技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物技术领域，尤其涉及一种透明型低酰基结冷胶的提取方法。
背景技术
[0002] 结冷胶(GellanGum)是美国Kelco公司20世纪80年代开发的一种微生物食用胶。继黄原胶之后kelco公司开发的又一新型微生物胞外多糖，其凝胶性能比黄原胶更为优越。它是由假单脑杆菌伊乐藻属(Pseudomonaseloden)在中性条件下，以
葡萄糖为
碳源，
硝酸铵为氮源及一些无机盐所织成的培养基中，经有
氧发酵而产生的细胞外多糖胶质，是一种新型的全透明的凝胶剂。结冷胶是由四个糖分子依次为D-葡萄糖、D-葡萄糖
醛酸、D-葡萄糖、L-鼠李糖通过糖苷键连接而成的高分子糖类化合物，其中第一个葡萄糖分子是以β-1，4糖苷键连接。山于结冷胶具有优越的凝胶性能，其被广泛的应用在食品领域，如奶制品、果肉饮料、果酱制品、布丁果冻及面包填料等，也应用在非食品领域中，如牙膏、药物的缓慢释放、微生物培养基等。结冷胶应用在奶制品中，将结冷胶加热到70℃～75℃可直接
水合于奶中，在酸性奶制品中加入此种水溶胶充当胶体保护剂，可以消除奶制品中的
蛋白质絮凝及口感的作用；用于糖果中，可给产品提供优越的结构和质地，并缩短
淀粉软糖胶体形成的时间；结冷胶加入到饼干制品中可以减少饱和
脂肪酸的用量，并改良饼干的层次，使饼干具有良好的疏松度；结冷胶也可替代果胶制备果酱和果冻，也能用于糕点和水果馅饼填料中；在肉制品和蔬菜类的加工过程中，添加结冷胶可弥补产品的口味不足，使其具有清爽的品味特点。
[0003] 按照结冷胶多糖分子中乙酰基的含量通常将结冷胶产品分为两种：一种是低酰基结冷胶，通过对高酰基结冷胶作脱酰基或部分脱酰基处理得到，水化后在阳离子作用下易形成脆性凝胶；另一种是高酰基结冷胶，即天然结冷胶，水化后易形成粘弹性凝胶。低酰基结冷胶根据透明度可分为透明型和非透明型，主要由菌体碎片、杂质蛋白和多糖的残余量的多少导致透明程度。CN201310134689公开了一低酰基非清型结冷胶的提取方法，该方法只针对非透明型低酰基结冷胶，而该工艺存在很多技术
缺陷，例如该工艺制备的结冷胶纯度较低并且产生了大量的废物，造成了坏境污染。如何开发一种结冷胶的产量高、透明度高以及工业能耗低的绿色提取工艺实
现有技术急待解决的技术问题。
发明内容
[0004] 为了克服现有技术的不足，提高低酰基结冷胶的产量和透明度，节省原料以及生产工艺中的废物
回收利用，本发明提供了一种透明型低酰基结冷胶的提取方法，包括以下制备步骤：
[0005] 第一步，发酵：将混合菌液(少动鞘脂单胞菌液和短小芽孢杆菌液重量比为8：1，8
两种菌液中菌体的浓度均为1×10个/mL)按照8％(体积比)的接种量接入
种子罐中进行培养，在
温度为30℃，PH值7.2的条件下，培养24小时得到液体A，然后按液体A：
发酵罐培养基为1：10的体积比例转入发酵罐中培养，温度30℃，PH值7.2，培养时间72小时，得到发酵液；其中，种子罐培养基的组分为：
蔗糖25g，蛋白胨5g，
硫酸铵4.0g，
酵母膏3.0g，
柠檬酸3.5g，碳酸
钙2.0g，蒸馏水1000ml；发酵罐培养基的组分为：蔗糖40g，蛋白胨8g，
磷酸二氢
钾3g，柠檬酸2.5g，碳酸钙2.0g，
硫酸镁1g，蒸馏水1000ml；
[0006] 第二步，过滤：在第一步获得的发酵液内同时加入
硅藻土和气相
二氧化硅的混合物，边添加边搅拌，搅拌10min，搅拌速度为100r/min，然后用板框过滤，分别收集过滤后的滤液和菌体；其中所述混合物的添加量为发酵液重量的0.5％，所述
硅藻土和气相二氧化2
硅的
质量比为3：1；所述气相二氧化硅的
比表面积为200m/g以上；
[0007] 第三步，脱酰基和絮凝沉淀：向第二步得到的滤液中加入液
碱调节pH为10，升温至90℃～95℃，维持30～40分钟，进行脱酰基处理，然后降至室温；随后加入2～3倍体积的70％～90％
乙醇，混合均匀，然后经
膜过滤除去废液，得到絮
凝结冷胶；并且低温旋转
蒸发回收废液中的乙醇后，得到液体B；将上述絮凝结冷胶重新分散和溶解于水，得到结冷胶液体，然后加入结冷胶液体体积6％～7％的饱和
氯化钠溶液，沉淀析出结冷胶；
[0008] 第四步，再次絮凝：将第三步析出的结冷胶按照1g结冷胶：100ml水的的比例重新溶于水中，得到结冷胶液体，然后加入占结冷胶液体2倍体积的80％乙醇，混合均匀，然后经膜过滤除去废液，得到絮凝结冷胶；
[0009] 第五步，
压榨干燥：将第四步得到的絮凝结冷胶经螺杆式压榨机，去除多余的水分，得湿品结冷胶；然后将湿品结冷胶干燥、
粉碎即得透明型低酰基结冷胶；
[0010] 第六步，废物利用：将第二步获得的菌体以及第三步获得的液体B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、
高粱粉、豆渣以及麦麸，边添加边搅拌至糊状；最后通入
蒸汽升温至110℃，蒸馏15分钟；然后将蒸馏物烘干、粉碎后，添加硫酸锌、维生素E以及
绿原酸，混合均匀，获得猪
饲料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸分别占混合溶液质量的6％，5％，2％和1％，硫酸锌、维生素E以及绿原酸分别占混合溶液质量的万分之一。
[0011] 本发明还公开了一种生产透明型低酰基结冷胶的复合菌液，其由少动鞘脂单胞菌8
液和短小芽孢杆菌液按照重量比为8：1混合而成，两种菌液中菌体的浓度均约为1×10个/mL。
[0012] 本发明使用的少动鞘脂单胞菌和短小芽孢杆菌为本领域常用的菌株，优选少动 鞘脂 单 胞菌Sphingomonas paucimobilis(ATCC31461，参见 J Ind Microbiol Biotechnol.2002Oct；29(4)：170-6.)和短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)(ATCC27142，参见Journal of Food Protection1995，Volume58，Number4)。
[0013] 本发明取得的有益效果主要如下：
[0014] 通过多次试验和研究，开拓性地在少动鞘脂单胞菌发酵中添加了合适比例的短小芽孢杆菌，使得短小芽孢杆菌能够有效地降解少动鞘脂单胞菌产生的各类酸性物质，并且使得发酵液始终维持在弱碱性条件下，保持少动鞘脂单胞菌发酵效果维持在较高的状态，提高了结冷胶的产量；适当地提高短小芽孢杆菌的比例可以提高结冷胶的透明度，但是对结冷胶的产量会有一定的影响；
[0015] 少动鞘脂单胞菌发酵产生结冷胶的最佳pH为7.2左右，但是在发酵过程中会产生多种酸性物质，包括羟基丁酸等，类酸性物质容易掺杂在结冷胶中而不容易被析出，造成结冷胶的透明度下降，而短小芽孢杆菌通过与少动鞘脂单胞菌的协同共生，促进了结冷胶的生成，并且降低了结冷胶中各类酸性物质的含量，提高了结冷胶的纯度和透明度；
[0016] 发酵液中无需添加pH调节剂，减少了原料的浪费，节约了成本；提取过程中减少了现有技术中其他提取方法使用的各类化学物质，避免了将化学物质带入到结冷胶中；
[0017] 在后序处理过程中本发明采用反复多次乙醇絮凝提纯的方式避免了多价金属阳离子的使用，从而避免了结冷胶成品掺入过多的杂质，保证了结冷胶的纯度和透明度，提纯过程中所用的乙醇可以回收再利用，降低了生产成本；
[0018] 在提取结冷胶的过程中，对菌体蛋白、大分子多糖等进行了回收，避免了此类物质的废液对环境造成的污染；同时，获得了营养丰富的菌体蛋白饲料，变废为宝，增加经济效益；同时实现了结冷胶提取过程绿色环保，几乎无
废水外排，料液组分充分利用。
具体实施方式
[0019] 以下将采用具体的
实施例来对本发明作进一步的解释，但是不应当看作是对本发明创新精神的限制。
[0020] 实施例1
[0021] 一种透明型低酰基结冷胶的提取方法，包括以下制备步骤：
[0022] 第一步，将混合菌液(少动鞘脂单胞菌液(ATCC31461)和短小芽孢杆菌液8
(ATCC27142)重量比为8：1，两种菌液中菌体的浓度均为1×10个/mL)按照8％(体积比)的接种量接入种子罐中进行培养，在温度为30℃，PH值7.2的条件下，培养24小时得到液体A，然后按液体A：发酵罐培养基为1：10的体积比例转入发酵罐中培养，温度30℃，PH值7.2，培养时间72小时，得到发酵液；其中，种子罐培养基的组分为：蔗糖25g，蛋白胨
5g，硫酸铵4.0g，酵母膏3.0g，柠檬酸3.5g，碳酸钙2.0g，蒸馏水1000ml；发酵罐培养基的组分为：蔗糖40g，蛋白胨8g，磷酸二氢钾3g，柠檬酸2.5g，碳酸钙2.0g，硫酸镁1g，蒸馏水
1000ml；
[0023] 第二步，在第一步获得的发酵液内同时加入硅藻土和气相二氧化硅的混合物，边添加边搅拌，搅拌10min，搅拌速度为100r/min，然后用板框过滤，分别收集过滤后的滤液和菌体；其中所述混合物的添加量为发酵液重量的0.5％，所述硅藻土和气相二氧化硅的2
质量比为3：1；所述气相二氧化硅的比表面积为200m/g以上；
[0024] 第三步，向第二步得到的滤液中加入液碱调节pH为10，升温至90℃～95℃，维持30～40分钟，进行脱酰基处理，然后降至室温得到脱酰基溶液；随后往脱酰基溶液中加入占脱酰基溶液2～3倍体积的70％～90％乙醇，混合均匀，絮凝结冷胶；然后经膜过滤除去废液，得到絮凝结冷胶；并且低温
旋转蒸发回收废液中的乙醇后，得到液体B；将上述絮凝结冷胶重新分散和溶解于水，得到结冷胶液体，然后加入结冷胶液体体积6％～7％的饱和氯化钠溶液，沉淀析出结冷胶；
[0025] 第四步，将第三步析出的结冷胶按照1g结冷胶：100ml水的的比例重新溶于水中，得到结冷胶液体，然后加入占结冷胶液体2倍体积的80％乙醇，混合均匀，然后经膜过滤除去废液，得到絮凝结冷胶；
[0026] 第五步，将第四步得到的絮凝结冷胶经螺杆式压榨机，去除多余的水分，得湿品结冷胶；然后将湿品结冷胶干燥、粉碎即得透明型低酰基结冷胶；
[0027] 第六步，将第二步获得的菌体以及第三步获得的液体B混合得到混合溶液，然后往混合溶液中添加玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸，边添加边搅拌至糊状；最后通入蒸汽升温至110℃，蒸馏15分钟；然后将蒸馏物烘干、粉碎后，添加硫酸锌、维生素E以及绿原酸，混合均匀，获得猪饲料；其中，玉米粉、高粱粉、豆渣以及麦麸分别占混合溶液质量的6％，5％，2％和1％，硫酸锌、维生素E以及绿原酸分别占混合溶液质量的万分之一。
[0028] 实施例2
[0029] 实施例1制备的透明型低酰基结冷胶的性能参数：
[0030] 对照组：仅采用少动鞘脂单胞菌发酵生产结冷胶，其他步骤同实施例1；实验组为实施例1制备的结冷胶。分子量测定(酸碱滴定法测定结冷胶中酰基的含量)：对照组低酰基的分子量为71万道尔顿，实验组的结冷胶的平均分子量在72万道尔顿。
[0031] 凝胶强度的测定：用TA.TX21物性测试仪进行测定透光率的测定；
[0032] 透光率的测定：称取0.5样品，加蒸馏水100ml，将烧杯置于80摄氏度水浴中，样品溶解后加入2.7％的
氯化钙溶液2ml，补充蒸发水量至原体积，趁热将胶溶液倾入比色皿，立即放入20摄氏度的恒温箱中放置15分钟，用分光光度计在497nm处测定透光率，用蒸馏水对照。具体参见表1：
[0033] 表1
[0034]
[0035] 实施例3本发明猪饲料的试验：
[0036] 经检测，实施例1制备的猪饲料蛋白含量35.2％，多糖类物质含量24.1％，无机矿物质含量2.7％，其余为淀粉、
纤维素及少量微量元素等。
[0037] 选取一个月大的断奶仔猪120头，分为两个组别，每组60头，其中实验组用本发明制备的饲料饲养，每50kg为210元，对照组用正大饲料(SSB-25型号)，按照每50kg为300元计算。饲养6周之后检测各项指标参见表1。
[0038] 表1
[0039]指标(每头仔猪) 对照组 本发明组
断奶仔猪体重(kg) 5.12 5.08
6周增加的体重(kg) 13.25 14.86
消耗饲料(kg) 17.2 17.3
喂养饲料成本(元) 103.2 72.7
[0040] 结论：本发明利用废料制备的猪饲料成本明显低于市场常用饲料，而且体重的增加也大于对照组。
[0041] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发
