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一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌 线虫基因RNAi方法

阅读：483发布：2020-05-13

专利汇可以提供一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法。首先通过根癌农杆菌介导将靶基因（如水稻干尖线虫Ab-far-1基因）dsRNA转入灰葡萄孢菌，构建表达该基因dsRNA的灰葡萄孢菌工程菌（即转基因灰葡萄孢菌），将食真菌线虫（如水稻干尖线虫雌虫）接种在灰葡萄孢菌工程菌上进行培养，即可实现靶基因的有效沉默。本发明为食真菌线虫（包括可取食真菌植物线虫和其他食真菌线虫）的RNAi提供了一种真菌介导的新方法，该方法操作简便、转化率高、重复性好、周期短，可做为食真菌线虫基因功能研究的有效工具。，下面是一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法，其特征在于，通过根癌农杆菌介导将靶基因dsRNA转入灰葡萄孢菌，构建表达靶基因dsRNA的灰葡萄孢菌工程菌，将食真菌线虫接种在灰葡萄孢菌工程菌上进行培养，即可实现靶基因的沉默。
2.根据权利要求1所述基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1.构建RNAi载体
首先以pBHt2和pSilent-1为骨架构建双元载体pBS-1；然后将靶基因正向片段插入pBS-1载体，构建得到pBS-Ab-far1载体；并进一步将靶基因反向片段插入到pBS-Ab-far1载体，构建得到pBS-Ab-far2载体；
S2.农杆菌介导转化灰葡萄孢菌：通过根癌农杆菌介导将pBS-Ab-far2载体转化灰葡萄孢菌获得阳性转基因灰葡萄孢菌；
S3.将食真菌线虫接种在转基因灰葡萄孢菌上进行培养，即可实现真菌介导的线虫靶基因RNAi。
3.一种基于喂食灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）构建水稻干尖线虫Ab-far-1 RNAi载体
1）构建双元载体pBS-1载体
pBHt2和 pSilent-1载体经EcoRI和XbaI双酶切后，纯化回收片段的末端用T4连接酶连接；质粒转化到大肠杆菌中进行扩繁，得到载体pBS-1；
2）构建pBS-Ab-far2载体
以含Ab-far-1 cDNA全长的质粒为模板，用引物FARcm-F/FARcm-R扩增得PCR片段，经酶切处理的正向PCR片段插入到pBS-1载体中，形成pBS-Ab-far1载体；然后再将经酶切处理的反向PCR片段插入到pBS-Ab-far1载体形成pBS-Ab-far2载体；
（2）农杆菌介导转化灰葡萄孢菌
农杆菌感受态细胞和pBS-Ab-far2载体质粒混合后，进行电击转化，并转化野生灰葡萄孢菌，筛选鉴定获得具有潮霉素抗性的转基因灰葡萄孢菌；
（3）线虫RNAi处理
先将转基因灰葡萄孢菌接种到含有潮霉素的PDA平板上，再接种水稻干尖线虫雌虫，进行培养。
4.根据权利要求3所述基于喂食灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，其特征在于，引物FARcm-F和FARcm-R的序列如SEQ ID NO.1～2所示。
5.根据权利要求3所述基于喂食灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，其特征在于，步骤2）中正向PCR片段的酶切处理是经XhoI 和 SnaBI双酶切处理；反向PCR片段的酶切处理是经BglII和 StuI双酶切处理。
6.根据权利要求3所述基于喂食灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，其特征在于，步骤（2）中，野生灰葡萄孢菌和含有pBS-Ab-far2质粒的农杆菌，在0.22μm微孔滤膜上22℃共培养48h，得到单个的转化子，分别接种到含100µg/ml潮霉素的PDA培养基上，筛选鉴定获得具有潮霉素抗性的转基因灰葡萄孢菌。
7.根据权利要求3所述基于喂食灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，其特征在于，步骤（2）中转基因灰葡萄孢菌的鉴定是利用引物对hph-F/hph-R、Hpt-F/Hpt-R、Pa-F/Pa-R和FARcm-F/FARcm-R进行PCR鉴定，结果为阳性则表示外源基因整合到灰葡萄孢菌基因组中；其中引物对hph-F/hph-R、Hpt-F/Hpt-R、Pa-F/Pa-R的上下游序列依次如SEQ ID NO.3～8所示。
8.根据权利要求3所述基于喂食灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，其特征在于，步骤（3）中培养后，统计水稻干尖线虫的繁殖量，并用以下引物对qPCR1F-F/ qPCR1F-R 和18S-F/18S-R检测水稻干尖线虫Ab-far-1的表达量，确定真菌介导的RNAi的有效性；所述引物对qPCR1F-F/ qPCR1F-R 和18S-F/18S-R的上下游序列依次如SEQ ID NO.9～12所示。
9.一种用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体，其特征在于，是以pBHt2和pSilent-1为骨架构建双元载体pBS-1；然后将靶基因正向片段插入pBS-1载体，构建得到pBS-靶基因载体；并进一步将靶基因反向片段插入到pBS-靶基因载体，构建得到所述用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体。
10.一种用于食真菌线虫基因RNAi的灰葡萄孢菌工程菌，其特征在于，通过根癌农杆菌介导将权利要求9所述RNAi表达载体转化灰葡萄孢菌获得所述灰葡萄孢菌工程菌。

说明书全文

一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌 线虫基因RNAi方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域。更具体地，涉及一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法。

背景技术

[0002] RNA干扰（RNA interference, RNAi）是一种细胞机制，由内源性或外源性的双链RNA特异性地降解同源的基因，这是普遍存在于真核生物中的自然现象。RNAi可以有效抑制基因表达，是线虫基因功能分析必不可少的工具。在植物寄生线虫RNAi研究中，目前普遍采用dsRNA溶液浸泡和植物介导的方法。

[0003] 但是，dsRNA溶液浸泡法的基因沉默效率受浸泡时间和浓度等环境条件影响，其诱导的基因沉默存在着时效短、不能遗传等局限性（Bakhetia et al., 2007）。植物介导RNAi方法的关键是将目的基因dsRNA转入寄主植物并表达，但是植物转基因技术难度大、成本高、周期长，目前通过根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens)介导的植物遗传转化存在着需要建立复杂高效的组织培养体系和再生体系的难题，存在着基因依赖性强、转化效率低、对农杆菌侵染不敏感以及外源基因在转基因植物中常受到抑制不能表达或表达水平下降等问题，这些问题使得植物介导的RNAi在植物线虫基因功能研究中的应用也受到限制。

[0004] 因此，根据不同生活类型植物线虫的生物学特性，研究建立更合理、更简便和更有效的RNAi方法是十分必要的。

发明内容

[0005] 本发明所要解决的技术问题是克服dsRNA溶液浸泡法的基因沉默效率受浸泡时间和浓度等环境条件影响，其诱导的基因沉默存在着时效短、不能遗传等局限性；克服植物介导的RNAi存在的技术难度大、成本高、周期长、对基因类型依赖性强、转化效率低、表达稳定等问题，提供一种通过根癌农杆菌介导将水稻干尖线虫Ab-far-1基因dsRNA转入灰葡萄孢菌，用表达Ab-far-1 dsRNA的灰葡萄孢菌工程菌株喂食培养水稻干尖线虫，将Ab-far-1 dsRNA导入虫体产生RNAi的方法。

[0006] 本发明的目的是提供一种基于灰葡萄孢菌的食真菌线虫基因RNAi方法。

[0007] 本发明另一目的是提供一种用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体。

[0008] 本发明再一目的是提供一种用于食真菌线虫基因RNAi的灰葡萄孢菌工程菌。

[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种基于灰葡萄孢菌的食真菌线虫基因RNAi方法，通过根癌农杆菌介导将靶基因（如水稻干尖线虫Ab-far-1基因）dsRNA转入灰葡萄孢菌，构建表达靶基因dsRNA的灰葡萄孢菌工程菌（即转基因灰葡萄孢菌），将食真菌线虫（如水稻干尖线虫雌虫）接种在灰葡萄孢菌工程菌上进行培养（即用灰葡萄孢菌工程菌喂食培养食真菌线虫），即可实现靶基因的沉默。

[0010] 具体地，上述基于灰葡萄孢菌的食真菌线虫基因RNAi方法，包括如下步骤：S1.构建RNAi载体
首先以含潮霉素抗性（由构巢曲霉启动子启动）的pBHt2和pSilent-1为骨架构建双元载体pBS-1；然后将靶基因（如水稻干尖线虫Ab-far-1基因）正向片段插入pBS-1载体，构建得到含有正向靶基因RNAi片段的pBS-Ab-far1载体；并进一步将靶基因反向片段插入到pBS-Ab-far1载体，构建得到含有正反向靶基因RNAi片段的pBS-Ab-far2载体；
S2.农杆菌介导转化灰葡萄孢菌：通过根癌农杆菌介导将pBS-Ab-far2载体转化灰葡萄孢菌，鉴定获得单拷贝的阳性转基因灰葡萄孢菌；
S3.将食真菌线虫接种在转基因灰葡萄孢菌上进行培养（即用该转基因灰葡萄孢菌喂食培养食真菌线虫，将靶基因dsRNA导入虫体产生RNAi），即可实现真菌介导的线虫靶基因RNAi。

[0011] 所述食真菌线虫包括滑刃类线虫或茎属线虫。

[0012] 所述食真菌线虫包括水稻干尖线虫、菊花叶枯线虫、草莓滑刃线虫、松材线虫、腐烂茎线虫或鳞球茎茎线虫等。

[0013] 以水稻干尖线虫Ab-far-1基因为例，一种基于灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法，包括如下步骤：（1）构建水稻干尖线虫Ab-far-1 RNAi载体
1）构建双元载体pBS-1载体
pBHt2和 pSilent-1载体经EcoRI和XbaI双酶切后，纯化回收片段的末端用T4连接酶连接；质粒转化到大肠杆菌中进行扩繁，得到载体pBS-1；
2）构建pBS-Ab-far2载体
以含Ab-far-1 cDNA全长的质粒为模板，用引物FARcm-F/FARcm-R扩增得PCR片段，经酶切处理的正向PCR片段插入到pBS-1载体中，形成pBS-Ab-far1载体；然后再将经酶切处理的反向PCR片段插入到pBS-Ab-far1载体形成pBS-Ab-far2载体；
（2）农杆菌介导转化灰葡萄孢菌
农杆菌感受态细胞和pBS-Ab-far2载体质粒混合后，进行电击转化，并转化野生灰葡萄孢菌，筛选鉴定获得具有潮霉素抗性的转基因灰葡萄孢菌，即转pBS-Ab-far2灰葡萄孢菌（ARTB）；
（3）线虫RNAi处理
先将转基因灰葡萄孢菌（ARTB）接种到含有潮霉素的PDA平板上，再接种水稻干尖线虫雌虫，进行培养。

[0014] 其中，所述引物FARcm-F和FARcm-R的序列如SEQ ID NO.1～2所示。

[0015] 另外，优选地，步骤2）中正向PCR片段的酶切处理是经XhoI 和 SnaBI双酶切处理；反向PCR片段的酶切处理是经BglII和 StuI双酶切处理。

[0016] 优选地，步骤（2）中，野生灰葡萄孢菌孢子和含有pBS-Ab-far2质粒的农杆菌，在0.22μm微孔滤膜上22℃共培养48h，得到单个的转化子，分别接种到含100µg/ml潮霉素的PDA培养基上，筛选鉴定获得具有潮霉素抗性的转基因灰葡萄孢菌。

[0017] 优选地，步骤（2）中转基因灰葡萄孢菌的鉴定是利用引物对hph-F/hph-R、Hpt-F/Hpt-R、Pa-F/Pa-R和FARcm-F/FARcm-R进行PCR鉴定，结果为阳性则表示外源基因整合到灰葡萄孢菌基因组中；其中引物对hph-F/hph-R、Hpt-F/Hpt-R、Pa-F/Pa-R的上下游序列依次如SEQ ID NO.3～8所示。

[0018] 优选地，步骤（3）中培养后，统计水稻干尖线虫取食表达Ab-far-1 dsRNA的转基因灰葡萄孢菌后的繁殖量，并用以下引物对qPCR1F-F/ qPCR1F-R 和18S-F/18S-R检测水稻干尖线虫Ab-far-1的表达量，确定真菌介导的RNAi的有效性。所述引物对qPCR1F-F/ qPCR1F-R 和18S-F/18S-R的上下游序列依次如SEQ ID NO.9～12所示。

[0019] 另外，上述构建的用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体以及用于食真菌线虫基因RNAi的灰葡萄孢菌工程菌，也都应在本发明的保护范围之内。

[0020] 具体地，一种用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体，是以pBHt2和pSilent-1为骨架构建双元载体pBS-1；然后将靶基因正向片段插入pBS-1载体，构建得到含有正向靶基因RNAi片段的pBS-靶基因载体；并进一步将靶基因反向片段插入到pBS-靶基因载体，构建得到所述用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体。

[0021] 以水稻干尖线虫Ab-far-1 RNAi载体为例，所述用于食真菌线虫基因的RNAi表达载体的构建方法如下：（1）构建双元载体pBS-1载体
pBHt2和 pSilent-1载体经EcoRI和XbaI双酶切后，纯化回收片段的末端用T4连接酶连接；质粒转化到大肠杆菌中进行扩繁，得到载体pBS-1；
（2）构建pBS-Ab-far2载体
以含Ab-far-1 cDNA全长的质粒为模板，用引物FARcm-F/FARcm-R扩增得PCR片段，经酶切处理的正向PCR片段插入到pBS-1载体中，形成pBS-Ab-far1载体；然后再将经酶切处理的反向PCR片段插入到pBS-Ab-far1载体形成pBS-Ab-far2载体。

[0022] 一种用于食真菌线虫基因RNAi的灰葡萄孢菌工程菌，通过根癌农杆菌介导将上述RNAi表达载体转化灰葡萄孢菌，鉴定获得所述灰葡萄孢菌工程菌。

[0023] 具体是：将农杆菌感受态细胞和所述RNAi表达载体质粒混合后，进行电击转化，并转化野生灰葡萄孢菌，野生灰葡萄孢菌孢子和含有所述RNAi表达载体质粒的农杆菌，在0.22μm微孔滤膜上22℃共培养48h，得到单个的转化子，分别接种到含100µg/ml潮霉素的PDA培养基上，筛选鉴定获得具有潮霉素抗性的灰葡萄孢菌工程菌。

[0024] 本发明提供了一种适用于食真菌线虫基因RNAi的真菌介导的新方法，同时进一步还明确给出了一种基于喂食转基因灰葡萄孢菌实现真菌介导的水稻干尖线虫Ab-far-1基因RNAi方法。水稻干尖线虫［Aphelenchoides besseyi Christie, 1942］是一种寄生植物地上部的迁移性植物线虫，分布广泛，能寄生超过200种植物，每年为害水稻造成约16亿美元的严重损失。脂肪酸和维生素A结合蛋白（fatty acid and retinoid binding protein，FAR）是线虫通过体壁分泌的一类既能结合脂肪酸又能结合维生素A（视黄醇）的蛋白，线虫在生长发育和侵染寄主的过程中通过分泌的FAR蛋白从环境中获得脂肪酸和维生素A来合成脂类和其他大分子结构。FAR蛋白是线虫特有的，迄今在哺乳动物和其他类群动物中尚未发现，因此该蛋白的研究对探索植物线虫防治新途径具有重要意义。本发明为该基因蛋白的功能研究提供了一种很有效的工具和方法。

[0025] 本发明以水稻干尖线虫Ab-far-1基因为例，通过根癌农杆菌介导将水稻干尖线虫Ab-far-1基因dsRNA转入灰葡萄孢菌，构建了表达Ab-far-1 dsRNA的灰葡萄孢菌工程菌株，水稻干尖线虫取食该工程菌后Ab-far-1表达被有效沉默，繁殖量和致病力明显降低，并且Ab-far-1沉默及其功能抑制效应具有持效性和可遗传性。

[0026] 另外，灰葡萄孢菌分布广、易培养，全基因组序列已经测出，遗传背景相对清楚，因此灰葡萄孢菌是一种很好的功能基因组研究材料。许多滑刃类线虫和茎属线虫如水稻干尖线虫、菊花叶枯线虫、草莓滑刃线虫、松材线虫、腐烂茎线虫和鳞球茎茎线虫等可以取食灰葡萄孢菌完成生活史，因此，本发明方法的适应性十分广泛。

[0027] 本发明具有以下有益效果：本发明为可取食真菌植物线虫和其他食真菌线虫的RNAi提供了一种真菌介导的新方法，即一种基于喂食灰葡萄孢菌的可食真菌线虫基因RNAi方法，能够有效实现水稻干尖线虫等食真菌线虫的基因沉默，对该类线虫功能基因的研究具有重要的意义。

[0028] 而且，该方法还具有如下优势：（1）持效性和可遗传性：与dsRNA溶液浸泡的RNAi方法进行比较，本发明方法产生的沉默效应具有持效性和可遗传性。

[0029] （2）操作简便，效率高：根癌农杆菌介导的真菌遗传转化的操作简便、转化率高、重复性好、周期短。

[0030] （3）材料易获得，遗传背景清楚：灰葡萄孢菌分布广、易培养，全基因组序列已经测出，遗传背景相对清楚，因此将灰葡萄孢菌做为介导载体有利于对靶标生物的功能基因组研究。

[0031] （4）应用范围广：适用于食真菌线虫，如滑刃类线虫和茎属线虫（菊花叶枯线虫、草莓滑刃线虫、松材线虫、腐烂茎线虫和鳞球茎茎线虫等）等，可以取食灰葡萄孢菌完成生活史，因此该方法可以广泛应用于这些植物线虫及其他可食真菌线虫。附图说明

[0032] 图1为双元载体pBS-1、pBS-Ab-far1和pBS-Ab-far2的构建图；两个多克隆位点XhoI, SnaBI, HindIII和 BglII, SphI, StuI, KpnI位于内含子的两侧，分别含有一个潮霉素抗性基因、Aspergillus nidulans trpC启动子和一个卡那霉素基因。

[0033] 图2为转基因灰葡萄孢菌的分子鉴定；（A）载体pBS-Ab-far1的酶切结果，1为pBS-1载体EcoRI酶切结果；2-3为正向PCR片段XhoI和SnaBI双酶切结果；（B）载体pBS-Ab-far2的酶切结果，1为pBS-Ab-far1载体EcoRI酶切结果；2-3为反向PCR片段BglII和StuI双酶切结果。

[0034] 图3为转基因灰葡萄孢菌单株系的PCR分子鉴定结果；M为Mark 2000，B为空白对照，V为载体 pBS-Ab-far2，1-6为转pBS-Ab-far2灰葡萄孢菌菌株。

[0035] 图4为转基因灰葡萄孢菌的Southern鉴定结果；W为来源于野生灰葡萄孢菌的DNA，V为pBS-Ab-far2载体EcoRI酶切结果，2, 3, 6分别为转pBS-Ab-far2灰葡萄孢菌菌株。

[0036] 图5为水稻干尖线虫取食转基因灰葡萄孢菌后的繁殖量和Ab-far-1表达量；（A）水稻干尖线虫在转基因灰葡萄孢菌上的繁殖量，（B）水稻干尖线虫取食转基因灰葡萄孢菌上后Ab-far-1表达量，CK1为线虫取食野生灰葡萄孢菌，CK2为线虫取食转egfp dsRNA 的灰葡萄孢菌，E1为线虫取食转Ab-far-1 dsRNA的灰葡萄孢菌，相同字母表示在p>0.05水平上差异不显著。

[0037] 图6为水稻干尖线虫在拟南芥上的繁殖量及其Ab-far-1的表达量；（A）水稻干尖线虫在拟南芥上的繁殖量；（B）水稻干尖线虫对拟南芥的危害严重度；（C）水稻干尖线虫Ab-far-1的表达量； CK1: 取食野生型灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫，CK2: 取食转egfp dsRNA灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫，E1: 取食转Ab-far-1 dsRNA灰葡萄孢菌的水稻干尖线虫，相同字母表示在p>0.05水平上差异不显著。

具体实施方式

[0038] 以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，所采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

[0039] 以下实施例以水稻干尖线虫Ab-far-1基因为例进行试验。

[0040] 实施例1 RNAi载体的构建和农杆菌介导转化灰葡萄孢菌1、水稻干尖线虫Ab-far-1 RNAi载体的构建方法
（1）双元载体pBS-1载体构建
以含潮霉素抗性（由构巢曲霉启动子启动）的pBHt2和pSilent-1为骨架构建双元载体pBS-1，具体方法为：pBHt2和 pSilent-1载体（如图1）经EcoRI和XbaI双酶切后，纯化回收片段的末端用T4连接酶连接。质粒转化到大肠杆菌中进行扩繁，经测序验证准确的质粒pBS-1用于后续研究。

[0041] （2）pBS-Ab-far2载体构建以含Ab-far-1 cDNA全长的质粒为模板，用引物FARcm-F/FARcm-R扩增到一个283bp的片段。经XhoI 和 SnaBI双酶切处理的正向PCR片段插入到pBS-1载体中，形成pBS-Ab-far1载体（如图1）。

[0042] FARcm-F和FARcm-R的引物序列如下：引物FARcm-F（SEQ ID NO.1）:
5’-GAAGGCCTCTCGAGTACGCCGAACTTACCGATGAA-3’
引物FARcm-R（SEQ ID NO.2）:
5’-GAAGATCTTACGTACAAGTCTGGCTTCTCTTCACCC-3’
然后经BglII和 StuI双酶切处理的反向PCR片段插入到pBS-Ab-far1载体形成pBS-Ab-far2载体（如图1）。

[0043] 另外，一个来源于PYL 322-d1-GFPn质粒（华南农业大学生命科学学院刘耀光教授赠予）片段经扩增后，按照上述方法分别构建pBS-eGFP1和 pBS-eGFP2载体。

[0044] （3）农杆菌介导转化灰葡萄孢菌农杆菌感受态细胞和pBS-Ab-far2载体质粒混合后，进行电击转化，并按照Rolland 等（2003）描述的ATMT方法转化野生灰葡萄孢菌（WTB）。野生灰葡萄孢菌孢子和含有pBS-Ab-far2质粒的农杆菌，在微孔滤膜（0.22μm）上共培养48h时的温度为22℃，得到单个的转化子，分别接种到PDA培养基上（含100µg/ml潮霉素），在25℃下培养备用。

[0045] 2、结果pBS-Ab-far1和pBS-Ab-far2载体酶切结果分别得到263bp和275bp的酶切片段，经测序确认其序列与Ab-far-1 cDNA片段的序列一致，说明Ab-far-1 dsRNA片段成功插入到构建的载体中（如图2中A图和B图）。

[0046] 共获得了20株具有潮霉素抗性的转基因灰葡萄孢菌，其中包括6株转pBS-Ab-far2灰葡萄孢菌（ARTB）和14株转pBS-eGFP2灰葡萄孢菌（GRTB）。

[0047] 实施例2 转基因灰葡萄孢菌分子鉴定1、检测方法
提取转基因真菌（转基因灰葡萄孢菌）的基因组DNA后，用引物hph-F/hph-R、Hpt-F/Hpt-R、Pa-F/Pa-R、FARcm-F/FARcm-R进行转化子的筛选和鉴定。以含Ab-far-1 cDNA全长的质粒为模板，用引物FARcm-F 和 FARcm-R进行 PCR 扩增，DIG 标记的扩增产物纯化回收后，作为Southern杂交检测的探针。

[0048] 所述引物序列如下：引物hph-F（SEQ ID NO.3）: 5’-TGCGCCCAAGCTGCATCAT-3’
引物hph-R（SEQ ID NO.4）: 5’-TGAACTCACCGCGACGTCTGT-3’
引物Hpt-F（SEQ ID NO.5）: 5’-GCAGCGAAATGCGATAAG-3’
引物Hpt-R（SEQ ID NO.6）: 5-TCCGAGGTCAACCATAGAAA -3’
引物Pa-F（SEQ ID NO.7）: 5’-GACAGGAACGAGGACATT-3’
引物Pa-R（SEQ ID NO.8）: 5’-GAGGTAAACCCGAAACG-3’
2、检测结果
ARTB的PCR检测结果显示（图3中A图和B图），以Pa-F/Pa-R、FARcm-F/FARcm-R、Hpt-F/Hpt-R 和 hph-F/hph-R 为引物，分别扩增得到596bp（载体片段）、283bp（目的基因片段）、
271bp（灰葡萄孢菌ITS序列）和858bp（潮霉素片段）的条带。

[0049] Southern杂交结果显示（图4），三株ARTB均为单拷贝，表明外源基因整合到灰葡萄孢菌基因组中。

[0050] 实施例3 水稻干尖线虫在转基因灰葡萄孢菌上的繁殖及其Ab-far-1基因表达1、实验方法
GRTB和ARTB分别接种到含有潮霉素的PDA平板上，以WTB接种PDA平板作为空白对照。分别接种20条水稻干尖线虫雌虫，培养28天后，分离统计线虫数量。提取线虫混合虫态的RNA后，反转录合成cDNA。利用特异性引物qPCR1-F/qPCR1-R 和内参引物18S-F/18S-R检测Ab-far-1基因的表达量。

[0051] 所述引物序列如下：引物qPCR1F-F（SEQ ID NO.9）: 5’-TCGCTCTTCTGTCTTGCCATG-3’
引物qPCR1F-R（SEQ ID NO.10）: 5’-GATGGATTTGTCTTCATCGGTA-3’
引物18S-F（SEQ ID NO.11）: 5’-CCGAAAGGAGATGGCAAAC-3’
引物18S-R（SEQ ID NO.12）: 5’-ACAAAGGGCAGGGACGTAA-3’
2、结果分析
水稻干尖线虫接种在ARTB、GRTB和WTB上培养28天后繁殖量由小到大的处理是ARTB（7704±175.39）、GRTB（12824±180.29）和WTB（19924±632.81），ARTB处理的线虫繁殖量分别是后二者的60.07%和38.67%，各处理间差异显著（P<0.05）（图5中A图）。

[0052] qRT-PCR检测结果表明（图5中B图），ARTB培养线虫的Ab-far-1 表达量与GRTB和WTB培养线虫的Ab-far-1 表达量相比，分别显著下降了68.72%和70.85%（P<0.05），GRTB和WTB培养线虫的Ab-far-1 表达量差异不显著。

[0053] 实施例4 灰葡萄孢菌介导的水稻干尖线虫Ab-far-1 RNAi的持效性和可遗传性1、实验方法
为检测灰葡萄菌介导的Ab-far-1基因沉默的持效性和可遗传性，分别从ARTB、GRTB和WTB上分离100条混合虫态的水稻干尖线虫接种到拟南芥叶片上，接种21天后，检测拟南芥发病严重程度，分离统计线虫的数量。对分离得到的线虫Ab-far-1基因的表达量进行qRT-PCR检测和分析。

[0054] 2、结果分析ARTB处理的线虫数量（1744±103.14），分别是GRTB和WTB处理线虫数量的67.70%和
65.66%，差异显著（P<0.05），GRTB和WTB处理线虫数量无显著差异（P>0.05）（图6中A图）。

[0055] 用ARTB培养的线虫接种的拟南芥受害症状严重度为3.02±0.06，显著低于GRTB和WTB培养线虫的接种处理（P<0.05）（图6中B图）。

[0056] qRT-PCR检测结果表明（图6中C图），ARTB培养的水稻干尖线虫在拟南芥上寄生繁殖的线虫Ab-far-1表达量与GRTB和WTB处理的Ab-far-1表达量相比，分别显著下降了43.72%和48.10%（P<0.05），后两个处理线虫Ab-far-1表达量差异不显著。

[0057] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

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