技术领域
[0001] 本
发明涉及一种引起广谱中和
抗体的HIV免疫原及其制备的
疫苗，特别涉及一种具有广谱保护作用的新型HIV疫苗。
背景技术
[0002]
艾滋病是全球所面临的最重大挑战之一，严重危害社会进步与经济增长，已造成6000多万人被感染，其中3000万人已经死亡，目前存活的感染者约为3320万，其中90％以上的病例发生在发展中国家。
[0003] 迄今为止，在各国政府与国际组织强有
力的支持下，世界上先后开展了100多个临床试验，但尚未有一个成功上市的艾滋病疫苗。艾滋病疫苗研制困难的一个主要原因是由于艾滋病病毒的特殊性，即HIV-1具有高度的变异性。以往的疫苗所选择的
抗原表位主要是自然感染中的优势抗原表位，而这些抗原表位是HIV-1中变异
频率最高的位点。因此，以这些抗原构建的疫苗诱导出的抗体具有延迟性，无法中和已经发生突变的HIV-1。
[0004] 因此，在艾滋病疫苗研究中所存在的一个重要问题是如何通过保守免疫原设计来诱导具有广谱保护作用的新疫苗。
发明内容
[0005] 为了解决
现有技术中由于HIV变异频率高而导致的抗体无法中和已经突变的HIV的问题，本发明提供了一种HIV免疫原，包括一种分枝肽序列，所述分枝肽序列中至少一个分枝包括HIV的4E10和/或2F5和/或Z13抗原表位序列。4E10、2F5和Z13抗原表位序列分别为目前分离得到的广泛中和抗体4E10抗体、2F5抗体和Z13抗体所识别的抗原表位序列，识别高度保守的HIV-1gp41近膜端外部区(membrane proximal external region，MPER)。不论HIV病毒如何变异，其gp41近膜端外部区MPER基本保持保守，所以针对该区域设计的免疫原产生的抗体能够避免由于病毒的变异导致的无法中和的问题。其中4E10能以较低的浓度中和HIV-1原始病毒株在内22株病毒株的全部亚型病毒，2F5可中和大约67％左右的病毒。同时本发明的免疫原由于具有分枝肽结构，包含多个分枝，分子量较大，能够增强该免疫原的免疫原性，而不需要另外的载体蛋白。本发明中，优选4E10表位序列。
更优选所述分枝肽有3至4个分枝均包括4E10表位序列。
[0006] 在一个实施方式中，本发明所述HIV免疫原的上述分枝肽序列可进一步包括Th细胞表位序列。所述Th细胞表位序列包括PADRE。通过B、T细胞双
信号识别，有助于增强
机体对抗原的免疫应答，并能产生广谱的保护作用。
[0007] 在一个实施方式中，上述HIV免疫原的分枝肽序列也可进一步包括破伤
风毒素830-843序列和/或
口蹄疫病毒200-213序列，以增强其免疫原性。
[0008] 上述HIV免疫原，其中所述分枝肽至少部分分枝被选自乙酰基、酰胺基、烷基羰基和链烯基羰基组成的组中的至少一种修饰基团修饰。优选乙酰基和/或酰胺基。所述烷基羰基可用通式CH3(CH2)nCO-表示，其中n可为1-16中的任意整数，优选10、12、14和16。所述链烯基羰基可用通式R(CH2)mCO-表示，其中R为烯基、二烯基或三烯基，例如，CH3(CH2)m’CH＝CH-、CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CH-、CH3CH2CH＝CHCH2CH＝CHCH2CH＝CH；m和m’可为
1-10中的任意整数，优选7。上述修饰基团可与所述分枝肽的N末端α-
氨基、C末端α-羧基或任一氨基酸的
侧链基团共价连接。优选N末端α-氨基。在所述分枝肽的末端或侧链添加修饰基团以保护所述分枝肽，防止过早被酶解而影响其免疫原性。
[0009] 根据一个实施方式，所述HIV免疫原中所述分枝肽的核心骨架为赖氨酸构成的多分枝核心骨架或利用二硫键构成的多分枝核心骨架。所述分枝肽可包括3-8个分枝。下文中，将所述多分枝核心骨架用MAP表示，分枝数用过跟在MAP之后的数字表示，例如“MAP4”表示的结构为 其分枝上可连接上述的抗原表位、带所述柔性序列和/或修饰基团的抗议表位等。这种多抗原表位肽(multiple antigen peptide，MAP)利用赖氨酸残基构成三到八个
辐射状分枝的多态骨架作为核心，形成较大免疫原分子。抗原表位在这种MAP分子中占有的数目和比例很高，赖氨酸核心分子量小且免疫原性弱的，一般只占分子量的10％以下，因此诱导的免疫反应相对明确而专一。优选本发明的免疫原包括三个赖氨酸组成的骨架和四条分枝，更优选这四条分枝均包括4E10抗原表位，此种结构的免疫原有利于
4E10抗原表位形成与天然结构更加接近的构象，从而引起对天然HIV更加特异性的抗体的产生。
[0010] 上述HIV的4E10和/或2F5抗原表位序列、Th细胞表位序列、以及破伤风毒素830-843序列和/或口蹄疫病毒200-213序列优选分别通过柔性序列与所述分枝肽的核心骨架连接，以增加各条链的
自由度，协助其形成正确的构象。
[0011] 所述柔性序列包括甘氨酸组成的序列、赖氨酸组成的序列、6-氨基己酰基(Ahx)组成的序列或它们的组合。优选KKKK-Ahx。优选地，各抗原表位序列侧翼还可加上其天然存在时的侧翼序列。以4E10为例，可以加上其侧翼序列YI，即NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx。优选其N末端被修饰基团修饰，即乙酰基(Ac)-NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx作为分枝的序列，或酰胺基-NWFDITNWLWYI-KKKK-Ahx作为分枝的序列。
[0012] 本发明优选的HIV免疫原，其中所述核心骨架为三个赖氨酸组成的四分枝骨架，所述抗原表位序列为N末端乙酰基化或酰胺化的4E10抗原表位序列，所述柔性序列为KKKK-6-氨基己酰基，连在4E10抗原表位序列C末端，所述抗原表位序列通过6-氨基己酰基与所述核心骨架相连。
[0013] 本发明还提供了一种HIV疫苗，包括上述任一种免疫原。
[0014] 该HIV疫苗，可进一步包括佐剂，例如包括氢
氧化
铝佐剂、短小棒状杆菌、脂多糖、细胞因子或明矾，或为油佐剂或
水型佐剂。优选油
溶剂。
[0015] 本发明的HIV疫苗可用于肌肉注射、皮下注射、皮内注射、
腹腔注射、口服
给药、
肺部给药、鼻腔给药、
口腔给药、
阴道肛
门给药。本领域技术人员可利用本领域公知的技术对其进行配方，以使其适合相应给药方式。本文中不再赘述。
[0016] 优选本发明的HIV疫苗在初次免疫及加强免疫过程中可采用同种抗原核心表位-辅助T细胞表位，也可以同种抗原核心表位-不同辅助T细胞表位交替进行免疫；并可以同种抗原核心表位的多肽疫苗和病毒疫苗交替免疫。
[0017] 本发明的免疫原和疫苗能够激发机体产生对HIV病毒具有广谱中和活性的抗体，从而克服了现有技术中因为HIV的频繁突变而导致的疫苗产生的抗体无法与突变后的病毒中和的问题。
附图说明
[0018] 图1为本发明优选实施方式的免疫原中辐射状非对称性4分枝肽的结构示意图。
[0019] 图2为本发明优选实施方式的分枝肽以及对照肽与抗体结合的Western blot图。其中左图为
电泳之后
染色的图，右图为经一抗和二抗结合之后显色的图。其中：
[0020] 第1道：
[0021] NK-284E10和2F5双表位线性肽：
[0022] Ac-NEQELLELDKWASLWNWFNITNWLWYIK-NH2
[0023] 第2道：
[0024] Ac-NK-174E10表位四分枝肽：
[0025] Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4
[0026] 第3道：
[0027] Ac-NK-Acp-16第二批次4E10表位四分枝肽：
[0028] Ac-NWFDITNWLWYIKKK-Ahx-MAP4
[0029] 第4道：
[0030] Ac-NK-16-Ahx-3对照四分枝肽：
[0031] Ac-NGSGSGKWEGGPSKKK-Ahx-MAP4
[0032] 第5道：
[0033] Ac-NK-16-Ahx-24E10表位线性肽：
[0034] Ac-NWFDITNWLWYIKKKK-Ahx-OH
[0035] 一抗：B为4E10单克隆抗体
具体实施方式
[0036] 高度保守的HIV-1gp41近膜端外部区被认为是最具潜力的中和抗体设计靶点。目前为止分离得到的七个广泛中和抗体有三个(2F5，4E10和Z13抗体)是识别该区域的，其中4E10能以较低的浓度中和HIV-1原始病毒株在内22株病毒株的全部亚型病毒，2F5可中和大约67％左右的病毒。这三个抗体(2F5，4E10和Z13抗体)所识别的表位分别称为2F5，4E10和Z13表位。具体而言，2F5表位的氨基酸序列包括下列序列：QELLELDKWASLW或其变异序列；4E10表位的氨基酸序列包括下列序列：NWFDITNWLW或NWFNITNWLW或此二者的变异序列；Z13表位的氨基酸序列包括下列序列：WASLWNWFDITN或其变异序列。
[0037] 分枝肽可以以赖氨酸残基构成三到八个辐射状分枝的多态骨架作为核心，通常采用固相合成法合成。抗原表位在分枝肽分子中占有的数目和比例很高，赖氨酸核心分子量小且免疫原性弱，一般只占分子量的10％以下，因此诱导的免疫反应相对明确而专一。并且由于分子量较大，不需要载体蛋白增加抗原表位的免疫原性。
[0038] 下文中结合具体
实施例说明了本发明的优势和技术效果。本发明的保护范围以
权利要求书限定的为准，实施例仅仅是示例性地说明本发明的理念和原则。
[0039] 实施例1
[0040] 抗原表位的设计
[0041] 选取HIV-1gp41MPER上的4E 10和/或2F5识别表位作为抗原表位。合成下列氨基酸序列：
[0042]
[0043]
[0044] 实施例2
[0045] 合成抗原多肽与抗体结合活性表征
[0046] 合成的抗原多肽进行Tricine电泳，以4E10抗体作一抗，AP标记抗人二抗，结果见图2。
[0047] 由图2可见，4E10表位MAP4四分枝肽具有最强的与HIV广谱中和抗体4E10结合的活性，其优于4E10表位线性肽、4E10和2F5双表位线性肽和对照四分枝肽。
[0048] 说明了本发明的免疫原能够形成正确的表位结构，与相应的抗体结合。
[0049] 实施例3
[0050] HIV疫苗的豚鼠免疫实验
[0051] 实验分4组，每组豚鼠8只。组1：弗式佐剂+本发明的免疫原分枝肽(Ac-4E10-Ahx四分枝肽，Ac-NWFDITNWLWYIKKKK-Ahx-MAP4)；组2：水型佐剂(商品名，
专利号)+本发明的免疫原分枝肽(Ac-4E10-Ahx四分枝肽，Ac-NWFDITNWLWYIKKKK-Ahx-MAP4)。
[0052] 豚鼠皮下(四肢)多点注射，初次免疫后每隔15天加强1次，0.5ug/g体重。四次免疫后心脏取血检测针对MPER的抗体产生情况，根据抗体效价进行中和活性评价。结合抗体检测流程：分枝肽包被孔→BSA封闭→待测血清→羊抗豚鼠IgG-HRP→TMB→OD450。血清稀释度1∶30。
[0053] 实验结果
[0054] 针对MPER的抗体产生情况见表1。
[0055] 抗体中和活性评价见表2。
[0056] 表1.本发明的4E10表位MAP4免疫豚鼠抗血清滴度检测
[0057]
[0058] 由表1结果可见，本发明的分枝肽在豚鼠中激发其了有效地较高水平的免疫响应，优于一般的小肽类疫苗，克服了小肽类疫苗容易降解，不易产生免疫应答的
缺陷。
[0059] 另外，用上述免疫产生的血清分别与不同HIV毒株进行中和反应，结果如表2所示。
[0060] 表2.豚鼠抗血清中和评价结果
[0061]
[0062] 由表2的结果可见，本发明的免疫原分枝肽能够与多种变异的HIV毒株发生中和反应，也就是说，能够广谱中和多种HIV变异毒株，包括Clade B，Clade AE和Clade BC，从而达到免疫的作用。
