用于多发性骨髓瘤损害增量和骨质疏松症的可注射生物可降解性骨基质
阅读：662发布：2020-12-05
专利汇可以提供用于多发性骨髓瘤损害增量和骨质疏松症的可注射生物可降解性骨基质专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且描述了骨填充剂组合物、其制造和使用方法以及 治疗 骨质疏松症和癌所致骨缺损的方法。，下面是用于多发性骨髓瘤损害增量和骨质疏松症的可注射生物可降解性骨基质专利的具体信息内容。
1.一种骨填充剂组合物，其包含：
碱土金属磷酸盐基水泥；
纳米管结构物；和
以下至少之一：治疗药或细胞；
其中组合物是固化成硬化团块的糊膏，并且硬化团块能够释放治疗药或细胞。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中纳米管结构物包含肽纳米管。
3.根据权利要求所述的组合物2，其中肽纳米管由Glyn-Aspn肽形成，其中每个n独立地是1至10[SEQ ID NO:3]。
4.根据权利要求2所述的组合物，其中肽纳米管包含肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQ ID NO:2]。
5.根据权利要求2所述的组合物，其中肽纳米管包含选自以下的化合物：N,N'-双(甘氨酰-甘氨酸)-己烷-1,6-双羧酰胺；N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)十八烷-1,18-双羧酰胺；和N,N'-双(甘氨酰甘氨酸)癸烷-1,10-双羧酰胺。
6.根据权利要求2所述的组合物，其中肽纳米管包含离子性互补肽。
7.根据权利要求6所述的组合物，其中离子性互补肽包含双苯基丙氨酸。
8.根据权利要求所述1的组合物，其中纳米管结构物包含碳纳米管。
9.根据权利要求4所述的组合物，其中碳纳米管经羧基官能化或氨基官能化。
10.根据权利要求4所述的组合物，其中碳纳米管是单壁、多壁或超短碳纳米管。
11.根据权利要求4所述的组合物，其中碳纳米管包含羧基官能化多壁碳纳米管。
12.根据权利要求所述1的组合物，其中纳米管结构物包含肽纳米管和碳纳米管的掺混物。
13.根据权利要求所述1的组合物，其中治疗药包含具有式I的结构式的化合物：
其中：
L是两个苯基环之间选自—C≡C—乙炔键、—C═C—乙烯键或C—C—乙烷键的键；
R1和R2各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；
m和n各自独立地是0、1、2、3、4或5，并且m或n至少之一是≧1；并且
R1和R2各自独立地选自：—OH；卤素；其中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基；C1-C6烷基；C2-C6链烯基；C2-C6炔基；和—OR3，其中R3是C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；其中R1和R2的至少一次出现是—OH；
前提是当L是—C═C—时，式I的化合物不是白藜芦醇。
14.根据权利要求9所述的组合物，其中治疗药选自：KST-201、KST-213、KST-301和KST-401。
15.根据权利要求9所述的组合物，其中R1或R2的至少一次出现是—OH，前提是：
(i)当L是—C═C—时，式I的化合物是反式茋并且不是白藜芦醇；
(ii)当L是—C≡C—时，化合物不是KST-201、KST-213、KST-301或KST-401；并且(iii)当L是—C—C—时，化合物不是1-(2,6-二氯-4-羟苯基)-2-苯基乙烷。
16.根据权利要求所述1的组合物，其中治疗药包含负责破骨细胞分化或活化的信号转导的拮抗剂。
17.根据权利要求所述1的组合物，其中治疗药选自双膦酸盐和RANKL抑制剂。
18.根据权利要求1所述的组合物，其中治疗药包括以下一种或多种：阿仑膦酸盐、唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、地诺单抗(Denosumab)、伊班膦酸盐、唑来膦酸和硼替佐米。
19.根据权利要求所述1的组合物，其中治疗药包含具有序列YCWSQYLCY[SEQ ID NO:1]的肽。
20.根据权利要求1所述的组合物，其中治疗药选自：双膦酸盐、雌激素、激素、蛋白酶体抑制剂、促进破骨细胞的细胞因子拮抗剂和植物化学物质。
21.根据权利要求所述1的组合物，其中治疗药选自：阿仑膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、唑来膦酸、雷洛昔芬、地诺单抗、特立帕肽、帕米膦酸二钠、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、盐酸多柔比星脂质体、来那度胺、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺、Salinosporamide A、MG132、英夫单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、依那西普、黄嘌呤衍生物、迷幻剂、异黄酮、木脂素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮、儿茶素、没食子酸表没食子儿茶素(EGCG)、芪、维生素B、维生素D和维生素K。
22.根据权利要求所述1的组合物，其中细胞包括间充质干细胞或衍生自间充质干细胞的成骨细胞。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中成骨细胞囊化于藻酸盐珠中。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中藻酸盐珠包含羧甲基纤维素。
25.根据权利要求所述1的组合物，其中于碱土金属磷酸盐基水泥是选自以下的磷酸钙基水泥：羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)；磷酸四钙(TTCP、Ca4(PO4)2O)、磷酸三钙[α-TCP、α-Ca2(PO4)2和β-TCP、β-Ca3(PO4)2]、无水磷 酸氢钙(DCPA、三斜磷钙石、CaHPO4)、脱水磷酸二钙(DCPD、钙磷石、CaHPO4·2H2O)、和磷酸八钙(OCP、Ca8H2(PO4)6·5H2O)。
26.根据权利要求所述1的组合物，其中碱土金属磷酸盐基水泥包括磷酸镁基水泥。
27.根据权利要求1所述的组合物，其中磷酸钙基水泥基本上由三斜磷钙石组成。
28.根据权利要求所述1的组合物，其中纳米管结构物以范围从约0.1wt％至约
5.0wt％组合物的浓度存在。
29.根据权利要求所述1的组合物，其中纳米管结构物以范围从约0.5wt％至约
2.0wt％组合物的浓度存在。
30.根据权利要求所述1的组合物，其中纳米管结构物以约1wt％组合物的浓度存在。
31.根据权利要求所述1的组合物，其中组合物是可注射糊膏。
32.产生骨填充剂材料的方法，包括：
分化间充质干细胞以产生成骨细胞；
将成骨细胞囊化于藻酸盐珠中；并且
将藻酸盐珠与含有纳米管结构物的碱土金属磷酸盐基水泥组合物混合以产生骨填充剂材料。
33.制备骨填充剂材料复合物的方法，包括：
制备碱土金属磷酸盐基骨水泥粉末；
将粉末与纳米管和预溶解的治疗药混合以形成糊膏；并且
添加囊化的细胞至糊膏以形成复合物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中通过以下方式制备碱土金属磷酸盐基骨水泥粉末：
将氢氧化钙或氢氧化镁与混合包含磷酸的固化溶液以形成糊膏；
用微波照射糊膏以形成团块；并且
将团块破碎成粉末。
35.根据权利要求33所述的方法，其中细胞囊化于藻酸盐珠中。
36.根据权利要求33所述的方法，其中纳米管包含肽纳米管。
37.治疗骨质疏松症的方法，包括：
通过细胞分化过程从患有骨质疏松症的患者采集间充质干细胞；
从间充质干细胞制备成骨细胞；
将成骨细胞并入包含碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管结构物的骨填充剂组合物中；并且
向患者递送骨填充剂组合物以治疗骨质疏松症。
38.治疗多发性骨髓瘤的方法，包括：
将负责破骨细胞分化和/或活化的信号转导的拮抗剂并入包含碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管结构物的骨填充剂组合物中；并且
向有需要的患者递送骨填充剂组合物以治疗多发性骨髓瘤。
39.治疗癌所致骨缺损的方法，包括：
注射根据权利要求1所述的组合物至有需求的受试者的骨缺损中；和
允许组合物固化成硬化团块。
40.根据权利要求39所述的方法，还包括实施骨增量手术的步骤。
41.用于制备骨填充剂组合物的试剂盒，包含：
容纳碱土金属磷酸盐基水泥的第一容器；
容纳纳米管源的第二容器；并且
容纳治疗药或细胞至少之一的第三容器。
42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中试剂盒在独立容器中包含治疗药和细胞。
43.根据权利要求41所述的试剂盒，还包含藻酸盐和多价阳离子源。
44.根据权利要求41所述的试剂盒，还包含设置成注射水泥糊膏的注射器。
用于多发性骨髓瘤损害增量和骨质疏松症的可注射生物可
降解性骨基质
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求根据35U.S.C.§111(b)在2013年3月14日提交的美国临时申请系列号61/783,100的优先权，所述文献的公开内容通过引用的方式完整并入本文。
[0004] 本发明未获得政府资助。美国政府在本发明中不享有权利。
[0006] 本申请含有已经通过电子方式以ASCII格式提交并因而通过引用方式完整并入的序列表。2014年3月12日创建的所述ASCII副本命名为420_54894_Sequence_Listing_D2013-62.txt并且大小为1,289比特。
[0007] 发明背景
[0008] 骨代谢可能受多种医学病症影响。这些病症包括增加骨再吸收性物质的原发性疾病如骨架中的转移性肿瘤。骨损害和骨折也可能是为了治疗原发性病症所给予的治疗药的副作用。例如，乳腺癌或前列腺癌的激素治疗可能诱导骨质疏松症。
[0009] 多发性骨髓瘤是第二最常见的血癌，并且造成骨质疏松破坏。骨质疏松破坏(多发性骨髓瘤患者中的主要并发症)严重影响生活质量。基础性机制是骨再吸收性(破骨细胞)细胞在恶性细胞产生的异常骨髓微环境中连续分解骨组织。目前，通过施加常规PMMA水泥进行治疗，所述水泥仅稳定骨折的椎骨，但不支持或诱导骨再生，并且可能在周围组织中造成损伤，原因在于其惰性和放热特性。此外，通过患者循环系统给予的治疗失衡骨重建过程的当前药物已经导致明显的并发症。因此，本领域需要用于多发性骨髓瘤以及其他癌所致骨病的额外和改进疗法。
[0010] 发明概述
[0012] 在某些实施方案中，纳米管结构物包含肽纳米管。在具体的实施方案中，肽纳米管从Glyn-Aspn肽形成，其中每个n独立地是1至10[SEQ ID NO:3]。在具体的实施方案中，肽纳米管包含肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQ ID NO:2](本文也称作Gly6-Asp2)。在具体的实施方案中，肽纳米管包含选自以下的化合物：N,N'-双(甘氨酰-甘氨酸)-己烷-1,6-双羧酰胺；N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)十八烷-1,18-双羧酰胺；和N,N'-双(甘氨酰甘氨酸)癸烷-1,10-双羧酰胺。在具体的实施方案中，肽纳米管包含离子性互补肽。在一些实施方案中，离子性互补肽包含双苯基丙氨酸。
[0013] 在某些实施方案中，纳米管结构物包含碳纳米管。在具体的实施方案中，碳纳米管经羧基官能化或氨基官能化。在具体的实施方案中，碳纳米管是单壁、多壁或超短碳纳米管。在具体的实施方案中，碳纳米管包含羧基官能化多壁碳纳米管。
[0014] 在某些实施方案中，纳米管结构物包含肽纳米管和碳纳米管的掺混物。
[0015] 在某些实施方案中，治疗药包含具有结构式式I的化合物：
[0016] 式I
[0017] 其中L是两个苯基环之间选自—C≡C—乙炔键、—C═C—乙烯键或C—C—乙1 2
烷键的键；R和R 各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；m和n各自独立地是
1 2
0、1、2、3、4或5，并且m或n至少之一≧1；并且R和R 各自独立地选自：—OH；卤素；其中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基；C1-C6烷基；C2-C6链烯基；C2-C6炔基和—
3 3 1 2
OR，其中R是C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；其中R 和R 的至少一次出现是—OH，前提是当L是—C═C—时，式I的化合物不是白藜芦醇。在具体的实施方案中，治疗药选自4,4'-二羟基二苯乙炔(KST-201)；4-羟-4'-三氟甲基二苯乙炔或4'-羟-4-三氟甲基二苯乙炔(KST-213)；3,4',5-三羟基二苯乙炔或3',4,5'-三羟基二苯乙炔(KST-301)；和
1 2
3,3',5,5'-四氢二苯乙炔(KST-401)。在具体的实施方案中，R或R 的至少一次出现是—OH，前提是(i)当L是—C═C—时，式I的化合物是反式茋并且不是白藜芦醇；(ii)当L是—C≡C—时，化合物不是KST-201、KST-213、KST-301或KST-401；并且(iii)当L是—C—C—时，化合物不是1-(2,6-二氯-4-羟苯基)-2-苯基乙烷。
烷键的键；R和R 各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；m和n各自独立地是
1 2
0、1、2、3、4或5，并且m或n至少之一≧1；并且R和R 各自独立地选自：—OH；卤素；其中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基；C1-C6烷基；C2-C6链烯基；C2-C6炔基和—
3 3 1 2
OR，其中R是C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；其中R 和R 的至少一次出现是—OH，前提是当L是—C═C—时，式I的化合物不是白藜芦醇。在具体的实施方案中，治疗药选自4,4'-二羟基二苯乙炔(KST-201)；4-羟-4'-三氟甲基二苯乙炔或4'-羟-4-三氟甲基二苯乙炔(KST-213)；3,4',5-三羟基二苯乙炔或3',4,5'-三羟基二苯乙炔(KST-301)；和
1 2
3,3',5,5'-四氢二苯乙炔(KST-401)。在具体的实施方案中，R或R 的至少一次出现是—OH，前提是(i)当L是—C═C—时，式I的化合物是反式茋并且不是白藜芦醇；(ii)当L是—C≡C—时，化合物不是KST-201、KST-213、KST-301或KST-401；并且(iii)当L是—C—C—时，化合物不是1-(2,6-二氯-4-羟苯基)-2-苯基乙烷。
[0018] 在某些实施方案中，治疗药包含负责破骨细胞分化或活化的信号转导的拮抗剂。在某些实施方案中，治疗药选自双膦酸盐和RANKL抑制剂。在某些实施方案中，治疗药包括以下一种或多种：阿仑膦酸盐、唑来膦酸盐、帕米膦酸盐、地诺单抗(Denosumab)、伊班膦酸盐、唑来膦酸和硼替佐米。在某些实施方案中，治疗药包含具有序列YCWSQYLCY[SEQ ID NO:1]的肽。在某些实施方案中，治疗药选自：双膦酸盐、雌激素、激素、蛋白酶体抑制剂、促进破骨细胞的细胞因子拮抗剂和植物化学物质。在某些实施方案中，治疗药选自：阿仑膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、唑来膦酸、雷洛昔芬、地诺单抗、特立帕肽、帕米膦酸二钠、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、盐酸多柔比星脂质体、来那度胺、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺、Salinosporamide A、MG132、英夫单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、依那西普、黄嘌呤衍生物、迷幻剂、异黄酮、木脂素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮、儿茶素、没食子酸表没食子儿茶素(EGCG)、芪、维生素B、维生素D和维生素K。
[0020] 在某些实施方案中，碱土金属磷酸盐基水泥是选自以下的磷酸钙基水泥：羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)；磷酸四钙(TTCP、Ca4(PO4)2O)、磷酸三钙[α-TCP、α-Ca2(PO4)2和β-TCP、β-Ca3(PO4)2]、无水磷酸氢钙(DCPA、三斜磷钙石、CaHPO4)、脱水磷酸二钙(DCPD、钙磷石、CaHPO4·2H2O)、和磷酸八钙(OCP、Ca8H2(PO4)6·5H2O)。在某些实施方案中，磷酸钙基水泥基本上由三斜磷钙石组成。在某些实施方案中，碱土金属磷酸盐基水泥包括磷酸镁基水泥。
[0021] 在某些实施方案中，纳米管结构物以范围从约0.1wt％至约5.0wt％组合物的浓度存在。在某些实施方案中，纳米管结构物以范围从约0.5wt％至约2.0wt％组合物的浓度存在。在某些实施方案中，纳米管结构物以约1wt％组合物的浓度存在。在某些实施方案中，组合物是可注射糊膏。
[0022] 本文中进一步提供一种产生骨填充剂材料的方法，所述方法包括步骤：分化间充质干细胞以产生成骨细胞，将成骨细胞囊化于藻酸盐珠中，并且将藻酸盐珠与含有纳米管结构物的碱土金属磷酸盐基水泥组合物混合。
[0023] 本文中进一步提供一种制备骨填充剂材料复合物的方法，所述方法包括步骤：制备碱土金属磷酸盐基骨水泥粉末，将粉末与纳米管和预溶解的治疗药混合以形成糊膏，并添加囊化的细胞至糊膏以形成复合物。在某些实施方案中，通过以下步骤制备碱土金属磷酸盐基骨水泥粉末：将氢氧化钙或氢氧化镁与包含磷酸的固化溶液混合以形成糊膏，用微波照射糊膏以形成团块，并且将团块破碎成粉末。在某些实施方案中，细胞囊化于藻酸盐珠中。在某些实施方案中，纳米管包括肽纳米管。
[0024] 本文中进一步提供一种治疗骨质疏松症的方法，所述方法包括步骤：通过细胞分化方法从具有骨质疏松症的患者采集间充质干细胞；从间充质干细胞制备成骨细胞；将成骨细胞并入包含碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管结构物的骨填充剂组合物中；并且向患者递送骨填充剂组合物以治疗骨质疏松症。
[0025] 本文中进一步提供一种治疗多发性骨髓瘤所致骨病和癌症本身的方法，所述方法包括步骤：将负责破骨细胞分化和/或活化的信号转导的拮抗剂或抑制骨髓瘤肿瘤进展的治疗药掺入包含碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管结构物的骨填充剂组合物的中；并且向有需要的患者递送骨填充剂组合物。
[0026] 本文中进一步提供一种治疗癌所致骨缺损的方法，所述方法包括注射本文所述的组合物有需求的受试者的骨缺损中并且允许该组合物固化成硬化团块。在某些实施方案中，该方法还包括实施骨增量手术。
[0027] 本文中进一步提供一种用于制备骨填充剂组合物的试剂盒，所述试剂盒包含容纳碱土金属磷酸盐基水泥的第一容器、容纳纳米管源的第二容器；和容纳治疗药或细胞的第三容器。在某些实施方案中，试剂盒在独立容器中包含治疗药和细胞。在某些实施方案中，试剂盒还包含藻酸盐和多价阳离子源。在某些实施方案中，试剂盒还包含设置成注射水泥糊膏的注射器。
[0030] 图1：制备和通过骨增量技术递送水泥/纳米管/药物/成骨细胞复合物的示例性图示。
[0031] 图2：通过加载药物的并入成骨细胞的水泥组合物抑制骨吸收和恢复骨形成的示例性图示。
[0032] 图3A-3B：从注射器挤出并就操作特性加以评价的含纳米管的水泥(图3A)和单一水泥(图3B)的照片。这些照片显示当并入碳纳米管时，水泥糊膏的可注射性保留。
[0033] 图4A-4B：碳纳米管的并入改善磷酸钙水泥的机械性能。图4A显示纳米管浓度变动的水泥的压缩强度(MPa)。图4B显示纳米管浓度变动的水泥的杨氏模量。这些图显示用具有1wt％纳米管的水泥实现了最佳机械强度。(DCPA：单独的三斜磷钙石磷酸钙水泥；mCNT：多壁羧基官能化碳纳米管；未处理：无羧基的多壁碳纳米管)。
[0034] 图5A-5D：在磷酸钙水泥(图5A-5B)和磷酸钙水泥/多壁碳纳米管(图5C-5D)上的7日成骨细胞培养物。
[0035] 图6：当加载有抗破骨细胞WP9QY[SEQ ID NO:1]，一种用于这种治疗的潜在候选药物时，其中浸没于前破骨细胞培养物中的水泥可以抑制破骨细胞活化。通过计数用细胞因子TNFα刺激后的TRAP(活跃破骨细胞标志物)阳性细胞，获得数据。
[0036] 图7A-7B：由自装配表面活性剂样肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQ ID NO:2](Glyn-Aspn成员)形成的纳米管的SEM图像。这些图像描述纳米级管状结构的形成。
[0037] 图8：在碳纳米管(MWCNT)/水泥复合材料中加载时药物MG132的药物释放谱。将MG132加入水泥中并留下以释放至细胞培养基持续如所示的某个时间段。这种培养基用来培养指示细胞，随后进行临界染色以显示活细胞。当使用CPC作为药物载体时显示毒性突发释放效应，但是这种突发释放在碳纳米管存在时衰减。
[0038] 图9：碳纳米管存在时药物释放的改善。在水泥上加载后，留下MG132以释放于细胞培养基中持续如所示的某个时间段。将这种培养基添加至用含有NF-kB启动子的萤光素酶报道分子预转染的细胞以测量细胞因子介导对NF-kB活化的抑制作用。结果显示当添加碳纳米管时药物更持久地释放。
[0039] 图10：MG132/MWCNT/CPC复合物阻断破骨细胞分化。
[0040] 图11：当干细胞与表面活性剂样肽Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Asp-Asp[SEQ ID NO:2]形成的纳米管温育1天和3天时，MTT测定法用来测量细胞生存力。未观察到明显细胞毒性，表明这种材料安全用于组织中。
[0041] 图12A-12B：双苯基丙氨酸纳米管结构(图12A)和随CPC一起并入时(图12B)的SEM图像。
[0042] 图13A-13D：在培养物中双苯基丙氨酸纳米管上积累的间充质干细胞，表明它们的生物相容性。
[0043] 图14：显示指示细胞可以在3日培养时间中在双苯基丙氨酸纳米管/CPC复合材料上贴附并增殖的照片。通过MTT检测活细胞。
[0044] 图15：通过测量碱性磷酸酶活性的BCIP/NBT方法测量的在羧甲基纤维素/镁离子/藻酸盐珠中培养的间充质干细胞的成骨细胞分化。
[0045] 根据附图阅读时，本领域技术人员将从以下详细描述显而易见本发明的各种方面。
[0046] 发明详述
[0048] 定义
[0049] 如本文所用的术语“肽”涵盖天然肽(或者降解产物、合成方式合成的肽或重组肽)和肽模拟物(一般，合成方式合成的肽)，以及类肽和类半肽(semipeptoid)，所述类肽和类半肽是肽类似物并且可以具有例如在体内的同时使肽更稳定或更能够渗透入细胞的修饰。这类种修饰包括但不限于：N末端修饰、C末端修饰或肽键修饰。肽键修饰包括但不限于：CH2-NH、CH2-S、CH2-S═O、O═C—NH、CH2-O、CH2-CH2、S═C—NH、CH═CH、CF═CH、主链修饰和残基修饰。用于制备肽模拟化合物的方法是本领域已知的。
[0050] 肽内部的肽键(—CO—NH—)可以例如由以下键取代：N-甲基化键(—N(CH3)-CO—)；酯键(—C(R)H—C—O—O—C(R)—N—)；酮亚甲基键(—CO—CH2-)；
α-氮杂键(—NH—N(R)—CO—)，其中R是任何烷基；卡巴键(—CH2-NH—)；羟乙基键(—CH(OH)—CH2-)；硫代酰胺键(—CS—NH—)；烯属双键(—CH═CH—)；逆酰胺键(—NH—CO—)；和肽衍生物(—N(R)—CH2-CO—)，其中R是“正常”侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可以在沿肽链的任何键处出现并且甚至同时在几种(2-3)键处出现。
α-氮杂键(—NH—N(R)—CO—)，其中R是任何烷基；卡巴键(—CH2-NH—)；羟乙基键(—CH(OH)—CH2-)；硫代酰胺键(—CS—NH—)；烯属双键(—CH═CH—)；逆酰胺键(—NH—CO—)；和肽衍生物(—N(R)—CH2-CO—)，其中R是“正常”侧链，天然存在于碳原子上。这些修饰可以在沿肽链的任何键处出现并且甚至同时在几种(2-3)键处出现。
[0051] 天然芳族氨基酸，Trp、Tyr和Phe，可以置换为合成性非天然酸如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(NaI)、Phe的环甲基化衍生物、Phe的卤代衍生物、O-甲基-Tyr和β氨基酸。
[0052] 除以上之外，本文所述的肽还可以包含一个或多个修饰的氨基酸(例如，巯基化氨基酸或生物素酰化氨基酸)，或一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复杂糖等)。还构思同二肽(homodipeptide)，如其中每个氨基酸均包含芳族部分的芳族同二肽。这些同二肽包括但不限于取代或未取代的萘基和取代或未取代的苯基。芳族部分可以备选地是取代或未取代的杂芳基，例如吲哚、噻吩、咪唑、 唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉、喹唑啉、喹 啉或嘌呤。当取代时，苯基、萘基或任何其他芳族部分，包含一个或多个取代基，如但不限于：烷基、三卤代烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、硝基、偶氮、羟基、烷氧基、硫氢基、硫代烷氧基、氰基和胺。
[0053] 如本文所用，术语“烷基”指包含直链和支链基团的饱和脂族烃。优选地，烷基具有1至20个碳原子。烷基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基可以例如是三卤代烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、硝基、偶氮、羟基、烷氧基、硫氢基、硫代烷氧基、氰基或胺。
[0054] 如本文所用，“环烷基”指全碳单环基团或稠环(即，共有一对毗邻碳原子的环)基团，其中一个或多个环不具有完全共轭的π-电子体系。环烷基的例子包括，而不限于环丙烷、环丁烷、环戊烷、环戊烯、环己烷、环己二烯、环庚烷、环庚三烯和金刚烷。环烷基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基可以例如是烷基、三卤代烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、硝基、偶氮、羟基、烷氧基、硫氢基、硫代烷氧基、氰基或胺。
[0055] 如本文所用，“烯基”指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳双键组成的烷基。
[0056] 如本文所用，“炔基”指由至少两个碳原子和至少一个碳-碳参键组成的烷基。
[0057] 如本文所用，“芳基”指具有完全共轭的π-电子体系的全碳单环基团或稠环多环(即，共有毗邻成对碳原子的环)基团。芳基的例子包括，而不限于苯基、萘基和蒽基。芳基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基可以例如是烷基、三卤代烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、硝基、偶氮、羟基、烷氧基、硫氢基、硫代烷氧基、氰基或胺。
[0058] 如本文所用，“杂芳基”指单环基团或稠环(即，共有一对毗邻原子的环)基团，所述基团在环中具有一个或多个原子，如，例如，氮、氧或硫并且此外具有完全共轭的π-电子体系。杂芳基的例子包括，而不限于吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、 唑、噻唑、吡唑、吡啶、嘧啶、喹啉、异喹啉和嘌呤。杂芳基可以是取代或未取代的。当取代时，取代基可以例如是烷基、三卤代烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、硝基、偶氮、羟基、烷氧基、硫氢基、硫代烷氧基、氰基或胺。
[0059] 如本文所用，“杂脂环”基指在环中具有一个或多个原子如氮、氧和硫的单环基团或稠环基团。环还可以具有一个或多个双键。然而，环不具有完全共轭的π-电子体系。杂脂环基可以是取代或未取代的。当取代时，取代的基团可以例如是孤对电子、烷基、三卤代烷基、链烯基、炔基、环烷基、芳基、杂芳基、杂脂环、卤素、硝基、偶氮、羟基、烷氧基、硫氢基、硫代烷氧基、氰基或胺。代表性例子包括哌啶、哌嗪、四氢呋喃、四氢吡喃、吗啉等。
[0060] “羟基”指—OH基团。
[0061] “叠氮基”指—N═N≡N基团。
[0062] “烷氧基”指如本文定义的—O-烷基和—O-环烷基。
[0063] “芳氧基”基指如本文定义的—O-芳基和—O-杂芳基。
[0064] “硫氢基”指—SH基团。
[0065] “硫代烷氧基”指如本文定义的—S-烷基和—S-环烷基。
[0066] “芳氧基氧基”指如本文定义的—S-芳基和—S-杂芳基。
[0067] “卤基”指氟、氯、溴或碘。
[0068] “三卤代烷基”指如本文定义的由三个卤基取代的烷基。代表性例子是三卤甲基。
[0069] “氨基”指其中R’和R”各自独立是氢、烷基、环烷基或芳基的—NR’R”基团。
[0070] “硝基”指—NO2基团。
[0071] “氰基”基指—C≡N基团。
[0072] 如本文所用的首字母缩略词“CPC”指磷酸钙基水泥组合物。如本文所用的首字母缩略词“MPC”指磷酸镁基水泥组合物。
[0073] 总体描述
[0074] 癌所致骨缺损的常规治疗，如在脊椎骨折处施加PMMA骨水泥，不支持或诱导新骨生长。在固化的同时，PMMA释放热，在周围组织中造成损伤。此外，这种材料的惰性特性可能阻碍向椎间盘供应养分。PMMA仅稳定骨折的椎骨并且因此，就长期而言不符合患者最佳利益。在多发性骨髓瘤骨髓的情况下，因为过多的破骨细胞活化性细胞因子持续产生，骨遭受溶骨性分解。与此同时，这些细胞因子的某些还可能抑制成骨细胞介导的骨形成。因此，多发性骨髓瘤的总体影响是维持有利于骨吸收的环境。因此，治疗这类缺损的理想方法应当通过引入抗骨质溶解治疗药，靶向骨重建过程的两端，以抑制骨质疏松症并供应活跃成骨细胞以恢复骨形成。
[0075] 本文描述了一种含有纳米管状结构的生物可降解性碱土金属磷酸盐基组合物，所述组合物能够携带并持续释放药物和/或细胞如成骨细胞。该组合物可以用于多种医学应用，如，但不限于脊柱手术以治疗骨质疏松损害或骨折，并且用于治疗癌所致骨缺损如多发性骨髓瘤损害。该组合物包含可注射的骨填充剂材料，所述骨填充剂材料与骨形成(成骨细胞)细胞生物相容，并且可以携带局部施用以抑制骨吸收的治疗药。这缓和了伴随用于治疗骨缺损如多发性骨髓瘤所致骨折的骨增量方法的现有许多问题。
[0076] 骨填充剂材料包含与纳米管或纳米级圆柱体混合的碱土金属磷酸盐基水泥。可以将这种复合物连同治疗药如破骨细胞拮抗剂和藻酸盐囊化的成骨细胞制备为用于执行骨增量术的可注射糊膏。作为一个非限制性例子，磷酸钙基水泥，如三斜磷钙石水泥，是PMMA的理想替代物，因为它是生物可降解的，骨引导的和固化时最吸热最少的。当随纳米管一起并入时，水泥保留与骨增量手术中所用的常规材料相当的合适机械特性和操作特性。在受损骨的空穴中注射并固化时，这种组合充当支架，从而允许形成骨的成骨细胞(在组合物中存在时)贴附并生长，同时稳定骨折的部位。在注射后，粘固在骨折部位剂固化，提供承载以稳定受损的椎骨。纳米管强化水泥支架，改善其操作特性并增加其药物递送能力。该组合物可以包含一种或多种治疗药如骨质溶解剂和/或介导骨生成的细胞的任何组合，以便从硬化的水泥团块递送。
[0077] 总体上，该组合物显示出保护骨组织免受多发性骨髓瘤所致或其他疾病所致损伤的协同效应。该组合物是可注射的，并且充当骨增量手术的负载支架。试验已经显示组合物具有与PMMA相当的机械特性和操作特性，并且是骨引导的，生物可降解的并且比PMMA放热更少。该组合物可用于许多应用，如，但不限于，与骨增量手术结合以治疗癌所致骨病。
[0078] 水泥组分
[0079] 可以在骨填充剂材料中使用许多碱土金属磷酸盐基水泥，如磷酸钙基水泥、磷酸镁基水泥和磷酸锶基水泥。合适的磷酸钙基水泥包括CaO-P2O5(Ca-P)双元系统内部的任何化合物，如但不限于：羟基磷灰石(Ca10(PO4)6(OH)2)；磷酸四钙(TTCP、Ca4(PO4)2O)、磷酸三钙[α-TCP、α-Ca2(PO4)2和β-TCP、β-Ca3(PO4)2]、无水磷酸氢钙(DCPA、三斜磷钙石、CaHPO4)、脱水磷酸二钙(DCPD、钙磷石、CaHPO4·2H2O)和磷酸八钙(OCP、Ca8H2(PO4)6·5H2O)。尽管出于解释性目在本说明书的各种部分中描述了磷酸钙基水泥，应当理解其他碱土金属磷酸盐基水泥，如磷酸镁基水泥，可以按相同方式利用。
[0080] 适用于本文中的碱土金属磷酸盐基水泥包括在被允许固化成硬化团块之前通过微波照射的水泥组合物。可选地，可以允许糊膏在不照射的情况下固化。在一个非限制性例子中，通过以下方式制备水泥组合物：将氢氧化钙或氢氧化镁与磷酸固化溶液、一水合柠檬酸、碳酸氢钠和去离子水混合，从而形成随后被微波照射以产生团块的糊膏，随后将所述团块碾碎成细粉末并且与水或纳米二氧化硅溶胶混合以制备水泥糊膏。
[0081] 当碱土金属磷酸盐基水泥是磷酸钙时，充当支架的磷酸钙基水泥在骨增量手术的负载中发挥重要作用。其机械特性和操作特性已经证明与PMMA相当。其他试验已经显示这种材料吸热最少、是骨引导的并且是生物可降解的。此外，还已经证实其药物携带能力。
[0082] 纳米管结构物
[0083] 可以将纳米管结构物并入水泥组合物以改善其强度、韧性、延性、抗疲劳性和大孔性。另外，并入纳米管改善磷酸钙水泥上所加载药物的突发释放问题。用于水泥组合物的合适纳米管结构物包括但不限于各种类型的碳纳米管、各种类型的肽纳米管及其组合。
[0084] 碳纳米管是具有独特机械特性和化学特性的圆柱结构。碳纳米管可以用来形成骨细胞增殖的支架，并且可以官能化以充当治疗药的载体。适用于本公开的水泥组合物中的碳纳米管类型包括但不限于羧基官能化或氨基官能化单壁(SWNT)、多壁(MWNT)和超短碳纳米管。SWNT是长程包裹的石墨烯片，并且MWNT通常是一组具有不同直径的同心SWNT。SWNT一般具有约1,000的长径比，并且本身视为几乎是一维的。这些纳米管由具有不同物理和化学特性的两个独立区域组成。第一区域是管的侧壁并且第二区域是管的端盖。端盖帽结构类似于较小的富勒烯，如C60。
[0085] 自装配肽，一组自发形成纳米结构的肽，显示出可用于生物医学应用中的生物化学活性。因为它们具有中空芯部、内部空穴、对生物分子的高亲和力、囊化效应、经管可扩散特性、可控降解速率和高度有序的排列，肽纳米管可以用于药物递送、再生医学、组织工程中的支架制造、抗微生物包衣和医学诊断。另外，肽纳米管容易进行化学修饰。纳米管中氨基酸的存在提供了与生命体系相互作用的生物活性位点。合适的肽纳米管包括但不限于：表面活性剂样分子；二肽；bola两亲分子(离子性互补肽)；堆叠的D-、L-肽亚单位；及其组合。
[0086] 肽纳米管的一个非限制性例子由含有甘氨酸疏水尾部和天冬氨酸亲水头部的肽形成。这些表面活性剂样肽可以因尾-头结构而自装配以形成肽纳米管。甘氨酸是最简单的氨基酸，不过是大部分蛋白质的重要结构单元。它仅具有一个氢，因而它非常稳定并且将不转化成其他氨基酸。天冬氨酸具有羧基并且是带电荷的，从而极性头部和甘氨酸尾部的相互作用导致强肽纳米管的自装配。通过相对简单的合成程序实现这两种氨基酸的组合。它提供优异的生物相容性以及机械与化学稳定性。此外，可以轻易地操控甘氨酸残基和天冬氨酸残基的数目以控制肽纳米管的降解速率。不希望受理论约束，认为圆柱亚单位从自装配成双层的表面活性肽形成，其中亲水头部基团保持暴露于水介质。管状阵列通过在表面活性剂和胶束结构中和形成过程中广泛存在的非共价相互作用发生自装配。在某些实施方案中，这些肽纳米管由7-8个残基组成并且当充分展开时长大约2nm，使得它们在二维上类似于细胞膜中存在的磷脂。
[0087] 肽纳米管的其他非限制性例子是通过二肽和bola两亲分子自装配形成的那些。二肽含有由单个肽键连接的两个氨基酸，或具有两个肽键和其他官能团如双苯基丙氨酸中苯基的一个氨基酸。bola两亲分子在疏水性烷基接头的两个末端上具有两个亲水肽和修饰的氨基酸，它们通过离子互补性形成纳米管。
[0088] 其他肽基纳米管结构物可以用于组合物中。例如，可以通过环状D-、L-肽亚单位的堆叠，产生肽基纳米管。这些肽通过氢键相互作用自装配成纳米通道，所述纳米通道转而自装配成纳米管的有序平行阵列。作为另一个例子，肽基N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)己烷-1,6-双羧酰胺分子装配成管状结构。
[0089] 可以成型为肽纳米管的化合物的一些非限制性例子包括但不限于：N,N'-双(甘氨酰-甘氨酸)-己烷-1,6-双羧酰胺；N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)十八烷-1,18-双羧酰胺；N,N'-双(甘氨酰甘氨酸)癸烷-1,10-双羧酰胺；及其组合。在某些实施方案中，肽纳米管由表面活性剂样分子生成，如，但不限于，合成性Glyn-Aspn肽，其中每个n独立地是任何整数。在具体的实施方案中，n是1至10。在某些实施方案中，肽纳米管包含离子性互补肽，如，但不限于双苯基丙氨酸。熟练执业者会认识到，上述化合物出于示例性目的给出，并且许多其他类型的肽纳米管是可能的并且涵盖于本公开范围内。
[0090] 碳纳米管和/或肽纳米管的恰当掺合可以增强水泥的机械特性并增加其携带生物分子或药物的能力。因此，本文所述的组合物的某些实施方案包括碳纳米管和肽纳米管的掺混物。当水泥糊膏在注射前中制备时，可以直接添加适宜量的纳米管。纳米管的浓度可以是组合物的约0.1wt％至约5wt％。在某些实施方案中，纳米管的浓度是约0.5wt％至约2wt％。在某些实施方案中，纳米管的浓度是约1wt％。
[0091] 治疗药
[0092] 本公开的组合物可以携带广泛类型的治疗药。合适的治疗药包括但不限于：用于治疗失衡骨代谢的抗再吸收药物如双膦酸盐(阿仑膦酸盐、阿仑膦酸盐、伊班膦酸盐、唑来膦酸等)、雌激素、激素、雷洛昔芬和地诺单抗(denosumab)；用于治疗失衡骨代谢的同化类药物如特立帕肽等；用于治疗多发性骨髓瘤和其他浆细胞瘤的药物如帕米膦酸二钠、硼替佐米、卡非佐米、环磷酰胺、盐酸多柔比星脂质体、来那度胺、普乐沙福(plerixafor)、泊马度胺等；蛋白酶体抑制剂如Salinosporamide A、MG132等；促进破骨细胞的细胞因子拮抗剂如英夫单抗(infliximab)、阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、戈利木单抗(golimumab)、依那西普、黄嘌呤衍生物、迷幻剂和小肽WP9QY[SEQ ID NO:1]；植物化学物质如异黄酮、木脂素、黄酮、黄烷醇、黄酮醇、黄烷酮、儿茶素、没食子酸表没食子儿茶素(EGCG)和芪；或维生素B、D、K等。另外，治疗药可以是式I的化合物：
[0093] 式I
[0094] 其中L代表两个苯基环之间选自—C≡C—乙炔键、—C═C—乙烯键或C—C—乙烷键的键；R1和R2各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；m和n各自独立地是0、1、2、3、4或5，代表分别代表该环的R1和R2取代基的数目，并且m或n至少之一≧1；其中R1和/或R2是：—OH、卤素、其中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基、C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基、—OR3，其中R3是C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；
并且R1和R2的至少一次出现是—OH，条件是当L是—C═C—时，式I的化合物不是白藜芦醇(否则称作3,5,4’-三羟基-反式茋)。
并且R1和R2的至少一次出现是—OH，条件是当L是—C═C—时，式I的化合物不是白藜芦醇(否则称作3,5,4’-三羟基-反式茋)。
[0095] 式I的化合物包括KST201，其具有式II的结构式：
[0096] 式II
[0097] 式I的化合物还包括KST-213，其具有式III的结构式：
[0098] 式III
[0099] 式I的化合物还包括KST-301，其具有式IV的结构式：
[0100] 式IV
[0101] 式I的化合物还包括KST-401，其具有式V的结构式：
[0102] 式V
[0103] 合适的治疗药还包括式I的化合物：
[0104] 式I
[0105] 其中：L代表两个苯基环之间选自—C≡C—乙炔键、—C═C—乙烯键或C—C—1 2
乙烷键的键；R和R 各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；m和n各自独立
1 2
地是0、1、2、3、4或5，分别代表该环的R和R 取代基的数目，并且m或n至少之一≧1；并
1 2
且R和/或R 是：—OH、卤素、其中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基、C1-C6
3 3
烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基、—OR ，其中R是C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；
1 2
其中R和R 的至少一次出现是—OH，条件是(i)当L是—C═C—时，式I的化合物是反式茋并且不是白藜芦醇(3,5,4’-三羟基-反式茋)；(ii)当L是—C≡C—时，该化合物不是KST-201、KST-213、KST-301或KST-401；并且(iii)当L是—C—C—时，该化合物不是1-(2,6-二氯-4-羟苯基)-2-苯基乙烷。
乙烷键的键；R和R 各自独立地是在苯基环的任何可用位置处的取代基；m和n各自独立
1 2
地是0、1、2、3、4或5，分别代表该环的R和R 取代基的数目，并且m或n至少之一≧1；并
1 2
且R和/或R 是：—OH、卤素、其中一个C原子用1至3个卤原子置换的卤代烷基、C1-C6
3 3
烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基、—OR ，其中R是C1-C6烷基、C2-C6链烯基或C2-C6炔基；
1 2
其中R和R 的至少一次出现是—OH，条件是(i)当L是—C═C—时，式I的化合物是反式茋并且不是白藜芦醇(3,5,4’-三羟基-反式茋)；(ii)当L是—C≡C—时，该化合物不是KST-201、KST-213、KST-301或KST-401；并且(iii)当L是—C—C—时，该化合物不是1-(2,6-二氯-4-羟苯基)-2-苯基乙烷。
[0106] 通过非限制性例子方式，水泥可以携带针对促进骨质溶解的信号途径的抑制剂。这些小分子可以在骨折部位浓缩并局部递送以与它们的靶直接相互作用，所述靶存在于骨髓瘤细胞、破骨细胞和骨髓内的其他细胞中存在或由其分泌并且是不平衡骨重建的原因。
在其中细胞是自体间充质干细胞衍生的成骨细胞的实施方案中，抗骨质溶解药物可以通过与成骨细胞协同发挥作用以增强骨再生，加速骨形成过程。
在其中细胞是自体间充质干细胞衍生的成骨细胞的实施方案中，抗骨质溶解药物可以通过与成骨细胞协同发挥作用以增强骨再生，加速骨形成过程。
[0107] 组合物中治疗药的另一个非限制性例子是设计成治疗骨质疏松症的一种治疗药。为了通过阻断骨吸收抑制骨质疏松症，负责破骨细胞分化和活化的信号转导的拮抗剂，其可以是小分子化合物、肽或蛋白质，可以加载于碱土金属磷酸盐基水泥/纳米管复合材料中。该拮抗剂随后可以局部而非借助循环递送到治疗部位，这是高度有利的。可以用于这个目的的合适抗破骨细胞药物包括但不限于：双膦酸盐，如阿仑膦酸盐、唑来膦酸盐、伊班膦酸盐、帕米膦酸盐和唑来膦酸；RANKL抑制剂，如地诺单抗(denosumab)；和蛋白酶体抑制剂，如硼替佐米。
[0108] 在本文所述的例子中，使用WP9QY[SEQ ID NO:1]和MG132作为组合物中的模型治疗药。基于结构性分析TNF受体1和RANK的配体结合位点，开发WP9QY[SEQ ID NO:1]以抑制由这两种受体介导的活化破骨细胞的信号途径。MG132是一种蛋白酶体抑制剂，所述蛋白酶体抑制剂用来打断NF-kB的抑制剂降解以阻止NF-kB的激活及其诱导负责破骨细胞生成的基因表达的活性和溶骨性活性。作为非限制性例子，并入组合物中的治疗药还可以靶向骨髓瘤细胞以诱导细胞死亡或抑制肿瘤进展，再次直接而非借助循环施用至治疗位置。
[0109] 因为骨填充剂材料不限于用于治疗癌所致骨病，所以根据所需的治疗效果，许多其他治疗药可以并入组合物中。用于骨填充剂材料中的合适治疗药包括但不限于：抗破骨细胞剂、肽、蛋白质、核酸、抗生素、抗微生物药、抗真菌药、防腐剂、抗病毒药、抗寄生虫药、抗原虫药、伤口愈合药、局部麻醉药、粘液分解药、抗过敏药、抗氧化剂、维生素、甾体和非甾体抗炎药、抗组胺药、化疗药、肿瘤生长抑制药、细胞抑制药及其组合。任何治疗药可以按所需的剂量直接添加至水泥糊膏。
[0110] 细胞
[0111] 为了进一步恢复骨形成能力以修复损伤，可以将细胞如间充质干细胞或成骨细胞并入骨填充剂材料中并随碱土金属磷酸盐基水泥/纳米管组合物(其还可以包括一种或多种治疗药)一起植入。成骨细胞细胞可以在体外从间充质干细胞制备，所述间充质干细胞通过采用恰当生长因子的细胞分化方法从患者采集。用来制备成骨细胞的间充质干细胞源可以是自体的或同种异型的。这些细胞是当暴露于恰当生长因子时可以分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的多能间质细胞。通过非限制性举例方式，ficoll纯化方法可以用来从收获自供体或患者的骨髓分离单核细胞，随后进行细胞培养以获得间充质细胞集落。当伴随BMP-2培养时，这些干细胞可以分化为成骨细胞。
[0112] 藻酸盐珠用于骨增量过程期间随水泥一起递送细胞时保护细胞。藻酸盐的生物相2+ 2+
容性和采用二价阳离子如Ca 或Mg 时简单凝胶化，使其适于细胞固定化和囊化。通过二价阳离子交联实现藻酸盐的凝胶化以囊化待携带的细胞。与水泥糊膏混合时，细胞/藻酸盐珠保留它们的结构，提供三维基质以便细胞在硬化的水泥内部增殖。可以通过添加二价阳离子、本文所述的任何纳米管和作为促进成骨细胞分化的阳性离子或其他化合物的储器发挥作用的羧甲基纤维素，制备由藻酸盐组成的这种细胞囊化系统。因此，本文所述的任何组合物可以包含囊化于藻酸盐珠中的成骨细胞。作为在藻酸盐中囊化细胞以便递送的方法的一个非限制性例子，成骨细胞可以重悬于2％海藻酸钠盐溶液中。可以通过向2％氯化钙逐滴添加悬液产生藻酸盐/细胞珠。这些珠随后可以随水泥糊膏一起注射。
容性和采用二价阳离子如Ca 或Mg 时简单凝胶化，使其适于细胞固定化和囊化。通过二价阳离子交联实现藻酸盐的凝胶化以囊化待携带的细胞。与水泥糊膏混合时，细胞/藻酸盐珠保留它们的结构，提供三维基质以便细胞在硬化的水泥内部增殖。可以通过添加二价阳离子、本文所述的任何纳米管和作为促进成骨细胞分化的阳性离子或其他化合物的储器发挥作用的羧甲基纤维素，制备由藻酸盐组成的这种细胞囊化系统。因此，本文所述的任何组合物可以包含囊化于藻酸盐珠中的成骨细胞。作为在藻酸盐中囊化细胞以便递送的方法的一个非限制性例子，成骨细胞可以重悬于2％海藻酸钠盐溶液中。可以通过向2％氯化钙逐滴添加悬液产生藻酸盐/细胞珠。这些珠随后可以随水泥糊膏一起注射。
[0113] 虽然出于解释性目的描述了成骨细胞，但是取决于所需的治疗或治疗作用，其他细胞可以并入组合物中。其他合适类型的细胞包括但不限于软骨细胞、脂肪细胞、间质细胞、未分化的间充质干细胞和用治疗药和/或核酸转染的细胞。
[0114] 添加物
[0115] 除水泥组分、纳米管、治疗药和细胞之外，可以在骨填充剂组合物中包含多种添加物以调节其特性。合适添加物的例子包括但不限于：蛋白质、骨诱导性和/或骨引导性材料、X射线造影剂如磷酸锶或氧化锶、支撑性或增强性填料物质、晶体生长调节剂、粘度调节剂、孔形成剂、抗生素、防腐剂、生长因子、化疗药、骨吸收抑制剂、变色剂(color change agent)、浸液、羧化物、羧酸、α-羟基酸、金属离子或其混合物。其他合适的添加物包括调节水泥固化时间的物质(如焦磷酸盐或硫酸盐)，增加可注射性或粘附作用(如疏水聚合物如胶原蛋白)、改变溶胀时间或引入大孔性(如致孔剂)。
[0116] 使用方法
[0117] 图1显示制备和使用骨填充剂组合物的非限制性例子。如图1中所见，在一个实施方案中，将抗破骨细胞药物连同成骨细胞一起添加至碱土金属磷酸盐基水泥和纳米管的混合物。随后将这种混合物在非侵入性骨增量术期间注入多发性骨髓瘤所致的脊椎骨折。一旦注射，水泥硬化以提供负载，目的在于稳定椎骨。形成骨的成骨细胞贴附并生长，同时稳定骨折的部位。纳米管强化固化的支架并允许从水泥混合物增加药物递送。
[0118] 本公开的组合物提供有前景的溶液剂用于癌所致骨病，如，但不限于多发性骨髓瘤所致骨病。靶向这种失衡衡骨重建过程的当前药物的重要缺点涉及因借助循环系统施用治疗药所致的副作用。与非侵入性骨增量技术(如后凸成形术或椎体成形术)组合，本公开的植入物作为可以向疾病部位递送治疗药的载具发挥作用。因为它是高度局限化的，所以可以精确地操纵治疗的有效浓度。
[0119] 本文所述的组合物特别可用于治疗癌所致骨缺损和骨质疏松症。这些治疗通常包括递送具有碱土金属磷酸盐基水泥、纳米管、抗破骨细胞药物和干细胞衍生性成骨细胞的骨填充剂组合物，所述骨填充剂组合物可以单独或与骨增量手术组合递送。在某些实施方案中，组合物通过协同效应保护骨组织免于多发性骨髓瘤所致的损伤，所述协同效应由各组分的特定组合整体上协调。每种组分本身可用于骨修复，但是这些跨学科材料和方法的组合提供超越各种组分的各种益处。
[0120] 在多发性骨髓瘤所致骨破坏的情况下，成骨细胞和破骨细胞介导的骨重建过程的调节作用失衡是基础性机制。骨髓瘤细胞通过与骨髓间质细胞互作用定位至骨髓。这种结合作用激活骨髓间质细胞中的核因子(NF)-kB依赖性基因表达，这导致分泌多种细胞因子，包括肿瘤坏死因子(TNF)α和白介素-6，以及分泌通过几个信号传导级联诱导骨髓瘤细胞增殖和抑制凋亡的黏附分子。负责诱导破骨细胞再吸收作用的主要机制之一涉及破骨细胞表达的NF-kB受体激活物(RANK)与其诱导破骨细胞从破骨细胞祖细胞分化的同族配体RANKL(骨髓间质细胞分泌的细胞因子)结合。TNFα还不仅可以促进骨髓瘤细胞存活和增殖，还通过与RANKL/RANK无关的机制在破骨细胞分化中发挥作用。因此，已经报道抑制破骨细胞分化/激活、促进成骨细胞分化/活化、和/或抑制肿瘤进展的药物和补充物可以与水泥/纳米管组合物组合使用以治疗癌所致骨病。这些包括但不限于，抗再吸收药物和同化类药物，多发性骨髓瘤或其他肿瘤的抗癌药如靶向NF-kB的蛋白酶体抑制剂、促进破骨细胞的细胞因子拮抗剂，或已经显示改进骨健康的植物化学物质和维生素。
[0121] 本公开的负载/药物递送系统可以实现治疗药局限于骨损伤部位以避免对其他组织的出乎意料的副作用。如2图中所示，如本文所述的加载药物的并入成骨细胞的磷酸钙基组合物可以抑制骨吸收并恢复骨形成。尽管本文中出于示例性目的描述了骨质疏松症和多发性骨髓瘤，应当理解本文所述的组合物和方法可以用于治疗广泛类型的疾病或病症。本文所述的组合物可以与任何非侵入性骨增量手术，如，但不限于椎体成形术或后凸成形术组合。
[0122] 本公开的实施方案还包括确定承保或拒保包括本文所述组合物和方法的疾病或损伤疗法的健康保险报销和/或支付的方法。在某些实施方案中，治疗包括使用包含碱土金属磷酸盐基水泥、纳米管、治疗药和成骨细胞的骨填充剂材料，并且健康保险的提供商否决该治疗的承保或报销。
[0123] 试剂盒
[0124] 进一步构思本文所述的组合物和方法可以体现为单个试剂盒或多个试剂盒的组成部分。这种试剂盒的非限制性例子包括在独立容器中的碱土金属磷酸盐基水泥、纳米管源和治疗药，其中容器可以或可以不按联合构造方式存在。许多其他试剂盒是可能的，如试剂盒还包括干细胞或衍生自干细胞的成骨细胞，试剂盒还包设置成注射水泥糊膏的注射器，或试剂盒还包括藻酸盐和多价阳离子源。试剂盒还可以包括使用试剂盒的组分以实施主题方法的说明书。实施主题方法说明书通常记录在合适的记录介质上。例如，说明书可以在试剂盒中作为包装插页存在或在试剂盒的容器的标签中或其部件中存在。在其他实施方案中，说明书作为电子储存数据文件存在，所述电子储存数据文件存在于合适的计算机可读取存储介质上，如闪盘驱动器、CD-ROM或磁盘盒。在其他实施方案中，实际说明书不存在于试剂盒中，但是提供从远程数据源(如通过互联网)获得说明书的手段。这个实施方案的例子是包含其中可以浏览和/或从中可以下载说明书的网址的试剂盒。与说明书一样，这种用于获得说明书的手段记录在合适的基材上。实施例
[0125] 含碳纳米管的CPC组合物的制备
[0126] 通过使用玛瑙研杵在玛瑙研钵中将Ca(OH)2与固化溶液和去离子水手工混合，制备水泥糊膏。为了制备15mL固化溶液，分别混入0.0032g一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O，100％)、6g碳酸氢钠(NaHCO3，>99.7％)、1.95mL用于稀释固化溶液的去离子水和13.05mL作为磷酸盐源的磷酸(H3PO4，85％)。起初，将0.6175g Ca(OH)2与0.8mL去离子水混合至少两分钟以形成Ca(OH)2均一分散于水中的糊膏。最后，将0.75mL固化溶液添加至这些材料。将混合的糊膏转移至具有1300W能量输入的家用微波炉并以最大功率焙烘5分钟。使用研杵，将所得到的团块碾碎为细粉末。随后将1g这种三斜磷钙石粉末与0.5mL水或纳米二氧化硅溶液混合以制备水泥糊膏。
[0127] 将0.01g羧酸官能化的MWCNT与1g三斜磷钙石粉末混合，同时制备水泥糊膏。将含纳米管的磷酸钙水泥(图3A)或单独的水泥(图3B)从注射器挤出，输出直径为1.36mm。评价浓度变动和纳米管类型对水泥固化时间的影响。表1显示作为碳纳米管wt％的函数观察到的固化时间变化。如从表1所见，增加糊膏中的纳米管浓度加速初始固化时间和最终固化时间。图3A-3B显示当随CNT并入时，水泥糊膏的可注射性保留。评价了操作特性(如固化时间；表1和图3)、机械强度(图4)和生物相容性(图5)，并且结果表明这种纳米管强化的水泥复合材料是用于骨支架的合适材料。
[0128] 表1–CNT浓度和类型变动时的水泥固化时间(其中mCNT是多壁羧基官能化的碳纳米管，并且未处理指无羧基官能化的多壁碳纳米管)
[0129]
[0130] 显示碳纳米管向三斜磷钙石(DCPA)水泥并入改善了水泥的机械性能。使用通用试验仪以50kN载荷传感器及负载十字头速率设定成0.5mm/分钟，实施单轴压缩试验。如图4A-4B中所见，从应力-应变曲线生成的杨氏模量显示在含1wt％纳米管的水泥处机械强度最佳。具有0.5wt％、1.0wt％和2.0wt％多壁羧基官能化碳纳米管(mCNT)的组合物各自具有比单一DCPA水泥更大的压缩强度(MPa)。(图4A.)具有未处理的碳纳米管(即，无羧基官能化的多壁碳纳米管)的组合物具有最低压缩强度。类似地，具有0.5wt％和1.0wt％mCNT的组合物均具有大于单一DCPA水泥的杨氏模量。(图4B.)
[0131] 为了评价生物相容性，将成骨细胞在单一磷酸钙水泥上并且在含多壁碳纳米管的磷酸钙水泥上培养7天。图5A-5D显示7天后这些支架的SEM图像，所述图像显示形成骨的成骨细胞成熟。
[0132] 掺入作为治疗药的WP9QY
[0133] 将MWCNT/CPC或单一CPC随WP9QY(YCWSQYLCY，[SEQ ID NO:1])一起加载，WP9QY是为竞争RANK的配体结合作用和抑制破骨细胞所设计的肽化合物。WP9QY肽具有序列H-Tyr-Cys-Trp-Ser-Gln-Tyr-Leu-Cys-Tyr–OH[SEQ ID NO:1]，并且和基于对TNF受体1和RANK的配体结合位点的结构性分析而开发以抑制破骨细胞活化作用。这种环状肽模拟了TNF受体1上的最关键肿瘤坏死因子(TNF)识别环，并阻止TNF与其受体相互作用。将肽直接添加至水泥糊膏以形成骨填充剂组合物。简而言之，与1g水泥粉末混合时，将100μL1mg/mL WP9QY加入0.5mL去离子水中。
[0134] 将水泥丸粒用乙醇洗涤并留在经处理以触发细胞分化的前破骨细胞RAW264.7细胞培养物中。为了测量从水泥释放的WP9QY的抗破骨细胞成熟，5天后将培养物对TRAP+(破骨细胞样)细胞染色。TRAP+是用细胞因子TNFα刺激后活跃破骨细胞的标志物。图6中所示的结果显示两种复合材料均可以携带并释放WP9QY。如图6中所见，破骨细胞活化被抑制，显示水泥组合物释放该肽的能力。
[0135] 掺入作为治疗药的MG132
[0136] 相似的方案用来研究药物MG132，所述药物显示出抗NF-kB活化的抑制作用。MG132是一种蛋白酶体抑制剂，所述蛋白酶体抑制剂用来打断NF-kB的抑制剂降解以阻止NF-kB的激活及其诱导负责破骨细胞生成的基因表达的活性和溶骨性活性。当制备水泥糊膏时，将50μL在二甲基亚砜(DMSO)中的10mM MG132或50μL单一DMSO加入去离子水中。
将糊膏在37℃留在6孔平板中以固化，随后进行乙醇洗涤和紫外消毒。将CPC/DMSO、载有MG132的CPC(CPC/MG132)、CNT强化的CPC(CPC/MWCNT/DMSO)和载有MG132的CNT强化的CPC(CPC/MWCNT/MG132)的每种丸粒浸没于用来培养物指示细胞的2mL培养基中，并且在不同时间点采集这种条件培养基。活细胞染色显示CPC/MG132有毒的，显示水泥复合材料的突发释放。然而，通过添加MWCNT，这种效应衰减，如图6中所见。
将糊膏在37℃留在6孔平板中以固化，随后进行乙醇洗涤和紫外消毒。将CPC/DMSO、载有MG132的CPC(CPC/MG132)、CNT强化的CPC(CPC/MWCNT/DMSO)和载有MG132的CNT强化的CPC(CPC/MWCNT/MG132)的每种丸粒浸没于用来培养物指示细胞的2mL培养基中，并且在不同时间点采集这种条件培养基。活细胞染色显示CPC/MG132有毒的，显示水泥复合材料的突发释放。然而，通过添加MWCNT，这种效应衰减，如图6中所见。
[0137] 为了进一步评价水泥/药物复合物的释放曲线，实施萤光素酶测定法以测量MG132对NF-kB激活的抑制作用。在HEK293细胞中转染含有3个拷贝NF-kB结合位点的报道质粒3XkB-Luc。在24小时后，将培养基更换为上文描述的在不同时间点采集的水泥/药物条件培养基。将细胞培养物进一步温育另外一小时，随后用TNFα(20ng/mL)处理8小时。针对萤光素酶活性制备细胞裂解物。图8中所示的结果显示在纳米管强化的复合材料中更持久的MG132释放，由其抗NF-kB活性所代表。
[0138] TNFα处理5天后在RAW264.7培养物中测试载有MG132的水泥的抗破骨细胞生成作用。在这种情况下，通过实时PCR测量标记基因组织蛋白酶K的表达。图9中所示的结果显示破骨细胞成熟可以被从水泥释放的MG132抑制。
[0139] 细胞囊化
[0140] 为了在藻酸盐珠中囊化干细胞或成骨细胞，在2％海藻酸钠盐溶液中制备细胞悬液。通过使用10mL注射器向2％氯化钙逐滴添加悬液，产生藻酸盐/细胞珠。可以使用共轴气流从针尖驱动藻酸盐/细胞液滴进入胶凝浴，产生显微级藻酸盐珠。将注射器中充入的在2％海藻酸钠盐溶液内的细胞悬液输送至产珠装置，所述装置利用10psi的氮气以形成在2％氯化钙中产生藻酸盐液滴的共轴气流。为了加速细胞分化，在藻酸盐/细胞珠的凝胶化期间添加预载有镁离子的羧甲基纤维素。在成骨性介质中温育7天以诱导成骨细胞分化后，实施碱性磷酸酶活性测定法以显示形成骨的成骨细胞的成熟。图15中所示的结果显示这种藻酸盐基基质为细胞分化提供合适环境。
[0141] 肽纳米管的制备和将其掺入水泥组合物中
[0142] 通过自装配过程制备表面活性剂样Glyn-Aspn肽纳米管。外包定制合成Gly6-Asp2肽[SEQ ID NO:2]。为了制备该纳米管，将Gly6-Asp2[SEQ ID NO:2]重悬于去离子水中，调节pH至中性，并将悬液用超声处理以获得清亮溶液。该肽形成了通过SEM可视并在图7中显示的纳米管结构物。当干细胞与从Gly6-Asp2[SEQ ID NO:2]形成的纳米管温育1天和3天时用来测量细胞生存力的MTT测定法(图11中所示)显示这种材料安全用于组织中。
[0143] 还从二肽双苯基丙氨酸(一种可以在水溶液中快速形成纳米管的修饰的氨基酸)制备纳米管。简而言之，100mg/mL双苯基丙氨酸母液通过在1,1,1,3,3,3-六氟-2-丙醇中溶解这种分子来制备。将20μL母液加入1mL去离子水以产生纳米管(图12A)。在固化期间10mg肽纳米管与1g磷酸钙水泥混合(图12B)，显示不破坏结晶。将这些纳米管添加至干细胞培养物以检验它们的生物相容性。如图12B中所见，细胞在纳米管上贴附并增殖。细胞生存力测定法还展示细胞贴附作用在并入纳米管的水泥上改善(图13A-D)。
[0144] 具有N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)己烷-1,6-双羧酰胺的装配结构的bola两亲肽可以通过以下三步骤方法制备：(1)制备甘氨酰甘氨酸苄酯盐酸盐，(2)制备N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)己烷-1,6-双羧酰胺，和(3)制备肽纳米管。甘氨酰甘氨酸苄酯盐酸盐可以如下制备：将14.8g叔丁氧羰基甘氨酸-二环己胺和14.0g甘氨酸苄酯对甲苯磺酸盐添加至80mL氯仿。向这种溶液，在-5℃添加含有8.75g 1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDAC)的70mL氯仿溶液，同时搅拌24小时。将所得到的溶液用10wt％柠檬酸水溶液洗涤两次，随后用水洗涤2次，随后用洗涤2次4wt％碳酸氢钠水溶液，并最终用水洗涤2次。干燥有机相并且获得作为白色固体的叔丁氧羰基-甘氨酰甘氨酸苄酯。将该固体溶解于HCl/乙酸乙酯中并搅拌4小时，并且随后在真空下移除溶剂以获得白色沉淀物。该沉淀物用二乙醚充分洗涤以获得甘氨酰甘氨酸苄酯盐酸盐。
[0145] N,N'-双(甘氨酰甘氨酰甘氨酸)己烷-1,6-双羧酰胺可以如下制备：将1,6-己烷二羧酸酸(0.50g)和1-羟基苯并三唑(0.65g)溶解于10mL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中。向这种溶液，在-5℃添加含有0.915g EDAC的10mL氯仿溶液，同时搅拌1小时。向所产生的溶液添加步骤(1)中制备的10mL含有1.24g甘氨酰甘氨酸苄酯盐酸盐的甲醇溶液，并且随后接着添加0.67mL三乙胺。将混合物搅拌24小时，同时逐渐升高温度到室温。随后，在真空下移除溶剂以获得沉淀物。随后在滤纸上用10wt％柠檬酸溶液、20mL水和50mol4wt％碳酸氢钠水溶液洗涤该沉淀物，并且随后从DMF结晶以获得N,N-双(甘氨酰甘氨酸苄酯)-己烷-1,6-双羧酰胺。在50℃的水浴中，将这种双羧酰胺溶解于DMF中，向其添加
0.25g催化剂(10wt％钯碳)以反应6小时。反应后，通过过滤移除催化剂，并且随后将滤液从DMF重结晶以获得N,N'-双(甘氨酰甘氨酸)-己烷-1,6-双羧酰胺。
0.25g催化剂(10wt％钯碳)以反应6小时。反应后，通过过滤移除催化剂，并且随后将滤液从DMF重结晶以获得N,N'-双(甘氨酰甘氨酸)-己烷-1,6-双羧酰胺。
[0146] 步骤(3)，可以通过将寡肽bola两亲分子与10mL含有8mg(0.2mmol)氢氧化钠的蒸馏水混合并且随后超声处理混合物以获得溶液，实施寡肽庚烷bola两亲分子纳米管的制备允许这种溶液在室温在空气中静置2周。通过滗析移除上清液并将沉淀物脱水并在高真空中完全干燥以获得纤维状微型管。
[0147] 磷酸镁水泥的制备
[0148] 通过使用玛瑙研杵在玛瑙研钵中将Mg(OH)2与固化溶液和去离子水手工混合，制备磷酸镁水泥。为了制备15mL固化溶液，分别混入0.0032g一水合柠檬酸(C6H8O7·H2O，100％)、6g碳酸氢钠(NaHCO3，>99.7％)、1.95mL用于稀释固化溶液的去离子水和13.05mL作为磷酸盐源的磷酸(H3PO4，85％)。将2.47g Mg(OH)2添加至2mL去离子水和3mL固化溶液的混合物以形成糊膏。将混合的糊膏转移至具有1300W能量输入的家用微波炉并以最大功率焙烘5分钟。使用研杵，将所得到的团块碾碎为细粉末。随后将2g MPC粉末与0.5mL水或纳米二氧化硅溶液混合以产生可注射磷酸镁水泥。
[0149] 水泥、纳米管结构物、治疗剂和细胞的集成
[0150] 可以通过将1g CPC或2g MPC粉末在预溶解有50μL 10mM MG132或100μl 1mg/mL WP9QY的0.5mL去离子水或纳米二氧化硅溶液中与1％w/w碳纳米管或干燥的肽纳米管均匀混合，实现这些实施例中所述的水泥、纳米管、治疗药和藻酸盐囊化的细胞的集成。随后可以将藻酸盐/羧甲基纤维素/成骨细胞或藻酸盐/羧基纤维素/干细胞珠添加至这种糊膏，并且所产生的复合物即可用于骨增量术中。
[0151] 以上实施例中定义了本文公开的组合物和方法的某些实施方案。应当理解尽管显示了本发明的具体实施方案，然而这些实施例仅以说明的方式给出。从以上讨论和这些实施例中，本领域技术人员可以确定本公开的必要特征，并且在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本文中描述的组合物和方法作出各种改变和修改以使之适应各种用途和条件。在不脱离本公开实质范围的情况下，可以做出各种变化并且可以用等同物替换其要素。此外，可以作出许多修改以使特定情形或材料适应于本公开的教授内容而不脱离其实质范围。
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