突变的PCR产物的混合物，产生异双链DNA。在95℃ 变性混合物2分钟，然后经1小时将温度从95℃逐渐降低至45℃，进 行再退火。在图3中解释了该实施例的步骤。
在65℃，在含有10mM Hepes(pH7.5)，5mM MgCl2，5％DMSO， 1.5M甜菜碱，1mM Endo V和7ml同源双链或异双链PCR产物的20 ml混合物中，进行Endo V突变测定40分钟。通过加入0.1体积(2ml) 100mM EDTA，终止反应。混合1ml剪切产物和8.5ml Hi-Di甲酰 胺(Applied Biosystems，Foster City，CA)和0.5ml LIZ标记的GeneScan -500LIZ大小标准物(Applied Biosystems，Foster City，CA)。在95 ℃变性2分钟并在冰上冷却后，将混合物装载到ABI 3730DNA测序仪 上，在15kV电压、1200秒运行时间、60℃烘箱温度下，在聚合物POP7 中进行电泳。用ABI收集软件观察凝胶图像。
有两组实验。在一组实验中，通过加入0.1体积(2ml)100mM EDTA 来终止Endo V反应，在另一组中，没有终止反应。在毛细管电泳图像 上，每种样品具有3个泳道。第一个泳道是没有加入Endo V的PCR 产物的电泳结果。第二个泳道是没有EDTA终止的Endo V剪切产物， 第三个泳道是有EDTA终止的Endo V剪切产物(见图19)。结果表明， 对于具有Endo V抗性的序列、和抗性序列+2’O甲基化的C的引物， 没有EDTA终止的PCR底物的荧光强度比具有EDTA终止的弱得多 (见图19A和B)。另一方面，对于具有内部标记的引物，没有EDTA 终止的PCR底物的荧光强度几乎与具有EDTA终止的相同(图19C)。
结果表明，含有5’“抗性序列，CGCCGC”或2-’O甲基-C主 链(见图19A和B)的引物仍然会被Endo V剪切。值得注意的是，在没 有EDTA终止Endo V反应的情况下，底物的强度比具有EDTA终止 的弱得多(在图19A和B中，比较第3条泳道和第2条泳道)。对于内 部标记的引物(在图19C中，比较第2条泳道和第3条泳道)，在没有 EDTA终止的情况下的总信号强度几乎与存在EDTA终止的情况相同 (图19C)。这表明，具有内部标记的引物对Endo V的剪切是抗性的(见 图19C)。
实施例15-对比Endo V剪切产物，其具有内在地-标记的通用引物 和其中Vic或Ned标记和引物的5’末端之间的连接是反 向通用引物(即3’-Vic-5’-5’-引物-3’)
本实验用于证实PCR片段的通用引物标记，并对比内部标记的引 物和反向标记的引物之间对剪切的抗性。
在表3中列出了通用引物。Vic-UniEV1F和Ned-UniEV2R是内 在地-标记的通用引物。Vic-UniEV5F和Ned-UniEV6R是其中Vic 和Ned的碱基和引物的5’末端被3’至5’反转的通用引物。p53外 显子6的基因-特异性的引物作为F167和R168列在表3中。
对于具有内在地-标记的通用引物的PCR反应，在含有20mM Tricine pH8.7，16mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，1pmol F167和 R168，10pmol Vic-UniEV1F和Ned-UniEV2R，5U AmpliTaqGold DNA聚合酶，100-150ng来自临床样品的基因组DNA的50ml反应 混合物中，扩增p53外显子6的DNA片段。PCR方案如下：95℃持续 10分钟，20个94℃持续30秒、65℃持续1分钟、72℃持续1分钟的 循环，然后是30个94℃持续30秒、55℃持续1分钟、72℃持续1分 钟的循环。最后在72℃延伸7分钟。对于具有其中Vic和Ned的碱基 和引物的5’末端被3’至5’反转的通用引物的PCR反应，在含有 20mM Tricine pH8.7，16mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，1pmol of 引物F161和R162，10pmol Vic-UniEV5F和Ned-UniEV6R，5U AmpliTaqGold DNA聚合酶，100-150ng来自临床样品的基因组DNA 的50ml反应混合物中，扩增p53外显子6的DNA片段。PCR方案如 下：95℃持续10分钟，20个94℃持续30秒、65℃持续1分钟、72℃ 持续1分钟的循环，然后是30个94℃持续30秒、55℃持续1分钟、 72℃持续1分钟的循环。最后在72℃延伸7分钟。
通过变性和再退火单独的野生型PCR产物，产生同源双链DNA 对照。通过变性和再退火含有50％野生型PCR产物和50％含有纯合 的p53Q192Ter或Y205F突变的PCR产物的混合物，产生异双链 DNA。在95℃变性混合物2分钟，然后经1小时将温度从95℃逐渐降 低至45℃，进行再退火。在图4中解释了该实施例的步骤。
在标准条件下，用内部标记的引物或反向的连接引物，对异双链 和同源双链DNA底物进行Endo V反应。由于本实验用于确定是否能 在高背景下区分突变剪切产物，省略了连接步骤。在65℃，在含有10 mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，5％DMSO，1.5M甜菜碱，7ml异 双链或同源双链DNA和1mM Endo V的20ml反应混合物中，进行 Endo V反应40分钟。通过加入2ml 100mM EDTA，终止反应。混合 1ml剪切产物和8.5ml Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems，Foster City，CA)和0.5ml LIZ标记的ABI GeneScan-500LIZ大小标准物。 在95℃加热混合物2分钟，并在冰上冷却，装载到ABI 3730DNA测 序仪上进行电泳。在15kV电压、1200秒运行时间、60℃烘箱温度下， 与聚合物POP7一起电泳。用ABI收集软件显示阵列图像，并用 GeneMapper软件版本3.0(Applied Biosystems，Foster City，CA)分析。
在由任一组通用引物产生的PCR片段的Endo V反应的凝胶图像 中(见图20A和B)，可以容易地观察到剪切产物(用箭头指示)。使用内 部标记的引物，存在2种高分子量伪迹，其迁移到600碱基对附近(见 图20A)。对于反向连接标记的引物，只有非常低的分子量剪切产物跑 到凝胶的底部附近(见图20B)。在具有内部标记的引物的凝胶图像中不 存在这些产物，表明Endo V可以从反向连接引物的5’末端剪掉荧光 基团，但是它不能从内部标记的引物的5’末端剪掉荧光基团。尽管如 此，两个通用引物集合都会提供可与背景容易地区分开的强信号，甚 至在没有连接-重新密封步骤的情况下。
实施例16-证实具有内部标记的引物的K-ras外显子1，p53外显 子6，7，和8的突变扫描
使用含有纯合的p53外显子8突变R273H的细胞系基因组DNA SW620作为突变型模板。使用含有p53外显子8中的野生型DNA的 细胞系基因组DNA Lovo作为野生型DNA对照。使用内部标记的引物 作为PCR引物，PCR扩增来自几种临床样品的在K-ras外显子1， p53外显子5，6，7和8中的DNA。在表5中列出了PCR引物序列。
表5.内部标记的PCR引物的序列
  扩增的区域   方向   引物名称   引物序列   k-ras外显子1   正向   反向   VIC K-rasEx1-F102   NED K-rasEx1-R104   TCCGC(C-c6-VIC)GCATAGTGTATTAACCTTATGTGTGAC   ATGTTC(SEQ ID NO：29)   CTCGGC(C-c6-NED)CGCAAAATGGTCAGAGAAACCTTT   ATCTGTATC(SEQ ID NO：30)   p53外显子5   正向   反向   VIC p53Ex5-F106   NED p53Ex5-R108   TCCGC(C-c6-VIC)GCTGTTCACTTGTGCCCTGACTTTC   (SEQ ID NO：29)   CTCGGC(C-c6-NED)CGCCCAGCTGCTCACCATCGCTATC   (SEQ ID NO：30)   p53外显子6   正向   反向   VIC p53Ex6-F110   NED p53Ex6-R112   TCCGC(C-c6-VIC)GCCTCTGATTCCTCACTGATTGCTC   TTA(SEQ ID NO：31)   CTCGGC(C-c6-NED)CGGCCACTGACAACCACCCTTAAC   (SEQ ID NO：32)   p53外显子7   正向   反向   VIC p53Ex7-F114   NED p53Ex7-R116   TCCGC(C-c6-VIC)GCTGGGCGACAGAGCGAGATTCCATC   (SEQ ID NO：33)   CTCGGC(C-c6-NED)CGTGGATGGGTAGTAGTATGGA   AGAAATC(SEQ ID NO：34)   p53外显子8   正向   反向   VIC p53Ex8-F118   NED p53Ex8-R120   TCCGC(C-c6-VIC)GCAGGGTGGTTGGGAGTAGATG   (SEQ ID NO：35)   CTCGGC(C-c6-NED)CGGTGATAAAAGTGAATCTGAGGC   ATAAC(SEQ ID NO：36)
在含有20mM Tricine pH8.7，16mM(NH4)2SO4，2.5mM MgCl2，0.25mM dNTP，10pmol每种引物，150ng野生型基因组DNA 或突变型DNA，5U AmpliTaq DNA聚合酶的50ml反应混合物中，进 行PCR反应。
对于K-ras外显子1的扩增：PCR混合物与上面相同，例外是， 引物是10pmol Vic-K-ras Ex1-F102，和Ned-K-ras Ex1- R104。使用来自HT29细胞系的基因组DNA作为野生型DNA。使用 来自含有G12V的细胞系SW620的基因组DNA作为突变型DNA。PCR 条件如下：95℃持续1分钟，然后加入5U AmpliTaq DNA聚合酶，随 后是35个94℃持续20秒、65℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环， 最后在72℃延伸7分钟。
对于p53外显子5的扩增：PCR混合物与上面相同，例外是，引 物是10pmol Vic-p53Ex5-F106，和Ned-p53Ex5-R108。使用来 自含有p53H179Y突变的肿瘤样品的DNA作为突变型DNA。使用来 自相同患者的正常组织的DNA作为野生型DNA。PCR方案是95℃持 续1分钟，然后加入5U AmpliTaq DNA聚合酶，随后是35个94℃持 续20秒、68℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环，最后在72℃延伸 7分钟。
对于p53外显子6的扩增：PCR混合物与上面相同，例外是，引 物是10pmol Vic-p53Ex6-F110，和Ned-p53Ex6-R112。使用来自 含有Q192Ter和Y205F的肿瘤样品的DNA作为突变型DNA。使用来 自相同患者的正常组织的DNA作为野生型DNA。PCR方案是95℃持 续1分钟，然后加入5U AmpliTaq DNA聚合酶，随后是35个94℃持 续20秒、68℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环，最后在72℃延伸 7分钟。
对于p53外显子7的扩增：PCR混合物与上面相同，例外是，引 物是10pmol Vic-p53Ex7-F114，和Ned-p53Ex7-R116。使用来自 含有R248Q的肿瘤样品的DNA作为突变型DNA。使用来自相同患者 的正常组织的DNA作为野生型DNA。PCR方案是95℃持续1分钟， 然后加入5U AmpliTaq DNA聚合酶，随后是35个94℃持续20秒、63 ℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环，最后在72℃延伸7分钟。
对于p53外显子8的扩增：PCR混合物与上面相同，例外是，引 物是10pmol Vic-p53Ex8-F118，和Ned-p53Ex8-R120。使用来自 含有R273H的细胞系SW620的基因组DNA作为突变型DNA。使用 来自细胞系LoVo的基因组DNA作为野生型对照。PCR方案是95℃ 持续1分钟，然后加入5U AmpliTaq DNA聚合酶，随后是35个94℃ 持续20秒、68℃持续30秒和72℃持续1分钟的循环，最后在72℃延 伸7分钟。
将1ml蛋白酶K(QIAGEN，20mg/ml)加入12ml PCR产物，以 灭活Taq DNA聚合酶。在65℃温育混合物30分钟，以灭活Taq DNA 聚合酶，然后在85℃温育15分钟，以灭活蛋白酶K。
通过变性和再退火单独的野生型PCR产物，产生同源双链DNA 对照。通过变性和再退火含有50％野生型PCR产物和50％含有纯合 的p53R273H突变的PCR产物的混合物，产生异双链DNA。在95℃ 变性混合物2分钟，然后经1小时将温度从95℃逐渐降低至45℃，进 行再退火。在图3中解释了该实施例的步骤。
在标准条件下，用内部标记的引物或反向连接标记的引物，对异 双链和同源双链DNA样品进行Endo V反应。由于本实验用于确定是 否能在高背景下区分突变剪切产物，省略了连接步骤。在65℃，在含 有10mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，5％DMSO，1.5M甜菜碱， 7ml异双链或同源双链DNA和1mM  Endo V的20ml反应混合物 中，进行Endo V反应40分钟。通过加入2ml 100mM EDTA，终止反 应。混合1ml剪切产物和8.5ml Hi-Di甲酰胺(Applied Biosystems， Foster City，CA)和0.5ml LIZ-标记的ABI GeneScan-500LIZ大小 标准物。在95℃加热混合物2分钟，并在冰上冷却，装载到ABI 3730 DNA测序仪上进行电泳。在15kV电压、1200秒运行时间、60℃烘箱 温度下，与聚合物POP7一起电泳。用ABI收集软件显示阵列图像， 并用GeneMapper软件版本3.0(Applied Biosystems，Foster City，CA) 分析。由于ABI 3730DNA测序仪是毛细管电泳装置，在每个毛细管中 的Endo V剪切产物具有它自己的独特的迁移率；在所有毛细管中，存 在一些微小的迁移率差异。相同分子量的剪切产物没有彼此对齐。软 件程序(称作Gel Render)可以自动地重新排列每个毛细管中的剪切产 物的凝胶图像，所以相同分子量的剪切产物迁移到相同位置。这有助 于在毛细管阵列图像上视觉地识别突变。
通过对比来自突变型DNA和野生型DNA的剪切产物，证实了使 用内部标记的引物，在3730DNA测序仪中电泳剪切产物后，可以显著 地检测到这些样品中的K-ras G12V，p53H179Y，Q192Ter，Y205F， R248Q和R273H的突变(见图21)。
实施例17-当使用异双链p53外显子8PCR片段作为底物时，优化 TmaEndo V/连接酶的突变检测的缓冲条件
在标准条件下，p53的外显子8总是产生高水平的背景剪切。因此， 使用该基因作为模型系统，来测试会提高Endo V/连接酶反应的信噪比 的条件。在这些实验中，在Endo V/连接酶反应中，测试了不同的Tricine 缓冲条件(I至IV)，它们中的每一种包括子条件(A至H)，并与标准Endo V剪切条件(即Hepes pH7.5缓冲液)相对比。
在2个分开的“通用”PCR中，扩增p53外显子8，其中的每个使 用2个引物对，如实施例8所述：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV1F 和p-UniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV1F 和NedUniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174。
如实施例11所述，扩增350-bp PCR片段。使用实施例10所述 和图5所示的“分裂标记，变性/复性”方法，制备异双链的DNA底物。 作为参照，在标准缓冲条件(两步反应)下进行Endo V/连接酶反应，如 前面实施例9所述。
条件I-E如下进行：
1-在含有20mM Tricine pH8，5mM MgCl2，1mM DTT，5％ DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，和1μM endoV的20-μl反应物中， 在65℃温育一半体积(约6.5μl)的每种PCR混合物(包括野生型对 照)60分钟。
2-然后，在65℃温育60分钟的过程中，使15μl每种Endo V剪 切反应物在20-μl终体积中进行连接酶反应。这通过加入2μl 10x补 充缓冲液(400mM Tricine pH8，12.5mM MgCl2，100mM DTT，200 μg/ml BSA)，1μl 100mM NAD，和2μl 60nM连接酶来实现。
条件III-E如下进行：
1-在含有40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，1mM DTT，5％ DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，和1μM endoV的20-μl反应物中， 在65℃温育一半体积(约6.5μl)的每种PCR混合物(包括野生型对 照)60分钟。
2-然后，在65℃温育60分钟的过程中，使15μl每种Endo V剪 切反应物在20-μl终体积中进行连接酶反应。这通过加入2μl 10x补 充缓冲液(400mM Tricine pH8，12.5mM MgCl2，100mM DTT，200 μg/ml BSA)，1μl 100mM NAD，和2μl 60nM连接酶来实现。
除了子条件E以外，在条件I和III中测试了几种其它的子条件：
-A：首先与Endo V一起温育60分钟，没有第二次温育
-B：首先与Endo V一起温育60分钟，其次只与连接酶缓冲液一 起温育30分钟
-C：首先与Endo V一起温育60分钟，其次与连接酶缓冲液+连 接酶一起温育30分钟
-D：首先与Endo V一起温育60分钟，其次只与连接酶缓冲液一 起温育60分钟
条件II-H如下进行：
1-在有1μM endoV，6nM连接酶和5mM NAD存在下，在含有 20mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜 菜碱，2％甘油的20-μl反应物中，在65℃温育一半体积(约6.5μl) 的每种PCR混合物(包括野生型对照)60分钟。
2-然后，在20-μl终体积中，在65℃，温育15μl每种[Endo V+ 连接酶]反应物60-分钟。这通过加入2μl 10x补充缓冲液(400mM Tricine pH8，12.5mM MgCl2，62.5mM DTT，200μg/ml BSA)和3μl H2O来实现。
条件IV-H如下进行：
1-在有1μM endoV，6nM连接酶和5mM NAD存在下，在含有 40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜 菜碱，2％甘油的20-μl反应物中，在65℃温育一半体积(约6.5μl) 的每种PCR混合物(包括野生型对照)60分钟。
2-然后，在20-μl终体积中，在65℃，温育15μl每种[Endo V+ 连接酶]反应物60-分钟。这通过加入2μl 10x补充缓冲液(400mM Tricine pH8，12.5mM MgCl2，62.5mM DTT，200μg/ml BSA)和3μl H2O来实现。
除了子条件H以外，在条件II和IV中测试了子条件F和G：
-F：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，没有第二次温育
-G：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，其次与连接酶缓 冲液一起温育30分钟
总之，条件I和III是“经典的”两步方法(1-Endo V，2-连接酶)， 而条件II和IV代表着在第一个温育步骤中组合两种酶的两步方法(1- [Endo V+连接酶]，2-连接酶缓冲液)。对每种PCR混合物(包括野生 型对照)进行这些不同的条件。
在ABI 3730基于荧光的DNA分析仪上观察Vic-标记的上链和 Ned-标记的下链的剪切，并使用Gene Mapper片段分析软件 (Applied Biosystems，Foster City，CA)定量剪切产物的量。表6显示 了在测试的条件I-E，II-H，III-E，和IV-H以及标准条件中得 到的定量数据。
数据清楚地表明，所有测试的条件都比标准条件产生了显著提高 的信号强度(信号的倍数增加见最后两列)。当对比G/T和A/C错配的 信噪比时，发现从组合的{1-[Endo V+连接酶]，2-连接酶缓冲液)两 步方法II-H和IV-H得到的值分别显著高于对应的{1-Endo V，2 -连接酶}“经典的”两步方法I-E和III-E的值。例如，在条件III -E和IV-H中的Vic-标记的上链剪切产物的信噪比分别是6.3和 13.6。
结果显示在图22中。分别用绿色和蓝色箭头指示上链和下链剪切 产物。在泳道的上面标示了野生型G-C匹配，以及G/T和A/C错配 (来自野生型+突变型混合物)。另外，在每个泳道的上面，指示了温育 条件的细节。在凝胶图像的下面，指示了条件I至IV包含的泳道。与来 自表6的定量数据相一致，凝胶图像揭示了与“经典的”两步条件相比， 在组合的[Endo V+连接酶]条件下背景剪切的急剧减少。因此，保留组合 的[Endo V+连接酶]方法用于进一步优化，尤其是条件IV-H(40mM Tricine)，它们都产生比条件II(20mM Tricine)更好的信号倍数增加。
表6.用Endo V/连接酶突变扫描测定检测p53R273H突变：
不同缓冲条件的对比
  条件  片段  名称   片段大小   (bp)   [G∶T]   错配   [A∶C]   错配   信号/噪音   比[G∶T]   信号/噪音   比[A∶C]   信号的倍数增加   [G∶T]   [A∶C]   标准   1.Endo V   2.连接酶   I-E   1.Endo V   2.连接酶   II-H   1.Endo V+Lig.   2.缓冲液   III-E   1.Endo V   2.连接酶   IV-H   1.Endo V+Lig.   2.缓冲液  VIC信号  VIC背景  NED信号  NED背景  VIC信号  VIC背景  NED信号  NED背景  VIC信号  VIC背景  NED信号  NED背景  VIC信号  VIC背景  NED信号  NED背景  VIC信号  VIC背景  NED信号  NED背景   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   650   ＜150   809   ＜150   6352   1415   5889   1635   4376   621   3794   672   7726   2349   7313   4706   6263   748   5249   727   1519   326   953   ＜150   16720   1686   7436   2041   16078   1071   6578   649   19299   3086   9402   5302   16758   1231   7337   739   ＞4.3   ＞5.4   4.5   3.6   7.0   5.7   3.3   1.6   8.4   7.2   4.7   ＞6.3   9.9   3.6   15.0   10.1   6.3   1.8   13.6   9.9   9.8   7.3   6.7   4.7   11.9   9.0   9.6   6.5   11.0   7.8   10.6   6.9   12.7   9.9   11.0   7.7
标准条件： [40分钟]1-1x Endo V缓冲液＝20mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，1mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
           [30分钟]2-1x连接酶缓冲液＝20mM Tris pH8.5，1.25mM MgCl2，50
                   mM KCl，10mM DTT，20μg/ml BSA，含有3nM连接酶+1mM
                   NAD
条件I-E：  [60分钟]1-1x Endo V缓冲液＝20mM Tricine pH8，5mM MgCl2，1mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
           [60分钟]2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，10
                   mM DTT，20μg/ml BSA，含有6nM连接酶+5mM NAD
条件II-H： [60分钟]1-1x Endo V缓冲液＝20mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V+6nM
                   连接酶+5mM NAD
           [60分钟]2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25
                   mM DTT，20μg/ml BSA
条件III-E：[60分钟]1-1x Endo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，1mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
           [60分钟]2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，10
                   mM DTT，20μg/ml BSA，含有6nM连接酶+5mM NAD
条件IV-H： [60分钟]1-1x Endo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V+6
                   nM连接酶+5mM NAD
           [60分钟]2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25
                   mM DTT，20μg/ml BSA
实施例18-对比TmaEndo V/连接酶突变扫描测定中的一步温育和两 步温育方法
提高测定的第二个方案包含，对比标准的Endo V/连接酶方法、组 合的[Endo V+连接酶]两步方法(条件V-H)，和在20-μl反应体积中 进行的一步方法(条件VI-J)。在2个分开的“通用”PCR中扩增p53外 显子8，其中的每个使用2个引物对，如实施例8所述：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV1F 和p-UniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV1F 和NedUniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174。
如实施例11所述，扩增350-bp PCR片段。使用实施例10所述 和图5所示的“分裂标记，变性/复性”方法，制备异双链DNA底物。 作为参照，在标准缓冲条件(两步反应：[1-Endo V，2-连接酶])下进 行Endo V/连接酶反应，如前面实施例10所述(图23)。平行地，每种 PCR混合物(包括野生型对照)进行2种其它的子条件：[1-Endo V，2 -无连接酶]和[1-Endo V，无步骤2]。
条件V-H如下进行：
1-在有500nM endoV，6nM连接酶和5mM NAD存在下，在含 有40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M 甜菜碱，2％甘油的20-μl反应物中，在65℃温育一半体积(约6.5μl) 的每种PCR混合物(包括野生型对照)60分钟。
2-然后，在20-μl终体积中，在65℃，温育15μl每种[Endo V+ 连接酶]反应物60-分钟。这通过加入2μl 10x补充缓冲液(400mM Tricine pH8，12.5mM MgCl2，62.5mM DTT，200μg/ml BSA)和3μl H2O来实现。
除了子条件H以外，测试了条件V中的子条件F：
-F：首先与Endo V+连接酶一起温育60分钟，没有第二次温育
条件VI-J包含，在65℃，在含有80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油的20-μl反 应物中，与500nM endoV，6nM连接酶和5mM NAD一起温育一半 体积(约6.5μl)的每种PCR混合物(包括野生型对照)120分钟(一步方 法)。
除了子条件J以外，测试了条件VI中的子条件I：
-J：首先与Endo V+连接酶一起温育120分钟，没有第二次温育
对照PCR混合物(包括野生型对照)进行这些不同的条件。在ABI 3730基于荧光的DNA分析仪上观察Vic-标记的上链和Ned-标记的 下链的剪切，并使用Gene Mapper片段分析软件(Applied Biosystems，Foster City，CA)定量剪切产物的量。
如表7所示，与标准条件相比，在两种测试条件下的G/T或A/C 错配的信号以类似的方式增加：即，对于G/T错配，两种条件V-H 和VI-J的Vic信号的增加是4.3-倍，对于A/C错配，两种条件V- H和VI-J的Vic信号的增加分别是5.4-和4.9-倍。凝胶图像如图 23所示。分别用绿色和蓝色箭头指示上链和下链剪切产物。在泳道的 上面，野生型G∶C匹配，以及G/T和A/C错配(来自[野生型+突变型] 混合物)。另外，在每个泳道的上面，指示了温育条件的细节。在凝胶 图像的下面，指示了下述条件包含的泳道：标准，V-H，和VI-J。 如定量数据所证实的，与标准条件相比，在同一个反应中与Endo V和 连接酶一起温育异双链底物产生的背景剪切显著减少。数据证实，一 步和两步方法在提高信号强度和信噪比方面产生大致相同的结果。
表7.用Endo V/连接酶突变扫描测定检测p53 R273H突变：
一步和两步温育方法的对比
条件 片段名称 片段 大小 (bp) [G∶T] 错配 [A∶C] 错配 信号/ 噪音比 [G∶T] 信号/ 噪音比 [A∶C] 信号的倍数增加 [G∶T] [A∶C] 标准 1.Endo V 2.连接酶 V-H 1.Endo V+Lig. 2.缓冲液 VI-J 1.Endo V+Lig.      VIC信号 VIC背景 NED信号 NED背景 VIC信号 VIC背景 NED信号 NED背景 VIC信号 VIC背景 NED信号 NED背景 158 144 194 115 158 144 194 115 158 144 194 115 650 ＜150 809 ＜150 2796 501 2701 ＜150 2792 410 2768 ＜150 1519 326 953 ＜150 8276 622 3650 446 7493 633 4503 ＜150 ＞4.3 ＞5.4 5.6 ＞18 6.8 ＞18 4.7 ＞6.3 13.3 8.2 11.8 ＞30 4.3 3.3 4.3 3.4 5.4 3.8 4.9 4.7
标准条件：[40分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝20mM Hepes pH7.5，5mM MgCl2，1mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有1μM Endo V
          [30分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝20mM Tris pH8.5，1.25mM MgCl2，50
                   mM KCl，10mM DTT，20μg/ml BSA，含有3nM连接酶+1mM
                   NAD
条件V-H： [60分钟] 1-1x Endo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                   DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM Endo V+
                   6nM连接酶+5mM NAD
          [60分钟] 2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25
                   mM DTT，20μg/ml BSA
条件VI-J：[120分钟]1x Endo V/连接酶缓冲液＝80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5
                   mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM Endo
                   V+6nM连接酶+5mM NAD
实施例19-对比TmaEndo V/连接酶突变扫描测定的一步和两步温育 方法中的两种NAD浓度
还检验了连接酶辅因子NAD对含有p53外显子8R273H突变的 异双链PCR片段的作用。测试组合的[Endo V+连接酶]两步方法(条件 VII和VIII)和一步方法(条件IX和X)的NAD浓度。在2个分开的“通 用”PCR反应中，扩增p53外显子8，其中的每个使用2个引物对， 如实施例8所述：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV1F 和p-UniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV1F 和NedUniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174。
如实施例11所述，扩增350-bp PCR片段。使用实施例10所述 和图5所示的“分裂标记，变性/复性”方法，制备异双链的DNA底物。
如实施例18所述，进行条件V。
条件VII类似于条件V，例外是，使用1mM NAD替代5mM。
在实施例18中描述了条件VI。
条件VIII类似于条件VI，例外是，使用1mM NAD替代5mM。
在ABI 3730基于荧光的DNA分析仪上观察Vic-标记的上链和 Ned-标记的下链的剪切，并使用Gene Mapper片段分析软件 (Applied Biosystems，Foster City，CA)定量剪切产物的量。结果(表8) 表明，在1mM NAD时的总信噪比略高于5mM NAD。关于A/C错配 数据，条件VII和VIII(1mM NAD)的Vic信噪比是13.4-和10.1-倍， 相反地，条件V和VI(5mM NAD)的是6.8-和5.6-倍。关于G/T错 配，观察到了类似的趋势，尽管不太急剧。因此，在使用1mM NAD 的一步方法下，进行后续实验。
表8.对比Endo V/连接酶突变扫描测定的一步和两步温育方法中 的两种NAD浓度
  条件   片段名称   片段大小   (bp)   [G∶T]   错配   [A∶C]   错配   信号/噪音比   [G∶T]   信号/噪音比   [A∶C]   V   1.Endo V+Lig.   2.缓冲液   VI   1.Endo V+Lig.   2.缓冲液   VII   Endo V+Lig.   VIII   Endo V+Lig.   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   3319   982   3395   ＜150   868   361   1184   ＜150   2997   680   2717   867   1688   464   1611   601   6789   1003   3758   ＜150   2732   488   2214   ＜150   13792   1028   7426   ＜150   5066   503   3989   581   3.4   ＞22.6   2.4   ＞7.9   4.4   3.1   3.6   2.7   6.8   ＞25   5.6   ＞14.8   13.4   ＞49   10.1   6.9
条件V：   [60分钟]  1-1xEndo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM endoV+6
                    nM连接酶+5mM NAD
          [60分钟]  2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25
                    mM DTT，20μg/ml BSA
条件VII： [60分钟]  1-1xEndo V缓冲液＝40mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM
                    DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM endoV+6
                    nM连接酶+1mM NAD
          [60分钟]  2-1x连接酶缓冲液＝40mM Tricine pH8，1.25mM MgCl2，6.25
                    mM DTT，20μg/ml BSA
条件VI：  [120分钟] 1xEndo V/连接酶缓冲液＝80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，
                    5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM endoV
                    +6nM连接酶+5mM NAD
条件VIII：[120分钟] 1xEndo V/连接酶缓冲液＝80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，
                    5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油，含有500nM endoV
                    +6nM连接酶+1mM NAD
实施例20-检测过量的野生型DNA中的K-ras G12V突变
为了确定Endo V/连接酶突变扫描测定在优化的单步骤条件下的 灵敏度，使用含有K-ras外显子1G12V突变的PCR片段作为模板， 在1∶1至1∶100的不同突变型/野生型DNA比下，评价测定的突变检测 能力。
从含有K-ras基因的外显子1(密码子12)的突变G12V的细胞 系，提取基因组DNA。HT-29细胞系含有野生型K-ras基因，而 SW480和SW620含有纯G12V(G-＞T)突变。对于K-ras外显子1 扩增，使野生型和突变型(G12V，G-＞T)基因组DNA平行地进行2 个“通用”PCR扩增，其中的每一个使用2个引物对：
第一个“通用”PCR 使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV1F 和p-UniEV2R，前者在它的5’-末端被Vic荧光地-标记，后者被 5’-磷酸化；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F161和 R162，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV1F 和NedUniEV2R，前者被5’-磷酸化，后者在它的5’-末端被Ned 荧光地-标记，2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F161和 R162。
在表3中列出了这些引物的DNA序列。VicUniEV1F和 NedUniEV2R被结合到第4个碱基(胞嘧啶4)的C6上的荧光基团(Vic 或Ned)内部标记。使野生型和突变型基因组DNA分别进行50-μl“通 用”PCR反应。“通用”PCR条件与在实施例7中所述的那些相同。 使用实施例10所述和图5所示的“分裂标记，变性/复性”方法，制备异 双链DNA底物。但是，以1∶1，1∶5，1∶10，1∶20，1∶50，和1∶100的 突变型/野生型比，混合含有G12V突变的PCR片段和野生型PCR片 段。PCR片段的总量保持恒定(约1500ng)。
Endo V/连接酶测定条件包含，在65℃，在含有80mM Tricine pH 8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油， with 1μM endoV，12nM连接酶和1mM NAD的20-μl反应物中， 温育一半体积(约6.5μl)的每种PCR混合物(包括野生型对照)1h或2h (一步方法)。
在ABI 3730基于荧光的DNA分析仪上，观察Vic-标记的上链 和Ned-标记的下链的剪切，并使用Gene Mapper片段分析软件 (Applied Biosystems，Foster City，CA)，定量剪切产物的量。
表9显示了从不同的突变型/野生型DNA比得到的定量数据。结 果表明，在最高达1∶100的突变型/野生型DNA比下，优化的Endo V/ 连接酶突变扫描测定能区分T/C错配的两条链的剪切信号和背景信 号。关于G/A错配，在1∶20可以区分两条链，且在1∶100，一条链仍 然提供超过背景的信号。结果如图24所示。图25显示了代表从不同 突变型/野生型DNA比得到的剪切产物的量的图，G/A(图25A)和T/C 错配(图25B)。在将所有值标准化成GeneScan-500LIZ大小标准物 (任意地选择与200-bp DNA片段相对应的峰面积作为参照)后，通过 GeneMapper片段分析软件测量峰面积，并用于确定相对荧光强度。 棒指示着在它们各自的突变型/野生型比下的相对荧光强度：上链剪切 产物是蓝色棒，下链剪切产物是粉红色棒。在每个图的上面指示着突 变、核苷酸改变和错配。这些结果表明，本测定可以以1∶100(突变型/ 野生型DNA)的灵敏度，辨别4条链中的3条的剪切。
表9.EndoV/连接酶扫描测定对K-ras G12V的灵敏度
  突变型/   野生型比   片段名称   片段大小   (bp)   [G∶A]   错配   [T∶C]   错配   信噪比   [G∶A]   信噪比   [T∶C]   1∶1   1∶5   1∶10   1∶20   1∶50   1∶100   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   133   164   174   177   133   164   174   177   133   164   174   177   133   164   174   177   133   164   174   177   133   164   174   177   5328   445   5594   912   1546   354   4096   773   1094   515   2951   903   880   ＜150   1781   742   658   447   635   ＜150   404   ＜150   ＜150   ＜150   3436   ＜150   8122   1243   4568   727   4904   1337   2749   ＜150   3216   920   2235   472   2804   ＜150   1707   ＜150   2292   880   966   ＜150   2090   ＜150   12.0   6.1   4.4   5.3   2.1   3.3   ＞5.9   2.4   1.5   ＞4.2   ＞2.7   ND   ＞22.9   6.5   6.3   3.7   ＞18.3   3.5   4.7   ＞18.7   ＞11.4   2.6   ＞6.4   ＞13.9
温育条件：1xEndo V/连接酶缓冲液＝80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘 油，含有1μM endoV+12nM连接酶+1mM NAD  [120 分钟]
实施例21-检测过量的野生型DNA中的p53R273H突变
对含有p53外显子8R273H突变的PCR片段，进行类似于实施例 20所述的实验。从含有p53基因的外显子8(密码子273)的突变的细胞 系，提取基因组DNA。LoVo细胞系含有野生型p53基因，而HT-29 SW480和SW620细胞系含有R273H(G-＞A)突变。类似于实施例16 的K-ras PCR扩增，在2个分开的“通用”PCR中，扩增p53外显子 8，其中的每一个使用2个引物对：
第一个“通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物VicUniEV1F 和p-UniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173 和R174，它们携带通用尾巴，它们比通用引物序列仅短3个碱基对。
第二个通用”PCR使用：1-正向和反向通用引物p-UniEV1F和 NedUniEV2R；2-正向和反向未标记的基因-特异性的引物F173和 R174。
VicUniEV1F和NedUniEV2R被结合到第4个碱基(胞嘧啶4)的C6 上的荧光基团(Vic或Ned)内部标记。在表3中列出了这些引物的DNA 序列。使野生型和突变型基因组DNA分别进行50-μl“通用”PCR。“通 用”PCR条件与在实施例7中所述的那些相同。使用实施例10所述和 图5所示的“分裂标记，变性/复性”方法，制备异双链DNA底物。但 是，以1∶1，1∶5，1∶10，1∶20，1∶50，和1∶100的突变型/野生型比，混 合含有R273H突变的PCR片段和野生型PCR片段。PCR片段的总量 保持恒定(约1500ng)。
Endo V/连接酶测定条件包含，在65℃，在含有80mM Tricine pH 8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘油， with 1μM endoV，12nM连接酶，和1mM NAD的20-μl反应物中， 温育一半体积(约6.5μl)的每种PCR混合物(包括野生型对照)1h或2h (一步方法)。
在ABI 3730基于荧光的DNA分析仪上，观察Vic-标记的上链 和Ned-标记的下链的剪切，并使用Gene Mapper片段分析软件 (Applied Biosystems，Foster City，CA)，定量剪切产物的量。
表10.Endo V/连接酶扫描测定对p53R273H的灵敏度
  突变型/   野生型比   片段名称   片段大小   (bp)   [G∶T]   错配   [A∶C]   错配   信噪比   [G∶T]   信噪比   [A∶C]   1∶1   1∶5   1∶10   1∶20   1∶50   1∶100   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   VIC信号   VIC背景   NED信号   NED背景   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   158   144   194   115   3153   868   2451   1021   1685   871   3424   ＜150   1266   461   1606   1053   1525   857   1625   1140   1258   799   ＜150   1101   542   615   ＜150   652   13602   1466   9277   967   9046   1371   3169   1284   4603   929   1997   1354   2729   807   1028   1038   1418   709   992   1100   ＜150   1697   ＜150   1931   3.6   2.4   1.9   ＞22.8   2.7   1.5   1.8   1.4   1.6   ND   0.9   ND   9.3   9.6   6.6   2.5   5.0   1.5   3.4   1.0   2.0   0.9   ND   ND
温育条件：1xEndo V/连接酶缓冲液＝80mM Tricine pH8，5mM MgCl2，5mM DTT，5％DMSO，1.5M甜菜碱，2％甘 油，含有1μM endoV+12nM连接酶+1mM NAD  [120 分钟]
表10中的结果表明，在最高达1∶20的突变型/野生型DNA比下， 该测定能区分剪切信号和背景信号。但是，值得注意的是，尽管G/T 错配的剪切信号显著超过背景(Vic和Ned信号分别是1.8-和1.4- 倍)，且A-C错配Vic信号也显著超过背景(3.4-倍)，A/C错配Ned 信号的信噪比仅等于1，这正在显著性标准以下。
凝胶图像也如图26所示。图27显示了代表从不同突变型/野生型 DNA比得到的剪切产物的量的图，G/T(图27A)和A/C错配(图27B) DNA。结果表明，在最高达1∶20的突变型/野生型DNA比下，优化的 Endo V/连接酶突变扫描测定能区分T/C错配的两条链的剪切信号和野 生型信号，且对于G链在最高达1∶100下。关于A/C错配，在1∶50可 以区分两条链。在将所有值标准化成GeneScan-500 LIZ大小标准物 (任意地选择与200-bp DNA片段相对应的峰面积作为参照)后，通过 GeneMapper片段分析软件测量峰面积，并用于确定相对荧光强度。 棒指示着在它们各自的突变型/野生型比下的相对荧光强度：上链剪切 产物是蓝色棒，下链剪切产物是粉红色棒。在每个图的上面指示着突 变、核苷酸改变和错配。这些结果表明，对于p53外显子8，本测定 可以以1∶50(突变型/野生型DNA)的灵敏度，辨别4条链中的3条的剪 切。
该应用代表着显著改进的Endo V/连接酶突变扫描测定，其通过分 离底物制备步骤(DNA扩增，异双链体形成)和突变查询步骤(Endo V/ 连接酶)、和突变检测步骤(通过毛细管电泳或芯片上的杂交来分离)来 实现。该正交方案允许分开地优化每种组分，以在集成系统中达到最 大的信噪比分辨力。
为了解释下面的观点的目的，一次考虑一种PCR扩增子。但是， 该概念意在与多种PCR扩增子(最后，数百种至数千种)一起使用。分 开地产生这些扩增子，并随后合并，或多路化(例如，使用PCR/PCR 方法)，或通过组合两种方案。
Endo V/连接酶突变扫描测定会产生许多独特的产物(见图1)。在标 准的基于电泳的测定中，根据在5’末端含有荧光标记的独特长度的产 物的出现，记录突变的存在。在本文所述的基于阵列的读出方法中， 根据下述特征记录突变：(i)存在新产生的3’OH，和上游序列的邻近 的独特碱基，(ii)存在新产生的5’磷酸基，和下游序列的邻近的独特 碱基，或(iii)存在新产生的3’OH，和上游序列的独特的碱基，如在通 用阵列上所显示的。这样的测定理论上会避免由于Endo V在末端附近 剪切产生的短片段造成的假阳性，和由于Endo V对一条链或其它链中 的某些GC富集序列的突变的弱活性造成的假阴性。
剪切/连接/毛细管电泳
用标准的变性/复性步骤处理PCR产物后，4种潜在的再退火的产 物可以形成：(i)上链突变型：下链野生型异双链，(ii)上链突变型： 下链突变型同源双链，(iii)上链野生型：下链野生型同源双链，和(iv) 上链野生型：下链突变型异双链。这些产物中只有两种可以产生指示 突变或多态性的存在的信号，而其它两种产物只能产生增加背景噪音 的信号。例如，当从野生型和代表G→A转换突变的突变型序列产生异 双链时，4种产物分别含有2种错配(A/C，G/T)和2种匹配(A∶T，G∶C)。
提高信噪比的一个方案是，产生仅属于一种类型的异双链的序 列，即纯A/C错配。这可以通过许多选择性地捕获一条链或选择性地 去除一条链的方法来实现。例如，使用含有荧光标记的上链引物和在 5’末端磷酸化的下链引物，可以PCR扩增突变型DNA。同时，使用 磷酸化的上链引物和含有在5’末端的荧光标记的下链引物，可以PCR 扩增野生型DNA。当组合这两种产物并使用λ外切核酸酶消化磷酸化 的链时，得到的单链可以再退火，形成上链突变型：下链野生型的异 双链(图2，也见图6)。当使用λ外切核酸酶来产生异双链的底物时， 得到提高的信噪比(见图13-16)。
以前已经证实，加入DMSO(5％)和甜菜碱(1.0-1.5M)会显著增 强异双链的PCR片段的剪切(Huang等，Oncogene 21(12)：1909- 21(2002)，其在这里整体引作参考)。为了测试其它添加剂是否也会增 强Endo V剪切，使用了四亚甲基亚砜和四氢噻吩砜。当扩增具有高GC 含量的模板DNA时，证实四氢噻吩砜会提高PCR产物产量 (Chakrabarti，R.，等，Gene，274(1-2)：293-8(2001)，其在这里整 体引作参考).四亚甲基亚砜具有与DMSO(二甲基亚砜)类似的化学基 团(见图17)。
在异双链体形成或Endo V剪切反应过程中，或在两个反应中，加 入这两种化学试剂。另外，在杂交步骤中，也加入EDTA。在实施例 13中提供了这些实验的详细描述(见图18)。已经证实，在Endo V反应 的过程中，可以使用5％四亚甲基亚砜或5％四氢噻吩砜替代1.5M 甜菜碱和5％DMSO。这提供了更广泛范围的缓冲条件，以同时优化 Endo V剪切和连接酶重新密封，如下面所证实的。
预防在Endo V突变扫描测定过程中丢失5’标记
图1所示方法的一个缺点是，当通过毛细管电泳分离产物时，会 出现2个未预见到的带：一个迁移到94碱基附近的宽黄色带(Ned)，和 一个迁移到102碱基附近的宽绿色带(Vic)(示意图见图3)。广泛对比揭 示，这些产物依赖于Endo V的存在，且会通过10kDa截止值的过滤去 除掉。因而这些带最可能是含有5’荧光标记、磷酸基(提供电荷)和最 可能的一个额外碱基的剪切产物。这些带会给标准Endo V/连接酶测定 带来两个问题：(1)2个剪切的标记带会干扰迁移到相同位置的由突变 引起的真实带的检测，和(2)信号的丢失会显著降低区分真实信号(源自 在突变处的剪切)和噪音(源自在匹配位置处的剪切)的能力(尽管以前观 察到由与在ABI 377上的凝胶电泳检测一起使用的Fam或Tet标记的 剪切引起的信号丢失，剪切的标记在标准凝胶上迁移到标记的引物附 近，因而不是如此严重的问题)。最后，观察到Endo V会保留活性并 将5’标记剪离异双链的片段，甚至在电泳过程中在毛细管内(尽管已 经在甲酰胺中变性)。
为了避免由于Endo V将标记剪离5’末端引起的信号丢失，评价 了许多修饰的标记的引物(见图3)。这些修饰包括：
1.将2个2’O-甲基化的C插入标记和引物的5’末端之间。
2.将序列CGCCGC添加到引物的5’末端。已经证实当位于片 段的中间时，该序列是Endo V剪切抗性的(Huang，J.，等、Oncogene 21(12)：1909-21(2002)，其在这里整体引作参考)。
3.将2个2’O-甲基化的C和Endo V抗性的序列(CGCCGC) 添加到引物的5’末端。
4.将C-c6-Vic(或Ned)插入抗性序列内离5’末端第4个或第5 个位置(例如CGC(C-c6-Ned)G)。这样的引物设计也称作内部标记的 引物。Vic和Ned是在ABI(Applied Biosystems，Foster City，CA)开 发的荧光基团。
5.以反向方向添加Vic或Ned标记，即3’-Vic-5’-5’基 因-特异性的寡核苷酸3’。
另外，将EDTA包含在甲酰胺中，以去除金属辅因子，并确保在 终止反应后没有活性。只有内部标记的引物是对Endo V剪切完全抗性 的(图19和实施例14)。但是，也产生了迁移到600碱基对附近的高分 子量伪迹(图20)。使用3’-标记5-5’寡核苷酸引物可以消除高分 子量伪迹，但是，有些标记仍然会被Endo V剪切掉(见实施例15)。内 在标记和反向连接修饰都会解决标记剪切问题，提供优良的信号，并 用于使用通用引物的后续实验中。
使用内部标记的引物作为PCR引物，扩增了来自几种临床样品的 在K-ras外显子1，p53外显子5，6，7和8中具有突变的DNA。在 标准条件下，进行Endo V反应(见实施例16)。由于该实验用于确定是 否能在高背景下区分突变剪切产物，省略了连接步骤。与来自野生型 PCR产物的剪切产物相比，证实使用内部标记的引物，在3730 DNA 测序仪中电泳剪切产物后，可以显著地检测到这些样品中的突变(见图 21和实施例16)。
异双链体形成和更高处理量Endo V突变扫描测定
Endo V测定的灵敏度足以辨别20-倍过量的未改变的DNA中的 一个突变型序列。当尝试发现过量野生型DNA中的低丰度突变的存在 时，这是有用的。而且，该方法适合从不同患者合并不同的DNA样品， 以寻找新突变的出现。也适用于合并许多不同的外显子或基因，并确 定突变在单一样品中的存在。
肿瘤样品的DNA经常是有限的。因而，可以在进行单个的Endo V 突变扫描测定之前，谨慎地预扩增DNA。这可以在产生的平均片段大 小大于Endo V反应所需的扩增子大小的条件下，使用全基因组扩增来 实现。另一个方案是，产生样品的代表，例如通过用限制性内切核酸 酶剪切它，连接到连接物上，并扩增给定大小级别的片段。代表扩增 的优点是，单个引物对可以扩增多个片段，用于进一步分析。但是， 待最终测定的片段必须存在于该代表中。
如果已知待查询的基因或区域，可以一起扩增它们，在本文中称 作“定向的代表扩增”。在这里，合成基因-特异性的引物，其在它们 的5’末端含有相同的通用引物序列。合并这些引物，并以低浓度使用， 以便在有限数目的循环中一起PCR扩增多个片段。尽管在单个PCR反 应中使用大量的引物存在扩增不希望的产物的风险，它们的产量不会 超过目标产物，引物PCR循环是有限的。另外，这些额外的片段等同 于全基因组或代表扩增中的额外的片段。代表的或定向的代表扩增的 原理也适用于从cDNA扩增片段。
随后，使用低浓度的基因-特异性的/通用的引物和Taq聚合 酶，PCR扩增基因组或基因组靶DNA的代表的一个或多个片段(见图 4)。在同一个或后续的反应中，存在高浓度的标记的通用引物，其含有 相同的序列和在它们的3’端的额外的标记碱基。在更低的温度继续 PCR反应，且标记的片段占优势。由于两种通用引物具有相同的序列， 引物二聚体不会扩增。在3’末端上的独特的标记碱基会确保每种通用 引物仅扩增(并标记)目标链。在分开的(或相同的)反应中，如上PCR 扩增正常的DNA。使产物变性和复性，产生标记的异双链的片段。一 次仅标记一种通用引物进行反应，在本文中称作“分裂标记，变性/复 性”，如图5所示。或者，可以不标记任一种通用引物进行PCR扩增， 用于后续的阵列检测。
已经设计了基因-特异性的/通用的引物和通用引物，所以它们可 以在单个均质反应中扩增目标靶。将基因-特异性的/通用的引物的基 因-特异性的部分设计成具有约70-72℃的Tm-值(使用Oligo 6.0软 件计算)。基因-特异性的/通用的引物的通用部分略短于全长通用引 物，并设计成具有约56-57℃的Tm-值(使用Oligo 6.0软件计算)。将 通用引物设计成在它们的5’部分具有相同的序列(约18个碱基，差别 仅在于荧光标记，如果存在的话)和3’CA或3’AC序列。这些3’差 异会确保，每种通用引物仅扩增(并标记)目标链(见实施例7和8和表 3)。
在制备Endo V底物的PCR反应中，基因-特异性的部分的起始 扩增发生在更高的温度，所以基因-特异性的/通用的引物可以扩增基 因组DNA或它们自己的片段(即94℃30秒，65℃1分钟，72℃1 分钟，20个循环)。随后，将温度降低至允许通用引物结合和延伸起始 PCR产物，并可以在更低的温度继续循环(即94℃30秒，55℃1分钟， 72℃1分钟，30个循环)。在几个起始循环后再次升高温度来提高下一 个PCR的效率，可以具有优点，如下所述(即94℃30秒，55℃1分 钟，72℃1分钟，5个循环，然后94℃30秒，65℃1分钟，72℃1分 钟，20个循环)。
在标准的PCR反应中，两种引物是不同的，所以每种引物唯一地 与它自己的位点杂交。在通用引物完全相同的PCR/PCR中，单一引物 会杂交两个位点。但是，对于Endo V反应，通用引物具有独特的3’ 末端，以确保它们仅仅在正确的链上延伸。(保持5’侧相同或大部分 相同，所以它会预防引物二聚体形成)。使用两种引物，它们能与任一 种序列杂交，但是二者中只有一种能正确地延伸，可以减少PCR反应 的产量。减少水平随与正确位点杂交的效率而变。如果在两个结合事 件之间没有区别，效率是50％或50％左右，如果引物的3’末端明显 有助于结合的效率(如当循环温度达到引物Tm值时所发生的)，则效率 会更高(约70％至90％)。
例如，为了用正常的PCR得到十亿-倍扩增，需要30个循环。 下面是用2种通用引物PCR所需的循环数(给定效率所需的循环数)： 50％效率需要53个循环；60％效率需要45个循环；70％效率需要40 个循环；80％效率需要36个循环；90％效率需要33个循环。
为了计算扩增的理论量，标准PCR的公式是：扩增＝(2X)N，其 中X是单个循环的效率，且N是循环数。
如果X＝1，N＝10；扩增＝1024
如果X＝1，N＝20；扩增＝1,048,576
为了计算扩增的理论量，2种引物PCR的公式是：扩增＝((1+％ 效率)X)N，其中X是单个循环的效率，％效率是向正确位点的正确引 物结合的百分比，且N是循环数。例如：
如果X＝1，效率＝50％，N＝10；扩增＝57.66＝58
如果X＝1，效率＝80％，N＝10；扩增＝357.0
如果X＝1，效率＝50％，N＝20；扩增＝3325
如果X＝1，效率＝80％，N＝20；扩增＝127,482
因而，上述的通用PCR扩增方案会实现避免引物二聚体的目的， 允许倍数扩增许多片段，并独特地标记每条链。引物集合和通用引物 可以在单个均质反应中一起使用，但是该设计需要比标准PCR反应 更多的扩增循环。
上述方案会产生异双链和同源双链DNA。为了只产生异双链 DNA，使用低浓度的基因-特异性的/通用的引物和Taq DNA聚合酶， PCR扩增靶DNA的一个或多个片段，如图6所示。在同一个或后续的 反应中，存在高浓度的一种标记的和一种磷酸化的通用引物，其含有 相同的序列和在它们的3’端的额外的标记碱基。在更低的温度继续 PCR反应，且标记的片段占优势。由于两种通用引物具有相同的序列， 引物二聚体不会扩增。在3’末端上的独特的标记碱基会确保每种通用 引物仅扩增(并标记)目标链。在分开的反应中，如上PCR扩增正常的 DNA，但是互换标记的和含有磷酸基的通用引物。使产物变性和复性， 产生标记的异双链的片段。混合两种PCR产物，并用λ外切核酸酶处 理，以消化磷酸化的引物和产物，允许剩余链形成异双链的DNA。反 转引物集合，产生互补的异双链集合。通过使用已知会促进杂交反应 的额外的缓冲液添加剂，如阳离子去污剂或蛋白(如单链结合蛋白)和/ 或RecA，可以辅助从新产生的单链形成异双链的DNA。一次仅标记一 种通用引物(如图5所示)，或者不标记任一种通用引物，进行反应，用 于后续的阵列检测。
关于阵列实验，必须确保去除所有单链的或不完全的PCR产物或 部分地异双链的片段。为此，使用低浓度的基因-特异性的/通用的引 物和Taq DNA聚合酶，PCR扩增靶DNA的一个或多个片段(图7)。在 同一个或后续的反应中，存在高浓度的磷酸化的通用引物，其含有相 同的序列和在它们的3’端的额外的标记碱基。在更低的温度继续PCR 反应，且磷酸化的片段占优势。由于两种通用引物具有相同的序列， 引物二聚体不会扩增。在3’末端上的独特的标记碱基会确保每种通用 引物仅扩增(并标记)目标链。在分开的反应中，使用在它们的5’末端 含有额外碱基的通用引物，如上PCR扩增正常的DNA。使产物变性和 复性，产生具有不对称的″粘端″的异双链的片段。用T4连接酶连接具 有对应突出的连接物，仅仅连接到正确的异双链的末端。可以使用伴 侣连接物，其连接到含有额外的3’A的末端，经常被Taq DNA聚合 酶添加到PCR产物的末端。连接物含有阻断基团，以赋予异双链的 DNA对随后的外切核酸酶消化的抗性。可以使用3’→5’外切核酸酶 (如E.coli ExoI和ExoIII)或5’→3’外切核酸酶(如λ外切核酸酶)或两 种类型。由于产生的异双链具有不相同的突出，分开的或同一个反应 含有用于保护互补的异双链的连接物。
在所有上面的方法中，应当指出，引物之一可以含有捕获基团(如 生物素)，允许捕获特定链和在溶液中释放补体(例如通过热或碱变 性)。混合捕获的野生型链和可溶的突变型链(在中性pH溶液中)，允许 形成异双链。可以捕获这些异双链，并用抗生物素蛋白链菌素包被的 顺磁珠子纯化。
为了总结上面的方案，它们允许同时扩增一个或多个片段，产生 适合Endo V突变扫描的底物。这允许几种类型的合并反应。最直接的 是，PCR扩增许多样品，然后合并产物(例如，在3-10种的组中)，进 行Endo V突变扫描。由于新突变或多态性在所有样品中存在于相同位 置的概率非常小，筛选会发现新突变。如果DNA是非常干净的，和/ 或精确定量的，可以在PCR扩增之前合并样品。一种替代方案是，用 标记的上链扩增一半样品，并用标记的下链扩增其它样品。合并这两 个集合，并通过变性/复性进行异双链，或使用λ外切核酸酶来产生纯 的异双链的片段。同时，用标记的上链扩增第二半样品，并与具有标 记的下链的第一半样品相混合。另外，新突变或多态性存在于所有样 品中的概率非常小。但是，现在每个泳道可以查找以前2倍数目的样 品。
上述方案是基于，鉴别多种样品在每个泳道的相同目标区域中的 突变，其中突变或多态性的频率显著低于合并在给定泳道中的样品 数。通过检测超过来自其它(野生型)样品的累积背景信号的突变型信号 的能力，可以确定测定的灵敏度界限。在一种不同的方案中，共同扩 增来自单一样品的靶DNA的多个区域，所以所有片段都是大约相同的 长度。在该方案中，每个片段产生背景信号，但是背景信号会随机地 分布，所以能容易地区分突变信号。该方法的一种变体是，将靶基因 或区域分成600碱基或更小的连续区域(例如外显子和内含子接头序 列)。第一个多重PCR反应扩增奇数区域，而第二个多重PCR反应扩 增偶数区域。这允许使用会产生可能含有一些重叠的片段的引物，所 以大外显子序列仍然被完全覆盖在PCR产物的偶数或奇数集合中。
在所有前述的方案中，需要适当的对照来区分常见的多态性和新 的多态性和突变。另外，一旦检测到突变信号，需要扫描，然后对来 自该组的各个样品或片段进行测序，以准确定位突变。
单步剪切/连接反应
内切核酸酶V会识别来自完美的双链DNA的一些改变，这允许 剪切磷酸盐主链。由于该酶会识别和剪切广范围的底物，从apurinic位 点到含有尿嘧啶的位点到插入、缺失和错配，难以预测在给定的条件 集合下，会强烈地剪切哪种类型的改变。为了确保更抗性的错配的剪 切，使用有机溶剂和其它添加剂来辅助将磷酸盐主链推向可剪切的构 象。这些条件又允许在特定位点剪切正常的同源双链化的DNA。在有 些情况下，甚至比抗性错配(如p53中的R273H突变)更有效率地剪切 正常序列。
实施例17和18(见图22和23，以及表6和7)表明，正确地选择条 件，会在过量的来自匹配位点的背景信号下，积累错配位点的目标片 段长度，甚至尽管在最佳缓冲条件下，会比后者更有效率地剪切前者。 该条件可以通过与内切核酸酶V同时加入连接酶来实现。尽管会更有 效率地剪切匹配位点，也更有效率地重新连接它们，且因此，在错配 位点的更弱的信号具有积累的机会。需要优化缓冲条件和酶浓度，使 得由错配剪切/重新密封产生的产物比由匹配剪切/重新密封产生的产 物更快地积累。关于要满足的这些条件，在给定缓冲液中的4种反应 的速度常数需要满足下面的方程：
kMm剪切-kMm连接＞kM剪切-kM连接
和
kMm剪切-kMm连接＞0
其中：
kMm剪切＝错配剪切的速度
kM剪切＝匹配剪切的速度
kMm连接＝错配连接的速度
kM连接＝匹配连接的速度
尽管不能直接确定单个的连接和剪切速度，确定了允许保持上述 方程的几个均质条件(见图22和23和表6和7)。
这些修饰会显著增强总突变信号和信噪比。例如，信号比标准条 件提高4.7至12.7-倍，信噪比提高4.3-6.3至最高15-倍(表6和7)。 结果，改进的方法的灵敏度足以鉴别突变或多态性，其中突变的核酸 序列与正常的靶核苷酸序列的比是在1∶1至1∶100的范围内。已经证 实，对于最高1∶100的K-ras G12V突变，可以实现G/A和T/C错配 中的至少3/4链的增强剪切(实施例20，图24和25，表9)，对于最高 1∶50的p53外显子8R273H突变，可以实现G/T和A/C错配中的至少 3/4链的增强剪切(实施例21，图26和27，表10)。
剪切/连接/微阵列
关于使用基因-特异性的或通用的阵列来检测新突变的存在，可 以考虑许多不同的方案(图8-11)。通常，如图4-8所示，在测试和正 常DNA之间形成异双链。测试DNA可以是基因组DNA、cDNA或来 自任一种这样的起始来源的PCR扩增。正常的DNA可以是没有额外 的DNA(即测试DNA样品也含有正常的DNA，如在含有肿瘤和间质 细胞的癌样品中)、克隆的DNA，或基因组或cDNA的PCR扩增。如果 需要，将异双链的DNA帽化，并使用固体支持物捕获，如抗生物素蛋 白链菌素包被的顺磁珠子对连接的生物素化的连接物的捕获。用Endo V处理异双链的DNA，并用连接酶重新密封不适当的切口(图8-11， 步骤1和2)。可以使用3种后续的变体来捕获新产生的3’OH或5’ 磷酸基。在第一种变体中，用末端转移酶给3’OH末端加尾巴，并使 用标记的引物和上游磷酸化的引物，PCR扩增新产生的片段(图8和 9)。在第二种变体中，将下游引物退火，并延伸，产生具有新产生的5’ 磷酸基的平端。使用T4连接酶，将连接物连接到该平端上。使用标记 的连接物引物和下游磷酸化的引物，PCR扩增新产生的片段(图10)。 在这两种变体中，PCR扩增步骤包含dUTP，允许用Endo V在这些位 置切口。现在，λ外切核酸酶的消化会去除所有DNA片段，除了标记 的片段和邻近的独特的基因-特异性的序列以外。使这些片段与跨该 基因序列的连续的50-聚体的阵列杂交。在第三种变体中，如上所述 用末端转移酶给3’OH末端加尾巴，并使用代码序列编码的基因-特 异性的引物，PCR扩增新产生的片段。这允许在通用阵列上检测片段 (图11和12)。
可以使用3种替代方案来产生数十至数百至数千种用于阵列检测 的异双链的DNA片段：(i)在96或384微孔平板中单独地扩增片段， 然后合并；(ii)使用如上所述的因-特异性的/通用的引物，扩增组中 的片段；和(iii)使PCR扩增的对照片段直接与基因组DNA或已经经 历几个扩增循环的基因组DNA杂交。第一种方案的优点是，能控制待 查询的每个区域的PCR扩增片段的数量和质量。第二种方案的优点 是，减少PCR反应的数目，同时仍然产生每个片段的良好产量。
产生异双链的DNA的第三个方案可能具有下述缺陷，即得到随后 产生假信号的来自基因家族成员的杂交。为此原因，用正确基因独有 的内含子区域的引物进行几个PCR扩增循环是有利的，同时识别下述 限制，即PCR扩增会增加产生假背景突变的危险。PCR错误产生对于 基于芯片的检测过高的背景，可以从一个克隆产生过量的正常链。作 为一个替代方案，可以如上所述使用邻近测试基因的独特的限制位点 和连接物捕获方法。可以将第三种方案修改成，包含基因组或cDNA 样品的代表扩增。分开地分析许多代表，以避免家族成员的交叉杂交， 前提是，来自密切相关的基因(即K-ras，H-ras，和N-ras)的家族 成员是在不同的代表中。也可以使用已知会加速DNA杂交的蛋白(如 RecA，ssb，和hnRNP)或试剂(如阳离子去污剂)(Pontius，B.W.，等， Proc Natl Acad Sci USA，88(18)：8237-41(1991)，Pontius，B.W.， 等，Proc Natl Acad Sci USA，87(21)：8403-7(1990)它们在这里整 体引作参考)。
在层叠的基因-特异性的阵列上捕获Endo VPCR扩增产物
第一个方案是基于，通过新产生的3’OH末端，捕获和扩增含有 突变位置的独特DNA。形成异双链的DNA，且使用热稳定的内切核酸 酶V，优先在错配的3′侧一个碱基处切割DNA(图8)。加入热稳定的 连接酶，重新密封在完美匹配区的背景切口。可以在单个步骤中进行 内切核酸酶和连接反应。使用末端转移酶，给新产生的3′OH加尾巴(例 如dGTP)。加入一组含有在3’末端上的2个独特碱基的12种聚dC8 引物(AA，AG，AT，CA，CG，CT，GA，GG，GT，TA，TG，TT)、 独特的识别序列(E1-E12)、和在5’末端上的通用序列(Un1)，并用 Taq DNA聚合酶延伸杂交的引物。使用在3’链上的2个独特碱基， 提供用以聚dC结尾的引物难以实现的在模板上延伸的特异性，以及提 供存在于错配处的特定碱基的记录。使用含有在5’末端的通用序列 (Un2)的基因-特异性的上游引物、磷酸化的Un2引物和荧光地-标记 的Un1引物，使用Taq DNA聚合酶和含有低浓度的dUTP的dNTP， PCR扩增延伸产物。尿嘧啶向PCR产物中的整合，允许使用内切核酸 酶V切割DNA。然后，使用λ外切核酸酶，从5’末端消化切口的PCR 产物。只会剩下5′标记的单链片段，其含有邻近错配位点的约20至50 个碱基的基因-特异性的序列，且包含错配位点。这是产生含有标记 的小片段所必需的，所述标记可以集中在层叠外显子片段长度的连续 互补寡核苷酸(即50-60个碱基长的寡核苷酸)的给定区域。在含有基 因序列层叠的阵列上，杂交标记的片段，以识别近似的错配位点。在 含有互补序列的阵列上，用相反链引物进行单独的方法，以确定互补 链上错配的存在。
该方法可以扩展成包含靶序列的多个区域(即外显子)(图9)。在这 里，可以用末端转移酶给多切口的位点加尾巴，并用含有聚dC的延伸 引物延伸。用含有在5’末端的通用序列(Un2)的多个基因-特异性的 上游引物、磷酸化的Un2引物、和荧光地标记的Un1引物，使用Taq DNA聚合酶和dNTP’s，PCR扩增延伸产物。使用紧挨每个基因- 特异性的引物的上游的阻断寡核苷酸寡核苷酸来确保目标PCR产物是 优势产物。用λ外切核酸酶使PCR产物变成单链，然后在含有基因序 列层叠(即外显子)的阵列上杂交，以鉴别哪个区域(即外显子)含有错 配。
当使用内切核酸酶V来切割DNA时(见图8)，可以有利地使用不 会被Endo V容易地剪切掉的标记报告基团。产生含有20至50个碱基 的标记的单链片段的替代方案不需要在PCR步骤中整合dUTP。它们 包括，用有限量的DNA酶I处理PCR产物，或整合低水平的核糖核 苷酸并用热或碱处理。
通过用基因-特异性的引物和含有独特的E1和Un1序列的引物重 新扩增，个别地对来自PCR产物的含有突变的片段进行测序(其它扩 增使用在Un1序列的3’末端上具有独特的E2-E12序列的引物)。或 者，含有在3’末端上的2个独特碱基的12种聚dC引物的集合可以含 有在5’末端上的12种独特的代码。通过12种代码引物之一(在5’末 端阻断寡核苷酸或未磷酸化)和磷酸化的上游基因-特异性的引物， PCR扩增片段。用Endo V裂解和消化后，使含有基因-特异性的序列 和代码序列的5’片段与层叠阵列杂交。代码序列会提供一个独特的区 域，其可以捕获含有报告基团的互补寡核苷酸。可以用荧光染料、用 独特的量子点(即Q-点)标记报告基团，或用荧光基团和Q-点的组合 来标记，以便可以区分与12种不同的2碱基组合相对应的所有12种 可能的代码序列。鉴别在突变位点的精确2碱基的优点是：(i)在区分 真实突变和背景剪切时提高的信噪比；(ii)提高的区分突变和在邻近的 50个碱基内的普通多态性的能力；和(iii)确定代码序列的能力，以用 于随后的PCR扩增和测序。
可以使用替代性的检测基序，如用氨基-烯丙基脱氧尿苷(Sigma) 标记3’OH末端，随后偶联到单功能NHS-酯Cy3或Cy5上。最近 开发的与微阵列杂交的靶的信号扩增，可以消除对代码-PCR步骤的 需要。这样的商业上可得到的方法包括，靶的生物素化，用抗生物素 蛋白链菌素藻红蛋白(SAPE)染色，用与生物素交联的抗体染色，和第 二种SAPE染色(Affymetrix)，以及3D树枝状聚合物标记系统 (Genisphere)。可以将3D树枝状聚合物标记系统修改成利用独特的代 码序列。也可以用Q-点标记代码补体。这样的Q-点标记可以使用 12种单个的且独特地发荧光的Q-点，或使用更少数量的联合使用的 Q-点，其允许明确区分12种信号的任何组合。还应当指出，在这些 方案中，可以通过整合链终止剂(如双脱氧核苷酸)来实现裂解，使得平 均延伸产物长度(包括代码引物)是约50个碱基。
第二个方案是基于，通过新产生的5’磷酸基末端，捕获和扩增邻 近突变位置的独特DNA(图10)。用Endo V剪切异双链，并用连接酶重 新密封背景切口。可以在单个步骤中进行内切核酸酶和连接反应。随 后，使下游基因-特异性的引物退火和延伸，产生具有新产生的5′磷 酸基的平端。用T4连接酶将含有Un1序列的连接物连接到平端上。使 用含有在5’末端的通用序列(Un2)的基因-特异性的下游引物、磷酸 化的Un2引物和荧光地标记的Un1引物，使用Taq DNA聚合酶和含 有低浓度的dUTP的dNTP，PCR扩增片段。尿嘧啶向PCR产物中的 整合，允许使用内切核酸酶V切割DNA。然后，使用λ外切核酸酶， 从5’末端消化切口的PCR产物。只会剩下5′标记的单链片段，其含 有离错配位点一个碱基的约20至50个碱基的基因-特异性的序列。 在含有基因序列层叠的阵列上，杂交标记的片段，以识别近似的错配 位点。通过上述的替代标记方案，也可以鉴别片段。
引物和互补阵列的第二种集合可以用于检测每个片段的相反链上 的剪切事件。这是确保突变的检测所需要的，特别是当一条链能抗剪 切时，如使用野生型Endo V观察到的约50％位点。
关于扩增新产生的3’OH或5’磷酸基，存在扩增非常短的或几 乎全长片段的风险，所述片段是Endo V在末端附近剪切的结果。通过 使用来自任一个末端的基因-特异性的引物20-60碱基对，可以减少 假信号。另外，可以使用PNA(肽核苷酸类似物)、或2’-o-甲基基 团、和/或含有5-丙炔基-dU和5-丙炔基-dC的寡核苷酸，来阻止 几乎全长链的扩增，后者会产生不希望的扩增子。
在通用代码阵列上捕获Endo VPCR扩增产物
第三个方案是基于，通过新产生的3’OH末端，捕获和扩增含有 突变位置的代码编码的DNA(图11和12)。形成异双链的DNA，并使 用热稳定的内切核酸酶V，优先在错配的3′侧一个碱基处切割DNA。 加入热稳定的连接酶，重新密封在完美匹配区的背景切口。可以在单 个步骤中进行内切核酸酶和连接反应。使用末端转移酶，给新产生的 3′OH加尾巴(例如dGTP)。加入一组含有在3’末端上的2个独特碱基 的12种聚dC引物(AA，AG，AT，CA，CG，CT，GA，GG，GT， TA，TG，TT)、独特的识别序列(E1-E12)、和在5’末端上的通用序 列(Un1)，并用Taq DNA聚合酶延伸杂交的引物。使用在3’链上的2 个独特碱基，提供用以聚dC结尾的引物难以实现的在模板上延伸的特 异性，以及提供存在于错配处的特定碱基的记录。使用含有代码序列 和在5’末端的通用序列(Un2)的基因-特异性的上游引物、磷酸化的 Un2引物和荧光地-标记的Un1引物，使用Taq DNA聚合酶和 dNTP′s，进行PCR扩增。可以得到含有不同代码序列的多种引物，但 是最短的PCR产物可能具有给定的位置优势。然后，使用λ外切核酸 酶，从5’末端消化切口的PCR产物。只会剩下5′标记的单链片段， 其含有邻近错配位点的基因-特异性的序列，且包含错配位点。在含 有代码序列的通用阵列上，杂交标记的片段，以识别近似的错配位点。 用相反链引物进行单独的方法，以确定互补链上错配的存在。
通过用特异性的代码引物和含有独特的E1和Un1序列的引物重新 扩增，个别地对来自PCR产物的含有突变的片段进行测序(其它扩增使 用在Un1序列的3’末端上具有独特的E2-E12序列的引物)。或者， 含有在3’末端上的2个独特碱基的12种聚dC引物的集合可以含有在 5’末端上的12种独特的代码(Q-拉链，隔开在阵列上使用的那些， 且与之相容)。通过12种12Q-拉链引物之一(在5’末端阻断寡核苷 酸或未磷酸化)和含有代码序列和在5’末端的通用序列(Un2)的磷酸化 的上游基因-特异性的引物、磷酸化的Un2引物，PCR扩增片段。用 Endo V裂解和消化后，使含有基因-特异性的序列和代码序列的5’ 片段与通用阵列杂交。Q-拉链序列会提供一个独特的区域，其可以捕 获含有报告基团的互补寡核苷酸。可以用荧光染料、用独特的Q-点 标记报告基团，或用荧光基团和Q-点的组合来标记，以便可以区分 与12种不同的2碱基组合相对应的所有12种可能的Q-拉链序列。鉴 别在突变位点的精确2碱基的优点是：(i)在区分真实突变和背景剪切 时提高的信噪比；(ii)提高的区分突变和在邻近的50个碱基内的普通 多态性的能力；和(iii)确定代码序列的能力，以用于随后的PCR扩增 和测序。
使用阵列格式的一个主要优点是，可以同时记录同一片段的多个 区域。另外，使用多个基因-特异性的引物，允许在有普通的已知的 多态性存在下，记录突变如图12所示。在该实施例中，将含有代码序 列和通用序列(Un2)的基因-特异性的引物设计成覆盖间隔50至100 碱基的重要目标区域。将由PNA(肽核苷酸类似物)、或2’-o-甲基 基团，和/或含有5-丙炔基-dU和5-丙炔基-dC的寡核苷酸组成的 阻断寡核苷酸寡核苷酸设计成紧挨基因-特异性的结合位点的下游杂 交。这会确保，希望的更短的PCR产物占优势。当在靶序列中存在已 知的多态性时，使用含有不同代码序列和相同通用序列(Un2)的等位基 因-特异性的引物。如果样品在给定位置是杂合的(即G，A)，而且含有 附近的下游突变(即G→A)，则会形成下面的16种异双链：(1)G∶C， G∶C；(2)G/T，G∶C；(3)G∶C，G/T；(4)G/T，G/T；(5)G∶C，A/C； (6)G/T，A/C；(7)G∶C，A∶T；(8)G/T，A∶T；(9)A/C，G∶C；(10)A∶T， G∶C；(11)A/C，G/T；(12)A∶T，G/T；(13)A/C，A/C；(14)A∶T，A/C； (15)A/C，A∶T；和(16)A∶T，A∶T。依赖于邻近新突变的碱基，可能难 以记录。但是，如果在上游多态性的位置使用两种等位基因-特异性 的PCR引物，则异双链3，5，12，和14能记录突变的存在。如果突 变存在于G等位基因染色体中，则异双链3和5会记录突变。如果突 变存在于A等位基因染色体中，则异双链12和14会记录突变。如果 突变是在多态性的偏上游，则使用用于记录互补链的引物(即，突变现 在是在多态性的下游)。
当使用多个代码编码的基因-特异性的引物和邻近的阻断基团 时，存在“盲点”(即可能遗漏突变的区域)的风险，因为它是在给定的含 有代码的基因-特异性的引物使用的相同序列内，所以引物不会延伸 该剪切产物。上游代码编码的基因-特异性的引物也可能不起作用， 因为阻断寡核苷酸寡核苷酸仍然会阻断直接邻近阻断寡核苷酸序列的 序列的扩增。通过将待测基因分隔成多个连续区域，解决了该潜在问 题。第一个多重PCR反应会扩增奇数区域中的潜在突变，而第二个多 重PCR反应会扩增偶数区域中的潜在突变。这允许使用会产生可能含 有一些重叠的片段的引物，所以大外显子序列仍然被完全覆盖在PCR 产物的偶数或奇数集合中。多重PCR反应的另外两个集合覆盖了下链 的序列。设计每条链的两个集合，使得每个集合覆盖其它集合的“盲 点”。
尽管已经在本文中详细地描述了优选的实施方案，相关领域的奇 数人员会明白，可以进行多种修改、增加、替代等，而不脱离本发明 的精神，因此认为它们是在下面的权利要求书确定的本发明范围内。
本申请要求享有2004年8月24日提交的美国临时专利申请系列号 60/603,937和2004年8月24日提交的60/603,855的利益，它们在这里 整体引作参考。
在NCI资助号2PO1 CA65930-05下，在国家卫生部的资助下完 成了本发明。美国政府可能具有本发明的某些权利。