权利要求

植物病原体的管理发明背景 发明领域本发明一般涉及控制植物病原体，包括植物病虫害，的多面性方 法。更具体地，本发明涉及经遗传修饰产生至少两种杀病虫害药剂或 抑病虫害药剂的植物例如作物植物，其中所述药剂联合赋予所述植物 对植物病虫害的增强抗性或降低的易感性。本发明还提供编码所述杀 病虫害药剂或抑病虫害药剂的遗传构建体以及包含这些药剂的组合 物。综合的植物病虫害管理策略也是本发明的一部分。现有技术描述在本说明书中提及的出版物的文献细节收集在本说明书末尾。 在本说明书中提及任何现有技术并不是，且不应视为，承认或以 任何形式暗示该现有技术在任何国家构成普通常识的部分。植物病原体（包括昆虫害和真菌）是导致农作物损失的主要因素。例如，据估计在美国仅欧洲玉米螟（European corn borer)就造成玉米 栽培业每年有多达十亿美元消耗在损失的产量和控制措施上。 一种尤 其重要的农作物是棉花。在许多国家棉花业是一种正在快速增长的经 济作物，例如，在澳大利亚，每年纺大约200， 000包棉花。这其中， "%用于出口。然而，棉花植物易于受到众多病虫害的侵害，单在澳 大利亚用于控制病虫害对棉花的侵扰的花费就以几千万美元计。传统上，控制植物病虫害例如昆虫的主要方法是使用各种i脊的化 学杀昆虫剂和杀真菌剂。然而，由于环境、管理和健康原因，目前不 鼓励对作物使用化学药品。实际上，许多广傳化学药品已经被禁止使 用或者它们的应用被严格地限制于特定作物或者特定农业区域。急需 开发用于控制和管理作物病虫害（包括昆虫和真菌）的备选策略。一种方法是使用更天然的药剂。 一种此类药剂是丝氨酸蛋白酶抑 制剂。它们的贮藏器官中以及在叶中累积丝氨酸蛋白酶抑制剂（Brown和 Ryan, Biochemistry 23: 3418-3422， 1984; Richard Phytochemistry 16: 159-169， 1977)。这些蛋白质对广泛的微生物和动物来源的蛋白 酶具有抑制性活性，但是该抑制性活性很少针对植物蛋白酶 (Richardson, 1977，见上文）。这些抑制剂被认为参与到植物对病原 体和捕食者的防御中。在马铃薯块茎和豆类作物的种子中，这些抑制 剂可以占贮藏蛋白的10%或更多（Richardson, 1977，见上文），而在 番茄和马铃薯（Green和Ryan, Science 776-777， 1972)及紫花苜蓿 (Brown和Ryan, 1984，见上文）的叶中，蛋白酶抑制剂可以在昆虫攻 击或者其它类型损伤的48小时内累积至可溶性蛋白质的2%的水平 (Brown和Ryan, 1984,见上文；Graham等，Plants 169: 399-405， 1986)。野生番茄，秘鲁番茄（Lycopersicon peruvianum)的未成熟果 实中也存在高水平的这些抑制剂（多达总可溶性蛋白的50%) (Pearce 等，Planta 175: 527-531， 1988)。在番茄和马铃薯中存在两个丝氨酸蛋白酶抑制剂家族（Brown和 Ryan, l984，见上文）。I型抑制剂是小蛋白（单体Mr 8100)，在单个 活性位点抑制胰凝乳蛋白酶（Melville和Ryan, Archives of Biochemistry and Biophysics 138: 700-702， 1970; Plunkett等， Arch Biochem Biophys 213: 463-472， 1982)。 II型抑制剂家族一般 含有两个活性位点，其中一个抑制胰凝乳蛋白酶而另一个抑制胰蛋白 酶（Bryant等，Biochemistry 15: 3418-3424， 1976; Plunkett等， 1982，见上文）。II型抑制剂具有12, 300的单体Mr (Plunkett等， 1982，见上文）。蛋白酶抑制剂I在黄化的烟草（Nicotiana tabacum) 叶中累积（Kuo等，Arch Biochem Biophys 230: 504-510， 1984)，并 且发现来自烟草寄生疫霉（Phytophthora parasitica Var. nicotianae)的诱导子（el ici tor)可以在烟草细胞悬浮培养物中诱导Rickauer等，Plant Physiol 9: 1065-1070， 1989)。来自烟草的丝氨酸蛋白酶抑制剂前体NaPI已经得到尤其充分的 表征并用于病虫害控制（见美国专利6, 031,087 、 6， 440， 727 、 6， 451， 573和6， 261， 821号，所有这些专利并入此处作为参考）。某些微生物物种也已知具有针对广镨病虫害（包括鳞翅目 (Lepidoptera)、双翅目（Diptera)、鞘翅目（Coleptera)、半翅目 (Hemiptera)等）的杀病原体活性。苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis)和金龟子芽孢杆菌（Bacillus papilliae)是两种特 别有用的生物控制剂。杀病虫害活性集中于伴胞晶体蛋白包函体中， 但是也已经自营养生长阶段的芽孢杆菌分离到杀病虫害蛋白。已经克 隆和表征了编码杀病虫害蛋白的几种基因（见美国专利5， 366， 982和 5， 840， 868号）。已经对玉米和棉花植物进行遗传工程化改造以产生来自苏云金芽孢杆菌的杀病虫害5-内毒素和晶体毒素（crytoxins) (AronsonCellMol Life Sci 59 (3): 417-425, 2002; Schnepf等，Microbiol Mol BiolRev 62 (3): 775-806， 1998)。尽管有生物控制剂的成功，但是总是存在抗性发生的危险。此外， 也存在与单种药剂的细胞毒性相关的一些变异性。需要开发在植物中用于病虫害控制的替代策略。发明概述在整个本说明书中，除非上下文有不同要求，否则措词"包含" 或其变体例如"含有"或"包括"将理解为意味着包括已经指出的项 目或整体或者项目或整体的組但不排除任何其它的项目或整体或者项 目或整体的组。根据本发明，提供一种用于在植物，尤其是农作物中进行病虫害 控制的多面性方法。在该方法中，源于生物来源的杀病虫害药剂或抑 病虫害药剂组件（modules )在植物或组合物中联合。其中至少一种药剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂或其前体，而至少 一种其它药剂以不同于蛋白酶抑制剂的方式起作用。 一般地，至少一种药剂是Bt蛋白，例如 Cry家族蛋白营养期杀昆虫蛋白（Vegetative Insecticidal Protein ， VIP)或者是防卫素样分子。 一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制 剂来自于茄科（Solanaceae)，例如但不限于来自烟草的NaPI。 一般 将编码所述杀病虫害药剂或抑病虫害药剂的遗传物质引入期望植物 中，然后该植物在遗传上被赋予产生该杀病虫害药剂或抑病虫害药剂 的能力。两种或两种以上的杀病虫害药剂或抑病虫害药剂组件相联合 可以赋予增强的、增加的、更稳定的、更有效的、更大的杀病虫害或 抑病虫害活性、更广的病虫害镨和/或对病虫害侵扰的更长时间的持久 抗性或降低的易感性。"病虫害"包括任何植物病原体或者昆虫或者 任何带有丝氨酸蛋白酶的因子。植物病虫害的实例包括真菌、酵母和 昆虫。本发明尤其考虑的昆虫组包括例如铃夜蛾属（He 1 i coverpa)、 Leptiderpa、鞘翅目、双翅目、直翅目（Orthoptera)、杆草螟属 (Diatraea)和Spocloptera。因此，本发明一方面提供经遗传修饰产生至少两种杀病虫害药剂 或抑病虫害药剂的植物，其中至少 一 种药剂是丝氨酸蛋白酶抑制剂或 其前体，其中以前体形式包含至少3个单体，其中至少一个单体是胰 蛋白酶抑制剂而至少 一个其它单体是胰凝乳蛋白酶抑制剂，并且其中 至少 一种其它药剂不是丝氨酸蛋白酶抑制剂。更特别地，本发明提供遗传修饰的植物或其由自交、回交或与另 一植物的杂交获得的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害药剂和/ 或抑病虫害药剂，其中至少一种所述药剂由所述遗传修饰或交配所产 生，其中至少一种药剂是来自茄科的丝氨酸蛋白酶抑制剂或其前体， 其中它以前体形式包含至少3个单体，其中至少一个单体是胰蛋白酶 抑制剂并且至少一个单体是胰凝乳蛋白酶抑制剂，并且其中至少一种 其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述植物对病虫害表现出抗 性或降低的易感性。在一个优选实施方案中，丝氨酸蛋白酶抑制剂或前体来自烟草，并称作NaPI。另一优选实施方案中，其它药剂是内毒素，例如Bt蛋 白，包括Cry家族蛋白、Cry、 VIP，或是防卫素或其成分。提及防卫 素包括单独的或者与异源蛋白质融合的其N端部分、酸性尾和/或中央 部分。因此，本发明另一方面提供遗传修饰的植物或其通过自交、回交 或与另一植物的杂交而产生的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害 药剂和/或抑病虫害药剂，其中所述药剂中的至少一种由所述遗传修饰 或交配所导致，其中至少一种药刑是NaPI前体或其单体或其重组物或 衍生物，并且其中至少一种其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中 所述植物对病虫害表现出抗性或降低的易感性。本发明一方面考虑遗传修饰的植物或其通过自交、回交或与另一 植物杂交而产生的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害药剂和/或抑 病虫害药剂，其中所述药剂中的至少一种由所述遗传修饰或交配所导 致，其中至少一种药剂是来自茄科的丝氨酸蛋白酶抑制剂或其前体， 其中它以前体形式包含至少3个单体，其中至少一个单体是胰蛋白酶 抑制剂且至少一个单体是胰凝乳蛋白酶抑制剂，并且其中至少一种其 它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述植物对病虫害表现出抗性 或降低的易感性，只是其中至少一种其它药剂是Bt家族蛋白，例如 Cry家族蛋白或防卫素。Cry蛋白的实例包括Cry9、Cry2、Cry3、CrylAc、 VIP。更特别地，本发明涉及遗传修饰的植物或其通过自交、回交或与 另一植物的杂交而产生的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害药剂 和/或抑病虫害药剂，其中所述药剂中的至少 一种由所述遗传修饰或交 配所导致，其中至少一种药剂是NaPI前体或其单体或其重组物或衍生 物，并且其中至少一种其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述 植物对病虫害表现出抗性或降低的易感性，只是其中至少一种其它药 剂选自Bt蛋白和防卫素。Bt晶体蛋白的实例描述在Hofte和Whiteley Microbiol Reviews 53: 242-255， 1989中。本发明还提供编码所述至少两种杀病虫害药剂或抑病虫害药剂的 两个或两个以上遗传构建体，或者编码所述至少两种药剂的单一构建 体。此外，本发明还考虑能通过例如喷雾、涂抹、撒粉或微粉化的蒸 气应用于作物、叶、种子、花或根的、含有所述至少两种药剂的组合 物。经遗传修饰产生所述至少两种杀病虫害药剂或抑病虫害药剂的作 物的部分、繁殖部分、果实、种子、花和收获的部分也是本发明的一 部分。附图简述图1图示食用包被有CrylAc的棉花叶圆盘后存活的幼虫的质量。 对照叶圆盘来自cv Coker;待测叶圆盘来自NaPI基因纯合的cv Coker。 (注：对叶进行选择以便仅给出幼虫体重的小的降低。）图2图示食用包被有CrylAc的棉花叶圆盘后存活的幼虫的质量。 对照叶圆盘来自cv Coker;待测叶圆盘来自NaPI基因纯合的cv Coker。图3图示喂给包被有CryHc的棉叶后幼虫的死亡率。对照叶圃盘 来自cv Coker;待测叶圆盘来自表达NaPI基因的cv Coker。图4图示从第11天至第12天（大约20个小时）幼虫的平均体重。 误差条表示平均值的标准误。图5图示自第11天至第12天幼虫质量的平均增加值。误差条表 示平均值的标准误。发明详述本发明提供一种用于在植物，尤其是作物植物中控制病虫害的多 面小生方法。提及"多面性方法"意味着在靶病虫害或病虫害组对植物侵扰或 者企图侵扰开始时或期间，联合使用两种或两种以上药剂对靶病虫害 或病虫害组实现杀病虫害或抑病虫害效果。该多面性方法为组件化设 计，因为每种杀病虫害药剂或抑病虫害药剂均被认为是一个组件成分。在整个病虫害管理系统中使用多个不同的组件成分。"抑病虫害（pestistatic)"意味着降低病虫害的生长或繁殖或 建群能力但该病虫害的死亡不是必需的。尽管杀病虫害活性是优选的， 但是抑病虫害效果也是可以接受的并是本发明的一部分。本文中，"杀病虫害活性"包括"杀昆虫活性"（当耙病虫害是昆 虫时）或者"杀真菌活性"（当靶病虫害是真菌时）或"杀细菌活性"（当 靶病虫害是细菌时）或"杀线虫活性，，（当靶病虫害是线虫时）。这些术 语指药剂（也称作"杀病虫害组件成分"）对抗病虫害的活性。该活性 可以方便地基于在暴露于药剂之后对病虫害死亡率、病虫害体重减轻、 病虫害排斥及病虫害的其它行为、生理和/或物理变化（包括消化蛋白 的能力、生长、维持自身和/或繁殖的能力）的影响来测量。因此，所 述药剂对病虫害的健康有不利影响，这可以通过至少一个可测量参数 来确定。根据本发明，至少两种药剂影响病虫害的健康，该影响可以 是加性的或协同性的或者以其它方式互补的。因此，所述至少两种药剂可以对可测量的病虫害健康参数表现出 相同的作用，或者联合效应可以不同于每种药剂的各自效应。此外， 至少一种药剂可以表现出杀病虫害活性而另一种药剂可以表现出抑病 虫害活性。然而，优选地，两种药剂均是杀病虫害的，或者它们的联 合效应是杀病虫害的。所述药剂当其在植物细胞中产生时在性质上是蛋白质，但是当掺 入杀病虫害或抑病虫害組合物中时其可以被化学修饰。因此，所迷药 剂可以是如此处所述的肽、多肽、或蛋白质或者是化学类似物或化学 模拟物或功能等价物。如上所述，药剂对病虫害产生效应，该效应可以被称作"影响"。 影响的实例包括在进食能力或习惯或容量、承受发育变化的能力上的 变化、细胞毒性、生长停滞、繁殖力下降、对卵或幼虫的影响、以及 病虫害的死亡或发病。此外，杀病虫害或抑病虫害活性的效力可以通 过在作物植物上产生的效应，例如生长产率、较少的病虫害、减轻的 病理来评价。以"有效杀病虫害的量，，或以"有效抑病虫害的量"向植物或者 在植物中提供本发明药剂。这些量指药剂在单独或者联合情况下可以 提供单种或整体杀病虫害或抑病虫害活性或其它适宜影响的量。本文中提及植物包括单子叶植物或双子叶植物，并且该植物可以 从遗传转化的愈伤组织或组织产生、或者可以是所转化的植物的后代 或者转化的植物或其后代与未转化的植物之间的杂种。本文中，术语 植物包括植物细胞、植物原生质体、能够再生植物的植物细胞组织培 养物、植物愈伤组织、植物块、以及植物中完好的植物细胞或植物部 分例如胚胎、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、核仁、穗、穗 轴、果壳、茎秆、根、根尖、花药等。目的植物的实例包括，但不限于，玉米（Zea mays)、芸萑属物种 (Brassica sp，）（例如，油菜（B， napus)、芜青（B. rapa)、芥菜（B. juncea)),尤其是可用作菜籽油来源的那些芸苔属物种、紫花苜蓿 (Medicago sativa)、稻(0ryza sativa)、 黑麦(Secale cereale)、 高梁(Sorghum bicolor， Sorghum vulgare)、 粟(例如，珍珠粟 (Pennisetum glaucum)、黍(Panicum miliaceum)、粟(foxtail millet, Setaria italica)、 糝子(finger millet, Eleusine coracana)、 向 曰葵(Helianthus annuus)、 红花(Carthamus tinctorius)、 小麦 (Triticum aestivum)、 大豆(Glycine max)、 烟草(Nicotiana tabacum)、马铃薯(Solarium tuberosum)、花生(Arachis hypogaea)、 棉(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、 甘薯(Ipomoea batatus)、 木薯(Manihot esculenta)、 咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、 cotton菠萝(Ananas comosus)、柑 橘树(Citrus spp.)、 可可(Theobroma cacao)、 茶(Camellia sinensis)、 香蕉(Musa spp.)、 聘梨(Persea americana)、 无花果 (Ficus casica)、 番石榴(Psidium guajava)、 芒果(Mangifera indica)、 橄榄(01ea europaea)、 番木瓜(Carica papaya)、腰果树 (Anacardium occidental)、 澳大利亚坚果 (Macadamia integrifolia)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗（Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。蔬菜包括番痴(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，Lactuca sativa)、 菜豆(Phaseolus vulgaris)、 利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆类（Lathyrus spp.)、以及甜瓜属（Cucumis)成员例 如黄瓜(C. sativus)、 罗马甜瓜(cantaloupe, C. cantalupensis)以 及甜瓜（C. melo)。观赏植物包括杜鹃（Rhododendron spp.)、绣球 (Macrophylla hydrangea)、 扶桑(Hibiscus rosasanensis)、 玫瑰 (Rosa spp.)、郁金香(Tulipa spp.) 、 7JC仙(Narcissus spp.)、碧冬 痴(Petunia hybrida)、 康乃舉(Dianthus caryophyllus)、 一品红 (Euphorbia pulcherrima)和菊花。可用于实践本发明的针叶树包括， 例如，；^如火炬木XPinus taeda)、湿地木XPinus eiliotii)、美国 黄松(Pinus ponderosa)、 小干松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata); 花旗松(Pseudotsuga menziesii); 加拿大铁杉(Tsuga canadensis);白云杉(Picea glauca); 红杉(Sequoia sempervirens); 真正的冷杉例如太平洋银冷杉（Abies amabilis)和香脂冷杉（Abies balsamea); 以及柏例如美国西部侧柏（Thuja plicata)和黄扁柏 (Chamaecyparis麵tkatensis)。本发明的植物包括作物植物（例如， 棉、玉米、紫花苜蓿、向日葵、芸苔属植物、大豆、棉、红花、花生、 高梁、小麦、粟、烟草等），例如玉米和大豆植物。草冲草包括，但不限于：早熟禾（Poa annua);多花黑麦草（Lolium multinorum); 加拿大早熟禾(Poa compressa); 紫羊茅(Festuca rubra); 细弱剪股颖（Agrostis tenuis); 匍旬蓊股颖（Agrost is palustris); 沙生冰草 (Agropyron desertorum); 扁穗冰草 (Agropyron cristatum); 硬羊茅(Festuca longifolia); 草地早熟 禾(Poa pratensis); 鸭茅(Dactylis glomerata); 黑麦草(Lolium perenne); 紫羊茅(Festuca rubra); 小糠草(Agrostis alba); 普通 早熟禾(Poa trivialis); 羊茅(Festuca ovina); 无芒雀麦(Bromus inermis); 高羊茅 (Festuca arundinacea); 猫尾草(Phleum pratense); 绒毛蓊股颖(Agrostis canina); 碱茅(Puccinelliadistans);蓝茎水草（Agropyron smithii);狗牙根（Cynodon spp.); 奥古斯汀草（Stenotaphrum secundatum);结缕草（Zoysia spp.); 巴 哈雀稗(Paspalum notatum); 地越草(Axonopus affinis); 百足草 (Eremochloa ophiuroides); 东非多良尾草(Pennisetum clandesinum); 海滨雀稗(Paspalum vaginatum); 格兰马草(Bouteloua gracilis); 野牛草（Buchloe dactyloids);垂穗草（Bouteloua curtipendula)。 目的植物包括提供目的种子的谷类植物、油籽植物和豆科植物。 目的种子包括谷粒，例如玉米、小麦、大麦、稻、高梁、黑麦、粟等。 油籽植物包括棉、大豆、红花、向日葵、芸苔属植物、玉米、紫花苜 蓿、棕榈、椰子、亚麻、蓖麻、橄榄等。豆科植物包括菜豆类（beans) 和豌豆类（peas)。菜豆类植物包括瓜尔豆（guar)、槐豆（locust bean)、 胡,巴(fenugreek)、 大豆、青刀豆(garden beans) 、 5t豆(cowpea)、 绿豆(mungbean)、 利马豆(lima bean)、 蚕豆(fava bean)、 扁豆 (lentil)、鹰嘴豆（chickpea)等。本文考虑的优选植物包括棉、甜玉米、番茄、烟草、甜椒 (piniento)、马铃薯、向曰葵、柑橘、李子、高梁、韭葱、大豆、紫 花苜蓿、菜豆类、木豆类（pidgeon peas)、鹰嘴豆类、洋蓟类、 curcurbits、莴苣、石竹（Dianthus)、天竺葵类、灯笼果、玉米、亚 麻和亚麻籽、羽扇豆类、蚕豆类、青豆类、花生类、canola、金鱼草 类、樱桃、向日葵、金盏花类、蜡菊（Helichrysum)、小麦、大麦、燕 麦类、黑小麦、胡萝卜类、洋葱类、兰花类、蔷薇类和矮牵牛类。本发明的实施方案可以有效地抵抗各种病虫害。为了本发明的目 的，病虫害包括，但不限于，昆虫、真菌、细菌、线虫、蜱螨类（acarids)、 原生动物病原体、动物寄生性肝吸虫等。尤其有意义的病虫害是昆虫 病虫害，尤其是给农业植物造成重大损失的昆虫病虫害。术语"昆虫 病虫害"在本文中指昆虫和其它相似病虫害，例如，蜱螨目（Acari) 的病虫害，包括但不限于螨类和虱类。本发明的昆虫病虫害包括，但 不限于，鳞翅目昆虫，例如，小蜡螟（Achoroia grisella)、东部黑 头长翅巻蛾(Acleris gloverana)、黑头长翅巻蛾(Acleris variana)、冲帛褐带巻叶蛾(Adoxophyes orana)、 小地老虎(Agrotis ipsilon)、 Alabama argillacea、秋星尺蠖(Alsophila pometaria) 、 Amyelois transitella、地中海粉螟(Anagasta kuehniella)、桃条麦蛾(Anarsia lineatella)、 Anisota senatoria、拃蚕(Antheraea pernyi)、黎豆 夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黄巻蛾属(Archips sp.)、条巻蛾属 (Argyrotaenia sp. )、 Athetis mindara、 家蚕(Bombyx mori)、棉潜 叶蛾(Bucculatrix thurberiella)、粉斑螟(Cadra cautella)、 色巻 蛾属(Choristoneura sp. )、 Cochylls hospes 、 苜蓿粉蝶(Colias eurytheme)、 米蛾(Corcyra cephalonica) 、 Cydia latiferreanus、 苹果蠹蛾（Cydia pomonella) 、 Datana integerrima、 落叶松毛虫 (Dendrolimus sibericus) 、 Desmiafeneralis、甜瓜绢野螟(Diaphania hyalinata)、黄瓜绢野螟（Diaphania nitidalis)、西南玉米杆草螟 (Diatraea grandiosella)、 小蔑螟(Diatraea saccharalis)、 白尺 蠖蛾(Ennomos subsignaria) 、 Eore認a loftini、烟草粉螟(Esphestia elutella)、 Erannis tilaria、 细斑灯蛾(Estigmene acrea) 、 Eulia salubricola、 Eupocoellia ambiguella、 女贞细巻蛾(Eupoeci 1 ia ambiguella)、黄毒蛾(Euproct is chrysorrhoea)、暗缘地老虎(Euxoa messoria)、蜡螟(Galleria mellonella)、梨小食心虫(GrapholUa molesta)、黑拟蛉蛾(Harrisina americana) 、 Helicoverpa subf lexa、 谷实夜蛾（Helicoverpa zea)、烟芽夜蛾（Heliothis virescens)、新 墨西哥草原毛虫(Hemileuca oliviae)、 向曰葵斑螟(Homoeosoma electellum)、 美国 白蛾 (Hyphantia cunea) 、 Keiferia lycopersicella、 Lambdina fiscellaria fiscellaria、 Lambdina fiscellaria lugubrosa、 雪毒蛾(Leucoma salicis)、 葡萄浆果小巻 蛾(Lobesia botrana)、 草地螟(Loxostege sticticalis)、 舞毒蛾 (Lymantria dispar) 、 Macalla thyrisalis、天幕毛虫属(Malacosoma sp.)、 甘蓝灯蛾(Mamestra brassicae) 、 Mamestra configurata、 Manduca quinquemaculata 、 烟草天蛾(Manduca sexta)、 豆野螟 (Maruca testulalis)、 Melanchra picta 、 秋尺蛾(Operophterabrumata)、 古毒蛾属（Orgyia sp.)、 欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis)、 Paleacrita vernata、 Papilio cresphontes、棉红铃 虫 (Pectinophora gossypiella) 、 Phryganidia californica 、 Phyllonorycter blancardella、暗脉菜粉蝶(Pieris napi)、油菜菜 粉蝶(Pieris rapae)、 苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra) 、 Platynota nouendana、荷兰石竹小巻蛾（Platynota stultana) 、 Platyptilia carduidactyla 、 印度谷螟(Plodia interpunctella)、 小菜蛾 (Plutella xylostella) 、 Pontia protodice、 一点粘虫(Pseudaletia unipuncta)、 大豆夜蛾(Pseudoplasia includens) 、 Sabulodes aegrotata、 Schizura concinna、 麦蛾(Sitotroga cerealella)、 苹 白小巻蛾(Spilonta ocellana)、 灰翅夜蛾属(Spodoptera sp.)、 Thaurnstopoea pityocampa、幕谷蛾(Tinsola bisselliella)、粉故 夜蛾（Trichoplusia hi)、温室结网野螟（Udea rubigalis) 、 Xylomyges curiails、 和苹果巢蛾(Yponomeuta padella)。此外，本发明的实施方案也可以有效地对抗昆虫病虫害，包括， 但不限于选自双翅目、膜翅目（Hymenoptera)、鳞翅目、食毛目 (Mallophaga)、同翅目（Homoptera)、半翅目、直翅目（Orthroptera)、 缨翅目（Thysanoptera)、革翅目（Dermaptera)、等翅目（Isoptera)、 虱目（A卿lura)、蚤目（Siphonaptera)、毛翅目（Trichoptera)、鞘 翅目（Coleoptera)等的昆虫，尤其是鳞翅目昆虫。针对主要作物，本 发明昆虫病虫害包括，但不限于：玉米：欧洲玉米螟（Ostrinia nubilalis， European corn borer); 小地老虎(Agrotis ipsilon, black cutworm); 谷实夜蛾(Helicoverpa zeae， corn earworm); 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda， fall armyworm); 西南玉米 杆草螟(Diatraea grandiosel la， southwestern corn borer); 南 美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer); 小蔑螟(Diatraea saccharalis， surgarcane borer); 西 部玉米根虫（western corn rootworm)， 例如，玉米根萤叶曱 (Diabrotica virgifera virgifera); 北部玉米根虫(northern cornrootworm)， 例如，Diabrotica longicornis barberi; 南部玉米根 虫(southern corn rootworm)， 例如，黄瓜十一星叶甲(Diabrot ica undecimpunctata howardi); 梳爪叩甲属(Melanotus spp.)， 金针 虫(wireworms); 圓头犀金龟(Cyclocephala borealis， northern masked chafer (white grub)); 圆头无斑犀金龟(Cyclocephala immaculata, southern masked chafer (white grub)); 曰本丽金龟 (Popillia japonica， Japanese beetle) 5 玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria, corn flea beetle); 玉米象虫(Sphenophorus maidis， maize billbug); 玉米缢管奸(Rhopalosiphum maidis, corn leaf aphid); 玉米根椅(Anuraphis maidiradicis， corn root aphid); 麦长棒(Blissus leucopterus leucopterus， chinch bug); 红腿埴 (Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper); 迁徙蚱娃 (Melanoplus sanguinipes， migratory grasshopper); 灰地种錄 (Hylemya platura, seedcorn maggot); 玉米斑潜錄(Agromyza parvicornis, corn blotch leafminer); 美洲锥尾蓟马 (Anaphothrips obscrurus， grass thrips); 窃叶蚊(Solenopsis milesta， thief ant); 二斑叶螨(Tetranychus urt icae， two spotted spider mite); 高梁：高粱螟 (Chilo partellus， sorghum borer); 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda， fall armyworm); 谷实夜蛾 (Hel icoverpa zea， corn earworm); 南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus， leser cornstalk borer); 粒肤地老虎(Feltia subterranea， granulate cutworm); 蜂螬(Phyllophaga crinita， white grub); Eleodes， 单叶叩曱属(Conoderus)， 和Aeolus spp.， 铁丝虫；黑角负泥虫(0ulema melanopus， cereal leaf beetle); 玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria, corn flea beetle); 玉米象虫 (Sphenophorus maidis, maize billbug); 玉米级管对 (Rhopalosiphum maidis, corn leaf aphid); 庶黄伪毛坊(Sipha flava， yellow sugarcane aphid); 麦长蝽(chinch bug, 例如， Blissus leucopterus leucopterus); 高梁痿蚊(Contariniasorghicola, sorghum midge);朱砂叶螨（Tetranychus cinnabari鹏， carmine spider mite) ; 二斑叶螨（Tetranychus urticae， two-spotted spider mite); 小麦： 一点粘虫（Pseudaletia unipunctata， army worm);草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda， fall army窗m); 南美玉米苗斑螟（Elasmopalpus lignosellus， lesser cornstalk borer);西部灰地老虎(Agrotis orthogonia, pale western cutworm); 南美玉米苗斑螟(Elasmopalpus lignosellus, lesser cornstalk borer); 黑角负泥虫(Oulema melanopus， cereal leaf beetle);三叶草叶象(Hypera punctata, clover leaf weevi 1); 南部玉米根虫（southern corn rootworm)，例如，黄瓜十一星叶曱 (Diabrotica undecimpunctata howardi);俄国麦对(Russian wheat aphid); 麦二叉辨(Schizaphis gramin認，greenbug); 麦长管椅 (Macrosiphum avenae， English grain aphid); 红腿埴(Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper); 异黑埴 (Melanoplus differentialis， differential grasshopper); 迁徙蚱娃 (Melanoplus sanguinipes， migratory grasshopper); 小麦黑森痿 蚊(Mayetiola destructor, Hessian fly); 麦红吸浆虫 (Sitodiplosis mosellana， wheat midge); 美州麦杆錄(Meromyza americana, wheat stem maggot); 麦种竭(Hylemya coarctata, wheat bulb fly); 烟蓟马(Frankliniella fusca， tobacco thrips); 麦 茎蜂(Cephus cinctus， wheat stem sawfly); 郁金香痿螨(Aceria tulipae， wheat curl raite); 向曰葵：向曰葵茎象甲 (Cylindrocupturus adspersus， sunflower stem weevil); 向曰葵 红色种子象(Smicronyx fulus， red sunflower seed weevil); 向 曰葵灰色种子象(Smicronyx sordidus， gray sunflower seed weevil); 向曰葵食芽蛾(Suleima helianthana， sunflower bud moth); 向曰葵螟(Homoeosoma electellum， sunflower moth); 向 曰葵叶甲(Zygogramma exclaraat ionis， sunflower beetle); 胡萝 卜金龟子（Bothyrus gibbosus， carrot beetle); 向曰葵籽瘿蚊(Neolasioptera murtfeldtiana， sunflower seed midge); 棉：烟 芽夜蛾(Heliothis virescens， tobacco budworra); 谷实夜蛾 (Hel icoverpa zea， 棉铃虫(cotton bollworm)); 甜菜夜蛾 (Spodoptera exigua， beet armyworm); 红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella， pink bollworm);(棉铃象甲，例如，墨西哥棉铃象 (Anthonomus grandis)); 棉奸(Aphis gossypii， cotton aphid); 棉盲棒象(Pseudatomoscel is seriatus, cotton f leahopper); 束 翅粉虱(Trialeurodes abutilonea， bandedwinged whitefly); 无 泽盲蝽(Lygus lineolaris， tarnished plant bug); 红腿植 (Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper); 异黑埴 (Melanoplus differentialis, differential grasshopper); 葱蓟 马(Thrips tabaci， onion thrips); 烟蓟马(Franklinkiella fusca, tobacco thrips); 朱砂叶螨(Tetranychus cinnabarinus， carmine spider mite); 二斑叶螨(Tetranychus urticae， two-spotted spider mite); 稻：小蔗螟(Diatraea saccharalis， sugarcane borer); 草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda， fall armyworm);谷实夜蛾 (Hel icoverpa zea， corn earworm); 葡萄肖叶甲(Colaspis brunnea， grape colaspis); 稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus， rice water weevil); 米象(Sitophilus oryzae， rice weevil); 二条黑 尾叶蝉(Nephotettix nigropictus， rice leafhoper); 麦长砵 (chinch bug, e.g., Blissus leucopterus leucopterus); 喜绿蝽 (Acrosternum hilare， green stink bug); 大豆：大豆夜蛾 (Pseudoplus ia includens， soybean looper);藜豆夜蛾(Ant icarsia gemmatalis, velvetbean caterpillar); 苜蓿绿夜蛾(Plathypena scabra， green cloverworm); 欧洲玉米螟(0strinia nubilalis， European corn borer); 小地老虎(Agrotis ipsilon， Mack cutworm); 甜菜夜蛾(Spodoptera exigua， beet armyworm); 烟芽 夜蛾(Heliothis virescens, tobacco budworm); 谷实夜蛾 (Hel icoverpa zea， 冲帛铃虫)；墨西哥大豆胍虫(Epilachnavarivestis， Mexican bean beetle); 桃蜂(Myzus persicae， green peach aphid);马铃薯微叶蝉(Empoasca fabae， potato leafhopper); 喜绿棒(Acrosternum hilare， green stink bug); 红腿埴 (Melanoplus femurrubrum， redlegged grasshopper); 异黑埴 (Melanoplus differentialis， differential grasshopper); 灰地 种錄(Hylemya platura， seedcorn maggot);大豆蓟马(Sericothrips variabilis, soybean thrips); 葱蓟马(Thrips tabaci， onion thrips); 土耳其斯坦叶螨(Tetranychus turkestani， strawberry spider mite); 二斑叶螨(Tetranychus urticae， two-spotted spider mite); 大麦：欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis， European corn borer); 小地老虎(Agrotis ipsilon, black cutworm); 麦二叉椅 (Schizaphis graminum， greenbug); 麦长蝽(chinch bug, 例如， Blissus leucopterus leucopterus); 喜绿棒(Acrosternum hilare， green stink bug); 褐臭棒(Euschistus servus， brown stink bug); 灰地种竭(Jylemya platura， seedcorn maggot); 小麦黑森瘿蚊 (Mayetiola destructor, Hessian fly) j 麦岩螨(Petrobia latens， brown wheat mite); 油籽油菜：甘蓝蜂(Vrevicoryne brassicae， cabbage aphid); 十字花科跳甲(Phyllotreta cruciferae， crucifer flea beetle);黄曲条跳甲（Phyl lotreta striolata, striped flea beetle);芫胥淡足跳甲(Phyl lotreta nemorum， striped turnip flea beetle); 油菜露尾甲(Mel igethes aeneus， rapeseed beetle); 以 及露尾曱(pollen beetle) (Meligethes rufimanus， Meligethes nigrescens， Meligethes canadianus， 和Mel igethes viridescens); 马铃薯：科罗拉多马铃薯叶甲（Leptinotarsa decemlineata， Colorado potato beetle)。而且，本发明的实施方案可以有效地对抗半翅目昆虫，例如，豆 荚草盲蜂(Lygus hesperus)， 美国牧草盲漆(Lygus lineolaris)，牧 草盲砵(Lygus pratensis)， 长毛草盲蝽(Lygus rugulipennis Popp)， Lygus pabulinus， Calocoris norvegicus， 0rthops compestris，Plesiocoris rugicollis ， Cyrtopeltis modestus , Cyrtopeltis notatus， Spanagonicus albofasciatus， Diaphnocoris chlorinonis, Labopidicola allii， Pseudatomoscelis seriatus， Adelphocoris rapidus， Poecilocapsus lineatus， 麦长棒(Blissus leucopterus)， 小长棒(Nysius ericae)，谷长漆若虫(Nysius raphanus)，褐臭棒 (Euschistus servus)， 稻绿椿(Nezara viridula)， 扁盾棒属 (Eurygaster)， 缘蝽科（Coreidae)， 红棒科（Pyrrhocoridae)， (Tinidae)，负子棒科（Blostomatidae)，猎棒科（Reduviidae),和臭 砵科（Cimicidae)。 目的病虫害也包括咖啡豆象（Araecerus fasciculatus， coffee bean weevil); 菜豆象(Acanthoscelides obtectus， bean weevil); 蚕豆象(Bruchus rufmanus， broadbean weevi 1);豌豆象(Bruchus pisorum， pea weevil);巴西豆象(Zabrotes subfasciatus， Mexican bean weevil); 黄瓜条叶甲(Diabrotica balteata， banded cucumber beetle); 菜豆萤叶甲(Cerotoma trifurcata, bean leaf beetle); 玉米根叶甲(Diabrotica virgifera: Mexican corn rootworm); 美洲马铃薯跳甲(Epitrix cucumeris， potato flea beetle); 甘薯叶甲(Chaetocnema confinis， sweet potato flea beetle) 5 苜蓿叶象虫(Hypera postica， alfalfa weevil); 苹果象甲(Anthonomus quadrigibbus， apple curculio); 豆茎象(Sternechus paludatus， bean stalk weevil); 埃及苜蓿叶 象(Hypera brunnipennis， Egyptian alfalfa weevil); 谷象 (Sitophilus granaries, granary weevil); 葡萄象甲(Craponius inaequalis， grape curculio); 玉米象(Sitophi lus zeamais， maize weevil); 李象(Conotrachelus nenuphar, plum curculio); 西印度 群岛甘薯象曱(Euscepes postfaciatus， West Indian sweet potato weevil); 紫绒鲍角金龟(Maladera castanea， Asiatic garden beetle);欧洲切根錄金龟(Rhizotrogus majalis， European chaf er); 蔷薇緦角金龟(Macrodactylus subspinosus， rose chafer); 杂拟谷 盗(Tribol ium confusum， confused flour beetle); 黑粉虫(Tenebrioobscurus， dark mealworm); 赤拟谷盗(Tr ibol ium castane體，red flour beetle); 黄粉虫(Tenebrio molitor， yellow mealworm)。线虫包括寄生线虫，例如根结线虫、胞嚢线虫和坏死线虫，包括 胞囊线虫属（Heterode ra spp.)， 根结线虫属(Meloidogyne spp.)， 和球形胞囊线虫属（Globodera spp.);尤其是胞嚢线虫成员，包括但 不限于，Heterodera glycines (大豆胞囊线虫）；Heterodera schachtii (甜菜胞嚢线虫）；Heterodera avenae (禾谷胞嚢线虫）j 和马铃薯金线虫（Globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫 (Globodera pailida )(马铃薯胞嚢线虫）。坏死线虫包括根腐线虫属 (Pratylenchus spp.)。本发明涉及植物病虫害管理系统，该系统在其涉及两种或两种以 上杀病虫害和/或抑病虫害药剂的意义上为多面性的，其中所述药剂一 般设计为对植物病虫害表现出联合的影响。至少一种药剂是丝氨酸蛋 白酶抑制剂，且至少一种药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂（即，其通过不 同于抑制丝氨酸蛋白酶活性的机制起作用）。该多面性系统可以同时地 或相继地使用这两种药剂。在任一种情况下，这都被描述为药剂的"联 用，，。因此，本发明一方面提供遗传修饰的植物或其由自交、回交或与 另 一植物的杂交得到的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害和/或抑 病虫害药剂，其中所述药剂中至少一种由所述遗传修饰或交配产生， 其中至少一种药剂是来自茄科的丝氨酸蛋白酶抑制剂或其前体，其中 该丝氨酸蛋白酶抑制剂以前体形式包含至少3个单体，其中至少一个 单体是胰蛋白酶抑制剂并且至少一个单体是胰凝乳蛋白酶抑制剂，并 且其中至少一种其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述植物对 病虫害表现出抗性或降低的易感性。所述丝氨酸蛋白酶抑制剂优选来自烟草，并且可以在前体形式中 包含至少3个单体或者4个单体或者5个单体或者6个单体或者7个 单体或者8个单体，其中至少一个单体抑制胰蛋白酶而且至少一个单 体抑制胰凝乳蛋白酶。术语"前体"在本文中不旨在对前体分子本身的应用设置任何限 制，也不旨在要求该分子在蛋白酶抑制活性获得表达之前首先被加工 成单体。该前体分子具有蛋白酶抑制活性，并且本发明涉及该前体以 及该前体的各个单体。在一个最优选的实施方案中，所述蛋白酶抑制剂或其前体来自Nicotiana alata (NaPI)(其描述于国际专利申请PCT/AU93/00659 号[WO 94/13810],并入此处作为参考）。因此，本发明另一方面提供遗传修饰的植物或其通过自交、回交 或与另一植物的杂交而产生的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害 药剂和/或抑病虫害药剂，其中所述药剂中的至少一种由所述遗传修饰 或交配所导致，其中至少一种药剂是NaPI前体或其单体或其重组物或 衍生物，并且其中至少一种其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中 所述植物对病虫害表现出抗性或降低的易感性。优选的至少一种其它药剂是毒素，包括内毒素，例如来源于微生 物或真菌的内毒素。特别有用的实例包括来源于芽孢杆菌属物种的毒 素。提及毒素包括表现出杀病虫害或抑病虫害活性但是并不仅仅能抑 制丝氨酸蛋白酶的肽、多肽或蛋白质。所述毒素只有在其还表现出另 一方式的杀病虫害或抑病虫害活性时才可能抑制丝氨酸蛋白酶。尤其 有用的毒素是来自苏云金芽孢杆菌的Bt相关毒素，例如Cry内毒素家 族。这些内毒素的实例包括Cry9、 Cry2s、 Cry3s或CrylA内毒素家族。术语"Cry9家族，，在本文中用于指与先前描述的野生型Cry9或 Cry9D序列具有高度序列同 一性或相似性的核苷酸或氨基酸序列。Bt毒素或内毒素旨在包括在各种状态的苏云金芽孢杆菌中发现的更宽的 Cry毒素类型，并且包括诸如CrylAc、 Cryls、 Cry2s和Cry3s等毒素。 适宜毒素的实例可以见于美国专利申请2005/0138685、 2004/0016020 和2004/0221333 (均并入此处作为参考)。其它适宜的毒素包括营养期杀昆虫蛋白（VIP)以及防卫素。适宜的 防卫素描述在国际专利申请PCT/AU2004/000524 (并入此处作为参考）中。因此，本发明另一方面考虑遗传修饰的植物或其通过自交、回交 或与另一植物杂交而产生的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害药 剂和/或抑病虫害药剂，其中所述药剂中的至少 一种由所述遗传修饰或 交配所导致，其中至少一种药剂是来自茄科的丝氨酸蛋白酶抑制剂或其前体，其中该丝氨酸蛋白酶抑制剂以前体形式包含至少3个单体， 其中至少 一个单体是胰蛋白酶抑制剂且至少 一个单体是胰凝乳蛋白酶 抑制剂，并且其中至少一种其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中 所述植物对病虫害表现出抗性或降低的易感性，只是其中至少 一种其 它药剂选自Bt蛋白，Cry9家族蛋白、Cry2家族蛋白或Cry3家族蛋白、 CrylAC、 VIP和防卫素。更特别地，本发明涉及遗传修饰的植物或其通过自交、回交或与 另一植物杂交而产生的后代，所述植物包含至少两种杀病虫害药剂和/ 或抑病虫害药剂，其中所述药剂中的至少 一种由所述遗传修饰或交配 所导致，其中至少一种药剂是NaPI前体或其单体或其重组物或衍生 物，并且其中至少一种其它药剂是非丝氨酸蛋白酶抑制剂，其中所述 植物对病虫害表现出抗性或降低的易感性，只是其中至少 一种其它药 剂选自Bt蛋白，包括Cry家族蛋白、VIP和防卫素。提及NaPI、蛋白酶抑制剂、Bt、 Cry9、 CrylAc、 Cryls、 Cry2s、 Cry3s、 VIP和防卫素及类似物包括衍生物和片段以及以其它方式修饰 的形式。修饰形式的实例包括经诱变的形式，例如具有改变的底物特 异性或者表现出更大的稳定性或者使所述药剂定向于植物细胞的细胞 器例如液泡的突变体。丝氨酸蛋白酶抑制剂例如NaPI已知直接作用于鳞翅目病虫害消 化系统的消化道蛋白酶。该特异抑制剂（胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶抑制 剂）和该蛋白酶（胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶)之间形成复合物。然后这些 复合物被排泄在虫粪中。结果是降低昆虫对蛋白质的消化能力和耗竭 昆虫幼虫的蛋白储备。蛋白酶抑制剂也可以影响昆虫的天然免疫系统。为了实现此效果， 抑制剂必须移动进入血淋巴，它们在该处能够与天然免疫系统级联中的蛋白酶复合。正常地，外来分子向昆虫的该基本免疫系统的接近受 到极大的限制。本发明的一个方面是提供允许增强PI向该天然免疫系 统接近的条件。如上所述，本发明延伸至遗传修饰的植物或其后代的部分，包括 种子、花粉、叶、花、柱头、茎、根、根毛、树皮和顶端分生组织。 所述部分也包括根状茎或者其它形式的商业可利用植物部分。本发明还提供编码所述杀病虫害或抑病虫害药剂的核酸分子。这 些核酸分子可以在单个构建体中、在多个构建体中或者可以在植物细 胞基因组中位于原位。方便地，这些核酸分子形成遗传组合物。这些核酸分子也可以成为珠子例如用于生物轰击DNA转移的珠子的部分。因此，本发明另一方面提供包含至少一种编码丝氨酸蛋白酶抑制 剂或其前体形式的构建体和至少一种编码非丝氨酸蛋白酶抑制剂的构 建体的遗传组合物，其中所述丝氨酸蛋白酶抑制剂以前体形式包含至 少3个单体，其中至少一个单体是胰蛋白酶抑制剂且至少一个其它单 体抑制胰凝乳蛋白酶。一般地，核酸分子与一个或多个启动子可操作连接。 就表达所发生在的细胞、組织或器官而言，或者就表达所发生在 的发育阶段而言、或者响应于外在刺激例如生理胁迫、或病原体或金 属离子等等，启动子可以差异地调节编码药剂的核苷酸序列的表达。优选地，启动子能够在植物细胞、組织或器官中至少一段时间调 节核酸分子的表达，在该段时间编码药剂的核苷酸序列在其中表达。尤其优选将植物可操作启动子用于本发明的构建体。适宜启动子 的实例包括pCaMV 35S (Fang等，户/a" 夭141—150， 1989)，PGEL1 (Hajdukiewicz等，/VaW M?"Zo7 ": 989-994， 1994)， III 型几丁质酶（Samac和Shah，户/ai7f Ce// J: 1063-1072， 1991)， (Keil等,扁O ": 1323-1330， 1989)， PEP羧化酶（Pathirana等， 户7fl/^ / 293-304， 1997; MAP激酶（Schoenbeck等，#o/ec 尸/a/3d/cro6e /"era", 1999)， MSV (Legavre 等，In: Vth International Congress of Plant Molecular Biology, Singapore,1997)， p/^? (Hsu等,尸细"c〃"： 63-70， 1999)， p迈;?/ (Cordero 等，In: General Meeting of the International Program on Rice Biotechnology of the Rockefeller Foundation, Malacca, Malaysia 1997) 或者谷氨酰胺合成酶（Pujade-Renaud等，户/a;^户力7s/0/ 5/oc力e迈JJ: 85—93， 1997)。在本上下文中，术语"可操作连接"或者"可操作地在……的控 制下"或类似术语应理解为指在细胞、组织、器官或整林植物中核酸 分子的表达处于和其在空间上连接的启动子序列的控制下。有大量的启动子可以用于实践本发明。可以基于期望的结果来选 择启动子。为了在宿主生物中表达，核酸可以与组成型的、组织优先 型的、诱导型的或其它的启动子组合。适宜用于植物宿主细胞中的组 成型启动子包括例如，Rsyn7启动子中的核心启动子和W0 99/43838 及美国专利6， 072， 050号中公开的其它组成型启动子；核心CaMV 35S 启动子（Odell爭，AW"reJ/ii 810-812， 1985);稻肌动蛋白（McElroy 爭，/7a/7f Ce//么163-171， 1990 );泛素（Christensen爭，尸/s;?f 超胁/ ":619-632， 1989和Christensen爭，户/W淑胁/ 7^ 675-689， 1992); pEMU (Last爭，r力eor J/?W 《7: 581—588，1991); MAS (Velten爭,/ J: 2723-2730， 1984); ALS启动子（美 国专利5， 659， 026号），等等。其它组成型启动子包括，例如，美国专 利5， 608， 149; 5, 608, 144; 5， 604， 121; 5， 569， 597; 5, 466, 785; 5， 399， 680; 5,268,463; 5， 608， 142;和6， 177， 611中讨论的那些。取决于所期望的结果，可能有益的是从诱导型启动子表达基因。 对于在植物中调节本发明核苷酸序列的表达而言，尤其有意义的是创 伤诱导型启动子。此类创伤诱导型启动子可以对昆虫进食所导致的损 害作出响应，并且包括马铃薯蛋白酶抑制剂（pin II)基因（Ryan Ann Rev Phytopath 28:425-449， 1990; D廳等，Nature Biotechnology 14:494-498， 1996); wunl和wun2，美国专利5， 428, 148号；winl和 win2 (Stanford等，Mol Gen Genet 215:200-208， 1989);系统素 (McGurl等，Science 225:1570-1573， 1992); WIP1 (Rohmeier等，Plant Mol Biol 22:783-792， 1993; Eckelkamp等，FEBS Letters 323:73-76， 1993); MPI基因（Corderok等，Plant J 6 (2): 141-150， 1994);等等，并入此处作为参考。此外，病原体诱导型启动子也可以用于本发明方法和核苷酸构建 体中。此类病原体诱导型启动子包括来自致病相关蛋白质（PR蛋白质） 的那些启动子，其中所述致病相关蛋白质在病原体感染后被诱导，例 如，PR蛋白质、SAR蛋白质、P-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。见例如， Redolfi等，Meth J Plant Pathol 89: 245-254， 1983; Uknes等，Plant Cell 4:645-656， 1992;和Van Loon Plant Mol Virol 4:111-116， 1985。也参见WO 99/43819，并入此处作为参考。有意义的是在病原体感染位置或者邻近位置局部表达的启动子。 见例如，Marineau等，Plant Mol Biol 9:335-342， 1987; Matton 等，Molecular Plant-Microbe Interactions 2: 325-331， 1989; Somsisch等，Proc Nat 1 Acad Sci USA 83: 2427-2430， 1986; Somsisch 等，Mol Gen Genet 2: 93-98， 1988;和Yang Proc Natl Acad Sci USA 93:14972-14977， 1996。也参见Chen等，Plant J 10: 955-966， 1996; Zhang等，Proc Natl Acad Sci USA 91:2507-2511， 1994; Warner 等，Plant J 3: 191—201， 1993; Siebertz等，Plant Cel 1 1: 961-968， 1989;美国专利5, 750, 386号（线虫诱导型）；以及其中引用的参考 文献。尤其有意义的是用于玉米PRms基因（其由病原体串珠镰孢菌 (Fusarium moni 1 iforme)诱导表达)的诱导型启动子(见，例如， Cordero等，Physiol Mol Plant Path 41:189-200， 1992)。可以利用受化学药品调节的启动子通过施用外源化学调节剂调制 植物中基因的表达。根据目的的不同，启动子可以是化学药品诱导型 启动子（在此该化学药品的施用可以诱导基因表达），或化学药品阻 抑型启动子（在此该化学药品的施用可以阻抑基因表达）。化学药品诱 导型启动子是本领域已知的，并且包括，但不限于，玉米In2-2启动 子（由苯磺酰胺除草剂安全剂激活）、玉米GST启动子（由用作芽前除草 剂的疏水性亲电子化合物激活）、以及烟草PR-la启动子（由水杨酸激活）。其它有意义的化学药品诱导型启动子包括类固醇响应启动子（见，例如，Schena等，Proc Natl Acad Sci USA 88:10421-10425, 1991 和McNellis等，Plant J 14 (2): 247-257， 1998中的糖皮质激素诱导 型启动子），以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子（见，例如，Gatz 等，Mol Gen Genet 227: 229-237， 1991，和美国专利5,814,618号 及5，789，156号），并入此处作为参考。组织优先型启动子可以用于使杀病虫害蛋白质定向在特定植物组 织中增强表达。组织优先型启动子包括Yamamoto等，Plant J 12 (2): 255-265， 1997; Kawamata 等，Plant Cell Physiol 38 (7): 792-803， 1997; Hansen等，Mol Gen Genet 254 (3): 337-343， 1997; Russell等，Transgenic Res 6 (2): 157-168， 1997; Rinehart 等，Plant Physiol 112 (3): 1331-1341， 1996; Van Camp等，Plant Physiol 112 (2): 525-535， 1996; Canevascini等，Plant Physiol 112(2):513-524， 1996; Yamamoto 等，Plant Cell Physiol 35 (5): 773-778， 1994; Lam Results Probl Cel 1 Differ 20:181-196， 1994; Orozco等，Plant Mol Biol 23 (6): 1129-1138， 1993; Matsuoka 等，Proc Natl Acad Sci USA 90 (20): 9586-9590， 1993; 和 Guevara-Garcia等，Plant J 4 (3): 495-505， 1993中讨论的那些。 如果必要的话，可以对此类启动子进行修饰以便弱表达。叶优先型启动子是本领域已知的。见，例如，Yamamoto等，1997 见上文；Kwon等，Plant Physiol 105:357-67， 1994; Yamamoto等， 1994见上文；Gotor等，Plant J 3: 509-18， 1993; Orozco等，1993 见上文和Matsuoka等，1993见上文。根优先型或根特异性启动子是已知的，并且可以选自许多可自文 献获得的启动子或者可以自各种相容性物种从头分离。见，例如，Hire 等，Plant Mol Biol 20 (2): 207-218， 1992 (大豆根特异性谷氨酰胺 合成酶基因）；Keller和Baumgartner Plant Cell 3 (10): 1051-1061， 1991 (四季豆（French bean)的GRP 1. 8基因中的根特异性控制元件）； Sanger等，Plant Mol Biol 14 (3): 433-443， 1990 (根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)甘露碱合酶（MAS)基因的根特异性启动 子）；和Miao等，Plant Cell 3(1) :11-22， 1991 (编码胞质谷氨酰 胺合成酶（GS)的全长cDM克隆，其在大豆的根和根瘤中表达）。也参 见Bogusz等，Plant Cell 2 (7): 633-641， 1990，此处描述了分离自 非豆科固氮植物Parasponia andersonii和非固氮非豆科的亲缘植物 山黄麻（Trema tomentosa)的血红蛋白基因的两种根特异性启动子。 将这些基因的启动子与P-葡糖醛酸酶报道基因连接，并引入非豆科植 物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科植物百脉根(Lotus corniculatus) 两者中，在两种情况下均保存了根特异性启动子活性。发根农杆菌 (Agrobacterium rhizogenes)的rolC和rolD根诱导基因的启动子也 是可用的（见Limerick Plant Science 79 (1): 69-76) 。 Teeri等，EMBO J 8 (2): 343-350, 1989描述了与lacZ的基因融合，证实编码章鱼碱 合酶的农杆菌T-DNA基因在根尖表皮中尤其具有活性并且TR2，基因 在完整植物中是根特异性的而在叶组织中受到创伤的刺激（对于和杀 昆虫或杀幼虫基因一起使用而言这是一种尤其期望的特征组合）。与 nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TRl，基因表现出类似的特征。其 它根优先型启动子包括VfEN0D-GRP3基因启动子（Kuster等，Plant Mol Biol 29 (4): 759-772， 1995);和rolb启动子（Capana等，Plant Mol Biol 25 (4): 681-691， 1994 。也参见美国专利5， 837， 876; 5， 750， 386; 5, 633,363; 5, 459,252; 5, 401, 836; 5, 110, 732;和 5， 023， 179。"种子优先型"启动子包括"种子特异性，，启动子（在种子发育过 程中具有活性的那些启动子，例如，种子贮藏蛋白的启动子）以及"种 子萌发"启动子（在种子萌发过程中具有活性的那些启动子）。见 Thompson等，BioEssays 10:108， 1989，在此并入作为参考。此类种 子优先型启动子包括，但不限于，Ciml (细胞分裂素诱导的信息）； cZ19Bl (玉米19 kDa玉米醇溶蛋白）；和milps (肌醇-l-磷酸合酶） (见美国专利6， 225， 529号，并入此处作为参考）。y-玉米醇溶蛋白和 Glob-l是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括，但不限于，菜豆P-菜豆蛋白、napin、 0-conglycinin、大豆凝 集素、cruciferin等等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括， 但不限于，玉米15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27 kDa 玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、waxy、 shrunken 1、 shrunken 2、 球蛋白1,等。也参见冊00/12733，其中公开了来自endl和end2 基因的种子优先型启动子；并入此处作为参考。在特定组织中具有"优 先的，，表达的启动子在该組织中比在至少一种其它植物组织中有更大 程度的表达。 一些组织优先型启动子表现出几乎只在该特定组织中表 达。当期望低水平表达时，可以使用弱启动子。 一般地，术语"弱启 动子"在本文中指驱动编码序列以低水平表达的启动子。低水平表达 意指大约1/1000转录物至大约1/100， OOO转录物至约1/500， OOO转录 物的水平。备选地，术语"弱启动子"也被认为包括仅在少数细胞中 驱动表达而在其它细胞中不驱动表达从而给出总的低表达水平的启动 子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以对该启动子序列 的部分进行缺失或修饰以降低表达水平。此类弱组成型启动子包括，例如，Rsyn7启动子的核心启动子（WO 99/43838和美国专利6， 072， 050号）、核心35S CaMV启动子等。其它 组成型启动子包括，例如，？>开在美国专利号5， 608， 149; 5， 608， 144; 5, 604,121; 5,569, 597; 5, 466, 785; 5, 399, 680; 5, 268, 463; 5， 608， 142;和6， 177， 611中的那些；并入此处作为参考。本发明构建体优选含有用于实现有效转录的其它调节元件，例如， 转录终止（或终止子）序列。术语"终止子"指位于转录单元末尾的DNA序列，该序列提供终 止转录的信号。终止子是一般包含多腺苷酸化信号的3，-非翻译DNA 序列，其促进多腺苷酸化序列向初级转录物3，末端的添加。在植物 细胞中具有活性的终止子是已知的，描述在文献中。它们可以自细菌、 真菌、病毒、动物和/或植物分离或者从头合成。与启动子序列一样，终止子可以是能够在其预期用于的细胞、组织或器官中可操作的任何终止序列。尤其适用于本发明合成基因的终止子的实例包括SV4Q多腺苷酸 化信号、HSV TK多腺苷酸化信号、CYC1终止子、ADH终止子、SPA终 止子、根癌农杆菌的胭脂碱合酶（NOS)基因终止子、花椰菜花叶病毒 (CaMV) 35S基因的终止子、来自玉米（Zea mays)的玉米醇溶蛋白基因 终止子、核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基基因（SSU)的终止子序列、 地三叶草矮化病毒（subclover stunt virus, SCSV)基因序列的终止 子、任何rho非依赖性大肠杆菌终止子、或lacZ ct终止子等等。在一个特别优选的实施方案中，终止子是可在动物细胞、组织和 器官中可操作的SV40多腺苷酸化信号或者HSV TK多腺苷酸化信号、 在植物细胞、组织或器官中具有活性的章鱼碱合酶（OCS)或胭脂碱合酶 (NOS)终止子、或者在原核细胞中具有活性的lacZ ct终止子。本领域技术人员将意识到可以适用于实施本发明的其它终止子序 列。这些序列可以容易地使用而无需任何过度的实验。将构建体引入（即，转染或转化）细胞的手段是本领域技术人员熟 知的。以上描述的构建体能够进一步例如通过包括编码可检测标记酶或 其功能类似物或衍生物的标记核苷酸序列而修饰，以便利于在表达本 发明合成基因的细胞、组织或器官中检测该基因。根据此实施方案， 标记核苷酸序列可以以可翻译形式存在并且表达。此外，可以包括转 运序列以便使一种或多种药剂定向于特定的植物细胞器。本领域技术人员将明了如何制备本文所述的构建体以及为了在特 定细胞或细胞类型中在期望的条件下获得其表达（当期望如此时）所需 的条件。尤其是，本领域技术人员将知晓实施本发明所需的遗传操作可能要求在原核细胞例如大肠杆菌细胞或者植物细胞或者动物细胞中 扩增本文所述的遗传构建体或其衍生物。可以将本发明构建体不加修饰地以线性DNA形式，任选地包含在 适宜载体如细胞、病毒粒或脂质体等中，引入适宜的细胞、组织或器 官。为了制备遗传构建体，可以将核酸插入适宜的载体或者附加体分子，例如噬菌体载体、病毒载体或质粒、粘粒或人工染色体载体，其 中所述载体或附加体分子能在其随后引入的宿主细胞、组织或器官中 维持和/或复制和/或表达。因此，本发明另一方面提供遗传构建体，该构建体至少包含编码 本文所述的一种或两种杀病虫害或抑病虫害药剂的遗传元件以及一个 或多个复制起点和/或选择标记基因序列。通常，适用于细菌中的复制起点或选择标记基因与遗传构建体中 所包含的旨在在植物细胞中表达或者转移至植物细胞中、或者整合至 植物细胞基因组中的遗传序列物理分开。本文中，术语"选择标记基因"包括向表达它的细胞赋予表型以 利于鉴定和/或选择被本发明遗传构建体或其衍生物转染或转化的细 胞的任何基因。本文中考虑的适宜选择标记基因包括氨苄青霉素抗性基因(AfflpO、 四环素抗性基因（Tc0、细菌卡那霉素抗性基因（KarO、 zeocin抗性基因（Zeocin是博来霉素家族的药物，是InVitrogen公 司的商标）、赋予对抗生素aureobasidin A的抗性的^W?/-C基因、膦 丝菌素抗性基因、新霉素磷酸转移酶基因（/7;7"I)、潮霉素抗性基因、 13-葡糖醛酸酶（GUS)基因、氯霉素乙酰转移酶（CAT)基因、绿色荧光蛋 白编码基因或者萤光素酶基因等等。优选地，选择标记基因是nptll基因或者Kanr基因或者绿色荧光 蛋白（GFP)编码基因。本领域技术人员将意识到可以用于实施本发明的其它选择标记基 因，本发明不受到该选择标记基因的性质的限制。本发明延伸至基本如本文所述的所有遗传构建体，其包括旨在用 于使所述遗传构建体在原核生物或真核生物中得以维持和/或复制和/ 或使所述遗传构建体或其部分整合至真核细胞或生物体的基因组中的 其它遗传序列。可以使用标准方法将构建体引入细胞、组织或器官，例如脂质体 介导的转染或转化、用减毒的病毒粒或细菌细胞进行的细胞转化、细胞接合、本领域技术人员已知的转化或转染方法。用于将重组DNA引入植物组织或细胞的其它手段包括，但不限于， 使用CaCl2的转化及其变异方案、原生质体对DNA的直接DNA摄取、 PEG介导的原生质体摄取、微粒轰击、电穿孔、DNA显微注射、对组织 外植体或细胞的微粒轰击、核酸对组织的真空渗入、或者对于植物而 言，T-DNA介导的自农杆菌至植物组织的转移。对于细胞的微粒轰击，微粒被推入细胞中以产生转化的细胞。任 何适宜的轰击细胞转化方法学和装置均可以用于实施本发明。示例性 的装置和方法公开在Stomp等（美国专利5， 122, 466号）和Sanf ord及 Wolf (美国专利4， 945，050号）中。当使用轰击转化法时，遗传构建体 可以合并能在待转化的细胞中复制的质粒。适用于此系统的示例性微粒包括1至5 jim金球。DNA构建体可以 通过任何适宜的技术，例如通过沉淀，沉积在该;敞粒上。本发明方法涉及将多肽或多核苷酸引入植物。"引入"旨在指以该多核苷酸或多肽。本发明方法并不依赖于用于将多核苷酸或多肽引 入植物的特定方法，只要该多核普酸或多肽可以进入该植物的至少一 个细胞的内部即可。用于将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领 域已知的，包括，但不限于，稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导的 方法。"稳定转化"旨在指引入植物的核苷酸构建体整合至植物基因组 中并能被该植物的后代遗传。"瞬时转化"旨在指多核苷酸被引入植 物中但是不整合在植物基因组中或者多肽被引入植物中。转化方案以及用于将核苷酸序列引入植物的方案可以根据作为转 化目标的植物或植物细胞的类型，即，单子叶植物或双子叶植物而变。微注射（Crossway等，Biotechniques 4:320-334， 1986)，电穿孔 (Riggs等，Proc Natl Acad Sci USA 83:5602-5606， 1986)，农杆菌 介导的转化（美国专利号5， 563， 055和5, 981, 840)，直接基因转移(Paszkowski等，EMBO J 3: 2717-2722， 1984)，和弹道粒子加速（见， 例如，美国专利号4， 945， 050; 5, 879,918; 5， 886， 244;和5， 932， 782; Tomes等，Plant Cell, Tissue, and Organ Culture: Fundamental Methods, 1995;以及McCabe等，Biotechnology 6: 923-926， 1988); 和Lecl转化（W0 00/28058)。对于马铃薯的转化，参见Tu等，Plant Molecular Biology 37:829-838， 1998和Chong等，Transgenic Research 9:71-78， 2000。其它转化法可以参见Weissinger等，Ann Rev Genet 22: 421-477， 1988; Sanford等，Particulate Science and Technology 5:27-37， 1987 (洋葱）；Christou等，Plant Physiol 87:671-674， 1988 (大豆）;McCabe等，Bio/Technology 6: 923-926， 1988 (大豆）；Finer 和McMullen In Vitro Cell Dev Biol 27P: 175-182， 1991 (大豆）；Singh等，Theor Appl Genet 96: 319-324， 1998 (大豆）；Datta等，Biotechnology 8: 736-740， 1990 (稻）；Klein 等，Proc Natl Acad Sci USA 85:4305-4309， 1988 (玉米）；Klein 等，Biotechnology 6: 559-563， 1988 (玉米）;美国专利号5， 240， 855; 5, 322,783和5, 324, 646; Klein等，Plant Physiol 91: 440-444， 1988 (玉米）;Fromm等，Biotechnology 8: 833-839， 1990 (玉米）； Hooykaas-Van Slogteren等，Nature (Umdon) 311:763-764， 1984; 美国专利号5，736， 369 (谷类植物）；Bytebier等，Proc Natl Acad Sci USA 84:5345-5349， 1987 (百合科（Li 1 iaceae)); De Wet等，The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, 197-209， 1985 (花 粉）；Kaeppler等，Plant Cel 1 Reports 9: 415-418， 1990和Kaeppler 等，Theor Appl Genet 84:560-566， 1992 (颈须介导的转化 (whisker-mediated transformation)); D'Halluin等，Plant Cell 4: 1495-1505， 1992 (电穿孔）;Li等，Plant Cell Reports 12: 250-255， 1993和Christou及Ford A醒ls of Botany 75: 407-413， 1995 (稻）； Osjoda等，Nature Biotechnology 14:745-750， 1996 (玉米，通过 根癌农杆菌）；所有这些文献均并入此处作为参考。

在本发明再一实施方案中，本文所述遗传构建体可以适应性修改以便整合至表达其的细胞的基因组中。本领域技术人员将明了，为了 实现遗传序列或遗传构建体在宿主细胞基因组中的整合，可能需要某些额外的遗传序列。就植物而言， 一般需要来自根癌农杆菌Ti质粒的 T-DNA的左和右边界序列。本发明还延伸至包含本发明构建体或其部分的分离的细胞、组织 或器官。本发明还延伸至由所述细胞、组织和器官来源的再生的组织、 器官和整个生物以及它们的无性繁殖体和后代以及种子和其它繁殖材 料。例如，植物可以从转化的植物细胞或组织或器官在含有激素的培 养基上再生，并且再生的植物可以采取各种形式，例如转化的细胞和 未转化的细胞的嵌合体；克隆的转化体（例如，所有的细胞均被转化以 含有表达盒）；转化的和未转化的组织的嫁接物（例如，柑橘物种中嫁 接至未转化的接穗上的转化的根砧木）。转化的植物可以通过各种方 式，例如，通过克隆繁殖或静电的育种技术进行繁殖。例如，第一代（或 Tl)转化的植物可以自交以产生纯合的第二代（或T2)转化植物，该T2 植物可以通过经典的育种技术进一步繁殖。本发明考虑可以根据实际目的构建密码子使用不同但是编码具有 基本上相同的杀病虫害或抑病虫害活性的相同或相似蛋白的任何其它 DNA序列。在一些原核和真核表达系统中已经描述过将密码子使用改 变成宿主细胞的密码子使用对于外源宿主中的基因表达是期望的 (Bennetzen & Hall, J Biol Chem 257: 3026， 1982; Itakura， Science 198:1056-1063， 1977)。密码子使用表可以从文献（Wada等，Nucl Acids Res 18: 2367-1411， 1990; Murray等，Nucleic Acids Research 17:477-498， 1989)以及主要的DNA序列数据库中获得。因此，可以 构建合成的DNA序列以产生相同或基本上相同的蛋白质。明显地，可 以一次设计本发明药剂蛋白的氨基酸序列的几种DNA序列。这些其它 的DNA序列包括已经经过改变以造成基因中的某些位点失活的合成的 或半合成的DNA序列，其中所述改变可以例如通过如下方式实现：选 择性地失活天然序列中存在的某些隐蔽的调节性元件或加工元件、或页

者将全部的密码子使用适应性修改为更相关的宿主生物的密码子使 用，优选地期望在其中实现表达的宿主生物的密码子使用。也可以根

据EP 0 385 962， EP 0 618 967或EP 0 682 115中所述的方法制备 合成的DNA序列。

可以常规地通过PCR介导的诱变（Ho等，Gene 77:51-59, 1989; White et al， Trends in Genet 5: 185-189， 1989)对DNA序列进行 小的修饰例如上述的那些。可以通过自动DNA合成以及所得DNA片段

的连接，制备新的合成或半合成的基因。

为了防止或延迟病虫害出现抗性，优选在相同植物宿主（优选转 基因植物）中还表达具有不同作用模式并且一旦在转基因宿主（优选植 物）中产生后对第一药剂（例如，丝氨酸蛋白酶抑制剂）所靶向的同一病 虫害具有高度毒性的其它蛋白质或蛋白质复合物。适宜与丝氨酸蛋白 酶抑制剂联合的候选物包括与PCT ^Hf WO 96/10083的VIP2Aa或 VIP2Ab蛋白联合的成熟VIPUa蛋白（如果这些VIP蛋白具有与所述 丝氨酸蛋白酶抑制剂不同的作用模式的话）；Photorhabdus或 Xenorhabdus属的玉米根虫毒素，例如，Photorhabdus luminescens W-14的杀昆虫蛋白（Guo等，J Biol Chem 274:9836-9842， 1999); W0 00/26378的CryET70蛋白；WO 97/40162中描述的Bt菌林PS80JJ1， PS149B1和PS167H2产生的杀昆虫蛋白，尤其是Bt菌林PS149B1的约 14 kD和大约44 kD蛋白；美国专利6， 023， 013号的Cry3Bb蛋白；蛋 白酶抑制剂例如大豆的N2和Rl半胱氨酸蛋白酶抑制剂（Zhao等， Plant Physiol 111:1299-1306， 1996)或者oryzastatine例如稻半 胱氨酸蛋白酶抑制剂（Genbank登录S49967)、玉米半胱氨酸蛋白酶抑 制剂（Genbank登录D38130, D10622, D63342)例如Irie等，Plant Mol Biol 30:149-157， 1996描述的在植物中表达的玉米半胱氨酸蛋 白酶抑制剂）。在此还包括上述任何蛋白质的所有等价物和变体，例如 保留杀昆虫活性的截短的蛋白质。

可以将本发明编码丝氨酸蛋白酶抑制剂的基因的DNA连接在适宜 表达栽体中并转化大肠杆菌，然后可以使用抗蛋白酶抑制剂的单克隆或多克隆抗体通过常规菌落免疫探测法（French等，Anal Biochem 156: 417-423， 1986)基于毒素的表达篩选克隆。此外，该DNA还可以连接 在适宜的Bt穿梭载体（Lereclus等，Bio/Technology 10: 418, 1992) 中，并转化无晶体（crystal minus)型Bt突变体。然后基于ISP蛋 白的产生筛选克隆（通过SDS-PAGE 、 Wes ten印迹和/或昆虫分析试验）。本发明编码基因可以以常规方式（Maxam和Gilbert Methods in Enzymol 65:499-560， 1980; Sanger Proc Natl Acad Sci USA 74: 5463-5467， 1977)测序以获得DNA序列。序列比较显示这些基因与 现有技术中描述的编码在芽孢杆菌或其它细菌物种的营养生长期分泌 的蛋白质的基因以及编码对鞘翅目昆虫具有活性的苏云金芽孢杆菌晶 体蛋白的基因(Crickmore等，Microbiology and Molecular Biology Reviews 62:807-813， 1998; W0 98/44137， W0 94/21795， W0 96/10083， W0 00/09697， WO 9957282，和WO 9746105)不同。也可以以常规方式，使用这些基因转化的微生物，或者优选地其 相应的蛋白质或其杀病虫害或抑病虫害有效部分作为活性成分，与适 宜的栽体、稀释剂、乳化剂和/或分散剂（参见例如Bernhard和Utz， An Environmental Biopesticide: Theory and Practice 255-267， 1993) 一起，配制本发明的杀病虫害或抑病虫害组合物。该杀病虫害或抑病 虫害组合物可以配制成可湿性粉剂、丸剂、颗粒剂或粉剂（dust)或者 使用水性或非水性溶剂配制成液体制剂如泡沫、凝胶、悬浮液、浓缩 液等。可以用于在蛋白质施用给昆虫前将蛋白质包封在稳定环境中的 已知微生物包括假单胞菌属（Pseudomonas)或其它细菌的细胞。本发明 还包括以联合制剂形式包含本文所述药剂以便同时、分开或相继使用 以对玉米植物形成对抗玉米根虫的保护作用的产品，特别地该产品是 杀昆虫组合物或转基因玉米植物。根据本发明控制病虫害的方法可以包括向待保护的地点（区域）施 用（例如，喷雾）杀病虫害或抑病虫害有效量的本发明药剂或者本发明 基因转化的宿主细胞。待保护的地点可以包括，例如，昆虫病虫害的 栖息地或者正在种植植物的地方或者待要种植植物的区域。为了获得本发明药剂，可以将表达所述药剂的重組宿主的细胞以 常规方式培养在适宜的培养基上，然后可以使用常规手段从该培养基 获得该蛋白质。所述药剂之后可以通过标准技术，例如层析、提取或 电泳等进行分离和纯化。然后可以通过蛋白酶例如半胱氨酸或丝氨酸 蛋白酶消化该蛋白质，获得抗蛋白酶的毒素形式。

尽管本发明不依赖于特定的用于增加植物对植物病虫害的抗性的 生物机制，但是本发明核苷酸序列在植物中的表达可以导致本发明杀 病虫害或抑病虫害蛋白的产生并导致植物对植物病虫害的抗性增加。 本发明植物可以农业应用于影响植物病虫害的方法中。本发明的某些 实施方案提供转化的作物植物，例如棉花植物，该植物可以用于影响 该植物的昆虫病虫害的方法中。

"对象植物或植物细胞"是就目的基因而言已经实现遗传改变例 如转化的植物或植物细胞，或者是来自经过如此改变且包含该改变的 植物或植物细胞的后代植物或植物细胞。"对照"或"对照植物"或 "对照植物细胞，，为测量对象植物或植物细胞的表型改变提供参考点。

对照植物或植物细胞可以包括，例如：（a)野生型植物或细胞， 即，与用于实施导致对象植物或细胞的遗传改变的起始材料具有相同 基因型；（b)与起始材料具有相同基因型但是由无效构建体（即，对目 的性状没有已知效应的构建体，例如，包含标记基因的构建体）转化的 植物或植物细胞；（c)是对象植物或植物细胞的后代中的未转化分离 子的植物或植物细胞；（d)遗传上与对象植物或植物细胞相同但是未 接触过将诱导目的基因表达的条件或刺激的植物或植物细胞；或者（e) 处于目的基因不表达的条件下的对象植物或植物细胞。

如上所述，本领域技术人员将容易地认识到，分子生物学领域的 进展，例如定点诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法学及蛋白质工 程技术，将提供大量的适用于改变或工程化改造具有农业意义的蛋白 质的氨基酸序列以及作为其基础的遗传序列的工具和操作方案。

因此，本发明Cry9家族蛋白可以通过各种方式进行改变，包括氨 基酸替代、缺失、截短和插入。此类操作的方法是本领域一般已知的。例如，可以通过在合成的核酸（例如，DNA分子）中引入突变来制备杀 病虫害或抑病虫害蛋白质的氨基酸序列变体。用于实施诱变和核酸改 变的方法是本领域熟知的。例如，可以使用寡核苷酸介导的定点诱变 技术引入经过设计的变化。见，例如，Kunkel ProcNatl AcadSci USA 82:488-492， 1985; Kunkel等，Methods in Enzymol 154: 367-382， 1987;美国专利4, 873，192号；Walker和Gaastra， Techniques in Molecular Biology 1983，以及其中引用的参考文献。

可以对本发明诱变后的Cry9家族核普酸序列进行修饰以便改变 在所编码的多肽的一级序列中存在的大约1、 2、 3、 4、 5、 6、 8、 10、 12或更多个氨基酸。备选地，可以引入甚至更多的不同于天然序列的

1%或2%、或大约3°/。、 4%、 5%、 6°/。、 7%、 8%、 9%、 10%、 11%、 12%、或 甚至大约13%、 14%、 15°/。、 16%、 17%、 18%、 19%、或20%、 21%、 22%、 23%、 24%、 or 25%、 30%、 35%或40%或更多的密码子发生改变或者修 饰。以相同的方式，该编码的蛋白质可以相对于相应的野生型蛋白质 有至少大约1°/。或2%、或大约3%、 4%、 5%、 6%、 7%、 8%、 9%、 10%、 11%、 12°/。、或甚至大约13%、 14%、 15%、 16%、 17°/。、 18%、 19%、或20%、 21%、 22%、 23%、 24%、或25%、 30%、 35%、或40%或更多的额外密码子。应 当理解，本发明诱变后的Cry9家族核苷酸序列旨在包括具有杀病虫害 活性（例如，通过针对草地贪夜蛾幼虫的拒食剂性质而确定的改善的杀 病虫害活性）的生物学功能等价肽。这些序列可以因已知天然存在于核 酸序列和由此编码的蛋白质中的密码子冗余性和功能等效性而产生。

本领域技术人员明了 ，氨基酸添加和/或替代一般是基于氨基酸侧 链取代基的相对类似性，例如它们的疏水性、电荷、大小等，而进行 的。考虑到上述各种特征的示例性氨基酸替代组是本领域技术人员熟 知的，包括：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸； 谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。

在某些实施方案中，本发明核苷酸序列可以与任何目的多核苷酸 序列组合叠加以便产生具有期望表型的植物。例如，本发明多核苷酸可以与任何其它编码杀病虫害和/或抑病虫害活性的多肽（例如，其它苏云金芽孢杆菌毒素蛋白（见美国专利号5, 366, 892; 5,747, 450;5, 736, 514; 5, 723, 756; 5， 593， 881;以及Geiser等，Gene 48:109， 1986)， pentin (见美国专利号5， 981， 722)等）的多核苷酸叠加。所产 生的组合也可以包括多拷贝的任何一种目的多核苷酸。本发明多核苷 酸也可以与任何其它基因或基因组合叠加以产生具有各种期望性状组 合的植物，其中所述期望的性状组合包括，但不限于，对动物饲料而 言期望的性状，例如高油基因（例如，美国专利号6,232, 529);平衡 的氨基酸（例如，hordothionins (美国专利号5， 990， 389; 5,885, 801; 5，885， 802;和5,703, 049);大麦高赖氨酸（Williamson等，Eur J Biochem 165:99-106, 1987;和W0 98/20122)以及高曱硫氨酸蛋白质 (Pedersen等，J Biol Chem 261:6279， 1986; Kirihara等，Gene 71:359， 1988;和Musumura等，Plant Mol Biol 12:123， 1989);增 加的可消化性（例如，修饰的贮藏蛋白（2001年11月7日提交的美国 申请系列10/053, 410号）；和硫氧还蛋白（2001年12月3日提交的 美国申请系列10/005, 429号）），这些文献的公开并入此处作为参考。本发明多核苷酸也可以与如下叠加：期望的疾病或除草剂抗性性 状（例如，串珠镰孢菌毒素脱毒基因（美国专利号5, 792, 931);无毒 性和疾病抗性基因（Jones等，Science 266:789， 1994; Martin等， Science 262:1432， 1993;和Mindrinos等，Cell 78: 1089， 1994); 导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶（ALS)突变体例如S4和/或Hra突变 体；谷氨酰胺合酶抑制剂，例如膦丝菌素或basta (例如，bar基因）； 和草甘膦（glyphosate)抗性（美国申请系列号10/004， 357;和 10/427， 692中公开的EPSPS基因和GAT基因）；以及对于正在加工的 或加工的产物所期望的性状，例如高油（例如，美国专利号6, 232, 529);改性油（例如，脂肪酸去饱和酶基因（美国专利号 5,952, 544; WO 94/11516));改性淀粉（例如，ADPG焦磷酸化酶 (AGPase)、淀粉合酶（SS)、淀粉分支酶（SBE)和淀粉脱分支酶（SDBE)); 和聚合物或生物塑料（例如，美国专利号5， 602， 321; P-酮基硫解酶(P-ketothiolase)、聚羟基丁酸合酶、和乙酰乙酰基-CoA还原酶 (Schubert等，J Bacteriol 170:5837-5847， 1988)利于多羟基链烷 酸酯（PHAs)的表达），这些文献的公开并入此处作为参考。也可以将本 发明多核苷酸与提供农艺性状例如雄性不育（例如，见美国专利号 5,583,210)、茎杆强度、开花时间、或转化技术性状例如细胞周期调 节或基因靶向（例如WO 99/61619; W0 00/17364; W0 99/25821)的多 核苷酸联合，这些文献的公开并入此处作为参考。这些叠加的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何 常规或TopCross方法学的杂交育种植物，或者遗传重组。如果通过遗 传转化植物来叠加性状，则目的多核苷酸序列可以在任何时间以任何 顺序组合。例如，包含一种或多种期望性状的转基因植物可以用作乾 标以通过随后的转化引入其它性状。在共转化方案中这些性状可以使 用由任何转化盒组合提供的目的多核苷酸同时地引入。例如，如果要 引入两个序列，则这两个序列可以包含在分开的转化盒中（反式）或者 包含在相同的转化盒上（顺式）。这些序列的表达可以由相同启动子或 者不同启动子驱动。在某些情况下，可能期望引入可以抑制目的多核 苷酸表达的转化盒。这可以与其它抑制盒或过表达盒的任何组合联合 以在植物中产生期望的性状组合。还可以认识到，多核苷酸序列可以 使用定点重组系统在期望的基因组位置实现叠加。见，例如， W099/25821, W099/25854, W099/25840, W099/25855，和W099/25853， 所有文献并入此处作为参考。本发明的组合物可以以各种方式用于保护植物、种子和植物产物。 例如，可以在涉及通过选自喷雾、撒粉、播撒或包被种子的方法将有 效量的杀病虫害或抑病虫害组合物放置在病虫害的环境中的方法中使 用本发明的组合物。在植物繁殖材料（杲实、块茎、球茎、谷粒、种子），但尤其是种 子，作为商品出售之前，惯常使用保护剂包衣（其包含除草剂、杀昆 虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、软体动物杀灭剂、或这些制 剂中几种的混合物、如果期望的以及配制领域通常使用的其它载体、表面活性剂或促进施用的助剂）进行处理，以提供针对有害的细菌、 真菌或动物的保护作用。为了处理种子，可以通过用液体制剂浸透块 茎或谷粒或者通过用联合的湿或干制剂包被它们，从而将保护剂包衣 应用于种子。此外，在特殊的情况下，其它向植物进行施用的方法也 是可以的，例如，指向芽或果实的处理。包含编码本发明药剂的核苷酸序列的本发明植物种子可以用种子 保护剂包衣进行处理，其中所述包衣包含种子处理化合物，例如，克菌丹（Captan)， 萎锈灵（carboxin)， 福美双（Thiram)， 甲霜灵 (metalaxyl)，甲基嘧咬磷（pirimiphos-methyl)及通常用于种子处 理的其它化合物。在本发明范围内的一个实施方案中，包含本发明杀 病虫害组合物的种子保护剂包衣单独地使用或者与一种惯常用于种子 处理的种子保护剂包衣联用。在本发明中，组合物包括整个生物、细胞、孢子、杀病虫害或抑 病虫害蛋白质、杀病虫害或抑病虫害成分、影响病虫害的成分、突变 体、活的或死的细胞及细胞成分，包括活的和死的细胞及细胞成分的 混合物、并包括破碎的细胞和细胞成分，或者分离的杀病虫害或抑病 虫害蛋白质可以与可接受的栽体一起配制成杀病虫害组合物，该组合 物可以是例如悬浮剂、溶液剂、乳剂、撒布剂（dusting powder)、可 分散粒剂、可湿性粉剂、和乳油、气雾剂、浸渍颗粒剂（impregnated granule)、助剂、可涂性糊剂（coatable paste)、以及在例如聚合物 物质中的包囊剂。以上公开的组合物可以通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、 湿润剂、取食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、色素、UV 保护剂、緩冲液、流动剂或肥料、微量营养物供体、或影响植物生长 的其它制剂而获得。 一种或多种农用化学药品，包括但不限于，除草 剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、软体动物杀灭剂、 杀螨剂、植物生长调节剂、落叶剂（harvest aid)和肥料，可以与制剂 领域惯常使用的栽体、表面活性剂或助剂或者其它成分联合以利于产 品的操作和应用于特定靶病虫害。适宜的载体和助剂可以是固体或液体并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如，天然或再生的矿物 质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂、或肥料。本发明活性 成分正常以组合物形式施用，并可以施用于待处理的作物区域、植物 或种子。例如，本发明组合物可以在谷粒预备用于贮存或者在于粮箱 或贮粮塔等中进行贮存的期间施用于谷粒。本发明组合物可以与其它 化合物同时或相继地施用。施用本发明活性成分或者含有至少 一种由 本发明细菌菌林产生的杀病虫害蛋白质的本发明农用化学组合物的方 法包括，但不限于，叶的施用、种子包被、以及土壤施用。施用的次 数和施用的速率取决于相应病虫害造成的侵扰的强度。适宜的表面活性剂包括，但不限于，阴离子化合物例如羧酸盐，例如，金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸 与脂肪醇乙氧基化物的单或二酯或者该酯的盐；脂肪族醇的硫酸盐， 例如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化 的脂肪醇的硫酸盐；乙氧基化的烷基酚的硫酸盐；木素磺酸盐；石油 磺酸盐；烷基酰基磺酸盐，例如烷基苯磺酸盐或低级烷基萘磺酸盐， 例如，丁基萘磺酸盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合 物的盐；更复杂的磺酸盐，例如酰胺磺酸盐类，例如油酸与N-甲基牛 磺酸的磺化的缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如，琥珀酸二辛 酯的磺酸钠。非离子型表面活性剂包括脂肪酸酯、脂肪族醇、脂肪酸 酰胺、或脂肪族烷基-或链烯基取代的苯酚与环氧乙烷的缩合产物，多 元醇醚的脂肪酸酯，例如，失水山梨糖醇脂肪酸酯、该酯与环氧乙烷 的缩合产物，例如聚氧乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯，环氧乙烷与环氧丙 烷的嵌段共聚物，炔烃邻二醇例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二 醇，或乙氧基化的炔烃邻二醇。阳离子表面活性剂的实例包括，例如， 脂肪族单-、二-或多胺，例如乙酸盐、环烷酸盐或油酸盐；或含氧胺， 例如，聚氧乙烯烷基胺的胺氧化物；通过羧酸和二-或多胺的缩合制备 的酰胺连接的胺；或季铵盐。惰性物质的实例包括但不限于无机矿物质例如高岭土、叶硅酸盐 类（phyllosilicates)、碳酸盐类、硫酸盐类、磷酸盐类，或植物材料例如软木、玉米棒子粉、花生壳、稻壳和胡桃壳。本发明组合物可以以适宜的形式直接应用或者釆取需要在使用前 用适宜量的水或其它稀释剂稀释的最初组合物的浓缩物形式。根据特 定制剂的性质，尤其是其是浓缩物还是直接使用，杀病虫害浓度将是可变的。组合物含有1至98%固体或液体惰性载体、和0至50%或0. 1 至50%表面活性剂。这些组合物将以针对该商品标示的比率施用，例 如，当以干形式施用时每英亩大约0. 01 lb至5. 0 lb以及当以液体形 式施用时每英亩大约0. 01 pts.至10 pts.。昆虫病虫害可以在发育早期，例如幼虫或其它未成熟形式时用于 检测本发明组合物的杀病虫害或抑病虫害活性。可以在全黑及大约20 r至大约30"C和大约30%至大约70%相对湿度下饲养这些昆虫。生 物试验可以按照Czapla和Lang J Econ Entomol 83 (6): 2480-2485， 1990中所述进行。饲养昆虫幼虫和实施生物试验的方法是本领域普通 技术人员熟知的。本领域普通技术人员已知大量的生物试验技术。 一般方法包括在 封闭式容器中将实验化合物或生物加入食物源。杀病虫害活性可以通 过，但不限于，在饲喂和暴露适当长时间后死亡率的变化、体重丧失、 吸引、排斥及其它行为和身体的变化来测量。此处描迷的生物试验可 以用于处于幼虫或成虫阶段的任何进食的昆虫害虫。本发明进 一 步通过以下非限制性实施例进行描述。实施例1 NaPI基于在以不同浓度CrylAc包被的NaPI纯合的棉叶上伺喂H. armigera幼虫开发了生物试验。特别地选择NaPI叶以便在幼虫体重 方面给出小的降低。（在以前的生物试验中，在无CrylAc的情况下， 使用对幼虫生长和发育给出较大影响的叶。）叶的制备使用打孔器将叶切成园盘，并通过浸没于测试溶液中5分钟，以 CrylA溶液实施包被。使用镊子自溶液中取出园盘，然后在塑料网上 空气干燥（大约30分钟）。当叶园盘表面上无可见水分时，将园盘转移 至24孔板的孔中。所述孔含有以水润湿的滤纸。未转化的cvCoker叶材料用于对照 实验中。卵的操作H. armigera卵(由Department of Primary Industry & Fisheries Indooroopilly， Queensland, Australia提供）被空运至实验室，并 孵育（根据发育阶段为18-20。至棕色卵阶段（孵化前）。将卵悬浮在 聚丙烯酸酯（Aquakeep聚丙烯酸酯，1 mg/ml H20)中，含有叶园盘的 每个孔中各放一个卵。然后向各孔分别转移单个卵。孔用带孔的Mylar膜覆盖，在有光（16小时光、8小时暗）的控制 温度的小室中25。C孵育。在第6天或第7天取出幼虫并分别称重。CrylAc溶液的制备将CrylAc晶体蛋白/孢子混合物（10mg，来自CSIRO， Canberra, 澳大利亚）溶解在0. 9ml 50fflM Na2C03， （pH10，5)中。在相同緩沖液中 制备牛胰腺的胰蛋白酶（Sigma T-8642 Type 8)贮存液0. 75 mg/ml, 并将0. 1 ml贮存液加入晶体蛋白孢子混合物中并室温孵育过夜。离心 (14,000 rpm)该溶液5分钟，收集上清液并保存于-70匸。基于50。/。起始材料是CrylA而另外50%是最终的被活化的物质， 活化的CrylA蛋白的浓度估计为2.5 mg/ml。估计的分子量：毒素原 133 kD;活化的毒素66 kD。在作为湿润剂的0. 03% v/v Triton Ag 98 中制备稀释物。Liao爭，///7rerre6r"e户"力o/《ft 55-63描述了适宜的CrylAc 分析试验。实验1 _检查对幼虫质量的影响在本实验中，选择亚致死浓度的CrylAc。焦点是检查对幼虫质量 的影响。使用温室生长的植物的第二片完全展开的叶（来自正在生长的 茎尖）。实验持续时间为7天。结果卵的孵化率为70-100%;每次试验12个卵（1个卵/孔）。图1显示 存活的幼虫的质量。没有显著的死亡。看起来CrylAc和NaPI均有助于幼虫体重随着CrylAc浓度的增加 而出现的降低。（对于cvCoker，于10 ju g CrylAc得到的结果似乎是 异常的）。实验2-高浓度CrylAc的影响本实验设计用于通过使用较高浓度的CrylAc来实现死亡。使用更 大数量的卵。第1天，使用第三片完全展开的叶。第4天，添加第2 片完全展开的叶的叶材料。实验持续时间为6天。结果卵的孵化率为50-83%;每次试验40个卵（1个卵/孔）。图2显示 存活的幼虫的质量。图3显示死亡率。除了 CrylAc浓度跨50至250jug/ml的范围进行增加外，本实验 基本上与实验l相同。这些浓度均导致显著的死亡，因此，给出的数 据涉及每种CrylAc浓度下存活的原始样品的子集。Coker或NaPI叶上饲喂的幼虫之间的质量差异在每个CrylAc浓 度（跨50-250 ju g/ml的范围）下都基本上相同。不添加CrylAc，死亡率上无显著差异。在每一个CrylAc浓度下， 应用表达NaPI的叶获得的死亡率都较应用Coker对照材料获得死亡率 显著增加。在任何这些实验中NaPI基因的表达都决不削弱CrylAc的作用。实验3-使用第三龄幼虫进行的生物试验本实验的目的是确定Bt毒素（CrylAc)和NaPI对第三至第四龄H. armigera幼虫的影响。在棉叶cv Coker上饲养幼虫（48只）ll天，之后转移至含有新鲜 叶园盘的新板上。将该48只幼虫分成4个处理组，各组12只幼虫。4种处理如下：-未转化的Coker 315叶-转基因NaPI叶-用100jLig/ffll CrylAc包被的未转化的Coker叶-用100 jug/oil CrylAc包^皮的转基因NaPI叶使幼虫在25。C再生长20小时。于第7、 11和12天记录幼虫体重。实验细节使用两个24孔板。每孔中各放入一个悬浮在聚丙烯酸酯（lg/L) 中的H. armigera卵。最初，每孔中放置一个叶园盘。在需要时添加 其它园盘。在头11天使用于位置3、 4和5的Coker叶。收获这些叶，切成 园盘并混合，之后将它们加入孔中。对于所述的处理，仅使用来自位 置2或3的叶。结果本试验中使用的所有H. armigera卵均获得孵化（表1)。在第11 天，对幼虫进行称重然后喂给测试食物。大约20个小时后（第12天）， 再次对幼虫进行称重（表l，图4)。表l.使用第三龄幼虫得到的H. armigera生物试验结果

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无卵 12 12 12 12孵化的幼虫 12 12 12 12存活的幼虫 11 U 12 12第11天的平均体重（mg) 64. 6 65. 3 67. 1 69. 0第12天的平均体重（mg) 95. 2 91. 0 81. 4 74. 5第11-12天的质量增加y。 47% 39% 21% 8%C-未转化的Coker叶，N-表达NaPI的转基因叶喂养在对照Coker叶和转基因NaPI表达叶上的幼虫两者在经过 20个小时所增加的平均体重方面存在小的差异。对照幼虫的体重平均 增加48。/。，而NaPI饲喂的幼虫体重平均增加41。/。（表l，图5)。注意， 对于每个试验组，第11天幼虫的平均体重稍有差别（表l)，在计算中 必须对此加以考虑。由于幼虫全都被喂给相同饮食，故此差异为幼虫 的天然变异而引起的。当给幼虫喂食CrylAc时存在较大的体重差异。CrylAc喂食的幼 虫体重仅仅平均增加21% (表1，图5)。最后，喂给CryUc包被的转基因叶的幼虫体重仅平均增加7%。 有意义的是注意到这12只幼虫中3只实际上体重降低或者体重未增加 (表l,图5)。这些结果提示，NaPI和CrylAc的联合可以增强削弱幼虫生长的 作用。这些结果与来自实验1和2 (其中新鲜赙化的幼虫被允许在测 试叶上飼喂7天）的结果相符。实施例2 中肠膜的性质当给H. armigera幼虫喂食含有NaPI或Bt蛋白，例如CrylAc 的饮食时，对肠道上皮细胞产生不同的作用。Bt在鳞翅目昆虫饮食中的存在导致柱状细胞膨胀以及位于上皮 层底部的干细胞增殖。最终，上皮层中的细胞在接触到Bt及相关细菌毒素时爆裂。相反地，饮食中存在NaPI将造成上皮层细胞的有限膨胀 并且无爆裂。当饮食含有Bt和NaPI两者时，上皮细胞组织出现广泛 且更为快速的崩解。细胞间隙扩得更大并且物质向血淋巴的接近得到 增强。然后渗透至血淋巴的物质可以与参与天然免疫应答的蛋白酶接 触。尤其是，当PI得以进入血淋巴时，它们可以干扰此天然免疫应答 所必需的蛋白级联。昆虫肠道自任一种毒素引起的损害后再生的能力 被减弱。本领域技术人员将明了，本文描述的发明不仅仅限于那些具体描 述的方案而是易于进行改变和修饰。应当理解，本发明包括所有这些 变体和修饰。本发明叶包括本说明书中单独地或集合地提及或指出的 所有步骤、特性、组合物和化合物，以及所述步骤或特性中的任何两 个或更多个的任何和所有组合。参考书目A醒son Cell Mol Life Sci 59 (3): 417-425， 2002 Bennetzen & Hall, J Biol Chem 257:3026， 1982 Bernhard and Utz， An Environmental Biopesticide: Theory and Practice 255-267， 1993Bogusz et al， Plant Cell 2 (7): 633-641， 1990Brown and Ryan, Biochemistry 23: 3418-3422， 1984Bryant et al, Biochemistry 15:3418-3424, 1976Bytebier et al， Proc Natl Acad Sci USA 84:5345-5349， 1987Ca證ascini et al， Plant Physiol 112 (2): 513-524， 1996Capana et al， Plant Mol Biol 25 (4):681-691， 1994Chen et al， Plant J 10:955-966， 1996Chong et al， Transgenic Research 9:71-78， 2000Christensen et al， Plant Mol Biol 12:619-632， 1989Christensen et al, Plant Mol Biol 18:675-689， 1992 Christou et al， Plant Physiol 87:671-674， 1988 Christou and Ford A麵ls of Botany 75:407-413， 1995 Cordero et al， In: General Meeting of the InternationalProgram on Rice Biotechnology of the Rockefeller Foundation,Malacca, Malaysia, 1997Cordero et al， Physiol Mol Plant Path 41:189-200， 1992Corderok 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