技术领域
[0001] 本
发明属制药领域，具体是一种含异甘草黄酮醇的抗肿瘤药物及其应用，涉及活性组分异甘草黄酮醇的制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。
背景技术
[0002] 血管生成被认为是超过1-2mm的肿瘤生长的绝对必备条件。在小于该限度的肿瘤中，
氧和营养物可通过扩散给细胞。然而，当达到一定尺寸时，每个肿瘤为了继续生长都要依赖血管生成。在低氧区域内的肿瘤发生细胞通过刺激血管内皮生长因子（VEGF）生成而起反应，这引起静息内皮细胞的激活来刺激新的血管形成。此外，在没有任何血管生成的肿瘤区域中的VEGF可通过ras
信号传导途径来进行。原位杂交实验已证实了在多种人肿瘤中VEGF mRNA 被严重上调，这些肿瘤包括
肺癌、
乳腺癌、胃肠道癌、卵巢癌、以及血管肉瘤和几种颅内肿瘤。
[0003] 因此，实体瘤可以通过血管内皮生长因子生成
抑制剂进行有效干预，因为这些肿瘤的发生都依赖于血管生成，以形成支持其生长所必需的血管。这些实体瘤包括组织性淋巴瘤、脑、生殖泌尿道、淋巴系统、胃、喉和肺部的癌症，包括肺腺癌和小细胞肺癌。
[0004] 实体肿瘤的生长、侵袭和转移均有赖于血管生成。而最近的研究表明,血管生成及其调控因子与白血病的发生、演变、
预后密切相关,以血管生成为靶部位的抗血管生成疗法同样适用于白血病的
治疗。
[0005] 所以，通过抑制肿瘤血管生长而 “饿死肿瘤”的治疗策略，不仅适用于实体瘤，还可应用于白血病，该治疗方法与现有的
化疗药物相比，具有
副作用小、对人体正常细胞无损害、不会引起化疗综合症、能显著抑制肿瘤的转移和扩散等显著特点。
[0006] 对于抗血管生成剂的开发用于肿瘤的
预防和治疗，已经成为世界各大制药公司的追捧的热点。化学合成的抑制肿瘤血管生长剂，由于不可避免的毒副反应成为进入临床的重要障碍；相比而言，若能筛选寻找的天然来源的抗血管生成剂，并用作活性组制备抗癌药物，将会具有巨大的开发优势和广泛的市场前景。但是，当前天然来源的具有抗癌功能的活性组分提取物仍处于试验探讨阶段，公开的报道仅仅限于实验室的成分分离及测试，没有发现关于能够规模化生产的天然来源的活性组分的报道。影响了含天然来源的活性组分的抗肿瘤药物工业化开发及其应用效果。
发明内容
[0007] 本发明目的在于开发和提供一种天然来源的抗血管生成剂活性组分异甘草黄酮醇，并提供一种可工业化生产的，适宜于提高
生物利用度的异甘草黄酮醇的制备方法，以促进其在抗肿瘤药物领域中的应用。
[0008] 本
发明人对天然药物成分进行了大量筛选和药理实验及
抗肿瘤效果对比评价，最终确认来源于中药甘草中的异甘草黄酮醇，对肿瘤血管内皮生长因子生成具有显著的抑制作用，能够通过抑制肿瘤新生血管的生成而达到抗肿瘤目的，是一种极具开发价值的抗肿瘤药物的天然来源活性药物组分化合物。
[0009] 异甘草黄酮醇(isolicoflavonol)是一种异黄酮类化合物,为黄色针状结晶, 难溶于
水, 溶于极性小的
溶剂, 如乙醚、氯仿等；存在于豆科
植物甘草的根等多种中药中，这使工业化提取、药理实验、毒性实验、临床研究以及利用异甘草黄酮醇研制新药成为可能。
[0010] 异甘草黄酮醇结构式如下：
[0011]
[0012] 式中 R1=R2=R4=R7=OH，R3=R5= H，R6=-CH2CH=C(CH3)2
[0013] 据文献报道，甘草中的黄酮类化合物，可分为以下几类：黄酮或黄酮醇类、查尔酮类、异黄酮类、二氢异黄酮类等。在筛选研究和药理实验过程中，本发明人意外发现，黄酮醇类化合物的结构与活性存在相关性，所以黄酮醇类化合物成为了本发明人关注的重点。文献报道甘草中含有的黄酮醇类成分主要是两种异甘草黄酮醇和甘草黄酮醇。二者的区别在于异甘草黄酮醇R3=H，R6=-CH2CH=C(CH3)2；而甘草黄酮醇R3=-CH2CH=C(CH3)2，R6=H。在分子长轴端的异戊烯链造成了分子空间结构的较大差异。众所周知，化合物的生理活性是经过药物与体内的受体或者靶点的结构而产生的，化合物的空间结构或构象是决定药物活性的重要因素。发明人对两种黄酮醇进行了大量的药理实验对比，惊喜的发现，异甘草黄酮醇具有显著的抑制新生血管生成的活性功能，效果显著强于甘草黄酮醇。
[0014] 本发明人在一系列的药理病理研究中，进一步确认了异甘草黄酮醇具有抑制新生血管生成功能作用，能够通过抑制肿瘤新生血管的生成而抑制肿瘤的生长和转移，从而达到抗肿瘤目的。这是一种新发现的抗癌机制，与以往报道都不同。
[0015] 此处术语“肿瘤”意指瘤性增殖性病症，例如实体瘤
疾病、液体瘤疾病。
[0016] 此处所用术语“实体瘤疾病”尤其指乳腺癌、卵巢癌、
宫颈癌、结肠癌和通常的胃肠道癌、肺癌，例如小细胞肺癌和非小细胞肺癌、肾癌、膀胱癌、
前列腺癌、
皮肤癌如黑色素瘤、头颈癌或脑瘤。
[0017] 此处所用术语“液体瘤疾病”尤其指白血病。
[0018] 本发明所述的异甘草黄酮醇化合物涉及的对肿瘤的抑制作用，通过本发明人一系列的试验效果数据对比，提供了确凿的证据。
[0019] 本发明所公开的典型实例的试验数据，进一步证明：异甘草黄酮醇能够明显抑制小鼠S180肿瘤的生长；能够明显抑制小鼠Lewis肺癌的生长，并有效抑制肺癌病灶的转移；在斑
马鱼的试验中进一步证明，异甘草黄酮醇的抗肿瘤作用，与其能够抑制血管内皮生长因子、从而抑制肿瘤新生血管的生成有关；异甘草黄酮醇能够明显抑制斑马鱼新生血管的生成，而在同样实验条件下，其结构类似物-甘草黄酮醇，仅有微弱的血管抑制作用，与空白对照相比较，并未表现出显著性差异。
[0020] 黄酮的提取工艺比较成熟，但是获得高纯度黄酮醇
单体化合物的制备工艺并不简单，原因在于甘草中目前仅黄酮类成分发现的就有几十种，分子结构的相似性，导致了分离纯化的难度，按照实验室的常规分离手段需经反复纯化分离，一般只能获得几毫克样品，只能用于检测和试验，并不能放大应用于生产，实验室的繁琐的分离技术，不具有工业化生产的价值。
[0021] 本发明需要解决一个技术问题是提供一种从植物甘草中提取纯化异甘草黄酮醇的方法，以克服目前实验室研究无法放大生产的
缺陷，以便进行规模化的提纯异甘草黄酮醇产品。本发明根据异甘草黄酮醇的分子结构特点，其分子中不含糖基，含有羟基，B环结构导致极性与其他的黄酮具有一定程度的差异。本发明就是利用异甘草黄酮醇的结构特点，设计了聚酰胺柱-
硅胶柱-葡聚糖凝胶组合色谱进行分离纯化的方法，成功的实现了从甘草中分离得到异甘草黄酮醇单体的规模化运行，回收率达到75%。
[0022] 在聚酰胺柱的分离过程中，极性较大的黄酮苷类成分会先被洗脱下来，不含糖基的黄酮
苷元随后才能被洗脱下来。分子中含有导致不同的极性，根据这个特点，硅胶柱色谱将黄酮与皂苷成分分开。而羟丙基葡聚糖凝胶会识别黄酮结构中的B环形成的不同空间结构，将异甘草黄酮醇与其他结构相近的黄酮成分分开。
[0023] 通过本发明方法，经过提取、
脱脂净化可得到异甘草黄酮醇含量不低于3%的稳定的提取物，经过进一步的聚酰胺柱-硅胶柱-葡聚糖凝胶
串联组合色谱分离制备，可得到纯度≥95%的异甘草黄酮醇。
[0024] 本发明所述抗肿瘤药物的主要活性成分异甘草黄酮醇的工业化制备方法具体如下：
[0025] 1）提取
[0026] 取甘草根，干燥
粉碎，每次用药材干重4-10倍的极性溶剂在加热状态下提取，提取2-3次。所述的药材粉碎粒度为80目以下；所述的极性溶剂为醇类（通常为甲醇、
乙醇、丙醇或异丙醇）、或醇水的混合溶剂：所述提取过程的加热
温度为50-80℃ ；所述的混合提取溶剂中醇所占体积比例为60%-95%。
[0027] 2）脱脂
[0028] 将上述的提取物浓缩，回收溶剂，得浸膏，加入5-15倍的醇水混合物作分散剂，加入等体积石油醚、乙醚、烷
烃类（正己烷、正戊烷或正庚烷、）进行提取脱脂，提取2-4次。所述醇水混合物为醇（通常为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇）与水的混合物，相对体积比例为
5-20%。
[0029] 3）聚酰胺柱分离
[0030] 将上述脱脂后的醇水相上到聚酰胺柱顶端，采用与上样药液相同浓度的醇水混合溶剂进行洗脱，洗脱至无色，将黄酮苷杂质类成分洗脱去掉，然后用40-60%的醇水混合洗脱剂进行洗脱，收集洗脱液。所述的柱层析的上样量为2-6倍柱体积，上样流速为3-5倍柱体积/每小时；所述醇水混合物为醇（通常为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇）与水的混合物。
[0031] 4）硅胶柱分离
[0032] 将上步洗脱液浓缩，回收溶剂，采用硅胶柱进行分离，每次上样量为硅胶重量的1/300-1/50，采用卤代烃（氯仿、二氯甲烷）与醇（通常为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇）组成的混合溶剂洗脱,收集洗脱液，回收溶剂得到黄色固体。所述混合溶剂比例为3：1～5:1。
[0033] 5）葡聚糖凝胶柱分离
[0034] 葡聚糖凝胶装柱（通常为羟丙基葡聚糖凝胶），径高比10:1,将上步得到黄色洗脱物上柱，采用醇（通常为甲醇、乙醇、丙醇或异丙醇）洗脱，接收第一个色带，回收溶剂，浓缩、干燥。
[0035] 所获得的异甘草黄酮醇采用高效液相色谱的方法测试，结果表明，异甘草黄酮醇含量为95%以上。
[0036] 然而黄酮类成分与生俱来的生物利用度较低的问题成为了异甘草黄酮醇实际应用于临床治疗疾病的另一个障碍。黄酮类成分的化学结构特性，致使其
水溶性和脂溶性都较差，很多黄酮类药物的临床应用都受限于药物吸收这个问题，药物吸收差则生物利用度低，所以药效的发挥也受到限制。
[0037] 就常规的方法得到的异甘草黄酮醇产品而言，由于在结晶过程中通常存在局部过饱和现象，导致异甘草黄酮醇晶体大小不均匀，粒度分布宽，晶体流动性差，比容高。
[0038] 药物粉体的变化将导致药物本质的不同。本发明在异甘草黄酮醇析晶后，增加了微粉化处理过程，并经试验对比，确定控制异甘草黄酮醇微粉微粒粒径中位值在≤100μm，能够提高生物利用度，增加药物吸收，并能避免常规方法导致的局部
过热黏结、分解现象。由于异甘草黄酮醇微粉粒径分布集中，粒度分布窄，达到了良好的药用效果要求，使得异甘草黄酮醇作为活性组分制备药物的可能成为了现实。
[0039] 本发明采用气流喷射技术或
超微粉碎对提取制得的异甘草黄酮醇进行微粉化处理，得到、平均粒径可控的微粉化异甘草黄酮醇产品。
[0040] 本发明的生产工艺生产周期短，安全，成本较低，收率高，特别适合产业化大量生产。鉴于异甘草黄酮醇具有强烈的抑制新生血管的作用，本发明的生产工艺从甘草中产业化大量制备异甘草黄酮醇将具有广阔的前景。
[0041] 正是基于对异甘草黄酮醇抑制血管生成的作用机制的深入研究以及对异甘草黄酮醇规模化提取方法的开发，本发明人进一步确认，以异甘草黄酮醇化合物为主要抗肿瘤活性成分，进行了相应的抗肿瘤药物产品的开发是完全可行的，可以为制药领域提供一种具有新型抗肿瘤机制的抗肿瘤药物。
[0042] 本发明所述的含异甘草黄酮醇的抗肿瘤药物，是以异甘草黄酮醇作为抑制肿瘤生长和转移的主要活性成分，与药学上可接受的辅料、载体组合加工制成各种类型的药用制剂，包括混悬型注射剂、片剂或胶囊剂等。
[0043] 本发明所述的抗肿瘤药物中，活性成分异甘草黄酮醇，占药物总重量的10%～99%。
[0044] 本发明所述的抗肿瘤药物的混悬型注射剂的活性组分及辅料的组成如下：按照重量比，异甘草黄酮醇1份，维生素B1 2～2.5份，
氯化钠1.8～2.5份，海藻酸钠2.0～2.6份, 聚山梨醇酯-80 0.8～1.3份，用注射用水混悬,制成混悬型注射剂。
[0045] 本发明所述的抗肿瘤药物的片剂或胶囊剂，是以异甘草黄酮醇为有效成分，与药剂学意义上的填充剂、崩解剂组成的常规片剂或胶囊剂；或者是异甘草黄酮醇与填充剂和羟丙甲基
纤维素组成的缓释片剂或胶囊剂；其中填充剂可选乳糖、微晶
纤维素，糊精，
淀粉，
磷酸钙；崩解剂可选用羟丙纤维素，羧甲基淀粉钠、交联聚维酮，交联
羧甲基纤维素钠；亦可选加
粘合剂、
润滑剂或湿润剂。
[0046] 所述较好的药物组合物组成配方如下：按照重量比，异甘草黄酮醇 1份：乳糖或微晶纤维素0.05～0.2：羟丙纤维素或羧甲基淀粉钠0.05～0.2；或者，异甘草黄酮醇1份：乳糖或微晶纤维素0.03～0.08：羟丙甲基纤维素K4M 0.15～0.4。
[0047] 所述优选的药物组合物组成配方如下：按照重量比，异甘草黄酮醇 1份：乳糖或微晶纤维素0.08～0.12：羟丙纤维素或羧甲基淀粉钠0.08～0.12；或者，异甘草黄酮醇 1份：乳糖或微晶纤维素0.05～0.07：羟丙甲基纤维素K4M 0.2～0.3。
[0048] 本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式
给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、肌肉、皮下、鼻腔、
口腔黏膜、皮肤、腹膜或直肠等。
[0049] 本发明化合物或含有它的药物组合物的给药途径可为注射给药。注射包括静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射和
穴位注射等。
[0050] 本发明化合物药物组合物的给药剂量取决于许多因素，例如所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的性别、年龄、体重、个体反应，给药途径给药次数、治疗目的，因此本发明的治疗剂量可以有较大范围的变化，可以根据本发明化合物组合物中的单位制剂剂量，加以适当的调整，以达到其
治疗有效量的要求，完成本发明的预防或治疗目的。本发明化合物的每天合适剂量范围又选为0.1～50mg/kg体重，更优选为50mg～1000mg/天/人。上述剂量可以单一剂量形式或分成几个，例如二、三、四个剂量形式给药，这受限于给药医生临床经验及包括同时运用其他治疗手段的给药方案。
[0051] 具体实施方式：
[0052] 为了更好的理解本发明实质，下面用异甘草黄酮醇的药理试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
[0054] 甘草样品5kg，粉碎,10倍量95 %乙醇50℃提取3 次,每次4 h。提取液过滤,减压浓缩回收溶剂，用15倍量20 %的乙醇适量稀释,用石油醚脱脂后，上聚酰胺柱进行分离，上样量为6BV，上样流速为3BV/h,用20%甲醇洗脱至流出液无色，之后换用40%甲醇洗脱,收集3倍柱体积至6倍柱体积的洗脱液，浓缩去除溶剂后，经硅胶柱层析,氯仿-甲醇(3 :1,v/ v) 进行洗脱，洗脱液再经过Sephadex L H-20凝胶色谱柱进行分离，甲醇洗脱，收集第一个色带，收集洗脱液，浓缩，析晶，微粉化处理，得到微粒粒径中位值≤100μm的异甘草黄酮醇；纯度98.0%，回收率75%。
[0055] 实施例2：
[0056] 甘草样品8kg，粉碎,5倍量75% 乙醇80℃提取3 次,每次2 h。提取液过滤,减压浓缩回收溶剂，用5倍量10 %的乙醇适量稀释,用石油醚脱脂后，上聚酰胺柱进行分离, 上样量为4BV，上样流速为4BV/h,用10%甲醇洗脱至流出液无色，之后换用50%甲醇洗脱，收集3倍柱体积至6倍柱体积的洗脱液，浓缩去除溶剂后，经硅胶柱层析,二氯甲烷-乙醇(4:1,v/ v) 进行洗脱，洗脱液再经过Sephadex L H-20凝胶色谱柱进行分离，甲醇洗脱，收集第一个色带，收集洗脱液，浓缩，析晶，微粉化处理，得到微粒粒径中位值≤100μm的异甘草黄酮醇；纯度95.1%，回收率76.2%。
[0057] 实施例3：
[0058] 甘草样品10kg，粉碎,8倍量60% 乙醇70℃提取3 次,每次2 h。提取液过滤,减压浓缩回收溶剂，用10倍量5 %的乙醇适量稀释,用石油醚脱脂后，上聚酰胺柱进行分离, 上样量为2BV，上样流速为5BV/h,用10%甲醇洗脱至流出液无色，之后换用60%甲醇洗脱，收集3倍柱体积至6倍柱体积的洗脱液，浓缩去除溶剂后，经硅胶柱层析,二氯甲烷-甲醇(5:1,v/ v) 进行洗脱，洗脱液再经过Sephadex L H-20凝胶色谱柱进行分离，乙醇洗脱，收集第一个色带，收集洗脱液，浓缩，析晶微粉化处理，得到微粒粒径中位值≤100μm的异甘草黄酮醇；纯度96.7%，回收率75.9%。
[0059] 实施例4
[0060] 药物粉体粒径的变化将导致药物本质的不同。在研究本发明微粉化异甘草黄酮醇产品的性质的一个实验中，我们观察到了由微粉粒径的不同导致的效果的差异。在使用不同的粒径的异甘草黄酮醇微粉处理斑马鱼模型后，观察对斑马鱼节间血管的生成的一致作用，结果表明，在粒径≤100μm时，抑制活性显示了显著性的差异（p<0.05）[0061] 表1 不同浓度异甘草黄酮醇对斑马鱼胚胎节间血管的抑制作用
[0062]
[0063] 实施例5：本发明实例2异甘草黄酮醇对小鼠S180抑瘤作用的观察
[0064] 无菌
抽取荷S180小鼠腹水，将细胞悬液置
显微镜下计数，调整细胞数为2.5×107/7
ml和2.0×10/ml，于小鼠右前肢腋部皮下接种瘤液0.2ml/只。次日随机分组，异甘草黄酮醇微粉与未进行微粉化的设为2组，阳性对照组（FT207110mg /kg）和生理盐水对照组。均连续灌胃给药9天，每鼠每天灌胃体积均为0.5 ml。生理盐水对照组灌胃给同体积生理盐水。末次给药后24小时处死动物，解剖瘤
块称瘤重及体重，计算抑瘤率。
[0065] 结果见表1，结果显示微粉化异甘草黄酮醇对小鼠S180有较强的抑瘤作用（p<0.05），作用与阳性对照组（抑制率为53.2%）相当。
[0066] 表2 异甘草黄酮醇对小鼠S180肉瘤生成的抑制作用
[0067]
[0068] 注：*，与对照相比；
[0069] 实施例6 ：本发明实例2异甘草黄酮醇对小鼠Lewis肺癌自发性转移的影响[0070] Lewis肺癌细胞株制成瘤细胞混悬液, 台盼蓝计数约为1×107 /mL 瘤细胞。消6 6
毒小鼠右前腋, 取0.2 mL(约1×10-2×10 个瘤细胞)接种于皮下。传代3次。在无菌条件下剥离Lewis肺癌荷瘤鼠皮下瘤块, 选取生长良好的瘤组织, 剪碎、称
质量, 用细胞匀浆器制成匀浆, 按体积比1: 3加生理盐水制成瘤细胞混悬液, 接种于C57BL /6J小
6 6
鼠右前肢腋窝皮下, 每只0.2mL (约1×10～2×10 个瘤细胞)。次日随机分组，异甘草黄酮醇微粉与未进行微粉化的设为2组，阳性对照组（FT207110mg /kg）和生理盐水对照组。
均连续灌胃给药9天，每鼠每天灌胃体积均为0.5 ml。生理盐水对照组灌胃给同体积生理盐水。末次给药后24小时处死动物，解剖瘤块称瘤重及体重。计算抑瘤率及病灶转移率。
[0071] 在小鼠Lewis肺癌自发性转移模型上
腹腔注射给予异甘草黄酮醇，结果异甘草黄酮醇能够明显抑制Lewis肺癌肿瘤的重量增长（p<0.05），并降低了出现肺转移的小鼠数（转移率），同时肺转移的数目也明显降低。结果见表2
[0072] 表3异甘草黄酮醇对小鼠Lewis肺癌转移的抑制作用
[0073]
[0074] ,*p<0.05，与对照相比
[0075] 实施例7 ：本发明异甘草黄酮醇对新生血管生成的抑制作用
[0076] TG（VEGFR2: GFP）系血管
荧光转基因斑马鱼受精卵发育24h时，在体视显位镜下挑选正常的斑马鱼胚胎，移入96孔培养板中，每孔1枚。样孔中预先加入一定体积药物，每浓度32孔，然后用营养用水补充体积至300μl，对照为胚胎营养用水。在受精卵发育72h时，荧光显微镜观察斑马鱼体节间血管的生长情况，计算抑制率，并观察胚胎或仔鱼死亡情况。
[0077] 斑马鱼胚胎的血管发育过程与人类极其相似，其背部主干血管的分支部分呈栏状排列，易观察，是观察药物对新生血管生长影响的最佳模型。肿瘤初期的生长或者病灶转移时出现的新生血管可以用斑马鱼模型进行评价。结果发现异甘草黄酮醇均能够明显抑制斑马鱼新生血管的生成（见表3），为本发明异甘草黄酮醇化合物抗肿瘤作用，提供了有利证据。同样实验条件下，其结构类似物-甘草黄酮醇，仅有微弱的血管抑制作用，与空白对照相比较，并未表现出显著性差异。
[0078] 表4 不同浓度异甘草黄酮醇对斑马鱼胚胎节间血管的抑制作用
[0079]
