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完全人抗-VEGF抗体和使用方法

阅读：595发布：2020-08-22

专利汇可以提供完全人抗-VEGF抗体和使用方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文公开了完全人抗体及其抗原结合片段，所述抗体及其抗原结合片段特异地结合人VEGF并抑制VEGF与VEGF-R1和VEGF-R2的结合，并因此抑制VEGF 信号转导。本文公开的抗体和抗原结合片段可用于，例如，治疗体内和体外血管生成以及与血管生成有关的病症。，下面是完全人抗-VEGF抗体和使用方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含一个或多个选自由以下组成的组中的成员：
a)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的重链可变区；
b)包含SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11的轻链可变区；
c)包含SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的轻链可变区；
d)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：15的重链可变区；
e)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：16的重链可变区；
f)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：17的重链可变区；
g)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：18的重链可变区；
h)包含SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：19的重链可变区；
i)包含在SEQ ID NO：3中列出的XPA.10.072轻链的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链；
j)包含在SEQ ID NO：5中列出的XPA.10.064轻链的LCDR1、LCDR2和LCDR3的轻链；
k)包含在SEQ ID NO：2中列出的XPA.10.072重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；
1)包含在SEQ ID NO：4中列出的XPA.10.064重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；
m)包含在SEQ ID NO：20中列出的XPA.10.064.03重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；
n)包含在SEQ ID NO：21中列出的XPA.10.064.04重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；
o)包含在SEQ ID NO：22中列出的XPA.10.064.06重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；
p)包含在SEQ ID NO：23中列出的XPA.10.064.07重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链；和
q)包含在SEQ ID NO：24中列出的XPA.10.064.10重链的HCDR1、HCDR2和HCDR3的重链。
2.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含一个或多个选自由以下组成的组中的成员：
a)包含SEQ ID NO：2的重链；
b)包含SEQ ID NO：3的轻链；
c)包含SEQ ID NO：4的重链；
d)包含SEQ ID NO：5的轻链；
e)包含SEQ ID NO：20的重链；
f)包含SEQ ID NO：21的重链；
g)包含SEQ ID NO：22的重链；
h)包含SEQ ID NO：23的重链；和
i)包含SEQ ID NO：24的重链。
3.一种分离的抗体或其抗原结合片段，其特异地结合VEGF并包含下列性能中的一种或多种：
a)结合人VEGF165的KD为约10-10M；
b)结合人VEGF165的ka为约1.89×105；
c)结合人VEGF165的kd为约1.73×10-5；
d)对人VEGF165的结合亲合力比贝伐单抗对人VEGF165的结合亲合力强约4.25倍；
e)抑制HUVEC细胞增殖的IC50为约154pM；
f)抑制HUVEC细胞增殖的IC50为贝伐单抗的约56％；
g)结合人VEGF165的KD在约1.97×10-10M至约3.49×10-11M的范围；
h)结合人VEGF165的ka在约1.5×105至约2.16×105M的范围；
i)结合人VEGF165的kd在约6.65×10-6至约2.94×10-5M的范围；
j)抑制HUVEC细胞增殖的IC50在约129pM至约174pM的范围；
k)对人VEGF的结合亲合力比所述抗体或其抗原结合片段对鼠VEGF的亲合力大至少约10倍；
1)与贝伐单抗竞争结合人VEGF165；
m)当以相同或较低剂量给予时，作为肿瘤生长抑制百分率的函数，抑制肿瘤生长的程度与贝伐单抗相同或更大；和
n)当以与贝伐单抗相同或更低的剂量给予时，延缓肿瘤生长至规定尺寸的持续时间比贝伐单抗更长。
4.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)包含在SEQ ID NO：20中列出的氨基酸序列的重链可变区；和
b)包含在SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列的轻链可变区。
5.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)包含在SEQ ID NO：21中列出的氨基酸序列的重链可变区；和
b)包含在SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列的轻链可变区。
6.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)包含在SEQ ID NO：22中列出的氨基酸序列的重链可变区；和
b)包含在SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列的轻链可变区。
7.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)包含在SEQ ID NO：23中列出的氨基酸序列的重链可变区；和
b)包含在SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列的轻链可变区。
8.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含：
a)包含在SEQ ID NO：24中列出的氨基酸序列的重链可变区；和
b)包含在SEQ ID NO：5中列出的氨基酸序列的轻链可变区。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，为单克隆抗体。
10.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，为多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、完全人抗体、标记的抗体、二价抗体或抗个体基因型抗体。
11.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，为骆驼化单域抗体、双体抗体、scFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、ds双体抗体、纳米抗体、结构域抗体或二价结构域抗体。
12.根据权利要求1-8中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，进一步包含免疫球蛋白恒定区。
13.根据权利要求12所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述免疫球蛋白恒定区是κ轻链、γ1重链、γ2重链、γ3重链或γ4重链恒定区。
14.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，当以贝伐单抗剂量的二分之一给予时，作为肿瘤生长抑制百分率的函数，所述抗体或抗原结合片段抑制肿瘤生长的程度与贝伐单抗相同或更大。
15.根据权利要求14所述的抗体或抗原结合片段，其中，当以贝伐单抗剂量的三分之一给予时，作为肿瘤生长抑制百分率的函数，所述抗体或抗原结合片段抑制肿瘤生长的程度与贝伐单抗相同或更大。
16.根据权利要求15所述的抗体或抗原结合片段，其中，当以贝伐单抗剂量的四分之一给予时，作为肿瘤生长抑制百分率的函数，所述抗体或抗原结合片段抑制肿瘤生长的程度与贝伐单抗相同或更大。
17.根据权利要求16所述的抗体或抗原结合片段，其中，当以贝伐单抗剂量的五分之一给予时，作为肿瘤生长抑制百分率的函数，所述抗体或抗原结合片段抑制肿瘤生长的程度与贝伐单抗相同或更大。
18.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，当以与贝伐单抗相同或更低的剂量给予时，所述抗体或抗原结合片段抑制肿瘤生长至规定尺寸的持续时间是贝伐单抗的至少两倍。
19.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，当以与贝伐单抗相同或更低的剂量给予时，所述抗体或抗原结合片段抑制肿瘤生长至规定尺寸的持续时间是贝伐单抗的至少三倍。
20.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人VEGF165结合的KD≤200pM。
21.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人VEGF165上的表位结合，所述表位与贝伐单抗所结合的表位至少部分地重叠。
22.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段阻断人VEGF165与VEGF-R1和VEGF-R2的结合。
23.根据权利要求1-13中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人VEGF165结合的KD是所述抗体或抗原结合片段与鼠VEGF165结合的KD在数量上的至多十分之一。
24.根据权利要求23所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人VEGF165结合的KD是所述抗体或抗原结合片段与鼠VEGF165结合的KD在数量上的至多五十分之一。
25.根据权利要求24所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或抗原结合片段与人VEGF165结合的KD是所述抗体或抗原结合片段与鼠VEGF165结合的KD在数量上的至多百分之一。
26.一种药物组合物，包含根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种生理学耐受组分。
27.根据权利要求26所述的药物组合物，其中，所述一种或多种生理学耐受组分包括一种或多种药用载体。
28.根据权利要求27所述的药物组合物，其中，所述一种或多种生理学耐受组分包括一种或多种抗氧化剂。
29.根据权利要求28所述的药物组合物，其中，所述一种或多种抗氧化剂选自由蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、和/或没食子酸丙酯组成的组。
30.一种药物组合物，包含与一种或多种其他化疗剂连接或联合的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中，所述其他化疗剂选自由以下组成的组：依维莫司、曲贝替定、abraXane、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、因扎托雷、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、FLT-3抑制剂、VEGF-R抑制剂、EGFR TK抑制剂、极光激酶抑制剂、PIK-1调节剂、Bcl-2抑制剂、HDAC抑制剂、c-MET抑制剂、PARP抑制剂、Cdk抑制剂、EGFR TK抑制剂、IGFR-TK抑制剂、抗-HGF抗体、PI3激酶抑制剂、AKT抑制剂、JAK/STAT抑制剂、检查点-1或2抑制剂、粘着斑激酶抑制剂、MAP激酶激酶(MEK)抑制剂、VEGF诱捕抗体、培美曲塞、厄洛替尼、达沙替尼、迪卡他尼、帕木单抗、氨柔比星、奥戈伏单抗、Lep-etu、诺拉曲特、azd2171、巴他布林、奥法木单抗、扎木单抗、艾特咔林、粉防己碱、卢比替康、替米利芬、奥利默森、CTLA-4单抗、普利木单抗、棉酚、醋酸棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西仑吉肽、吉马替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR、KRX-0402、硫蒽酮、LY 317615、neuradiab、维特斯朋、Rta 744、Sdx 102、他仑帕奈、阿曲生坦、Xr 311、romidepsin、ADS-100380、CG-781、CG-1521、SB-556629、厚膜素、JNJ-16241199、伏立诺他、依托泊苷、吉西他滨、多柔比星、脂质体多柔比星、5’-脱氧-5-氟尿苷、长春新碱、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib；PD0325901、AZD-6244、卡培他滨、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]-二钠盐七水合物、喜树碱、伊立替康；伊立替康、5-氟尿嘧啶和亚叶酸的组合、PEG-标记的伊立替康、FOLFOX方案、他莫昔芬、托瑞米芬柠檬酸盐、阿那曲唑、依西美坦、来曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、轭合的雌激素、贝伐单抗(一种分离的与人IGF1R特异结合的抗体)、IMC-1C11、CHIR-258、3-[5-(甲磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮、瓦他拉尼、AG-013736、AVE-0005、醋酸性瑞林、亮脯利特醋酸盐、曲普瑞林双羟萘酸盐、舒尼替尼、舒尼替尼苹果酸盐、醋酸甲羟孕酮、己酸羟孕酮、乙酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡鲁胺、氟他胺、尼鲁米特、乙酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、厄洛替尼、拉帕他尼、卡纽替尼、ABX-EGF抗体、爱必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、罗那法尼、BMS-214662、替吡法尼；阿米斯丁、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺异羟肟酸、丙戊酸、曲古菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨鲁米特、安吖啶、阿那格雷、L-天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、博来霉素、布舍瑞林、白消安、卡铂、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨、氯屈膦酸、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼、亚叶酸、亮脯利特、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑、6-巯基嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽、奥沙利铂、帕米膦酸、喷司他丁、普卡霉素、卟吩姆、丙卡巴肼、雷替曲塞、利妥昔单抗、链佐星、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、联合地塞米松的沙利度胺、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、13-顺-视黄酸、苯丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌氮芥、六甲蜜胺、氮尿苷、5-脱氧尿苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、6-巯基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、普卡霉素、长春碱、长春瑞滨、拓扑替康、雷佐生、马立马司他、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、维塔辛、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那司提、甲腈咪胍、曲妥珠单抗、地尼白介素-2、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、不含克列莫佛的紫杉醇、多西他赛、埃博霉素B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、拓扑替康、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羟乙基)-雷帕霉素、替西罗莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779，450、PEG-非格司亭、达贝泊汀、5-氟尿嘧啶、促红细胞生成素、粒性白细胞群刺激因子、唑仑二膦酸盐、泼尼松、西妥昔单抗、粒性白细胞巨噬细胞群刺激因子、组氨瑞林、聚乙二醇化干扰素α-2a、干扰素α-2a、聚乙二醇化干扰素α-2b、干扰素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酶、来拉度胺、吉妥珠单抗、氢化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿仑珠单抗、全反式维甲酸、酮康唑、干扰白细胞素-2、甲地孕酮、氮芥、甲泼尼龙、替伊莫单抗、雄激素、地西他滨、六甲三聚氰胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、可的松、棕榈仁油酸、米托坦、环胞霉素、脂质体柔红霉素、埃德温-门冬酰胺酶、锶89、卡索匹坦、奈妥匹坦、NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼、阿瑞吡坦、苯海拉明、羟嗪、甲氧氯普胺、劳拉西泮、阿普唑仑、氟哌啶醇、氟哌利多、屈大麻酚、地塞米松、甲泼尼龙、丙氯拉嗪、格拉司琼、昂丹司琼、多拉司琼、托烷司琼、聚乙二醇化非格司亭、促红细胞生成素、依伯汀α和达贝泊汀α，

32.一种复合体，包含与人VEGF或人VEGF的片段结合的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
33.一种分离的多肽，包含一个或多个选自由SEQ ID NO：2-5和20-24组成的组中的氨基酸序列。
34.一种分离的多核苷酸，编码权利要求33所述的多肽。
35.一种分离的载体，包含权利要求34所述的多核苷酸。
36.一种分离的宿主细胞，包含权利要求35所述的载体。
37.一种表达包含一个或多个选自由SEQ ID NO：2-5和20-24组成的组中的氨基酸序列的多肽的方法，包括在表达权利要求34所述的多核苷酸的条件下培养权利要求36所述的分离的宿主细胞。
38.根据权利要求37所述的方法，其中，所述多核苷酸可操作地与CMV启动子连接并且其中所述宿主细胞为中华仓鼠卵巢细胞。
39.一种抑制需要其的哺乳动物受试者中的血管生成的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段可选地连接或联合一种或多种其他化疗剂。
40.一种治疗需要其的哺乳动物受试者中的与异常血管生成有关的疾病的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段可选地连接或联合一种或多种其他化疗剂。
41.一种治疗需要其的哺乳动物受试者中的与VEGF 信号转导有关的炎性疾病的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段可选地连接或联合一种或多种其他化疗剂。
42.根据权利要求41所述的方法，其中，所述疾病选自由类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘组成的组。
43.一种治疗需要其的哺乳动物受试者中的湿性急性黄斑变性或糖尿病视网膜病变的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
44.一种治疗需要其的哺乳动物受试者中的与VEGF信号转导升高有关的癌症的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体或其抗原结合片段可选地连接或联合一种或多种其他化疗剂。
45.根据权利要求44所述的方法，其中，所述癌症选自由以下组成的组：恶性肿瘤，胚细胞瘤，肉瘤，生殖细胞肿瘤，如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤的血液或淋巴恶性肿瘤，如小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌或肺鳞状细胞癌的肺癌，腹膜癌，如肝细胞癌/肝细胞瘤的肝癌，如胃肠癌的胃癌、胰癌，如成胶质细胞瘤/多形性成胶质细胞瘤、非成胶质细胞瘤、脑肿瘤或脑膜瘤的脑肿瘤，如室管膜瘤、星形细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突神经胶质细胞瘤、或如少突星形细胞瘤的混合性神经胶质瘤的神经胶质瘤，宫颈癌，卵巢癌，如肝母细胞瘤、肝细胞癌/肝细胞瘤、或肝部癌的肝癌、如尿道癌的膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，结直肠癌，直肠癌、，子宫内膜癌或子宫癌，唾液腺癌，如肾横纹肌样瘤的肾癌，前列腺癌，外阴癌，阴茎癌，如肛门鳞状细胞癌的肛门癌，甲状腺癌，如鼻咽癌的头部和颈部癌症，如黑素瘤或鳞状细胞癌的皮肤癌，骨肉瘤，尤因肉瘤，软骨肉瘤，如横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、皮肤多发性出血性肉瘤的软组织肉瘤，类癌性癌，如成视网膜细胞瘤的眼癌，间皮瘤，如急性淋巴细胞/成淋巴细胞白血病、慢性成淋巴细胞/淋巴细胞白血病、急性骨髓性/成髓细胞白血病的淋巴细胞/成淋巴细胞白血病，包括肥大细胞白血病、慢性骨髓性/髓细胞/成髓细胞白血病、毛细胞白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤、慢性单核细胞性白血病、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、蕈状真菌病、赛谢综合征、皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞赘生物、成神经管细胞瘤、肾胚细胞瘤、孤立性浆细胞瘤、脊髓发育不良综合征、慢性和非慢性骨髓增生性疾病、中枢神经系统肿瘤、垂体腺瘤、前庭许旺氏细胞瘤、原发神经外胚层肿瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多、血小板增多、和自发骨髓纤维化。
46.一种试剂盒，包括根据权利要求1-25中任一项所述的抗体或其抗原结合片段以及使用所述抗体或抗原结合片段的说明书。
47.一种分离的抗体或其抗原结合片段，包含重链可变区，其中所述重链可变区包含选自由SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19组成的组中的氨基酸序列。

说明书全文

背景技术

血管内皮生长因子(VEGF)是参与内皮细胞活化、增殖和存活，特别是在视网膜增殖性疾病和肿瘤发生期间的血管原蛋白的主要家族。VEGF属于VEGF-PDGF(血小板源性生长因子)超基因家庭，并且是结合在血管和淋巴内皮细胞中表达的受体的小型糖蛋白二聚体。目前，VEGF家族中有七种已知的配体：VEGF-A(VEGF)、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(病毒源性)和胎盘生长因子(PIGF)-1和-2。这些VEGF配体通过与三种已知VEGF受体(VEGF-R)中的一种或多种结合而介导它们的作用，其中每种受体均具有受体酪氨酸激酶活性。VEGF-R1(Flt-1)主要在内皮细胞和单核细胞中表达，与VEGF和VEGF-B结合，并且看似介导内皮细胞和单核细胞的迁移。VEGF-R2(即人KDR或鼠Flk-1)主要在内皮细胞中表达，对VEGF(以及VEGF-C和VEGF-D的特定片段)有选择性，并介导VEGF-诱导的内皮细胞增殖、存活和迁移，以及血管通透性。VEGF-R3(Flt-4)主要在淋巴内皮细胞中表达，并且与VEGF-C和VEGF-D结合以促进淋巴管生成。VEGF-R1、-R2和-R3各自在一些肿瘤细胞中表达。VEGF与VEGF受体的结合触发了受体二聚化，导致随后的受体激活和信号转导。VEGF与VEGF-R2的结合启动了在促进血管生成中占主导地位的信号转导途径。该途径涉及受体激活以及随后胞内信号转导的诱导。这种情况下，受体激活需要三个基本事件：(i)VEGF结合至VEGF-R2，(ii)受体二聚化和(iii)受体酪氨酸激酶的受体自磷酸化(以及由此的激活)。胞内信使，如磷脂酶C和磷脂酰肌醇-3-激酶直接结合至VEGF-R2的自磷酸化形式并通过受体酪氨酸激酶而磷酸化，其随后触发信号转导事件的胞内级联，从而导致产生了最终促进细胞增殖、迁移和存活(抗细胞凋亡)和提高血管通透性的核信号。

异常血管生成与包括癌症的各种疾病状态有关(Holash 2002)。已证实VEGF信号转导在正常血管发育和与各种疾病有关的病理性血管生成中均起作用(Erikkson 1999；Ferrara 1999；Yancopoulos2000)。VEGF促进血管内皮细胞生长并提高血管通透性(Ferrara2004)。

先前研究已表明，在大多数肿瘤类型中VEGF表达水平升高(Berkman 1993；Brown 1993；Brown 1995；Dvorak 1995；Mattern1996)。研究还显示，在患有如湿性老年性黄斑变性(AMD)的眼血管疾病的受试者中VEGF水平升高。湿性AMD仅占全部AMD病例的约10％，但却造成约90％由AMD引起的失明。湿性AMD的特征在于脉络膜新血管形成(CNV)，即视网膜的视网膜色素上皮层下的异常血管发育。认为VEGF-A在这些血管的形成中起主要作用，这些血管在黄斑下渗漏并引起视网膜变形和视力退化。

目前可获得治疗性抗VEGF抗体。例如，人源化IgG1单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab)(a.k.a.，由Genentech出售，San Francisco，CA；本文中还称为BM-1)与人VEGF结合的亲合力(KD)为约500pM。虽然贝伐单抗已用于治疗各种癌症，但是在本领域需要具有更高体内效力的抗体。这样的抗体提出了巨大的技术挑战并且非常难以实现，因为仅提高VEGF抗体的结合亲合力不必定提高其体内效力(Liang 2006)。

发明内容

本发明解决了对于具有优良效力的VEGF抗体的需求。本文提供了治疗性抗体及其抗原结合片段，以及用于治疗如癌症的医学病症的组合物和使用方法。

在某些实施方式中，提供了一种抗体或抗原结合片段，其包含选自由XPA.10.064、XPA.10.072、XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10组成的组中的HCDR3区。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段进一步包含XPA.10.064或XPA.10.072的HCDR1和/或HCDR2。

在某些实施方式中，提供了一种抗体或抗原结合片段，其包含：XPA.10.072的LCDR1、LCDR2和LCDR3；XPA.10.064的LCDR1、LCDR2和LCDR3；XPA.10.072的HCDR1、HCDR2和HCDR3；XPA.10.064的HCDR1、HCDR2和HCDR3；XPA.10.064.03的HCDR1、HCDR2和HCDR3；XPA.10.064.04的HCDR1、HCDR2和HCDR3；XPA.10.064.06的HCDR1、HCDR2和HCDR3；XPA.10.064.07的HCDR1、HCDR2和HCDR3；和/或XPA.10.064.10.的HCDR1、HCDR2和HCDR3。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段包含XPA.10.072、XPA.10.064、XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07或XPA.10.064.10的重链。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段包含XPA.10.064或XPA.10.072的轻链。

在某些实施方式中，提供了一种包含重链可变区的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含选自由SEQ ID NO：15、SEQ IDNO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19组成的组中的氨基酸序列。在这些实施方式的某些中，重链可变区进一步包含一个或多个在SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段包含重链，其中该重链包含选自由SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24组成的组中的氨基酸顺序。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段进一步包含轻链可变区，其中该轻链可变区包含一个或多个在SEQ ID NO：12、SEQ IDNO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10和SEQ IDNO：11中所示的氨基酸序列。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含轻链，其中该轻链包含在SEQ ID NO：5或SEQID NO：3中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：17中所示的氨基酸序列，而该轻链可变区包含一个或多个在SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段的重链可变区进一步包含在SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，而在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，其中该重链包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：18中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含一个或多个在SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段的重链可变区进一步包含在SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，而在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，其中该重链包含在SEQ ID NO：23中所示的氨基酸序列而该轻链包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：15中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含一个或多个在SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段的重链可变区进一步包含在SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，而在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，其中该重链包含在SEQ ID NO：20中所示的氨基酸序列而该轻链包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：16中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含一个或多个在SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：10和SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段的重链可变区进一步包含在SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，而在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，其中该重链包含在SEQ ID NO：21中所示的氨基酸序列而该轻链包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了一种包含重链可变区和轻链可变区的抗体或抗原结合片段，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含一个或多个在SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：9、SEQ IDNO：1Q和SEQ ID NO：11中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段的重链可变区进一步包含在SEQ ID NO：6和/或SEQ ID NO：7中所示的氨基酸序列，而在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含重链和轻链，其中该重链包含在SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列而该轻链包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了一种抗体或抗原结合片段，其特异地结合VEGF并具有一种或多种下列性能：1)与hVEGF165结合的KD为约10-100M；2)与hVEGF165结合的ka为约1.89×105；3)与hVEGF165结合的kd为约1.73×10-5；4)对hVEGF165的结合亲合力比贝伐单抗对hVEGF165的结合亲合力高约4.25倍；5)抑制制HUVEC细胞增殖的IC50为约154pM；6)抑制HUVEC细胞增殖的IC50为贝伐单抗的约56％；7)与hVEGF165结合的KD在约1.97×10-100M至约3.49×10-11M的范围内；8)与hVEGF165结合的ka在约1.5×105至约2.16×105M的范围内；9)与hVEGF165结合的kd在约6.65×10-6至约2.94×10-5M的范围内；10)抑制HUVEC细胞增殖的IC50在约129pM至约174pM的范围内；11)对hVEGF的结合亲合力比该抗体或其抗原结合片段对mVEGF的结合亲合力大至少约10倍；12)与贝伐单抗竞争结合hVEGF165；13)当以相同或更低的剂量给药时，作为肿瘤生长抑制百分率的函数，对肿瘤生长的抑制程度与贝伐单抗相同或比贝伐单抗更大；和14)当以与贝伐单抗相同或更低的剂量给药时，延缓肿瘤生长使其达到特定尺寸的持续时间比贝伐单抗更长。在某些实施方式中，提供了一种抗体或抗原结合片段，其与包含在SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：19中所示的氨基酸序列的抗体结合至hVEGF165上的相同表位。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段与包含在SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ IDNO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23或SEQ ID NO：24中所示的氨基酸序列的抗体结合至hVEGF165上的相同表位。

在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的KD≤200pM。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的KD≤150pM，而在其他实施方式中≤100pM，而在其他实施方式中≤50pM。在某些实施方式中，本文中提供的抗体或抗原结合片段结合的hVEGF165上的表位与由贝伐单抗所结合的表位至少部分重叠。

在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段阻断hVEGF165与VEGF受体的结合，其中的受体在某些实施方式中为VEGF-R1或VEGF-R2。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段抑制hVEGF165诱导的VEGF受体磷酸化。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的KD比它们结合mVEGF165的KD大至少10倍(即，亲和力大至少10倍，表示数量上小至少10倍)。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的KD比它们结合mVEGF165的KD大至少50倍，而在某些实施方式中，大至少100倍。

在上述实施方式的某些中，本文所公开的抗体或抗原结合片段包含κ轻链、γ1重链、γ2重链、γ3重链或γ4重链恒定区。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段包含IgG2恒定区。在某些实施方式中，本文所公开的抗体为完全抗体。在这些实施方式中的某些中，该抗体可以是单克隆抗体、多克隆抗体、重组抗体、双重特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、标记抗体、二价抗体、抗独特型抗体或完全人抗体。在某些实施方式中，如本文所提供的抗体或抗原结合片段可以为骆驼化(camelized)单域抗体、双体抗体(双特异性抗体，diabody)、scFv、scFv二聚体、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、F(ab’)2、ds双体抗体、纳米抗体、域抗体(domain antibody)或二价域抗体。

在某些实施方式中，提供了用于抑制需要其的受试者体内血管生成的方法，通过所述受试者给予治疗有效量的本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，以每次给予5mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，以每次给予1mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段，而在其他实施方式中给予0.5mg/kg或更小的剂量，而在其他实施方式中给予0.1mg/kg或更小的剂量。在某些实施方式中，以每天一次至每两月一次的间隔向受试者多次给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，可以以约每周一次、约每两周一次、约每月一次或约每两月一次给予该抗体或抗原结合片段。

在某些实施方式中，提供了用于治疗需要其的受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类、灵长类、犬、大鼠、兔或小鼠)中与异常血管生成有关的疾病的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段。在这些实施方式中的某些中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，以每次给予5mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，以每次给予1mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段，而在其他实施方式中给予0.5mg/kg或更小的剂量，而在其他实施方式中给予0.1mg/kg或更小的剂量。在某些实施方式中，以每天一次至每两月一次的间隔向受试者多次给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，可以以约每周一次、约每两周一次、约每月一次或约每两月一次给予该抗体或抗原结合片段。

在某些实施方式中，提供了用于治疗需要其的受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类、灵长类、犬、大鼠、兔或小鼠)中与VEGF信号转导有关的炎性疾病的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，与VEGF信号转导有关的疾病为类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺病或哮喘。在某些实施方式中，以每次给予5mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，以每次给予1mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段，而在其他实施方式中给予0.5mg/kg或更小的剂量，而在其他实施方式中给予0.1mg/kg或更小的剂量。在某些实施方式中，以每天一次至每两月一次的间隔向受试者多次给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，可以以约每周一次、约每两周一次、约每月一次或约每两月一次给予该抗体或抗原结合片段。

在某些实施方式中，提供了用于治疗需要其的受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类、灵长类、犬、大鼠、兔或小鼠)中湿性急性黄斑变性或糖尿病性视网膜病的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，以每次给予5mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，以每次给予1mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段，而在其他实施方式中给予0.5mg/kg或更小的剂量，而在其他实施方式中给予0.1mg/kg或更小的剂量。在某些实施方式中，以每天一次至每两月一次的间隔向受试者多次给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，可以以约每周一次、约每两周一次、约每月一次或约每两月一次给予该抗体或抗原结合片段。

在某些实施方式中，提供了用于治疗需要其的受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类、灵长类、犬、大鼠、兔或小鼠)中与VEGF信号转导升高有关的癌症的方法，包括向所述受试者给予治疗有效量的本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段进一步包含一种为毒素、细胞因子或化疗剂的轭合物。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段联合或连接至一种或多种化疗剂进行给药。在某些实施方式中，受试者接受一种或多种其他治疗方法，如外科肿瘤切除术或抗癌放射疗法。在某些实施方式中，以每次给予5mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，以每次给予1mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段，而在其他实施方式中给予0.5mg/kg或更小的剂量，而在其他实施方式中给予0.1mg/kg或更小的剂量。在某些实施方式中，以每天一次至每两月一次的间隔向受试者多次给予该抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，可以以约每周一次、约每两周一次、约每月一次或约每两月一次给予该抗体或抗原结合片段。

在某些实施方式中，提供了一种试剂盒，其包含如本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，试剂盒进一步包含使用该抗体或抗原结合片段和/或利用该试剂盒中其他组分的说明书。

在某些实施方式中，提供了编码在SEQ ID NO：2-24中所示的氨基酸序列的多核苷酸。在某些其他实施方式中，提供了包含这些多核苷酸的载体，而在某些其他实施方式中，提供了包含这些载体的宿主细胞。在某些实施方式中，提供了用于表达本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段的方法，通过在载体表达编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸的条件下培养这些宿主细胞。在某些实施方式中，本文所提供的多核苷酸可操作地与载体中的启动子(如CMV启动子)连接。在某些实施方式中，包含本文所提供载体的宿主细胞为中华仓鼠卵巢细胞。

在某些实施方式中，提供了包含本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段的药物组合物。在这些实施方式的某些中，该组合物进一步包含一种或多种生理学耐受组分。在这些实施方式的某些中，该一种或多种生理学耐受组分可以是一种或多种药用载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助物质。在这些实施方式的某些中，该一种或多种生理学耐受组分可以包括一种或多种抗氧化剂，其可以选自蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA(乙二胺四乙酸)、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。同样地，在某些实施方式中，提供了使用一种或多种抗氧化剂用于抑制本文所提供抗体或其抗原结合片段的氧化和/或防止其VEGF结合的亲合力降低的方法。在某些实施方式中，用于该组合物的抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：22中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段包含重链可变区和轻链可变区，其中该重链可变区包含在SEQ ID NO：20、21、23或24中所示的氨基酸序列而该轻链可变区包含在SEQ ID NO：5中所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，提供了本文所提供的一种或多种抗体或抗原结合片段在制备用于治疗与异常血管生成有关的疾病、与异常血管生成有关的炎症疾病、与VEGF信号转导有关的炎性疾病、湿性急性黄斑变性、糖尿病性视网膜病或与VEGF信号转导升高有关的癌症的药剂中的应用。

在某些实施方式中，提供了本文所公开的抗体或抗原结合片段用于治疗与异常血管生成有关的疾病、与异常血管生成有关的炎性疾病、与VEGF信号转导有关的炎症疾病、湿性急性黄斑变性、糖尿病性视网膜病或与VEGF信号转导(例如，相对于非癌细胞，癌症表现出VEGF信号升高)有关的癌症。

附图说明

图1：XPA.10.064和XPA.10.072的重链可变区(包括HCDR)和轻链可变区(包括LCDR)。

图2：对XPA.10.064IgG2与hVEGF165结合的Biacore分析。

图3：对XPA.10.072IgG2与hVEGF165结合的Biacore分析。

图4：对贝伐单抗与hVEGF165结合的Biacore分析。

图5：通过贝伐单抗(BM1)、XPA.10.064和XPA.10.072对hVEGF165与VEGF-R1结合的抑制。

图6：通过贝伐单抗(BM1)、XPA.10.064和XPA.10.072对hVEGF165与VEGF-R2结合的抑制。

图7：对由贝伐单抗(BM1)、XPA.10.064(064)和XPA.10.072(072)所结合的hVEGF165表位的分析。

图8：XPA.10.064与G153-694的共定位。部分A显示了用XPA.10.064的染色。部分B显示了用G153-694的染色。部分C显示了用核染料的染色。部分D显示了合并的图像，其中较大的强度(白色)反映了共定位。

图9：XPA.10.072与G153-694的共定位。部分A显示了用XPA.10.072的染色。部分B显示了用G153-694的染色。部分C显示了用核染料的染色。部分D显示了合并的图像，其中较大的强度(白色)反映了共定位。

图10：通过(A)XPA.10.064IgG2和(B)XPA.10.072IgG2对HUVEC增殖的抑制。

图11：用hVEGF165剂量滴定处理HUVEC导致VEGF-R2磷酸化的升高。

图12：用hVEGF165+贝伐单抗剂量滴定处理HUVEC导致VEGF-R2磷酸化的降低。

图13：XPA.10.064(064)和XPA.10.072(072)IgG2抑制hVEGF165诱导的VEGF-R2磷酸化。

图14：用于栓子的目测评分系统。显示了0到3的每个得分的实例。

图15：栓子测定显示了在贝伐单抗(BM-1)、XPA.10.064(064)和XPA.10.072(072)以不同剂量存在下的血管生成抑制的水平。

图16：通过栓子测定所确定的血管生成的抑制。数量为双盲得分的结果的平均值。(A)无细胞；(B)DU145+αKLH；(C)贝伐单抗(0.1mg/kg)；(D)贝伐单抗(1mg/kg)；(E)贝伐单抗(5mg/kg)；(F)XPA.10.064(0.1mg/kg)；(G)XPA.10.064(1mg/kg)；(H)XPA.10.064(5mg/kg)；(I)XPA.10.072(0.1mg/kg)；(J)XPA.10.072(1mg/kg)；(K)XPA.10.072(5mg/kg)。

图17：通过XPA.10.064和XPA.072对体内A673肿瘤生长的抑制。(1)仅载体；(2)0.5mg/kg的XPA.10.064IgG2；(3)5mg/kg的XPA.10.064IgG2；(4)0.5mg/kg的XPA.10.072IgG2；(5)5mg/kg的XPA.10.072IgG2；(6)5mg/kg的CHO.KLH IgG2；(7)0.5mg/kg的贝伐单抗；(8)5mg/kg的贝伐单抗。

图18：在四个独立测定中通过XPA.10.064IgG2对HUVEC增殖的抑制(#1-4)。

图19：在四个独立测定中通过XPA.10.064.03IgG2对HUVEC增殖的抑制(#1-4)。

图20：在四个独立测定中通过XPA.10.064.06IgG2对HUVEC增殖的抑制(#1-4)。

图21：在四个独立测定中通过XPA.10.064.07IgG2对HUVEC增殖的抑制(#1-4)。

图22：在四个独立测定中通过XPA.10.064.10IgG2对HUVEC增殖的抑制(#1-4)。

图23：在四个独立测定中通过贝伐单抗IgG2对HUVEC增殖的抑制(#1-4)。

图24：通过XPA.10.064.03(■)、XPA.10.064.04(▲)、XPA.10.064.06()、XPA.10.064．07(◆)、XPA.10.064.10(●)、XPA.10.064(□)和贝伐单抗(x，*)对HUVEC增殖的抑制。对各个抗体的结果均为四个独立测定的平均值。

图25：24天中由XPA.10.064.06和贝伐单抗对体内A673肿瘤生长的抑制。(●)0.5mg／kg同种型对照抗体；()0.1mg／kg的贝伐单抗；(◆)0.1mg／kg的XPA.10.064.06 IgG2；(■)0.5mg／kg的贝伐单抗；(▲)0.5mg／kg的XPA.10.064.06 IgG2；(□)5mg／kg的贝伐单抗和(△)5mg／kg的XPA.10.064.06 IgG2。x轴上的箭头指示剂量给药天数。

图26：28天中由XPA.10.064.06和贝伐单抗对体内A673肿瘤生长的抑制。(●)0.5mg／kg同种型对照抗体；()O．1mg／kg的贝伐单抗；(◆)0.1mg／kg的XPA.10.064.06 IgG2；(■)0.5mg／kg的贝伐单抗；(▲)0.5mg几g的XPA.10.064.06 IgG2；(□)5mg／kg的贝伐单抗和(△)5mg／kg的XPA.10.064.06 IgG2。x轴上的箭头指示剂量给药天数。

图27：31天中由XPA.10.064.06和贝伐单抗对体内A673肿瘤生长的抑制。(●)0.5mg／kg同种型对照抗体；()0.1 mg／kg的贝伐单抗；(◆)0.1mg／lkg的XPA.10.064.06 IgG2；(■)0.5mg／kg的贝伐单抗；(▲)0.5mg／kg的XPA.10.064.06 IgG2；(口)5mg／kg的贝伐单抗和(△)5mg／kg的xPA.10.064.06 IgG2。x轴上的箭头指示剂量给药天数。

图28：抗体蛋氨酸氧化对hVEGFl65结合的影响。A．在存在或不存在蛋氨酸氧化的情况下对XPA.10.064与hVEGFl65结合的Biacore分析。B．在存在或不存在蛋氨酸氧化的情况下对XPA.10.064.06与hVEGFl65结合的Biacore分析。

图29：热应力氧化条件后，蛋氨酸对xPA.10.064.06与hVEGF】165结合的影响。A．热应力氧化后对XPA.10.064.06与hVEGFl65结合的Biacore分析。B.在存在蛋氨酸的情况下，热应力氧化后对XPA.10.064.06与hVEGFl65结合的Biacore分析。

图30：氧化后，蛋氨酸对XPA.10.064.06对hVEGF165结合亲合力的影响。A.在存在或不存在蛋氨酸的情况下，热应力氧化后，对XPA.10.064.06与hVEGF165结合的ELISA(酶联免疫吸附测定)分析。B.在存在或不存在蛋氨酸的情况下，化学应力氧化后对XPA.10.064.06与hVEGF165结合的ELISA分析。

图31：XPA.10.064重链+轻链载体pMXSP117的结构。除了用hisD基因代替neo基因外，XPA.10.064重链+轻链载体pMXSP 119具有相同结构。A.环形结构。B.用Xbal消化后的线性结构。

图32：XPA.10.064.06重链和轻链可变区模块表达载体。A.重链载体的结构。B.轻链载体的结构。

具体实施方式

本发明的以下描述仅旨在说明本发明的各种实施方式。同样，不能将所讨论的具体变形视为对本发明范围的限制。对于本领域的技术人员来说，在不背离本发明范围的情况下各种等同替换、变化和变形将是显而易见的，并且应理解该类等价实施方式将包括在本文中。
缩写
本文使用了以下缩写：ADCC，抗体依赖的细胞毒性；AMD，年龄相关性黄斑变性；BDS，原料药物质；BM-1，贝伐单抗；CDC，补体依赖的细胞毒性；CNV，脉络膜新血管形成；COPD，慢性阻塞性肺病；DF，渗滤；EDTA，乙二胺四乙酸；GMP，药品生产质量规范；HAMA，人抗-小鼠抗体；HIC，疏水性相互作用色谱；HUVEC，人脐静脉内皮细胞；hVEGF，人VEGF；MCB，原始细胞库；mpk，mg/kg；mVEGF，鼠VEGF；PD，药效学；PK，药物动力学；RA，类风湿性关节炎；RIA，放射免疫沉淀；UF，超滤；VEGF，血管内皮生长因子；VEGF-R，血管内皮生长因子受体；VHL，希林二氏(von Hippel/Lindau)；X-反应性，交叉反应性。
定义
如本文所用的，术语“抗体”包括与特定抗原结合的任何单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(二价)抗体。完全抗体包含两条重链和两条轻链。每条重链由可变区和第一、第二和第三恒定区组成，而每条轻链由可变区和恒定区组成。哺乳动物的重链分为α、δ、ε、γ和μ，而哺乳动物的轻链分为γ或κ类。抗体具有的形状为“Y”形，其中Y的柄部由通过二硫键结合在一起的两条重链的第二和第三恒定区组成。Y的每条臂包括与一条轻链的可变区和恒定区结合的一条重链的可变区和第一恒定区。轻链和重链的可变区负责抗原的结合。两种链中的可变区通常含有三个高度可变的环，其称作互补决定区(CDR)(轻(L)链CDR包括LCDR1、LCDR2和LCDR3，而重(H)链CDR包括HCDR1、HCDR2和HCDR3)。可以通过Kabat、Chothia或A1-Lazikani(Al-Lazikani 1997；Chothia 1985；Chothia 1987；Chothia 1989；Kabat 1987；Kabat 1991)的常规方法定义或鉴别本文所公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界。将三个CDR插入到被称为框架区(FR)的侧翼延伸之间，该框架区比CDR更加高度保守并形成支持高变环的支架。重链和轻链的恒定区不参与抗原结合，但表现出各种效应子的功能。根据抗体重链恒定区的氨基酸序列对其进行分类。抗体的五种主要种类或同种型为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其特征在于分别存在α、δ、ε、γ和μ重链。将几种主要抗体种类分为子类，如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α1重链)。
为“二价”的抗体或其抗原结合片段包含两个抗原结合位点。该两个抗原结合位点可以与相同抗原结合，或它们可以各自与不同的抗原结合，这种情况下该抗体或抗原结合片段的特征在于“双特异性”。
如本文所用的，术语“抗原结合片段”指抗体片段，例如双体抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性dsFv(dsFv-dsFv’)、二硫键稳定的双体抗体(ds双体抗体)、单链抗体分子(scFv)、scFv二聚物(二价双体抗体)、由包含一个或多个CDR的抗体部分形成的多特异性抗体、骆驼源化单域抗体、纳米抗体(nanoantibody)、域抗体、二价域抗体或与抗原结合但不包含完全抗体结构的任何其他抗体片段。抗原结合片段能够与亲代抗体所结合的相同抗原结合。在某些实施方式中，抗原结合片段可以包含一个或多个来自接枝到来自一个或多个不同人抗体的框架区上的特定人抗体的CDR。
与抗体有关的“Fab”指由通过二硫键结合至单重链的可变区和第一恒定区的单轻链(可变和恒定区)所组成的抗体的部分。
“Fab”’指包括部分绞链区的Fab片段。
“F(ab’)2”指Fab的二聚体。
与抗体有关的“Fc”指由通过二硫键结合至第二重链的第二和第三恒定区的第一重链的第二和第三恒定区所组成的抗体的部分。抗体的Fc部分负责各种效应子功能，如ADCC和CDC，但是在抗原结合中不起作用。
与抗体有关的“Fv”指具有完全抗原结合位点的抗体的最小片段。Fv片段由结合至单重链的可变区结合的单轻链的可变区组成。
“单链Fv抗体”或“scFv”指改造抗体，其由直接或肽接头序列彼此连接的轻链可变区和重链可变区所组成(Houston 1988)。
“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”指由连接至抗体Fc区的scFv所组成的改造抗体。
“骆驼源化单域抗体”、“重链抗体”或“HCAb”指含有两个VH结构域并且不含轻链的抗体(Riechmann 1999；Muyldermans 2001；WO94/04678；WO94/25591；美国专利No.6005079)。重链抗体最初来源于骆驼属(骆驼、单峰驼和美洲驼)。尽管缺少轻链，但是骆驼源化抗体具有可信的抗原结合组成部分(Hamers-Casterman1993；Nguyen 2002；Nguyen 2003)。重链抗体的可变结构域(VHH结构域)代表由适应性免疫应答所产生的最小已知抗原结合单元(Koch-Nolte 2007)。
“纳米抗体”指由来自重链抗体的VHH域和两个恒定域(CH2和CH3)所组成的抗体片段。
“双体抗体”包括具有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中这些片段包含连接至相同多肽链中VL结构域的VH结构域(VH-VL或VH-VL)(见，例如，Holliger 1993；EP404097；WO93/11161)。通过使用短到不允许在相同链的两个结构域间配对的接头，迫使这些域与另一条链的互补结构域配对，由此产生两个抗原结合位点。
“(结构)域抗体(domain antibody)”指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些情况下，两个或多个VH域通过肽接头共价结合而产生二价域抗体。二价域抗体的两个VH域可以靶向相同或不同的抗原。
在某些实施方式中，“(dsFv)2”包含三条肽链：通过肽接头连接且通过二硫桥结合至两个VL部分的两个VH部分。
在某些实施方式中，“双特异性ds双体抗体”包含经由在VH1和VL1之间的二硫桥结合至VL1-VH2(通过肽接头连接)的VH1-VL2(也通过肽接头连接)。
在某些实施方式中，“双特异dsFv”或“dsFv-dsFv”包含三条肽链：VH1-VH2部分，其中重链通过肽接头连接(例如，长的柔性接头)并通过二硫桥分别结合至VL1和VL2部分，其中每个通过二硫桥成对的重链和轻链具有不同的抗原特异性。
在某些实施方式中，“scFv二聚体”为二价双体抗体，其包含与另一VH-VL部分二聚化的VH-VL(通过肽接头连接)从而使得一个部分的VH与另一部分的VL配位并形成两个相同的结合位点。在其他实施方式中，“scFv二聚体”是双特异双体抗体，其包含与VL1-VH2(通过肽接头连接)相连的VH1-VL2(也通过肽接头连接)从而使得VH1与VL1配位而VH2与VL2配位，并且每个配位对具有不同的抗原特异性。
如本文所用的，术语“表位”指抗原上与抗体结合的原子或氨基酸的特定基团。如果两个抗体对抗原表现出竞争性结合，则它们可以与抗原内的相同表位结合。例如，如果本文所公开的抗体或抗原结合片段与贝伐单抗竞争与VEGF的结合，则可以(但不必须)认为抗体所结合的表位与贝伐单抗相同。
如本文所用的，“VEGF”或“VEGF配体”指目前已知的七种VEGF配体之一：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(病毒来源)或胎盘生长因子(PIGF)-1或-2。对于VEGF-A，目前有四种已知的拼接亚型，每种均表现出独特的生物学功能。165氨基酸亚型(VEGF165、SEQ ID NO：1)以肝素-结合和可溶形式存在。121氨基酸亚型(VEGF121)，其丢失了对应于VEGF165中的残基115和159之间的区域的片段，仅以可溶形式存在。更长的189和206氨基酸亚型(分别为VEGF189和VEGF206)保持了结合肝素的能力。本文所提供的抗体和抗原结合片段表现出对hVEGF165的高结合亲合力，但在某些实施方式中，其可以交叉反应或表现出对非人VEGF蛋白或对其他VEGF亚型的低结合亲合力水平。
如本文所用的，“VEGF信号转导”包括由VEGF与一个或多个VEGF受体结合所诱导的胞内事件，如受体磷酸化(例如，酪氨酸磷酸化)、胞内信号转导分子(例如，PLCγ；磷脂酶C-γ)与受体或其他胞内信号转导分子的结合、信号转导级联的启动和/或生物学响应的启动(例如，诱导细胞生理或发育(例如，增殖)中基因表达和变化)。
如本文所用的，“癌症”或“癌性病症”指通过肿瘤形成或恶性肿瘤细胞生长、增殖或转移所介导的任何医学病症，包括实体癌症和非实体癌(如白血病)两种。如本文所用的，“肿瘤”指肿瘤和/或恶性肿瘤细胞的实体块。
如本文所用的，病症的“治疗”包括防止或减轻病症、减缓病症的发作或发展速度、降低发展病症的风险、防止或延缓与病症有关的症状发展，减少或终止与病症有关的症状、导致病症完全或部分消退、治愈病症或它们的一些组合。对于癌症，“治疗”可以指抑制或减缓肿瘤形成或恶性肿瘤细胞生长、增殖或转移，防止或延缓肿瘤形成或恶性肿瘤细胞生长、增殖或转移的发展，或它们的一些组合。对于肿瘤，“治疗”包括消除所有或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤的生长和转移、防止或延缓肿瘤的发展，或它们的一些组合。
如本文所用的，术语“特异结合”指两个分子之间非随机的结合反应，例如，抗体和配体之间。如本文所用的，与第一配体特异结合的抗体或抗原结合片段可以表现出与第二配体的交叉反应或低水平的结合亲合力。在某些实施方式中，与配体特异结合的抗体或抗原结合片段结合该配体的亲合力(KD)≤10-7M(例如，5×10-8M、10-8M、5×10-9M)。如本文所用的，KD指解离速率与结合速率的比值(koff/kon)，并可以使用本领域已知的方法确定(例如，使用Biacore或Kinexa技术)。在某些实施方式中，与配体特异结合的抗体或抗原结合片段结合该配体的结合亲合力比该抗体结合第二配体的结合亲合力高至少10倍(例如，≥10倍、≥15倍、≥20倍、≥50倍、≥102倍、≥103倍或≥104倍)。在其他实施方式中，与配体(如hVEGF165)特异结合的抗体结合该配体的结合亲和力(KD)≤10-7M，但该抗体对第二配体(如mVEGF165)未表现出可检测的结合亲合力。
“分离的”物质已被人改变了自然状态。如果“分离的”组合物或物质是天然发生的，则它已经从其原始环境中发生变化或移出，或两者均发生。例如，天然存在于活动物中的多核苷酸或多肽不是“分离的”，但是如果相同的多核苷酸或多肽已经与其天然状态的共存材料充分分离以致于以基本纯态存在，则它是“分离的”。
如本文所用的，术语“载体”指编码蛋白质的多核苷酸可以可操作地插入其中从而导致该蛋白质表达的载体。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞从而导致宿主细胞内其所携带遗传元件的表达。载体的实例包括质粒，噬粒，粘粒，诸如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)、或P 1来源人工染色体(PAC)的人工染色体，诸如λ噬菌体或M13噬菌体的细菌噬菌体，和动物病毒。用作载体的动物病毒种类包括反转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒(例如，单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、和乳多空病毒(例如，SV40)。载体可以包含控制表达的各种元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、可选择元件和报告基因。另外，载体可以包含复制原点。载体还可以包含有助于其进入细胞的材料，包括，但不限于，病毒颗粒、脂质体、或蛋白质涂层。
如本文所用的，短语“宿主细胞”指其中已引入外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可以选自各种细胞类型，包括，例如，细菌细胞如大肠杆菌(E.coli)或枯草芽孢杆菌(B.subtilis)细胞，真菌细胞如酵母细胞或曲霉菌(Aspergillus)细胞，昆虫细胞如果蝇S2(Drosophila S2)或草地贪夜蛾(Spodoptera Sf9)细胞，或动物细胞如成纤维细胞、CHO细胞、COS细胞、NSO细胞、HeLa细胞、BHK细胞、HEK293细胞、或人细胞。
如本文所用的，“与异常血管生成有关的疾病”指由血管生成增加，特别是由与VEGF信号转导有关或通过它所介导的血管生成增加所引起的、加剧的或与之有关的任何病症。这样的病症包括由依赖于新生血管进行生长、增殖或转移的细胞所介导的癌症，诸如(例如)湿性AMD的眼病和诸如(例如)类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺病(COPD)、或哮喘的炎性病症。
如本文所用的，“阻断结合”或“竞争结合”的能力指抗体或抗原结合片段将两分子间的结合相互作用抑制到任何可检测程度的能力。在某些实施方式中，阻断两分子间结合的抗体或抗原结合片段将两分子间的结合相互作用抑制了至少50％。在某些实施方式中，该抑制可以大于60％，在某些实施方式中大于70％，在某些实施方式中大于80％，在某些实施方式中大于90％。在某些实施方式中，被抑制的结合相互作用可以是贝伐单抗对hVEGF165的结合相互作用。在某些其他实施方式中，被抑制的相互作用可以是hVEGF165或任何其他VEGF配体对VEGF-R1和/或VEGF-R2的结合相互作用。
完全人VEGF抗体和抗原结合片段
相对于鼠抗体、嵌合抗体、或人源化抗体，完全人抗体在安全和效力方面具有几个潜在优势。第一，它们缺少非人残基使得给予完全人抗体后产生宿主免疫应答的可能性较小。第二，完全人抗体通常比其他抗体类型表现出较低的清除率。这种降低的清除率允许使用较低的剂量和频率。
本文提供了抗-hVEGF抗体及其抗原结合片段，其特征在于具有优良的体内抗肿瘤活性。由于与开发具有优良体外抗原结合特征(作为KD的函数)以及优良体内生物学作用的抗体有关的不确定性，这代表了意想不到和惊人的发现。事实上，众所周知，对VEGF具有特别高的体外结合亲合力的抗体不一定具有高体内效力(Liang2006)。因此，对具有高体内效力的抗体如本文所公开的那些的鉴别是高度不可预知的并且需要广泛的科学实验。
本文公开了完全人亲本抗体XPA.10.064和XPA.072，两者均与hVEGF165特异结合。如以下所讨论的，该亲本XPA.10.064抗体为亲合力成熟的从而产生具有高体内效力的抗体。通过用hVEGF165淘选噬菌体展示scFv文库而鉴别出XPA.10.064和XPA.10.072。以下示出了XPA.10.072的重链和轻链可变区序列并分别在SEQ IDNO：2和3中表示，以下还示出了XPA.10.064的重链和轻链可变区序列并分别在SEQ ID NO：4和5中表示。如在SEQ ID NO：2和4中分别所示的，XPA.10.072和XPA.10.064重链可变区在残基31-35(HCDR1，SEQ ID NO：6)、50-66(HCDR2，SEQ ID NO：7)和99-108(HCDR3，SEQ ID NO：8)处含有CDR。如在SEQ ID NO：3中所示的XPA.10.072轻链可变区在残基26-35(LCDR1，SEQ ID NO：9)、51-57(LCDR2，SEQ ID NO：10)和90-100(LCDR3，SEQ IDNO：11)处含有CDR。如在SEQ ID NO：5中所示的XPA.10.064轻链可变区在残基23-35(LCDR1，SEQ ID NO：12)、51-57(LCDR2，SEQ ID NO：13)和90-100(LCDR3，SEQ ID NO：14)处含有CDR。
成熟XPA.10.072和XPA.10.064重链和轻链的氨基酸序列(缺少信号序列)(CDR加下划线)：
XPA.10.072重链：
RLQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWARQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDHRIVGGLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：2)。
XPA.10.072轻链：
QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNLGSNFVYWYQQLPGTAPKLLIYRNHQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCASWDDSLRVVVFGGGTKLTVL(SEQ ID NO：3)。
XPA.10.064重链：
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDHRIVGGLDYWGQGTLVTVS S(SEQ ID NQ：4)。
XPA.10.064轻链：
SYVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGINYVYWYQQLPGTAPKLLIYRNDQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDDSLSGVVFGGGTKVTVL(SEQ ID NO：5)。
根据XPA.10.064和XPA.10.072scFv在ELISA中以高亲和力结合hVEGF165的能力和抑制hVEGF165结合VEGF-R1和VEGF-R2的能力，选择向scFv-Fc和IgG2转化的抗体以进行其他功能研究。如通过Biacore分析所确定的，XPA.10.064和XPA.10.072scFv-Fc和IgG2均对hVEGF165显示出相似的高结合亲合力。两种抗体还都与hVEGF121结合。XPA.10.064和XPA.10.072IgG2对mVEGF165仅表现出弱结合。XPA.10.064和XPA.10.072IgG2对hVEGF165的结合亲合力分别为1.24-1.71nM和1.66-1.7nM。Biacore分析还揭示XPA.10.064和XPA.10.072IgG2阻断hVEGF165与VEGF-R1和VEGF-R2的结合至与在贝伐单抗中所观察到的类似程度。通过ELISA实验确认了XPA.10.064和XPA.10.072抑制VEGF信号转导的能力，表明这两种抗体均抑制hVEGF165诱导的VEGF-R2磷酸化。
表位分析表明，XPA.10.064和XPA.10.072与hVEGF165上的线性表位结合，而且这些表位可以与贝伐单抗所结合的表位至少部分重叠。免疫组织化学分析揭示，与贝伐单抗不同，XPA.10.064和XPA.10.072均表现出宽范围的组织交叉反应性。这两种抗体均抑制HUVEC增殖，并且均抑制体内血管生成和肿瘤生长。表1中列出了对XPA.10.064和XPA.10.072特性的总结。
表1：XPA.10.064和XPA.10.072特性总结
  XPA.10.064   XPA.10.072   贝伐单抗   HUVEC增殖潜力  (HPP)：  HEK293-hVEGF165，  IgG2(IC50)   0.07μg/ml(第二  次测定为0.66)   0.68μg/ml   0.04μg/ml   HPP：sf21-hVEGF165，  scFvFc(IC50)   0.41μg/ml   ＞1μg/ml   0.06μg/ml   HPP：sf21-hVEGF165，  IgG2(IC50)   0.15μg/ml   0.24μg/ml   0.05μg/ml   与hVEGF165的结合  (KD)   1.24-1.71nM  (IgG2)   1.66-1.70nM  (IgG2)   0.425-0.605nM  (IgG2)   与mVEGF165的结合  (KD)   通过Biocore分  析为弱结合(＞  100nM)   通过Biocore分  析为弱结合(＞  100nM)   通过Biocore分  析为无可检测的  结合   人/鼠交叉反应性   无   无   无   阻断hVEGF165与  VEGF-R1的结合   是  (scFV-FC)   是  (scFV-FC)   是   阻断hVEGF165与  VEGF-R2的结合   是  (scFV-FC)   是  (scFV-FC)   是   结合与贝伐单抗不同  的hVEGF165表位   否   否
  构象与线性表位结合   线性   线性   线性   MPA(％αKLH浓度  (cntr)；2×5mg/kg)   20   26   38
为了产生具有改善的结合和效力的完全人抗体的诱变形式，在XPA.10.064的重链CDR上进行亲合力成熟。通过对五个氨基酸区段的XPA.10.064HCDR3进行随机诱变处理而生成抗体文库，并使用噬菌体展示技术针对与hVEGF165的结合筛选该文库。以下示出了五种亲合力成熟的IgG(XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10)的HCDR3序列，并分别在SEQ ID NO：15-19中表示。
XPA.10.064.03：DQMVHGGLDY(SEQ ID NO：15)。
XPA.10.064.04：DEMQNGGLDY(SEQ ID NO：16)。
XPA.10.064.06：DEMTRGGLDY(SEQ ID NO：17)。
XPA.10.064.07：DEMHVGGLDY(SEQ ID NO：18)。
XPA.10.064.10：DEMVWGGLDY(SEQ ID NO：19)。
如通过Biacore分析所确定的，每个XPA.10.064亲合力成熟的克隆体与hVEGF165结合的亲合力比亲本XPA.10.064抗体或贝伐单抗的亲合力高，并且对mVEGF165仅表现出弱结合。亲合力成熟的克隆体还表现出比亲本XPA.10.064对HUVEC增殖更大程度抑制的能力。另外，以低至0.1mg/kg的剂量，XPA.10.064.06在横纹肌肉瘤肿瘤生长模型中表现出比贝伐单抗对体内肿瘤生长更大程度抑制的能力。以0.1mg/kg和0.5mg/kg的剂量给予XPA.10.064.06后，肿瘤生长抑制百分率与以至少高五倍的剂量给予贝伐单抗时所获得的百分率大致相同。当以相同剂量给予时，XPA.10.064.06将肿瘤生长抑制在特定尺寸的持续时间比贝伐单抗至少长二至三倍。如以上所讨论的，由于VEGF抗体亲合力的升高不必定与降低体内肿瘤生长的效力的提高相关，因此这种体内效力的提高是出乎意外的(Liang 2006)。
在某些实施方式中，本文提供了抗体和抗原结合片段，其包含如分别在SEQ ID NO：15-19中示出的XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07或XPA.10.064.10的HCDR3序列。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段可以进一步包含分别在SEQ ID NO：6和7中示出的XPA.10.064的HCDR1(GHYIH)和/或HCDR2(WINPYSGGTNFPREFQG)序列。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含以下提出且分别在SEQ ID NO：20-24中示出的XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07或XPA.10.064.10的重链可变序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段进一步包含一个或多个在SEQ ID NO：12-14中示出的XPA.10.064的LCDR序列。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO：5中示出的XPA.10.064的轻链可变序列。在某些实施方式中，本文还公开了抗体及其抗原结合片段，其与亲合力成熟的抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07或XPA.10.064.10所结合的相同表位结合。以下示出了成熟亲合力成熟的XPA.10.064重链的氨基酸序列(缺少信号序列)并在SEQ ID NO：20-24中表示(用下划线表示CRD)：
XPA.10.064.03：
EVQIVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDQMVHGGLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：20)。
XPA.10.064.04：
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMQNGGLDYWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO：21)。
XPA.10.064.06：
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMTRGGLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：22)。
XPA.10.064.07：
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMHVGGLDYWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：23)。
XPA.10.064.10：
EVQLVQSGAEVRKPGASVKVSCKASGYSFTGHYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPYSGGTNFPREFQGRVTMTRDTSVNTVYMELTRLTSDDTSVYYCARDEMVWGGLDYWGQGTLVTVS S(SEQ ID NO：24)。CDR加下划线。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段包含分别在SEQ ID NO：17和18中示出的XPA.10.064.06或XPA.10.064.07的HCDR3序列。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段可以进一步包含分别在SEQ ID NO：6和7中示出的XPA.10.064的HCDR1和/或HCDR2序列。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段包含分别在SEQ ID NO：22和23中示出的XPA.10.064.06或XPA.10.064.07的重链可变序列。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段进一步包含一个或多个在SEQ ID NO：12-14中示出的XPA.10.064的LCDR序列。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段包含在SEQ ID NO：5中示出的XPA.10.064的轻链可变序列。
在某些实施方式中，本文提供了抗体或其抗原结合片段，其特异地与VEGF结合并具有下列一种或多种性能：(1)对hVEGF165的KD为约10-10M(即与亲合力成熟的XPA.10.064抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的平均KD类似)；(2)对hVEGF165的ka为约1.89×105(即与亲合力成熟的抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的平均ka类似)；(3)对hVEGF165的kd为约1.73×10-5(即与亲合力成熟的抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的平均kd类似)；(4)对hVEGF165的结合亲合力(作为KD的函数)比贝伐单抗(即约4.25×10-10)大的程度与亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10对hVEGF165的结合亲合力比贝伐单抗大的程度大致相同；(5)抑制HUVEC细胞增殖的能力所具有的IC50为约154pM(即与亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的平均IC50类似)；(6)抑制HUVEC细胞增殖的能力所具有的IC50为贝伐单抗的约56％；(7)对hVEGF165的KD为从约1.97×10-10M至约3.49×10-11M之间(即在亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的范围内)；(8)对hVEGF165的ka为从约1.5×105至约2.16×105之间(即在亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的范围之内)；(9)对hVEGF165的kd为从约6.65×10-6至约2.94×10-5之间(即在亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的范围之内)；(10)抑制HUVEC细胞增殖的能力所具有的IC50为从约129pM至约174pM之间(即在亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10所表现出的范围之内)；(11)对hVEGF165的结合亲合力比该抗体或抗原结合片段对mVEGF165的结合亲合力大至少约10倍；和(12)与贝伐单抗竞争与hVEGF165结合的能力。
本文还提供了包含本文所公开的一个或多个抗体或抗原结合片段及其一个或多个VEGF配体或抗原片段的复合体。这些复合体可以在体外或体内形成。例如，在某些实施方式中，这样的复合体可以在向受试者给予如本文所公开的抗体或抗原结合片段并且该抗体或抗原结合片段在该受试者体内与VEGF结合时形成。
通过对XPA.10.064HCDR3进行随机诱变以及随后的结合和功能测定，产生了如本文所提供的亲合力成熟抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10。在某些实施方式中，可以用另一种氨基酸残基例如丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸或亮氨酸残基取代XPA.10.064.06HCDR3中的蛋氨酸残基。在SEQ ID NO：25-29中示出了这样突变的HCDR3序列的实例。因此，在某些实施方式中，提供了包含在SEQ ID NO：25-29的任一个中所示的HCDR3序列的抗体和抗原结合片段。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段可以进一步包含分别在SEQID NO：6和7中所示的XPA.10.064的HCDR1和/或HCDR2序列。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段可以进一步包含一个或多个在SEQ ID NO：12-14中所示的XPA.10.064的LCDR序列。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段可以包含在SEQ ID NO：5中所示的XPA.10.064的轻链可变序列。
在某些实施方式中，通过对XPA.10.064HCDR1、HCDR2、LCDR1、LCDR2和/或LCDR3的一个或多个残基进行诱变处理而产生了亲本抗体XPA.10.064的其他亲合力成熟形式。因此，在某些实施方式中，提供了包含XPA.10.064的一个或多个CDR序列的抗体和抗原结合片段，其中该一个或多个CDR序列包含一个或多个氨基酸取代。为了鉴别具有改善的结合特性的亲合力成熟抗体，可以对以这种方式产生的抗体和抗原结合片段与hVEGF165的结合进行筛选。可以对具有有利结合特性的抗体进行一种或多种功能测定以确定它们的例如抑制HUVEC增殖、血管生成、肿瘤生长和/或hVEGF165诱导的VEGF-R2磷酸化的能力。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的亲合力比贝伐单抗对hVEGF165的大。例如，在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的KD为≤500pM。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段结合hVEGF165的KD为≤200pM，在其他实施方式中为≤150pM，在其他实施方式中为≤100pM，而在其他实施方式中为≤50pM。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段对mVEGF165未表现出可检测的结合亲合力或表现出弱的结合亲合力。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段对mVEGF165所表现出的KD为≥约100nM。在某些实施方式中，抗体和抗原结合片段对hVEGF165所表现出的结合亲合力比该抗体和抗原结合片段对mVEGF165的结合亲合力大至少10倍(例如，大20倍、30倍或40倍)。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段对hVEGF165的结合亲合力比该抗体或抗原结合片段对mVEGF165的结合亲合力大至少50倍(例如，大60倍、70倍、80倍或90倍)，而在某些实施方式中大至少100倍(例如，大110倍、120倍、150倍、175倍、200倍、250倍、300倍、400倍或500倍)。
根据它们对hVEGF165和hVEGF121的高结合亲合力以及它们阻断VEGF与VEGF-R1和VEGF-R2结合及VEGF诱导的受体磷酸化的能力，本文所提供的抗体和抗原结合片段可以用于抑制VEGF信号转导。在此基础上，该抗体和抗原结合片段可以用于治疗与VEGF表达和/或信号转导有关的各种病症。
已发现本文所提供的抗体和抗原结合片段抑制HUVEC增殖并抑制血管生成。因此，该抗体和抗原结合片段可以用于治疗与血管生成增加有关的各种病症。例如，该抗体和抗原结合片段可以通过抑制肿瘤位点的血管增殖并因此抑制肿瘤生长而用于治疗癌症。同样地，该抗体和抗原结合片段可以通过破坏肿瘤位点的血管从而导致肿瘤坏死而用于治疗癌症。已在体内确认了本文所公开的抗体和抗原结合片段治疗癌症的效力。
在某些实施方式中，本文所提供的抗体和抗原结合片段抑制血管生成和/或肿瘤生长的水平与贝伐单抗类似或比贝伐单抗高。在体内A673横纹肌肉瘤肿瘤生长抑制实验中，在所有测试的剂量，XPA.10.064和XPA.10.072抑制肿瘤生长的程度与贝伐单抗类似或比贝伐单抗高。亲合力成熟抗体XPA.10.064.06对肿瘤生长的抑制比贝伐单抗更有效。作为肿瘤生长抑制百分率的函数，XPA.10.064.06在减少肿瘤生长方面的有效性比贝伐单抗高约五倍。同样地，当以相同剂量给予抗体时，XPA.10.064.06延缓肿瘤生长至特定尺寸的持续时间明显长于贝伐单抗。因此，在某些实施方式中，当以相同或相似剂量给予时，本文公开的抗体和抗原结合片段对通过肿瘤生长抑制百分率或肿瘤生长延缓持续时间所测量的肿瘤生长抑制的有效性至少是贝伐单抗的两倍。在这些实施方式的某些中，本文公开的抗体和抗原结合片段抑制肿瘤生长的有效性至少是贝伐单抗的三倍，而在其他实施方式中至少是贝伐单抗的四倍，而在其他实施方式中至少是贝伐单抗的五倍，而在其他实施方式中至少是贝伐单抗的五倍以上。同样地，在某些实施方式中，当以低于贝伐单抗的剂量给予时，本文公开的抗体和抗原结合片段对肿瘤生长的抑制程度大致等于或大于贝伐单抗的抑制程度。在这些实施方式的某些中，当以贝伐单抗剂量的一半给予时，而在其他实施方式中以贝伐单抗剂量的三分之一给予，而在其他实施方式中以贝伐单抗剂量的四分之一给予，而在其他实施方式中以贝伐单抗剂量的五分之一给予，本文公开的抗体和抗原结合片段对肿瘤生长的抑制程度大致等于或大于贝伐单抗的抑制程度。与贝伐单抗相比，本文所提供的抗体和抗原结合片段可以表现出类似或改善的药物动力学(PK)性能。例如，与贝伐单抗相比，该抗体或抗原结合片段可以表现出提高的循环半衰期或降低的免疫原性。在某些实施方式中，其中相对于贝伐单抗，该抗体或抗原结合片段表现出类似或改善的药物动力学性质，该抗体或抗原结合片段可以以比贝伐单抗更长的时间间隔给予而不表现出与贝伐单抗给予间隔增长有关的负面影响。
本文所公开的抗体和抗原结合片段可以用于治疗与至少部分受VEGF信号转导控制的异常血管生成有关的任何病症。这些病症，通常与VEGF表达水平升高有关，包括与血管生成增加有关的眼病，如湿性AMD或增殖性视网膜病如糖尿病性视网膜病、糖尿病性肾病以及其他糖尿病血管增殖性疾病、囊性纤维化和各种肿瘤类型(Amoroso 1997；McColley 2000；Khamaisi 2003)。
可以使用本文公开的抗体或抗原结合片段治疗的癌性病症和肿瘤类型包括，但不限于，恶性肿瘤、胚细胞瘤、肉瘤、生殖细胞肿瘤或血液或淋巴恶性肿瘤，如白血病、淋巴瘤或多发性骨髓瘤。更具体地，可以使用本文公开的抗体治疗的癌性病症和肿瘤类型包括，但不限于，鳞状细胞癌、肺癌(例如，小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌或肺鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝癌(例如、肝细胞癌/肝瘤)、胃癌(例如，胃肠癌)、胰癌、脑肿瘤(例如，成胶质细胞瘤/多形性成胶质细胞瘤(GBM)、非成胶质细胞瘤脑肿瘤或脑膜瘤)、神经胶质瘤(例如，室管膜瘤、星形细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤、少突神经胶质瘤、或如少突星形细胞瘤的混合性胶质细胞瘤)、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(例如，肝胚细胞瘤、肝细胞癌/肝细胞瘤或肝部癌)、膀胱癌(例如，尿道癌)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(例如，肾脏杆状肿瘤)、前列腺癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌(例如，肛门鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头部和颈部癌(例如，鼻咽癌)、皮肤癌(例如，黑素瘤或鳞状细胞癌)、骨肉瘤、尤因肉瘤(Ewing’ssarcoma)、软骨肉瘤、软组织肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、皮肤多发性出血性肉瘤)、类癌性癌、眼癌(例如，成视网膜细胞瘤)、间皮瘤(mesothelioma)、淋巴细胞/成淋巴细胞白血病(例如，T细胞谱系和B细胞前体谱系的急性淋巴细胞/成淋巴细胞白血病(ALL)、慢性成淋巴细胞/淋巴细胞白血病(CLL)、急性骨髓性/成髓细胞白血病(AML)，其包括肥大细胞白血病、慢性骨髓性/骨髓细胞/成髓细胞白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金氏病(Hodgkin’s disease)、非霍奇金氏淋巴瘤、慢性单核细胞白血病(CMML)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫型大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt’s lymphoma，BL)、蕈状真菌病、赛谢综合征(Sezary syndrome)、皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞赘生物、成神经管细胞瘤、肾胚细胞瘤、孤立性浆细胞瘤(solitary plasmacytoma)、脊髓发育不良综合征、慢性和非慢性骨髓增生性疾病、中枢神经系统肿瘤、垂体腺瘤、前庭许旺氏细胞瘤(vestibular schwannoma)、原发性神经外胚层肿瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、脾大性红细胞增多、血小板增多、自发骨髓纤维化和小儿癌症，如小儿肉瘤(例如，成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤和骨肉瘤)。另外，肿瘤可以是恶性的(例如，癌)或良性的(例如，增生、囊肿、拟孢囊、错构瘤(hamartoma)和良性赘生物)。
可以使用本文公开的抗体或抗原结合片段治疗的肿瘤类型还包括与特定生物标记有关的癌。例如，生物标记包括，但不限于，希林二氏(von Hippel-Lindau，VHL)肿瘤抑制基因中的突变和/或缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的过表达。在某些实施方式中，这些抗体可用于治疗显示为VHL肿瘤抑制基因突变的癌。VHL基因中的突变导致缺氧诱导转录因子1α和2α的组成稳定化，该转录因子1α和2α与VEGF基因中的增强子元件结合并刺激血管生成(Harris2000)。可以使用本文所公开的抗体治疗的VHL突变肿瘤类型包括，例如，中枢神经系统成血管细胞瘤、视网膜成血管细胞瘤、内淋巴囊肿瘤(endolymphatic sac tumor)、肾透明细胞癌和/或肾囊肿、嗜铬细胞瘤、胰腺囊肿、神经内分泌肿瘤和附睾以及阔韧带囊腺瘤。通过已知方法，如使用突变特异的巢式反转录聚合酶链反应或巢式单链构象多态性分析的分子检测(Ashida 2003)，首先对受试者进行VHL基因突变存在性的选择或筛选。然后对所鉴别的受试者用本文公开的抗体或抗原结合片段进行治疗。在其他实施方式中，这些抗体可用于治疗受试者中显示HIF-1α过表达的癌症。可以通过组织活检(例如，脑、胸、子宫颈、食道、口咽、卵巢和前列腺组织)检查HIF-1α的过表达。选择所鉴别的受试者并用这些抗体或抗原结合片段进行治疗，或用这些抗体或抗原结合片段联合HIF-1α抑制剂进行治疗，该抑制剂如：2-甲氧雌甾二醇、4-O-methylsarcemeol、三白脂素A(manassantin A)、三白脂素B 1、NSC-134754、NSC-643735、拓扑替康(topotecan)、SCH66336、PX-478、R115777、西妥昔单抗(Cetuximab)、103D5R和NSAID(Kimbro 2006)。本文提供了选择使用本文公开的抗体或抗原结合片段治疗的受试者的方法，如果观察到受试者具有一种或多种如上所讨论的生物标记(例如，VHL基因突变)，和任选地，用该抗体或抗体结合片段治疗该受试者的方法。
可以使用本文的抗体和抗原结合片段治疗的其他疾病包括炎性病症如类风湿性关节炎、牛皮癣、硬皮病、慢性阻塞性肺病和哮喘。在某些实施方式中，本文所提供的抗体或抗原结合片段可以用于治疗已对贝伐单抗的治疗有抗药性的疾病。
可以在各种非治疗性用途中使用本文所提供的抗体和抗原结合片段。在某些实施方式中，该抗体或抗原结合片段可以用作亲合性纯化试剂用于纯化hVEGF165、其他VEGF亚型或其片段。在这些实施方式中，可以使用本领域已知的方法将该抗体或抗原结合片段固定至固相，如树脂或滤纸上。抗体或抗原结合片段还可以用于使hVEGF165、其他VEGF亚型或其片段从溶液中沉淀出来。在其他非治疗性实施方式中，抗体或抗原结合片段可以在各种体外或体内诊断或检测应用中使用。在这些实施方式的某些中，抗体或抗原结合片段可以与可检测标记物轭合。在其他实施方式中，抗体或抗原结合片段可以不与可检测标记物轭合，但是可以使用与该抗体结合的标记第二抗体进行检测。在某些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以用于检测hVEGF165的表达。在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段可以用于诊断与hVEGF165表达升高有关的病症。例如，该抗体或抗原结合片段可以与来自受试者的生物样本接触以诊断与受试者中hVEGF165表达升高有关的病症。同样地，可以直接向受试者给予该抗体或抗原结合片段，并用本领域已知的方法检测与hVEGF165的结合。
突变表位结合研究表明，本文公开的抗体和抗原结合片段可以结合VEGF上的线性表位，这些线性表位可以与贝伐单抗所识别的表位至少部分重叠。因此，在某些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以结合至由hVEGF165的残基79-94(SEQ ID NO：1)组成或包含这些残基的表位。同样地，抗体或抗原结合片段可以结合完全或部分与对应于SEQ ID NO：1的残基79-94的序列重叠的表位。在某些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段竞争性地抑制贝伐单抗与hVEGF165的结合。
本文提供的抗体或抗原结合片段可以在人类中具有与贝伐单抗相似或比贝伐单抗高的终末半衰期(t1/2)，其中贝伐单抗的终末半衰期为17-21天(Ferrara 2004)。例如，在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段可以具有的终末半衰期为约21天、28天、35天或60天。终末半衰期，其是指所给予抗体的血浆浓度降低一半所需的时间，可以使用本领域已知的方法计算。在某些实施方式中，本文所公开的抗体或抗原结合片段的终末半衰期可以为至少17天。在某些其他实施方式中，它可以为17-21天，而在这些实施方式的某些中，它可以大于21天。
本文公开的抗原结合片段可以包含抗体的一个或多个片段，例如Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv或scFv片段。可以使用本领域公知的方法从抗体中产生这些片段，例如用酶进行蛋白水解裂解以产生Fab片段(使用木瓜蛋白酶)或F(ab’)2片段(使用胃蛋白酶)。在某些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以包含来自接枝到一个或多个人框架区的SEQ ID NO：2-5或20-24的一个或多个CDR。
本文公开的抗体或抗原结合片段可以单独给予或联合一种或多种其他治疗剂给予。例如，可以联合化学疗法、放射疗法、用于治疗癌症的外科手术(例如，肿瘤切除术)，用于由化学疗法引起的并发症的一种或多种止吐药或其他治疗方法，或用于在治疗癌症或由升高的VEGF表达和/或信号转导所介导的任何医学疾病中使用的任何其他治疗剂，给予本文公开的抗体或抗原结合片段用于治疗癌症。在这些实施方式的某些中，联合一种或多种其他治疗剂给予的本文所公开的抗体或抗原结合片段可以与该一种或多种其他治疗剂同时给予，在这些实施方式的某些中，该抗体或抗原结合片段以及其他治疗剂可以作为相同药物组合物的部分给予。然而，“联合”另一种治疗剂给予的抗体或抗原结合片段不必须与该试剂或在相同组合物中同时给予。如本文所用的短语，认为在另一种试剂之前或之后给予抗体或抗原结合片段为“联合”该试剂给予，即使该抗体或抗原结合片段与第二试剂是通过不同途径给予的。如果可能，按照该其他治疗剂的产品信息单上所列的时间表或按照“医师桌上手册2003(Physicians’Desk Reference 2003，Physicians’DeskReference，57th Ed；Medical Economics Company；ISBN：1563634457；57th edition(November 2002))”或本领域中公知的方案联合本文公开的抗体或抗原结合片段给予的该其他治疗剂。
本领域的技术人员将认识到，可以将多种轭合物连接到本文提供的抗体或抗原结合片段上(参见，例如“Conjugate Vaccines”，Contributions to Microbiology and Immunology，J.M.Cruse and R.E.Lewis，Jr.(eds)，Carger Press，New York，(1989))。这些轭合物可以通过共价结合、亲合结合、插入、配位结合、络合、缔合、混合或加入以及其它方法连接到该抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，本文公开的抗体和抗原结合片段可以改造成包含表位结合部分之外的特异位点，其可以用于与一个或多个轭合物结合。例如，这样的位点可以包含一个或多个反应性氨基酸残基，例如半胱氨酸或组氨酸残基，以有利于共价连接至轭合物。在某些实施方式中，抗体可以间接地或通过另一轭合物连接至轭合物。例如，抗体或抗原结合片段可以轭合至生物素，然后间接地轭合至与抗生物素蛋白轭合的第二轭合物。
在某些实施方式中，连接至本文公开的抗体或抗原结合片段上的轭合物可以包含旨在改变该抗体或抗原结合片段的一种或多种药物动力学(PK)性能的一种或多种试剂，例如聚乙二醇(PEG)，以增大该抗体或抗原结合片段的半衰期或降低其免疫原性(见，例如，Katre 1990)。
在某些实施方式中，连接到本文公开的抗体或抗原结合片段的轭合物可以包含一种或多种可检测标记物。这样的标记物包括，但不限于，放射性同位素，如123I、124I、125I、131I、35S、3H、111In、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、90Y、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32p；其他镧系元素；发光标记物；荧光标记物，例如荧光素、罗丹明、丹磺酰(dansyl)、藻红蛋白或得克萨斯红(Texas Red)；和酶-底物标记物，例如辣根过氧化酶、碱性磷酸酶或β-D-半乳糖苷酶。
在某些实施方式中，提供了包含与一种或多种细胞因子连接或联合的本文所公开的抗体或抗原结合片段的组合物，该细胞因子包括作为细胞间介体在细胞上起作用的蛋白质。细胞因子的实例包括，但不限于，淋巴因子、单核因子、人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、松弛素、松弛素原(prorelaxin)、促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)、促黄体生成激素(LH)、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、促乳泌素、胎盘催乳质、肿瘤坏死因子α和β、苗勒抑制物质(mullerian-inhibiting substance)、小鼠促性腺激素关联肽、抑制素、活化素、整合素、促血小板生成素(TPO)、神经生长因子如NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子I和II、促红细胞生成素(EPO)、成骨因子、干扰素如干扰素-α、-β和-γ、集落刺激因子如巨噬细胞-CSF、粒性白细胞巨噬细胞CSF和粒性白细胞-CSF、白细胞介素如IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11和IL-12、肿瘤坏死因子如TNF-α和TNF-β以及其他多肽因子。可以联合任何细胞因子，包括任何以上列出的那些细胞因子，提供和/或给予本文公开的抗体或抗原结合片段。
在某些实施方式中，提供了包含连接或联合一种或多种化疗剂的本文所公开的一种或多种抗体或抗原结合片段的组合物。化疗剂的实例包括，但不限于，ALT-110、AMN-107(尼罗替尼(Nilotinib))、氨柔比星(amrubicin)、ARQ-197、阿曲生坦(atrasentan)AV-299、AZD 1152、AZD 2171、巴他布林(batabulin)、BIO-111、BIO-140、骨化三醇(calcitriol)、CC 8490、西仑吉肽(cilengitide)、达沙替尼(dasatinib)、迪卡他尼(decatanib)、DN-101、艾特咔林(edotecarin)、因扎托雷(enzastaurin)、厄洛替尼(erlotinib)、依维莫司(everolimus)、吉马替康(gimatecan)、棉酚(gossypol)(例如，醋酸棉酚)、GSK461364、GSK690693、IL13-PE38QQR、INO1001、IPdR、普利木单抗、KRX-0402、Lep-etu、罗那法尼(lonafamib)、硫蒽酮(lucanthone)、LY 317615、MK-0457、MLN8054、neuradiab、诺拉曲特(nolatrexed)、奥利默森(oblimersen)、奥法木单抗(ofatumumab)、ON 0910.Na、奥戈伏单抗(oregovomab)、帕木单抗(panitumumab)、帕唑帕尼(pazopanib)、PHA-739358、R-763、RTA 744、卢比替康(rubitecan)、Sdx 102、他仑帕奈(talampanel)、替西罗莫司(temsirolimus)、替米利芬(tesmilifene)、粉防己碱(tetrandrine)、CTLA-4单抗(ticilimumab)、TKI-258、TLK 286、曲贝替定(trabectedin)、凡德他尼(vandetanib)、维特斯朋(vitespan)、Xr 311、扎木单抗(zanolimumab)、131-I-TM-601和唑仑二膦酸盐(zolendronate)、组氨瑞林、阿扎胞苷、右雷佐生(dexrazoxane)、阿仑珠单抗、来拉度胺(lanalidomide)、吉妥珠单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、六甲三聚氰胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、棕榈仁油酸盐(editronate)、环胞霉素、埃德温-门冬酰胺酶(Edwina-asparaginase)和锶89。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合romidepsin(一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂)(FK-228)，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合ADS-100380，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合CG-781，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合CG-1521，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合SB-556629，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合厚膜素(chlamydocin)，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合JNJ-16241199，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合以下化合物：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合伏立诺他(vorinostat)(SAHA)，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合依托泊苷(VP-16)，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合吉西他滨，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合美国专利No.2004/0209878A1中公开的化合物，其中该化合物具有以下核心结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至多柔比星()或与其联合使用，包括Caelyx或(多柔比星盐酸脂质体注射液；Ortho Biotech Products L.P.，Raritan，NJ)。包含脂质体载体携带的多柔比星，该脂质体载体由N-(羰基-甲氧基聚乙二醇2000)-1，2-二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺钠盐(MPEG-DSPE)、完全氢化的大豆磷脂酰胆碱(HSPC)和胆固醇组成。多柔比星具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合5’-脱氧-5-氟尿嘧啶，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合长春新碱，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合替莫唑胺(methazolastone)，其具有如下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合CDK抑制剂，如ZK-304709或Seliciclib(R-细胞周期蛋白依赖激酶(R-roscovitine)、CYC-202)。seliciclib具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合MEK抑制剂，如PD0325901或AZD-6244(ARRY-142886)。PD0325901具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合卡培他滨(5’-脱氧-5-氟-N-[(戊氧基)羰基]-胞啶)或培美曲塞(L-谷氨酸，N-[4-[2-(2-氨基-4，7-二氢-4-氧代-1H-吡咯并[2，3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲酰基]-二钠盐七水合物)，其具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合喜树碱(camptothecin)(Beisler 1971；Stork 1971)。喜树碱具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合伊立替康(irinotecan)(作为出售；Pharmacia&Upjohn Co.；Kalamazoo，MI)；伊立替康、5-氟尿嘧啶和亚叶酸的组合；或PEG-标记的伊立替康。伊立替康具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段联合FOLFOX方案，该方案由奥沙利铂和灌注氟尿嘧啶以及亚叶酸组成(chaouche 2000；de Gramont 2000)。奥沙利铂具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合抗雌激素，如他莫昔芬(tamoxifen)(作为出售；AstraZeneca Pharmaceuticals LP；Wilmington DE)或托瑞米芬柠檬酸盐(toremifene citrate)(作为出售；Shire US，Inc，；Florence，KY)。他莫昔芬具有以下结构：

托瑞米芬柠檬酸盐具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合芳香酶抑制剂，如阿那曲唑(作为出售；AstraZenecaPharmaceuticals LP；Wilmington DE)、依西美坦(exemestane)(作为出售；Pharmacia Corporation；Kalamazoo，MI)或来曲唑(作为出售；Novartis Pharmaceuticals Corporation；EastHanover，NJ)。阿那曲唑具有以下结构：

依西美坦具有以下结构：

来曲唑具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合雌激素，如己烯雌酚(diethylstibestro1)(DES)、雌二醇(作为出售；Warner Chilcott，Inc.；Rockaway，NJ)或轭合雌激素(作为出售；Wyeth Pharmaceuticals Inc.，Philadelphia，PA)。己烯雌酚具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合抗血管增生剂，如贝伐单抗、VEGFR-2抗体IMC-1C11、其他的VEGF-R抑制剂，如CHIR-258、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK/ZK；CGP-79787；ZK-222584)、AG-013736、3-[5-(甲磺酰基哌啶甲基)-吲哚基]-喹诺酮或VEGF捕获(AVE-0005)，它是包含VEGF受体1和2部分的可溶性诱骗受体。CHIR-258具有以下结构：

瓦他拉尼具有以下结构：

AG-013736具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合具有下列专利中所示核心结构的抗血管增生剂，WO2004/13145：

WO2004/09542：

WO00/71129：

WO2004/09601：

WO2004/0105：

WO01/29025：

WO02/32861：

WO03/88900：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合黄体生成素释放激素(LHRH)或促性腺激素释放激素(GnRH)激动剂，如醋酸瑞林(goserelin acetate)(作为出售；AstraZeneca UK Limited；Macclesfield，England)、亮脯利特醋酸盐(leuprolide acetate)(作为出售；Sanofi-Synthelabo Inc.；New York，NY)或曲普瑞林双羟萘酸盐(triptorelin pamoate)(作为出售；Pharmacia Company，Kalamazoo MI)。
醋酸性瑞林是[D-Ser(But)6，Azgly10]LHRH的醋酸盐，化学名为pyro-Glu-His-Trp-Ser-TYr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-Azgly-NH2醋酸盐[C59H84N18O14C2H4O2)x，其中x＝1至2.4])。醋酸性瑞林的结构为：

亮脯利特醋酸盐为LHRH的合成九肽，化学名称为5-氧-L-脯氨酰-L-组氨酰-L-色氨酰-L-丝氨酰-L-酪氨酰-D-亮氨酰-L-亮氨酰-L-精氨酰-N-乙基-L-脯氨酰氨醋酸(盐)。亮脯利特醋酸盐的结构为：

曲普瑞林双羟萘酸盐具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合舒尼替尼(sunitinib)或舒尼替尼苹果酸盐。舒尼替尼具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合孕激素剂(progestational agent)，如醋酸甲羟孕酮(作为出售；Pharmacia&Upjohn Co.；Kalamazoo，MI)、己酸羟孕酮(17-((1-氧代己基)氧)孕甾-4-烯-3，20-二酮))、甲地孕酮或孕酮。醋酸甲羟孕酮具有以下结构：

己酸羟孕酮具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合选择性雌激素受体调节剂(SERM)，如雷洛昔芬(作为出售；Eli Lilly and Company；Indianapolis，IN)，其具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合抗雄激素，如比卡鲁胺(bicalutamide)(作为出售；AstraZeneca Pharmaceuticals LP；Wilmington DE)、氟他胺(flutamide)(2-甲基-N-[-4-硝基-3-(三氟甲基)苯基]丙酰胺；作为出售；Schering Corporation；Kenilworth，NJ)、尼鲁米特(nilutamide)(作为出售；Aventis Pharmaceuticals Inc.；Kansas City，MO)或醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(作为出售；Bristol-Myers Squibb)。比卡鲁胺具有以下结构：

氟他胺具有以下结构：

尼鲁米特具有以下结构：

醋酸甲地孕酮具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合拮抗EGF受体或HER2的作用的一种或多种抑制剂，如CP-724714、TAK-165(莫立替尼(mubritinib))、HKI-272、OSI-774(厄洛替尼(erlotinib)；Hidalgo 2001)、拉帕替尼(1apatinib)(GW2016；Rusnak 2001；N-{3-氯-4-[(3-氟代苄基)氧]苯基}-6-[5-({[2-(甲磺酰基)乙基]氨基}甲基)-2-呋喃基]-4-喹唑啉胺；PCT专利申请WO99/35146)、卡纽替尼(canertinib)(CI-1033；Erlichman 2001；Smaill 2000)、EKB-569(Wissner 2003)、PKI-166(CGP-75166)、ABX-EGF抗体(Abgenix，Inc.，Freemont，CA；Yang1999；Yang 2001)、爱必妥(erbitux)(IMC-C225、西妥昔单抗；美国专利申请No.6217866；Imclone，New York，NY)、GW-572016或任何抗EGFR或抗-HER2抗体。
CP-724714具有以下结构：

TAK-165(莫立替尼)具有以下结构：

HKI-272具有以下结构：

OSI-774(厄洛替尼)具有以下结构：

拉帕替尼具有以下结构：

卡纽替尼具有以下结构：

EKB-569具有以下结构：

PKI-166具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合罗那法尼(lonafarnib)(作为出售；Schering-Plough，Kenilworth，NJ)，其结构如下：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合FPT抑制剂，其具有以下结构：

或

在其他实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合FPT抑制剂，如BMS-214662(Hunt 2000；Dancey 2002；(R)-7-氰-2，3，4，5-四氢-1-(1H-咪唑-4-基甲基)-3-(苯基甲基)-4-(2-噻吩酰基)-1H-1，4-苯二氮杂)或R155777(替吡法尼(tipifamib)；Garner2002；Dancey 2002；(B)-6-[氨基(4-氯苯基)(1-甲基-1H-咪唑-5-基)-甲基]-4-(3-氯苯基)-1-甲基-2(1H)-喹啉酮]；作为出售；Johnson&Johnson，New Brunswick，NJ)。BMS-214662具有以下结构：

R155777具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合下列化合物，包括：氨磷汀(amfostine)、NVP-LAQ824(Atadja2004)、辛二酰苯胺异羟肟酸(suberoyl analide hydroxamic acid)、丙戊酸(Michaelis 2004)、曲古菌素A(trichostatin A)、FK-228(Furumai 2002)、SU11248(Mendel 2003)、BAY43-9006(索拉非尼(sorafenib))，KRN951、氨鲁米特(aminoglutethimide)、安吖啶(amsacrine)、阿那格雷(anagrelide)、阿那曲唑(anastrozole)(作为出售；AstraZeneca Pharmaceuticals LP，Wilmington，DE)、门冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗(Garrido 1997)、博来霉素、布舍瑞林(buserelin)、白消安(1，4-丁二醇二甲磺酸盐；作为出售；ESP Pharma，Inc.，Edison，New Jersey)、沙铂、卡铂(作为出售；Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ)、卡莫司汀、苯丁酸氮芥、顺铂、克拉屈滨(cladribine)、氯屈膦酸(clodronate)、环磷酰胺、环丙孕酮、阿糖胞苷、达卡巴嗪(dacarbazine)、放线菌素D、柔红霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟达拉滨、氟氢可的松、氟甲睾酮、氟他胺、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、伊马替尼(imatinib)(作为出售；NovartisPharmaceuticals Corporation，East Hanover，NJ)、亚叶酸、亮脯利特(leuprolide)、左旋咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法仑(作为出售；Celgene Corporation，Warren，NJ)、巯嘌呤、美司钠、甲氨蝶呤、丝裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼鲁米特、奥曲肽(octreotide)(Katz 1989；作为SandostatinDepot出售；Novartis Pharm.Corp.，E.Hanover，NJ)、依度曲肽(edotreotide)(yttrium-90标记的或未标记的)、奥沙利铂(作为出售；Sanofi-Synthelabo Inc.，New York，NY)、帕米膦酸(pamidronate)(作为出售；Novartis Pharmaceuticals Corp.，East Hanover，NJ)、喷司他丁(pentostatin)(作为出售；Supergen，Dublin，CA)、普卡霉素、卟吩姆(porfimer)(作为出售；Axcan ScandipharmInc.，Birmingham，AL)、丙卡巴肼(procarbazine)、雷替曲塞(raltitrexed)、利妥昔单抗(作为出售；Genentech，Inc.；South San Francisco，CA)、链佐星(streptozocin))、替尼泊苷、睾酮、沙利度胺、沙利度胺联合地塞米松、硫鸟嘌呤、塞替派、维A酸、长春地辛、全反式视黄酸或13-顺式-视黄酸。氨磷汀具有以下结构：

NVP-LAQ824具有以下结构：

辛二酰苯胺异羟肟酸具有以下结构：

丙戊酸具有以下结构：

曲古菌素A具有以下结构：

FK-228具有以下结构：

SU11248具有以下结构：

BAY43-9006具有以下结构：

KRN951具有以下结构：

氨鲁米特具有以下结构：

安吖啶具有以下结构：

阿那格雷具有以下结构：

阿那曲唑具有以下结构：

博来霉素具有以下结构：

布舍瑞林具有以下结构：

白消安具有以下结构：

卡铂具有以下结构：

卡莫司汀具有以下结构：

苯丁酸氮芥具有以下结构：

顺铂具有以下结构：

克拉屈滨具有以下结构：

氯屈膦酸具有以下结构：

环磷酰胺具有以下结构：

环丙孕酮具有以下结构：

阿糖胞苷具有以下结构：

达卡巴嗪具有以下结构：

放线菌素D具有以下结构：

柔红霉素具有以下结构：

己烯雌酚具有以下结构：

表柔比星具有以下结构：

氟达拉滨具有以下结构：

氟氢可的松具有以下结构：

氟甲睾酮具有以下结构：

氟他胺具有以下结构：

羟基脲具有以下结构：

伊达比星具有以下结构：

异环磷酰胺具有以下结构：

伊马替尼具有以下结构：

亚叶酸具有以下结构：

亮脯利特具有以下结构：

左旋咪唑具有以下结构：

洛莫司汀具有以下结构：

氮芥具有以下结构：

美法仑具有以下结构：

巯嘌呤具有以下结构：

美司钠具有以下结构：

甲氨蝶呤具有以下结构：

丝裂霉素具有以下结构：

米托坦具有以下结构：

米托蒽醌具有以下结构：

尼鲁米特具有以下结构：

奥曲肽(oactreotide)具有以下结构：

奥沙利铂具有以下结构：

帕米膦酸具有以下结构：

喷司他丁具有以下结构：

普卡霉素具有以下结构：

卟吩姆具有以下结构：

丙卡巴肼具有以下结构：

雷替曲塞具有以下结构：

链佐星具有以下结构：

替尼泊苷具有以下结构：

睾酮具有以下结构：

沙利度胺具有以下结构：

硫鸟嘌呤具有以下结构：

塞替派具有以下结构：

维A酸具有以下结构：

长春地辛具有以下结构：

13-顺式-视黄酸具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至abraxane(一种注射用紫杉醇)或与其联合使用。abraxane是包含紫杉醇的白蛋白结合形式的紫杉醇蛋白质结合颗粒的可注射悬液，其平均粒度为约130纳米。供应的abraxane为白色至黄色的无菌冻干粉末，静脉内注射前用20mL的0.9％氯化钠注射液(美国药典)重新溶解。每个单次使用小瓶包含100mg的紫杉醇和约900mg人白蛋白。每毫升(mL)重新溶解的悬液中含有5mg紫杉醇。abraxane不含溶剂和克列莫佛(cremophor)(聚氧乙烯蓖麻油)。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合以下化合物的一种或多种，包括：苯基丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌氮芥、六甲蜜胺、氮尿苷、5-脱氧尿苷、阿糖胞苷、6-巯基嘌呤、脱氧柯福霉素、骨化三醇、戊柔比星、普卡霉素、长春碱、长春瑞滨、拓扑替康、雷佐生、马立马司他(marimastat)、COL-3、新伐司他、BMS-275291、角鲨胺、内皮他丁(endostatin)、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、血管他丁、维塔辛(vitaxin)、屈洛昔芬、idoxyfene、螺内酯、非那雄胺(finasteride)、甲腈咪胍、曲妥珠单抗、地尼白介素-2、ddftitox、吉非替尼、硼替佐米、紫杉醇、多西他赛、埃博霉素B、BMS-247550(Lee 2001)、BMS-310705、屈洛昔芬(3-羟基他莫昔芬)、4-羟基他莫昔芬、哌喷昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟维司群、阿考比芬、拉索昔芬(CP-336156)、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、拓扑替康、PTK787/ZK 222584(Thomas 2003)、VX-745(Haddad 2001)、PD 184352(Sebolt-Leopold 1999)、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646(Vlahos 1994)、渥曼青霉素(Wortmannin)、BAY-43-9006(Wilhelm 2002)、ZM336372、L-779450、Raf抑制剂(LoWinger 2002)、夫拉平度(flaopiridol)(L86-8275/HMR 1275；Senderowicz 2000)、UCN-01(7-羟基星孢菌素；Senderowicz 2000)、任何mTOR抑制剂、雷帕霉素(西罗莫司)、依维莫司(雷帕霉素的40-O-(2-羟乙基)衍生物)、CCI-779(替西罗莫司；Sehgal1994；Elit 2002)、AP-23573、RAD001、ABT-578或BC-210。雷帕霉素(西罗莫司)具有以下结构：

CCI-779具有以下结构：

AP-23573具有以下结构：

RAD001具有以下结构：

ABT-578具有以下结构：

BC-210具有以下结构：

在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合以下专利所示化合物中的一种或多种，包括：美国专利No.5,656,655，其中公开了苯乙烯基取代的杂芳基EGFR抑制剂；美国专利No.5,646,153，其中公开了双、单和/或双环芳基杂芳基碳环和杂碳环EGFR和PDGFR抑制剂；美国专利No.5,679,683，其中公开了抑制EGFR的三环嘧啶化合物；美国专利No.5,616,582，其中公开了具有受体酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物；Fry1994，其中公开了具有抑制EGFR的结构的化合物(参见Fry 1994中图1)；美国专利No.5,196,446，其中公开了抑制EGFR的杂芳基乙烯二基或杂芳基乙烯二基芳基化合物；和Panek 1997，其中公开了被鉴别为PD 166285(6-(2，6-二氯苯基)-2-(4-(2-乙基氨基乙氧基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3-d)嘧啶-7-酮)的化合物，其抑制EGFR、PDGFR和FGFR受体家族。
在某些实施方式中，本文提供的抗体或抗原结合片段连接至或联合一种或多种聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素α-2a、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素α-2b、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素α-2c、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素αn-1、聚乙二醇化或非聚乙二醇化干扰素αn-3和聚乙二醇化、非聚乙二醇化复合干扰素或白蛋白-干扰素-α。
可以通过将干扰素α偶合至水溶性聚合物而制备其他干扰素α轭合物。这样的聚合物的非限制性列表包括如聚丙二醇的其他聚环氧烷均聚物、聚氧乙烯化多元醇、它们的共聚物和它们的嵌段共聚物。作为聚环氧烷基聚合物的替代，可以使用有效非抗原性物质，如葡聚糖、聚乙烯基吡咯烷酮、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、碳水化合物基聚合物等。在下列专利中描述了这样的干扰素α-聚合物轭合物，例如，美国专利No.4,766，106、美国专利No.4,917,888、EP专利申请No.0236987或0593868以及国际专利No.WO95/13090。可以通过将PEG聚合物连接至干扰素α-2b分子上的组氨酸残基而制备PEG12000-IFNα2b。
适于肠胃外给药的聚乙二醇化干扰素α的药物组合物可以用适合的缓冲液配制，例如，用于注射的无菌水中的Tris-HCl、乙酸盐或如磷酸氢二钠/磷酸二氢钠缓冲液的磷酸盐缓冲液和药用赋形剂(例如，蔗糖)、载体(例如，人血浆白蛋白)、毒性试剂(例如，NaCl)、防腐剂(例如，水杨乙汞(thimerosol)、甲酚或苯甲醇)和表面活性剂(例如，tween或多山醇酯)。可以以冻干粉末的形式在2-8℃的冷藏环境下储存聚乙二醇化干扰素α。当在2至8℃存储并在重新溶解后24小时内使用，则该重新溶解的水溶液是稳定的(见，例如，美国专利NO.4492537；5762923和5766582)。该重新溶解的水溶液也可以储存在预填充、多剂量注射器中，如用于递送如胰岛素的药物的那些注射器。典型、适合的注射器包括包含连接至笔型注射器的预填充小瓶的系统，该笔型注射器如购自Novo Nordisk的Novo Pen或购自Schering Corporation，Kenilworth，NJ的其他注射器系统包括包含玻璃药筒的笔型注射器，其中该药筒中含有稀释剂以及位于独立隔间内的冻干聚乙二醇化干扰素α粉末。
包含止吐药的组合物可用于防止或治疗恶心；一种化学疗法常见的副作用。因此，在某些实施方式中，提供了组合物，其包含与一种或多种抗癌化疗剂和一种或多种止吐药连接或联合的本文提供的抗体或抗原结合片段，该止吐药包括，但不限于，卡索匹坦(casopitant)(GlaxoSmithKline)、奈妥匹坦(Netupitant)(MGI-Helsinn)及其他NK-1受体拮抗剂、帕洛诺司琼(palonosetron)(作为Aloxi出售；MGI Pharma)、阿瑞匹坦(aprepitant)(作为Emend出售；Merck and Co.；Rahway，NJ)、苯海拉明(diphenhydramine)(作为出售；Pfizer；New York，NY)、羟嗪(hydroxyzine)(作为出售；Pfizer；New York，NY)、甲氧氯普胺(metoclopramide)(作为出售；AH Robins Co，；Richmond，VA)、劳拉西泮(lorazepam)(作为出售；Wyeth；Madison，NJ)、阿普唑仑(alprazolam)(作为出售；Pfizer；NewYork，NY)、氟哌啶醇(haloperidol)(作为出售；Ortho-McNeil；Raritan，NJ)、氟哌利多(droperidol)()、屈大麻酚(dronabinol)(作为出售；Solvay Pharmaceuticals，Inc.；Marietta，GA)、地塞米松(作为出售；Merck and Co.；Rahway，NJ)、泼尼松龙、甲泼尼龙(作为出售；Pfizer；NewYork，NY)、丙氯拉嗪(作为出售；Glaxosmithkline；Research Triangle Park，NC)、格拉司琼(granisetron)(作为出售；Hoffmann-La Roche Inc.；Nutley，NJ)、昂丹司琼(ondansetron)(作为出售；Glaxosmithkline；Research Triangle Park，NC)、多拉司琼(dolasetron)(作为出售；Sanofi-Aventis；NewYork，NY)、托烷司琼(tropisetron)(作为出售；Novartis；East Hanover，NJ)。本文还提供了通过向有需要的受试者(例如，哺乳动物受试者，如人类、灵长类、犬、大鼠、兔或小鼠)给予这样的组合物治疗癌症的方法。
癌症治疗的其他副作用包括红细胞和白细胞缺乏。因此，提供了组合物，其包含与治疗红细胞和/或白细胞缺乏的药剂连接或联合的本文提供的抗体或抗原结合片段，该治疗红细胞和/或白细胞缺乏的药剂如：聚乙二醇化非格司亭、促红细胞生成素、依伯汀α或达贝泊汀α。
在某些实施方式中，提供了组合物，其包含与一种或多种抗高血压剂连接或联合的抗体或其抗原结合片段，该抗高血压剂如：利尿剂、肾上腺素能受体拮抗剂、肾上腺素能受体激动剂、钙离子通道阻断剂、ACE抑制剂、血管紧张素II受体拮抗剂、醛甾酮拮抗剂、血管扩张剂或中枢作用肾上腺素能药物。
在某些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以作为包含一种或多种生理学耐受组分的药物组合物的一部分进行给药。因此，在某些实施方式中，本文提供了这样的组合物以及配制这样的组合物的方法。包含本文公开的一种或多种抗体或抗原结合片段以及一种或多种生理学耐受组分的组合物可以用于治疗与高VEGF表达水平和/或信号转导、和/或血管生成增加有关的疾病。
在本文公开的药物组合物中使用的生理学耐受组分可以包括，例如，药用液体、凝胶或固体载体、稀释剂、佐剂、赋形剂或无毒辅助性物质、本领域已知的其他组分或它们的各种组合。适合的组分可以包括，例如，抗氧化剂、填充剂、粘结剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、润滑剂、调味剂、增稠剂、着色剂或乳化剂。
适合的抗氧化剂可以包括，例如，蛋氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、硫代甘油、巯基乙酸、硫代山梨糖醇、丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯和/或没食子酸丙酯。如本文所公开的，在包含本文所提供的抗体或抗原结合片段的组合物中包含一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)降低了该抗体或抗原结合片段的氧化。氧化的这种降低防止或减少了结合亲合力的损失，从而改善了抗体稳定性并使贮藏期限最长。因此，在某些实施方式中提供了组合物，其包含本文公开的一种或多种抗体或抗原结合片段以及一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)。通过将该抗体或抗原结合片段与一种或多种抗氧化剂(如蛋氨酸)混合，进一步提供了防止本文提供的抗体或抗原结合片段氧化、延长其贮藏期限和/或改善其效力的方法。
适合的载体可以包括，例如水性载体，如氯化钠注射液、林格注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液或葡萄糖和乳酸化林格注射液；非水载体，如植物来源的不挥发性油、棉子油、玉米油、芝麻油或花生油；抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂；等渗试剂，如氯化钠或葡萄糖；缓冲剂，如磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂；抗氧化剂，如硫酸氢钠；局部麻醉剂，如盐酸普鲁卡因；悬浮和分散剂，如羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯基吡咯烷酮；乳化剂，如聚山梨醇酯80(TWEEN-80)；掩蔽剂或螯合剂，如EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇四乙酸)、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。可以将作为载体使用的抗微生物剂加入到置于多剂量容器内的药物组合物中，包括苯酚或甲酚、水银、苯甲醇、氯丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、苯扎氯铵和苄索氯铵。适合的赋形剂可以包括，例如，水、盐水、葡萄糖、甘油或乙醇。适合的无毒辅助性物质可以包括，例如，润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、稳定剂、助溶剂或如醋酸钠、山梨糖醇单月桂酸酯、油酸三乙醇胺或环糊精的试剂。
如本文所使用的，术语“治疗有效量”或“有效剂量”指治疗疾病或病症的有效药物剂量或浓度。例如，对于使用本文公开的抗体或抗原结合片段治疗癌症来说，治疗有效量为能够消除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长、抑制介导癌性病症的细胞生长或增殖、抑制肿瘤细胞转移、改善与肿瘤或癌性病症有关的任何症状或标记物、防止或延缓肿瘤或癌性病症发展或它们的一些组合的抗体或抗原结合片段的剂量或浓度。
可以使用本领域公知的方法确定本文提供的抗体或抗原结合片段的有效剂量。例如，可以通过在给予特定剂量后确定受试者中正在治疗的肿瘤是否缩小、停止生长或生长更加缓慢来建立有效剂量。可以使用本领域公知的方法确定肿瘤的尺寸和进程，例如，X射线、磁共振成像(MRI)、CT扫描或目视检测(例如，外科手术程序)。例如，当治疗的癌症为多形性胶质母细胞瘤时，临床医师可以通过使用CT或MRI扫描对肿瘤成像以监测治疗进展。与肿瘤生长的症状表现有关的患者访问(例如，头疼、行为或情绪变化)也是有教益的。根据临床医师的发现，可以相应地改变剂量方案。在另一实施例中，所治疗的癌症为黑素瘤，临床医师可以通过对黑素瘤病变进行目视检查来监测治疗进展。临床医师可以评价各种各样的目视参数，例如，尺寸、厚度、生长模式的改变或外观改变。根据临床医师的发现，可以相应地改变剂量方案。
一般说来，可以使用胸苷PET扫描测量肿瘤尺寸和增殖(见，例如，Wells 1996)。胸苷PET扫描通常需要注射放射性示踪剂，如[2-11C]-胸苷，然后再对受试者身体进行PET扫描(Vander Borght1991a；Vander Borght 1991b)。可用的其他示踪剂包括[18F]-FDG(18-氟脱氧葡萄糖)、[124I]IUdR(5-[124I]碘-2’-脱氧尿苷)、[76Br]BrdUrd(溴脱氧尿苷)、[18F]FLT(3’-脱氧-3’氟代胸苷)或[11C]FMAU(2’-氟-5-甲基-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)。
如本文所提供的抗体或抗原结合片段的有效剂量将取决于本领域已知的各种因素，例如，体重、年龄、既往病史、现有药物疗法、受试者的健康状况和交叉反应的可能、过敏性、敏感性和不利的副作用，以及给药途经和肿瘤发展的程度。本领域的常规技术人员(例如，内科医师或兽医)可以根据这些及其他环境或要求的指示按比例降低或增加剂量。
在某些实施方式中，如本文所提供的抗体或抗原结合片段可以以约0.01mg/kg至约100mg/kg的治疗有效剂量给予(例如，约0.01mg/kg、约0.5mg/kg、约1mg/kg、约2mg/kg、约5mg/kg、约10mg/kg、约15mg/kg、约20mg/kg、约25mg/kg、约30mg/kg、约35mg/kg、约40mg/kg、约45mg/kg、50mg/kg、约55mg/kg、约60mg/kg、约65mg/kg、约70mg/kg、约75mg/kg、约80mg/kg、约85mg/kg、约90mg/kg、约95mg/kg或约100mg/kg)。在这些实施方式的某些中，以约50mg/kg或更小的剂量给予该抗体或抗原结合片段，而在这些实施方式的某些中，该剂量为10mg/kg或更小、5mg/kg或更小、1mg/kg或更小、0.5mg/kg或更小或0.1mg/kg或更小。可以以各种时间间隔给予给定剂量，例如，每天一次，每天两次或更多次、每周两次或更多次、每周一次、每两周一次、每三周一次、每月一次或每两月或更长时间一次。在某些实施方式中，可以随治疗疗程改变给药剂量。例如，在某些实施方式中，初始给药剂量可以高于随后的给药剂量。在某些实施方式中，可以随治疗疗程根据受试者的反应改变给药剂量。
可以调整给药方案以提供最佳的所期望响应的反应(例如，治疗反应)。例如，可以给予单剂量，或可以随时间给予分成几份的剂量。
可以通过药学领域公知的方法制备包含本文公开的抗体或抗原结合片段，以及在某些实施方式中的各种化疗剂的药物组合物。见，例如，Gilman et al.，(eds.)(1990)，The Pharmacological Bases ofTherapeutics”，8th Ed.，Pergamon Press；A.Gennaro(ed.)，Remington’sPharmaceutical S ciences”，18th Edition，(1990)，Mack Publishing Co.，Easton，Pennsylvania；Avis et al.，(eds.)(1993)，Pharmaceutical DosageForms：ParenteralMedications”，Dekker，New York；Lieberman et al.，(eds.)(1990)，Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets”，Dekker，NewYork；and Lieberman et al.，(eds.)(1990)，Pharmaceutical DosageForms：Disperse Systems”，Dekker，New York。
可以通过本领域已知的任何途径给予本文公开的抗体和抗原结合片段，例如肠胃外途径(例如，皮下注射、腹膜内注射、包括静脉内输注的静脉内注射、肌内注射或皮内注射)或非肠胃外途径(例如，口服、鼻内给药、眼内给药、舌下给药、直肠给药或局部给药)。在通过注射给予该抗体或抗原结合片段的实施方式中，可以将可注射药物组合物制备成任何常规形式，例如液体溶液、悬液、乳液或适于形成液体溶液、悬液或乳液的固体形式。注射液制剂可以包括待注射的无菌溶液、使用前准备联合溶剂的无菌干燥可溶性产品(如冻干粉末，其包括皮下片剂)、待注射无菌悬液、使用前准备联合载体的无菌干燥不溶性产品和无菌乳液。这些溶液可以是水性的或非水性的。
在某些实施方式中，将单位剂量的肠胃外制剂包装在安瓿、小瓶或带针注射器中。如在本领域中已知和实践的，肠胃外给药的所有制剂应为无菌的。
在某些实施方式中，通过将如本文所公开的抗体或抗原结合片段溶解至适合的溶剂而制备无菌、冻干粉末。溶剂可以含有赋形剂，其改善了粉末或由粉末制备的重新溶解的溶液的稳定性或其他药理学要素。可以使用的赋形剂包括，但不限于，水、葡萄糖、山梨醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适合的试剂。溶剂可以含有缓冲剂，如柠檬酸盐、磷酸钠盐或钾盐或本领域技术人员已知的其他这样的缓冲剂，在一个实施方式中，缓冲液的pH为约中性。随后对该溶液过滤除菌，接着在本领域技术人员已知的标准条件下冻干从而提供了所期望的剂型。在一个实施方式中，将所得溶液分装至小瓶中冻干。各个小瓶可以含有单剂量或多剂量的抗-VEGF抗体或其抗原结合片段或它们的组合物。用少量超过所需剂量或剂量组的量(例如，约10％)对小瓶过量填注是可接受的，以便有利于准确吸取样品和准确定量配料。可以在适当的条件下储存冻干粉末，如约4℃至室温。
用注射用水重新溶解冻干粉末提供了肠胃外给药的剂型。在一个实施方式中，将冻干粉末加入至无菌水或其他液体适合载体以重新溶解。精确的量取决于所采取的选中疗法，并且可以通过经验进行确定。
在某些实施方式中，提供了用于表达本文公开的抗体或抗原结合片段的表达系统。这些表达系统包括编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸、包含这些多核苷酸的载体、以及包含这些载体的宿主细胞。可以使用本领域已知的方法分离或合成编码本文所公开的抗体或抗原结合片段的多核苷酸，并且可以将其插入至可复制载体用于扩增或克隆。可以从单个载体中表达编码所述抗体可变轻链(VL)和可变重链(VH)的多核苷酸，或可以使用两个单独的载体对它们进行表达，然后再进行体外装配。在某些实施方式中，可以使用同一细胞内的两个不同载体对它们进行共表达并胞内装配(见，例如美国专利No.4816567或5595898)。适合的载体可以包含一个或多个调控序列的各种构造，如启动子、增强子或转录起始序列，以及编码用于表型选择的标记物的基因。具有用于表达本文所公开的抗体或抗原结合片段的适合主链的载体是本领域中已知的(见，例如美国专利No.7192737)。在某些实施方式中，该载体可以包含编码人IgG2免疫球蛋白的重链(CH)和轻链(CL)的恒定区的多核苷酸序列。可替换地，载体可以仅表达该抗体的VH和VL链，其中所表达的多肽包含Fv片段而不是完整的抗体。可以将载体插入至适合的宿主细胞以扩增或表达该多核苷酸序列。可以在本领域已知的多种培养基上培养这些宿主细胞用于抗体生产，例如最低必需培养基(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、杜皮克氏改良爱哥尔氏培养基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)(DMEM)(Sigma)和哈姆氏F10培养基(Ham’s F10)(Sigma)。可以向培养基中添加各种各样的试剂，例如激素、生长因子、盐、缓冲剂、核苷酸、抗生素、微量元素、葡萄糖或其他能源。可以使用本领域熟知的参数调节培养条件，如温度和pH。表达后，可以使用本领域已知的方法纯化如本文所提供的一种或多种抗体或抗原结合片段。
本文公开的抗体或抗原结合片段可以包含用于特异地向癌细胞递送的轭合物。另外，可以使用抗体或抗原结合片段与肿瘤细胞的结合来招募宿主免疫应答。可以通过利用二价抗体来提供这种宿主免疫应答，其中该二价抗体的一个结合位点对应于本文提供的完全人抗体或抗原结合片段，而另一个结合位点识别另一抗原。
在某些实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以包含高岩藻糖(fucose)含量的低聚糖。在其他实施方式中，本文公开的抗体或抗原结合片段可以具有低岩藻糖含量，例如不含岩藻糖的Fc抗体。可以使用具有低岩藻糖基化活性的细胞系产生低岩藻糖抗体，例如大鼠YB2/0细胞(Shinkawa 2003)或CHO变体细胞系Lec13(Shields 2002)。
提供了下列实施例以更好地举例说明所要求保护的发明，并且不应将下列实施例解释为对本发明范围的限制。如下所述的所有具体的组合物、材料和方法以整体或部分地落入本发明的范围。这些具体组合物、材料和方法不用来限制本发明，而仅用于说明属于本发明范围的具体实施方式。在没有创造性能力的实践和不背离本发明范围的情况下，本领域技术人员可以形成等价的组合物、材料和方法。应理解，可以对本文所述的程序做出多种变化，但其仍在本发明的范围内。本发明发明人的意图在于这些变化包含在本发明的范围内。
实施例
实施例1：结合hVEGF 165 的抗体的产生：
针对固定的hVEGF165对人单链Fv(scFv)噬菌体展示文库进行淘选以鉴别具有结合hVEGF165能力的一组抗体片段。使用标准方案进行淘选(见，例如，Methods in Molecular Biology，vol.178：Antibody  Phage Display：Methods and Protocols  Edited by P.M.O’Brien and R.Aitken，Humana Press；“Panning of AntibodyPhage-Display  Libraries，”Coomber.  D.W.J.，PP.133-145，and“Selection of Antibodies Against Biotinylated Antigens，”Chames，P.etal.，pp.147-157)。
简要地，用50μl在PBS中浓度为10μg/ml的重组hVEGF165(R&D Systems，目录号：293-VE)包被MAXISORP板的三个孔。在4℃孵育过夜后，在室温下用5％的牛奶PBS溶液阻断自由结合位点达1小时。然后，将约200μl在5％牛奶/PBS中的噬菌体文库加入至封闭的孔中并在室温下孵育约1至2小时。使用标准方法，清洗孔并洗脱结合的噬菌体(见，例如，Sambrook andRussell，Molecule Cloning：A Laboratory Manual，3th Edition，ColdSpring Harbor Laboratory Press，2001)。将洗脱的噬菌体在37℃感染到处于对数生长期的大肠杆菌(E.coli)TG1宿主细胞中进行扩增。以2500RPM的转速离心5分钟回收感染的TG1细胞，将其置于15cm 2YT-氨苄西林-2％葡萄糖琼脂板上并在30℃孵育过夜。然后使用扩增的噬菌体重复该淘选过程。
用降低的浓度将淘选、洗脱和扩增循环重复三轮(例如，第一轮为50μg/ml的hVEGF165；第二轮为10μg/ml；接着第三轮为10μg/ml)，此时将来自涂板的TG1细胞的单个菌落用于接种96孔板中的培养基。微量(细胞)培养生长至OD600为0.6，此时通过加入1mM的IPTG并在30℃下在震荡器中孵育过夜而诱导可溶性scFv的表达。细菌离心沉淀，并且胞质提取物用来利用标准ELISA测定而测试scFv与固定化的hVEGF165的结合。
实施例2：通过scFv对hVEGF 165 与VEGF受体结合的阻断：
使用基于微板的竞争性筛选测定(Perkins Elmer，Waltham，MA)，对实施例1中通过ELISA表现出与hVEGF165结合的噬菌体克隆体测试它们阻断hVEGF165与VEGF-R1和/或VEGF-R2结合的能力。
简要地，将生物素化的hVEGF165溶液以体积比1∶1加入至实施例1的胞质提取物中以达到0.5μg/ml的最终浓度。将100μl该混合物加入到用VEGF-R1或VEGF-R2(R&D Systems：VEGF-R1/Flt-1，目录号：321-FL；VEGF-R2/KDR/Flk-1，目录号：357-KD)包被的板上并在室温下孵育1.5小时。用PBST清洗板，并以50μl/孔的量加入在DELFIA测定缓冲液中的铕-抗生蛋白链菌素的1∶250稀释液。将该板在室温下孵育1小时，然后用DELFIA清洗缓冲液清洗。以50μl/孔的量加入DELFIA增强缓冲液，并将该板在室温下孵育5分钟。用时间分辨荧光Gemini板读数器读取该板。
实施例3：scFv向scFv-Fc和IgG的转化
选择实施例2中将hVEGF165与VEGF-R1或VEGF-R2的结合抑制超过60％的两个scFv(XPA.10.064和XPA.10.072)用于向scFv-Fc和/或IgG的转化。图1示出了XPA.10.064和XPA.10.072的重链可变区(包括重链CDR)和轻链可变区(包括轻链CDR)。通过Kabat编号系统(Kabat，E.A.，et al.1987，in Sequences ofProteins of Immunological Interest，US Department of Health andHuman Services，NIH，USA)确定重链CDR(例如，HCDR1、HCDR2和HCDR3)和轻链CDR(例如，LCDR1、LCDR2和LCDR3)。分别在SEQ ID NO：6、7和8中示出了XPA.10.064和XPA.10.072的HCDR1、HCDR2和HCDR3氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：12、13和14中示出了XPA.10.064的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。分别在SEQ ID NO：9、10和11中示出了XPA.10.072的LCDR1、LCDR2和LCDR3氨基酸序列。
对于XPA.10.064和XPA.10.072向scFv-Fc融合蛋白的转化来说，将scFv cDNA克隆入已经过修饰以编码γ2重链恒定区基因的CH2和CH3结构域的真核表达载体中(美国专利No.7192737；WO 2004/033693)。
对于XPA.10.064和XPA.10.072向IgG的转化来说，将重链和轻链的可变区均克隆入编码κ、λ或γ2重链和轻链恒定区基因的真核表达载体中(US 2006/0121604)。
XPA.10.064和XPA.10.072scFv-Fc和IgG抗体在之前所述的293E细胞中瞬间表达(US 2006/0121604)。在培养的第6天收获转染细胞的上清液，并通过蛋白质-A色谱法纯化IgG。
实施例4：XPA.10.064和XPA.10.072scFv-Fc和IgG结合动力学的 Biacore分析：
使用BIACORE 2000和具有以高密度固定在所有流动池上的蛋白质A/G(Piece)的CM5传感芯片(Biacore)来评价XPA.10.064和XPA.10.072scFv-Fc的结合亲合力。用于这些实验的稀释液和运行缓冲液为用(Chemicon)以1∶50稀释的HBS-EP(Biacore)。通过以20ul/min的流速向流动池2(fc2)注入稀释的XPA.10.064和XPA.10.072scFv-Fc进行抗体捕获，所注入的体积是变化的以达到大约为50-70RU的抗体捕获。抗体浓度为约0.5μg/ml。使用相对于fc1和fc2进行15分钟解离的Kinject特性，以30μl/min的流速在5分钟内注入sf21细胞所表达的hVEGF165。通过一系列的三倍稀释，制备了四种hVEGF165的稀释液，得到的浓度为5μg/ml(119nM)、1.667μg/ml(39.7nM)、0.55μg/ml(13.2nM)和0.185μg/ml(4.4nM)。以50μl/min的流速注入两次100mMHCl(每次各12秒)以进行再生。在两次参考对照流动池和空白注射后，在Scrubber2中处理数据并通过1∶1朗格缪尔相互作用模型(Langmuir interaction model)进行拟合。XPA.10.064和XPA.10.072scFv-Fc对hVEGF165表现出高且几乎相同的结合亲合力。
利用相似的方案评价XPA.10.064和XPA.10.072IgG2的结合动力学。XPA.10.064和XPA.10.072IgG2均以相似的低单数位纳摩尔亲合力(图2-4)特异地与hVEGF165结合，并且对mVEGF165仅表现出弱结合(＞100nM)。两种抗体均表现出与贝伐单抗相似的结合动力学(表2)。
表2：XPA.10.064和XPA.10.072IgG2与hVEGF165的结合亲合力
  ka(1/Ms)   kd(1/s)   Rmax(RU)   KD(M)   Chi2   贝伐单抗   1.22×105   7.38×10-5   20   6.05×10-10  (605pM)   0.251   XPA.10.064   2.30×105   2.86×10-4   30   1.24×10-9  (1.24nM)   0.379   XPA.10.072   1.68×105   2.79×10-4   24   1.66×10-9  (1.66nM)   0.110  10
实施例5：XPA.10.064和XPA.10.072IgG对hVEGF 165 与VEGF受体结合的阻断：
使用具有CM5芯片的Biacore 2000评价了XPA.10.064和XPA.10.072IgG2阻断hVEGF165与VEGF-R1和/或VEGF-R2结合的能力。
通过胺偶合(Biacore)以约15000的密度将VEGF受体(R&DSystems)固定在CM5芯片上。将VEGF-R2固定在fc2上，而将VEGF-R1固定在fc4上。流动池1和3用作参照，并用与受体固定的流动池相同的方法进行活化和阻断。将在HBS-EP运行缓冲液中的0.15μg/ml的hVEGF165溶液与抗体样本或缓冲液1∶1混合。最终抗体浓度为15、5、1.667、0.556、0.185、0.0617、0.0206和0μg/ml。在开始Biacore分析运行之前，将样品孵育至少1小时。所有样品均注射两次，每组抗体重复均具有其自己的阳性和阴性对照(分别为无抗体和VEGF以及无VEGF)。以10ul/min的流速注入样品1.5分钟以通过所有流动池。以50μl/min的流速注入pH 1.75的Glycene12秒以进行再生。
对于数据分析，通过线性拟合确定结合相的结合线性部分(30秒至1分钟)的斜率。来自各个点的信号减去最近的空白，然后再除以100％匹配的信号(无抗体)对照以得到该循环的抑制百分率。用GraphPad Prism对数据画图，并用S形剂量反应曲线拟合以计算EC50。
XPA.10.064和XPA.10.072IgG2均以与贝伐单抗类似的水平阻断hVEGF165与VEGF-R1和VEGF-R2的结合(图5-6，表3)。
表3：XPA.10.064和XPA.10.072对hVEGF165与VEGF-R1/R2结合的抑制：
  贝伐单抗   XPA.10.064   XPA.10.072   hVEGF 165/VEGF-R 1  (EC50)   0.1002μg/ml   0.1589μg/ml   0.1211μg/ml   hVEGF 165/VEGF-R2  (EC50)   0.06328μg/ml   0.1287μg/ml   0.1730μg/ml
实施例6：对由XPA.10.064和XPA.10.072结合的hVEGF 165 表位的分析：
为了确定XPA.10.064和XPA.10.072识别的hVEGF165表位是否为线性或构象的，在三块独立的SDS-PAGE凝胶上对未降低的或降低的且热变性的重组hVEGF165的三个200ng样品进行电泳。将电泳后的蛋白质转移到Immulon-P膜上，将印迹与XPA.10.064IgG、XPA.10.072IgG或贝伐单抗抗体杂交并与1μg/ml的第二羊-抗人IgG HRP-轭合抗体进行孵育。用增强的化学发光(ECL)底物(Pierce)检测结合。
XPA.10.064、XPA.10.072和贝伐单抗均与hVEGF165上的线性表位结合(图7)。
实施例7：XPA.10.064和XPA.10.072hVEGF 121 表位结合研究：
为了确定XPA.10.064和XPA.10.072所结合的hVEGF121表位是否与贝伐单抗相同，使用多种hVEGF121突变体进行了三次ELISA比较结合测定。
之前的突变分析表明，VEGF残基M81、G88、Q89和G92对于贝伐单抗与hVEGF165的结合是至关重要的(Fuh 2006)。为了确定这些残基是否对XPA.10.064以及XPA.10.072的结合也至关重要，产生了下列hVEGF121突变体：hVEGF121-M81A、hVEGF121-Q89A、hVEGF121-G92A和hVEGF121-G88S。在CHO-K1细胞中瞬间表达这些突变体，并且收集细胞上清液用于通过ELISA进行结合分析。
以1、2或5μg/ml的浓度用XPA.10.064、XPA.10.072、贝伐单抗或对照多克隆山羊-抗人VEGF(PAB)包被微滴定板并在4℃孵育过夜。在室温下用30％的ChemiBlockTM试剂(Millipore)的PBS溶液阻断该板1小时，并且在适合的孔中加入30、60或100μl的各种突变体的CHO-K1培养上清液或1μg/ml的野生型hVEGF121、重组hVEGF165或重组mVEGF165。孵育1小、时后，冲洗该板并与生物素化的山羊多克隆抗-VEGF抗体在室温下孵育1小时。用HRP轭合的抗生蛋白链菌素进行检测，随后使用制造商的方案用TMB生色底物(Calbiochem)进行检测。
XPA.10.064和XPA.10.072与hVEGF121突变体的结合类型与贝伐单抗类似(表4-5)，表明这些抗体与重叠或类似的表位结合。
表4：XPA.10.064和XPA.10.072与hVEGF突变体的结合：

每种抗体的上一行：相对于CHO背景的结合倍数
每种抗体的下一行：原始数据
表5：表位结合结果的总结
  抗体   hVEGF121   hVEGF121  -M81A   hVEGF121  -G88s   hVEGF121  -Q89A   hVEGF121  -G92A   rHu  -VEGF165   rMu  -VEGF165   PAB   是   是   是   是   是   是   否   贝伐单抗   是   降低   否   弱   是   是   否   XPA.10.064   是   降低   否   弱   是   是   否   XPA.10.072   是   降低   否   弱   是   是   否
实施例8：XPA.10.064和XPA.10.072的组织交叉反应性：
利用单色显色技术，将冷冻正常人组织阵列(TMA)用来评价XPA.10.064和XPA.10.072的免疫组织化学(IHC)反应性。TMA包含32个正常人组织类型，其中各个类型由来自两到三个不同供体的组织组成。除TMA之外，使用正常人肝、肾、输卵管、胰腺、输尿管和肾上腺的较大组织切片以证实TMA的染色结果或代替TMA中缺失的组织。阳性对照包括在UV-树脂片上的hVEGF蛋白质斑点和如用抗-hVEGF兔单克隆抗体强染色所评价的表达高水平hVEGF的肾恶性肿瘤组织。
利用人对人IHC染色方案，以20μg/m1的浓度用XPA.10.064、XPA.10.072(人类IgG2)或贝伐单抗对TMA和正常人组织以及hVEGF蛋白质斑点和肾恶性肿瘤阳性对照进行染色。还包含人类扁桃腺炎病例以监测染色方案的有效性。最终方案对扁桃体组织B细胞区中的组织内源免疫球蛋白不具有反应性。阴性对照抗体为人IgG 1和IgG2(Sigma，St.Louis，MO)和人KLH抗体CHO.KLHG2.60(IgG2)。
XPA.10.064、XPA.10.072和贝伐单抗对hVEGF蛋白质斑点均具有2-3+(范围为0-4+)的反应性，其中4+表示最高的染色强度。对于肾恶性肿瘤组织，贝伐单抗的染色模糊，而XPA.10.064和XPA.10.072对肿瘤细胞的细胞质染色。
人IgG1和IgG2不染色任何组织成分，仅有最低的背景染色。CHO.KLHG2.60对肾上腺皮质中的细胞，食管、乳腺、胰腺、前列腺、胃、甲状腺、输尿管颈和输卵管中的上皮细胞具有反应性。由于这种反应性，使用人IgG1和IgG2作为参考阴性对照。
XPA.10.064对测试抗体具有最广泛的组织反应性谱。XPA.10.064对膀胱、胃肠道、输卵管、乳腺、前列腺、输尿管和子宫中的平滑肌细胞，以及输卵管、前列腺、皮肤、小肠、胃、甲状腺、输尿管、子宫的子宫内膜腺和子宫颈中的上皮细胞强染色。另外，XPA.10.064对小脑、大脑皮层和脊髓中的一些神经元和神经纤维，以及心肌和骨骼肌，脑下腺、肾小球、肝窦状隙内皮中的细胞，胸腺基质细胞，肺巨噬细胞和肾上腺皮质细胞染色。XPA.10.072对小脑、大脑皮层和脊髓中的神经纤维强染色。XPA.10.072还对胃肠道、输卵管、前列腺、输尿管和子宫的平滑肌，食管、输卵管、乳腺、前列腺、胃、小肠、甲状腺和输尿管中的上皮细胞，肺巨噬细胞和胎盘的成纤维细胞/组织细胞染色。贝伐单抗对所有正常人组织阴性染色。
为了确定XPA.10.064和XPA.10.072的免疫组织化学反应性是否表示靶标上(on-target)结合或靶标外(off-target)结合，利用了多色免疫荧光基方法。该方法基于同时比较已知“金标准”抗-VEGF抗体与测试抗体的免疫反应性。测试抗体的靶标上反应性证实与“金标准”抗体的共定位，而缺少共定位表明靶标外反应性。
利用初始实验中采用的相同显色IHC方法，用商购小鼠抗-人抗-VEGF抗体(BD Pharmingen，clone G153-694)对来自阳性(Du145)和阴性(Hek 293)对照细胞的细胞球粒的冷冻切片进行染色。该抗体对Du145细胞染色，但是不能对Hek 293细胞染色。另外，用该抗体染色的结肠恶性肿瘤的冷冻切片表明了在上皮和肿瘤相关基质组分与良好内部阴性对照中的反应性特征类型。因此，G153-694 指定为“金标准”阳性对照抗体。
使用来自Zenon IgG标记试剂盒(Molecular Probes)的方案，将一次抗体用荧光染料轭合的Fc-靶向抗-人Fab进行预孵育，随后用摩尔过量的恰当正常血清中和未反应的Fab。使用荧光抗体-Fab复合体作为染色剂，随后用DAPI进行核复染色。使用来自结肠(Tissue ID 4558)腺癌的冷冻切片作为这些共定位研究的对照VEGF-阳性组织。用红色(Alexa Fluor 594)标记XPA.10.064和XPA.10.072抗体，而用绿色(A1exa Fluor 488)标记“金标准”抗体。使用相反的颜色组合重复该测定，得到基本相同的结果。使用LeicaTCS SP(型号DM RXE)激光扫描共聚焦显微镜和2.0版的Leica共聚焦软件(Leica Microsystems，Wetzler，Germany)获取图像。以400×对多个视野成像(至少三个)，并使用Image Pro software(Media Cybemetics，Silver Spring，MD)并分析代表性视野的共定位。由于在对结肠恶性肿瘤和冷冻球粒切片的初始IHC研究中，贝伐单抗基本上均为阴性，因此在共定位研究中未将其包括在内。
XPA.10.064和XPA.10.072显示了类似的高度共定位，其中XPA.10.064显示出最大的组织染色强度(图8-9)。
实施例9：XPA.10.064和XPA.10.072对HUVEC增殖的抑制：
对XPA.10.064和XPA.10.072的scFv-Fc和IgG2测试了它们阻断HUVEC增殖的能力。
在ECGM完全培养基(Clonetics#CC-3024)加BulletKit-2(补充了rhEGF、rhFGF、rhVGEF、抗坏血酸、氢化可的松、IGF、肝素、庆大霉素/两性霉素和2％FBS)中生长混合的HUVEC(Clonetics#CC-2519)。细胞在每个T-75烧瓶中以2-3×105个细胞进行接种，并在3-4天达到汇合。用PBS冲洗接近汇合的单层细胞后，使其受胰蛋白酶作用，并用含有PBS的完全培养基中和。
为了测量存在hVEGF165下HUVEC的增殖，通过用基本生长培养基稀释(0-200ng/m1的最终浓度，2×稀释，2×浓度，50μl/孔)建立了HEK 293细胞所表达的hVEGF165的16个点的剂量滴定。在冷的基本培养基/0.1％BSA中以2×105细胞/毫升重新悬浮HUVEC细胞，向hVEGF165滴定板的各个孔中加入50μl的细胞(1×104c/w)至最终体积为100μl/孔。孔外充满PBS，并用石蜡封口膜密封该板以防止脱水。将板在37℃，5％的CO2中孵育96小、时，然后在约15-20分钟内使其恢复到室温。将Cell TiterGlo(TTG，Promega)解冻并恢复到底物温度，并向各个孔中加入100μl的底物/缓冲液混合物。将该板在定轨板式振荡器上震荡1-2分钟，然后从各个孔中取出150μl溶液转移到白底白壁板并在黑暗中孵育5-10分钟。用具有1秒积分的光度计读取该板。
对于增殖抑制测定，生成XPA.10.064、XPA.10.072和贝伐单抗的滴定(0-50μg/ml最终浓度，3×稀释，4×浓度，25μl/孔的最终体积)。抗体用hVEGF165以1∶1的比例预孵育2小时。预孵育后，向50μl/孔的重新悬浮的HUVEC细胞中加入50μl/孔的VEGF/抗体复合体，然后将该板孵育96小时并用如上该的TiterGlo缓冲液处理。
XPA.10.064和XPA.10.072scFv和IgG2抑制HUVEC增殖。图10和表6中示出了IgG2的结果。
表6：XPA.10.064、XPA.10.072和贝伐单抗对HUVEC增殖的抑制

实施例10：XPA.10.064和XPA.10.072对VEGF-R2磷酸化的抑制：
通过ELISA分析了XPA.10.064和XPA.10.072抑制hVEGF165的VEGF-R2磷酸化的能力。
要产生溶菌物板，解冻2代至6代之间的HUVEC细胞并铺放在TC烧瓶的EGM2完全培养基(Lonza)中，并使其生长一至两代。用胰蛋白酶作用接近汇合细胞，并用完全培养基中和，再用PBS冲洗两次然后计数。以1×105个/孔将细胞置于24孔板的完全培养基(重复三个孔)中并在37℃孵育24小时。孵育后，用室温PBS冲洗细胞两次，并在加有0.1％BSA的EBM2培养基(Lonza)中饥饿5小时。倒出PBS，将细胞与剂量滴定的hVEGF165(刺激)或预复合的VPA.10.064+hVEGF165、VPA.10.072+hVEGF165或贝伐单抗+hVEGF165(抑制)孵育5分钟。通过将2×剂量滴定的抗体与2×hVEGF165(最终浓度：20ng/ml)以1∶1的比例混合并在37℃孵育24小时产生了VPA.10.064+hVEGF165和VPA.10.072+hVEGF165。倒出hVEGF165、VPA.10.064+hVEGF165和VPA.10.072+hVEGF165，用冰冷的PBS冲洗细胞两次。每孔加入65μl/孔的溶菌缓冲液(1％NP-40；20mM Tris，pH 8.0；137mM的NaCl；10％的甘油；2mMEDTA；1mM活化的原钒酸钠；10μg/ml的亮肽素)，细胞在4℃摇动30分钟备用。
将捕获的VEGF-R2(R&D Systems，VEGF-R2/KDR/Flk-1，目录号357-KD)特异抗体在PBS中稀释至8.0g/ml的工作浓度，并以100μl/孔包被96孔微板。VEGF-R2/KDR/Flk-1与磷酸化和非磷酸化的VEGF-R2均结合。密封该板并孵育过夜。吸取各个孔中的液体并用冲洗缓冲液冲洗5次，然后加入300μl/孔的封闭缓冲液并在室温下孵育1至2小时以封闭该板。吸取各个孔中的液体并用冲洗缓冲液再冲洗5次，然后向各个孔中加入100μl的HUVEC溶菌物。将该板在室温下孵育2小时，吸取孔中的液体并用冲洗缓冲液冲洗5次。向各个孔中加入100μl对磷酸化酪氨酸特异的HRP-轭合的检测抗体，覆盖该板并在室温下避光孵育2小时。吸出孔中液体并用冲洗缓冲液冲洗5次，然后向各个孔中加入100μl底物溶液。将该板在室温下避光孵育20分钟，然后向各个孔中加入50μl终止溶液。用酶标仪读取各个孔在450nm处的光密度。
用剂量滴定的hVEGF165处理的HUVEC表现出磷酸化的VEGF-R2的增加(图11)。用剂量滴定的贝伐单抗+hVEGF165处理的HUVEC表现出VEGF-R2磷酸化的减少(图12)。用剂量滴定的XPA.10.064+hVEGF165或XPA.10.072+hVEGF165处理的HUVEC表现出VEGF-R2磷酸化的减少。图13中总结了各个抗体的结果。
实施例11：XPA.10.064和XPA.10.072对血管生成的抑制：
使用栓测定检测XPA.10.064和XPA.10.072抑制体内血管生成的能力。
向6-7周龄的雌性NU/NU小鼠腹腔注射0.5mL含有2×106个DU145细胞的(BD Biosciences，San Jose，CA)，其产生人VEGF以诱导血管生成。在第0和3天，小鼠用载体对照或0.1、1或5mg/kg的XPA.10.064、XPA.10.072或贝伐单抗腹膜内注射。第7天，处死小鼠并切下栓、称重并拍照。根据以下方案，对栓进行目视评分(0至3分)：0，无颜色或无明显的血管；1，有颜色迹象和少量血管；2，黄色-红色，血管清楚；和3，均匀的红色或粉红色，血管发暗(图14)。由得到照片的盲评员对栓进行评价，其中打乱了照片的顺序。
在所有测试的剂量，XPA.10.064的给予均导致血管生成显著降低，而XPA.10.072以1mg/kg和5mg/kg给予时导致显著降低(图15和16)。血管生成抑制水平与存在贝伐单抗时所观察到的类似。
在最后一次给予抗体剂量后的第4天，通过ELISA测量小鼠血清中XPA.10.064、XPA.10.072和贝伐单抗的浓度。在任何测试的剂量，三种抗体之间的抗体水平无显著差异。
实施例12：XPA.10.064和XPA.10.072对肿瘤生长的抑制：
利用先前公开的方案(Liang 2006)，用A673横纹肌肉瘤肿瘤生长模型测试了XPA.10.064和XPA.10.072抑制肿瘤生长的能力。保持培养的A673细胞生长直至汇合，然后收获并重新悬浮于无菌的50％中。通过向6周龄的雌性裸鼠肋部皮下注射悬浮于中的5×106个细胞而建立异种移植。当肿瘤尺寸达到约100mm3时，将小鼠随机分为8组(每组10个)，并腹膜内注射仅载体(组1)、0.5mg/kg XPA.10.064IgG2(组2)、5mg/kg XPA.10.064IgG2(组3)、0.5mg/kg XPA.10.072IgG2(组4)、5mg/kg XPA.10.072IgG2(组5)、5mg/kg的同种型对照抗-KLH IgG2(组6)、0.5mg/kg贝伐单抗(组7)或5mg/kg贝伐单抗(组8)，每周注射两次持续18天(共计6次剂量)。在最后一次剂量后的24、72和168小时，采集血液和组织样本。
在所测试的两种剂量下，XPA.10.064和XPA.10.072的给予导致显著的体内肿瘤生长抑制(图17)。在所有测试的剂量，两种抗体的生长抑制水平均比贝伐单抗中所观察到的略高。在给定的剂量给予的所有抗体的血清水平相似(0.5mg/kg，血清水平为约5-7μg/ml；5mg/kg，血清水平为约75-100μg/ml)。
实施例13：亲合力成熟：
对XPA.10.064进行亲合力成熟以优化亲合力。使用标准分子生物学技术(见，例如，Clackson&Lowman，Phage Display-APractical Approach(Oxford University Press，2004))，通过HCDR3的随机诱变产生了scFv文库。为了覆盖全部10个氨基酸的CDR，将HCDR3随机分为两个五个氨基酸的区，从而得到了文库H3B1(HCDR3的N末端5个氨基酸区)和H3B2(HCDR3的C末端5个氨基酸区)。使用类似于实施例1中所述的那些技术，对两个文库均进行了噬菌体选择。随着连续每轮淘选的进行，靶抗原的包被浓度逐步降低。
使用类似于实施例3中所述的那些技术，将相对于亲本抗体表现出改善的hVEGF165结合的koff速率的五种scFv克隆体转化为IgG。通过在极低密度的抗原表面上注射抗体，在Biacore上测试了这些IgG的VEGF结合亲合力。通过标准胺偶合法，将人或鼠VEGF165固定到在C1(平面羧基表面)芯片上的流动池。固定了约85RU的每种抗原，并活化和封闭了参考流动池。在两个不同的浓度，经过400秒注入抗体通过芯片表面，在此之后监测解离。利用双参考和以1∶1相互作用拟合，通过分析数据。用90mM HCl和500mM NaCl进行再生。
每个亲合力成熟的克隆体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10与hVEGF165结合的亲合力比亲本XPA.10.064或贝伐单抗的更大(表7)。分别在5EQID NO：15-19中示出了XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10的HCDR3氨基序列。分别在SEQ ID NO：20-24中示出了XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10的完整重链序列。XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10的轻链序列与XPA.10.064和XPA.10.072(SEQ ID NO：5)的相同。所有五种这些亲合力成熟的抗体均在HCDR3中含有蛋氨酸残基。
表7：亲本XPA.10.064和亲合力成熟的XPA.10.064对hVEGF165的结合亲合力：
  IgG2克隆   ka(1/Ms)   kd(1/s)   KD   贝伐单抗   1.92×105   8.08×10-5   4.25×10-10M  (425pM)   XPA.10.064   1.93×105   3.35×10-4   1.71×10-9M  (1.71nM)   XPA.10.064.03   1.96×105   1.80×10-5   9.17×10-11M  (92pM)   XPA.10.064.04   1.50×105   2.94×10-5   1.966×10-10M  (197pM)   XPA.10.064.06   1.78×105   2.07×10-5   1.21×10-10M  (121pM)
  XPA.10.064.07   2.07×105   6.65×10-6   3.49×10-11M  (35pM)   XPA.10.064.10   2.16×105   1.16×10-5   5.56×10-11M  (56pM)
亲本XPA.10.064以及亲和力成熟的克隆XPA.10.064.06和XPA.10.064.07每一个均对mVEGF165仅表现出弱结合(＞100nM)(表8)。
表8：亲本XPA.064和亲和力成熟的XPA.064对mVEGF165的结合亲和力：
  IgG2克隆   KD   贝伐单抗   无结合   XPA.10.064   197nM   XPA.10.064.06   208nM   XPA.10.064.07   130nM
实施例14：亲合力成熟的XPA.10.064对HUVEC增殖的抑制：
使用类似于实施例9中所述的方案，测试了亲合力成熟的XPA.10.064IgG2阻断HUVEC增殖的能力。产生了XPA.10.064、XPA.10.064.03、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07、XPA.10.064.10和贝伐单抗的滴定，并且这些抗体用hVEGF165预孵育2小时。预孵育后，将VEGF/抗体复合体加入到悬浮的HUVEC细胞中。对每个抗体，实验重复四次。
在图18-23中示出了对各个抗体的结果，并在图24中总结了这些结果。每个亲合力成熟的抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10抑制HUVEC增殖的程度均比亲本XPA.10.064大。表9中示出了各个抗体IC50的几何平均数。表9中所示的P值基于相对于贝伐单抗，各个抗体的log(IC50)的试验内配对单侧t检验。在该分析中，亲合力成熟的XPA.10.064.03、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10抗体彼此之间在统计学上无差异。
表9：亲合力成熟的XPA.10.064HUVEC测定总结：
  抗体   IC50的几何平均值  (SE)   P值 (检测IC50中2×改变的能力)   贝伐单抗   275pM  (29)
  XPA.10.064   1320pM  (984)   (10％)   XPA.10.064.03   174pM  (29)   0.0394  (90％)   XPA.10.064.06   173pM  (22)   0.0132  (98％)   XPA.10.064.07   129pM  (40)   0.0525  (40％)   XPA.10.064.10   139pM  (38)   0.04625  (50％)
实施例15：XPA.10.064.06对肿瘤生长的抑制：
使用实施例12中所讨论的相同A673横纹肌肉瘤肿瘤生长模型，测试XPA.10.064.06抑制肿瘤生长的能力。从第0天开始，将含有2.5×106个肿瘤细胞的50％皮下注射入六周龄裸鼠的中线胸脊柱区。第3天，当肿瘤尺寸达到约200mm3时，将小鼠随机分成7组(20只一组)并腹膜内注射同中型对照抗-KLH IgG2，以0.1、0.5或5mg/kg的XPA.10.064.06，或以0.1、0.5或5mg/kg的贝伐单抗，每周两次。在第3、7、10、14、17、21、24、28和31天测量肿瘤尺寸。如果和当肿瘤尺寸达到2000mm3时，处死小鼠。对每只小鼠进行最终肿瘤测量后，采集肿瘤和血清样本。
XPA.10.064.06和贝伐单抗均以剂量依赖方式抑制肿瘤生长(图25-27)。用0.5mg/kg的XPA.10.064.06处理导致至第17天的肿瘤退化，肿瘤尺寸保持在200mm3以下(图25-27)。在第17、21、24、28和31天，用0.1或0.5mg/kg的XPA.10.064.06处理的小鼠表现出比用相同剂量的贝伐单抗处理的小鼠显著更小的肿瘤(图25-27)。由于肿瘤体积超过2000mm3，因此必须在第24天处死三只用0.1mg/kg贝伐单抗处理的小鼠和三只用对照抗体处理的小鼠，而在整个研究过程中用XPA.10.064.06处理的小鼠无一达到该阈值。
在第24天(所有动物均存活的最后一次测量日)，用0.1mg/kg的XPA.10.064.06处理的小鼠的肿瘤生长抑制百分率(％TGI)(55％)与用5倍剂量的贝伐单抗所得到的结果(0.5mg/kg时为50％)类似。类似地，用0.5mg/kg的XPA.10.064.06处理的小鼠的％TGI(85％)与用10倍剂量的贝伐单抗处理的小鼠中所观察到的结果(5mg/kg时为95％)类似。这些结果表明，XPA.10.064.06在降低肿瘤体内生长方面比贝伐单抗有效至少5倍。表10中总结了各个抗体在第24天时的肿瘤生长抑制百分率结果。
表10：XPA.10.064.06对肿瘤生长的抑制：
  抗体比较   肿瘤生长抑制％   P值  (通过Anova和Tukey检验确定)
  对照与BM-1  (0.1mg/kg)   无影响   对照与XPA.10.064.06  (0.1mg/kg)   55％   p＜0.01   对照与BM-1  (0.5mg/kg)   50％   p＜0.01   对照与XPA.10.064.06  (0.5mg/kg)   85％   p＜0.01   对照与BM-1  (5mg/kg)   95％   p＜0.01   对照与XPA.10.064.06  (5mg/kg)   90％   p＜0.01
将各个抗体对肿瘤生长的延缓计算为用抗体和对照处理后肿瘤分别达到500mm3所需的天数之间的差值。在0.5mg/kg的剂量(分别为14天和5天)和在0.1mg/kg的剂量(分别为7天和2天)，XPA.10.064.06对肿瘤生长的延缓明显长于BM-1。这些结果显示当抗体以相同剂量给予时，XPA.10.064.06延缓肿瘤生长至特定尺寸的持续时间比贝伐单抗长2到3倍。表11中总结了结果。
表11：XPA.11.064.06对肿瘤生长的延缓
  抗体(剂量)   肿瘤生长延缓  (天数)   对照huIgG(0.5mg/kg)   0   XPA.10.064.06(0.1mg/kg)   7   BM-1(0.1mg/kg)   2   XPA.10.064.06(0.5mg/kg)   14   BM-1(0.5mg/kg)   5
在第28天，对各个抗体/剂量进行基于肿瘤体积对时间的曲线下面积(AUC)的计算。0.5mg/kg的BM-1的AUC明显比相同剂量的XPA.10.064.06的高(分别为8865和5517)。尽管差异不太明显，但是0.1mg/kg的BM-1的AUC也比XPA.10.064.06的高(分别为9638和8703)。表12中总结了结果。
表12：XPA.10.064的曲线下面积
  抗体(剂量)   AUC  (肿瘤体积×天数)   对照huIgG(0.5mg/kg)   11015   XPA.10.064.06(0.1mg/kg)   8703   BM-1(0.1mg/kg)   9638   XPA.10.064.06(0.5mg/kg)   5517   BM-1(0.5mg/kg)   8865   XPA.10.064.06(5mg/kg)   5069   BM-1(5mg/kg)   4418
进一步在HT-29人结直肠腺癌模型中测试了XPA.10.064.06抑制肿瘤生长的能力。初步结果表明，每周给予两次0.1、0.5或5mg/kg的XPA.10.064.06在35天内不会导致肿瘤尺寸在统计学上的显著降低。对相同浓度的贝伐单抗得到了类似的结果。
实施例16：对亲合力成熟的抗体氧化的抑制：
如以上在实施例13中所讨论的，每个亲合力成熟的抗体XPA.10.064.03、XPA.10.064.04、XPA.10.064.06、XPA.10.064.07和XPA.10.064.10均在HCDR3中含有亲本抗体中不存在的蛋氨酸残基(具体地，在101残基)。蛋氨酸残基的氧化是蛋白质产品在储存期间常见的降解途径。
为了测试蛋氨酸氧化对亲合力成熟抗体的影响，将XPA.10.064.06和亲本XPA.10.064均暴露于氧化剂叔丁基过氧化氢(tBHP)。通过胰蛋白酶标测(tryptic mapping)结合液相色谱-质谱法(LC/MS)分析了在各个蛋氨酸残基处所得的氧化程度。表13中总结了结果。两种抗体在蛋氨酸残基48和81处表现出氧化，而在蛋氨酸残基70处无可测量的氧化。XPA.10.064.06在位置101处的额外蛋氨酸残基表现出显著的氧化程度。
表13：XPA.10.064和XPA.10.064.06中的蛋氨酸残基的氧化

用Biacore分析了氧化的抗体对hVEGF165的结合动力学。XPA.10.064的氧化对hVEGF165结合动力学的影响较小(图28A)，而XPA.10.064.06的氧化则导致体外VEGF结合亲合力显著降低(图28B)。
为了克服与氧化有关的问题并提高亲合力成熟抗体长期储存的稳定性，测试了包含XPA.10.064.06加抗氧剂的剂型。将用10mM的L-组氨酸和140mM的L-精氨酸(pH 6.0)配制的1mg/ml的XPA.10.064和XPA.10.064.06通过化学应力或热应力进行氧化。对于化学应力，将抗体用0.1％的tBHP在存在或不存在5mM的L-蛋氨酸的情况下室温孵育过夜。对于热应力，将抗体在存在或不存在5mM的L-蛋氨酸的情况下，在聚山梨醇酯中在40℃孵育4周。用Biacore和ELISA分析这些抗体结合hVEGF165的能力。在抗体剂型中存在蛋氨酸保留了热应力下的hVEGF165结合亲合力(图29A、29B和30A)，并降低了化学应力对结合亲合力的消极影响(图30B)。表14中总结了结果。
表14：

实施例17：XPA.10.064的进一步亲合力成熟：
可以向XPA.10.064的重链可变区引入其他突变。具体地，XPA.10.064.06HCDR3中的蛋氨酸残基可以突变为一个或多个丙氨酸、赖氨酸、脯氨酸、苏氨酸和亮氨酸。SEQ ID NO：25-29中分别示出了这些突变体的HCDR3氨基序列。将对含有所得的HCDR3序列的抗体进行结合分析以确定对hVEGF165的结合亲合力。对hVEGF165表现出高亲合力并且解离速率高于10-5的抗体将重整为IgG并进行功能性分析以确定它们抑制HUVEC增殖、血管生成、肿瘤生长和/或hVEGF165诱导的VEGF-R2磷酸化的能力。
实施例18：XPA.10.064.06的表达：
构建第一载体用于在CHO-K1细胞中表达XPA.10.064.06IgG2。该载体(pMXSP117)含有分别融合至γ-2和κ恒定区的XPA.10.064.06重链和轻链可变区，其中每个区均受人CMV启动子和小鼠轻链3’未翻译区的控制。该载体含有用于选择G418-耐受转染子的新基因。在图31A和31B中分别示出了环形和线性形式的pMXSP117结构。构建pMXSP117之前，将XPA.10.064.06重链和轻链可变区克隆入含有分别如图32A和32B所示的重链(γ-2)和轻链(κ)恒定区中的模块表达载体。将含有抗体信号顺序的重链可变区作为Sall/Blpl片段克隆如该重链模块载体中。将含有抗体信号顺序的轻链可变区作为Sall/BsiW1片段克隆入轻链模块载体中。
分两步构建第二载体(pMXSP119)，其中除用编码耐组氨醇(histidinol)的hisD基因(组氨醇脱氢酶)代替neo基因外，该第二载体的结构与pMXSP117相同。第一步涉及将XPA.10.064.006重链转录单元与含有hisD基因的载体节段组合以产生载体pMXSP118。第二步涉及将由XPA.10.064.06轻链转录单元组成的限制片段与来自含有XPA.10.064.06重链转录单元和hisD基因的pMXSP118的载体节段组合而产生pMXSP119。
培养出表达XPA.10.064.06IgG2的CHO-K1细胞系。转染前，将来自未转染细胞的研究细胞库的细胞解冻并在302无血清培养基(SAFC Biosciences，Lenexa，KS)上生长。通过使用线性聚氮丙啶(PEI；25000MW；Polysciences，Warrington，PA)和已经过Xbal消化而线性化的pMXSP117(图31B)进行转染，将编码XPA.10.064.06轻链和重链的基因引入至适应无动物产品培养基的CHO-K1细胞。在无动物产品培养基上孵育三天后，将细胞悬浮于补充了0.8mg/ml和1％胎儿牛血清(FBS)的302培养基并铺在96孔板上。将含有单菌落的孔转移到深孔96孔板中无FBS的302培养基上。再次用ELISA筛选后，在含有10mL培养物的50ml开口管和含有25mL培养物的125mL摇瓶中测试较好的(top)产生克隆以用于表达。
根据它们的生产能力选择的，将来自用pMXSP117初始转染的几种较好的生产细胞调整到生产培养基，以便产生XPA.10.064.06IgG2。为了进一步提高生产水平，用表达相同重链和轻链序列但具有不同的可选择标记物的另一载体(例如，载体pMXSP119，其编码了组氨醇耐受性)对较好遗传霉素(Geneticin)耐受的生产细胞进行再转染。通过Xbal消化使pMXSP119载体线性化。在无动物产品培养基上孵育三天后，将细胞悬浮于补充了0.4mg/ml遗传霉素、8mM组氨醇和1％FBS的302培养基并铺在96孔板上。将含有通过ELISA鉴别为高产细胞的单菌落的孔转移到深孔96孔板中无FBS的302培养基。在通过另外的ELISA筛选后，在摇瓶中测试产生较好的克隆体的表达。根据生长和生产能力选择的，将来自这种再转染的几种较好的生产细胞调整至无动物产品生产培养基以便评价在摇瓶培养和生物反应器中的生长和生产。为已适应生产培养基的这些较好的克隆准备了研究细胞库。根据这些测试结果，将选择一个克隆体用于主细胞库(MCB)的准备，其将用作良好作业规范(GMP)下生产XPA.10.064.06IgG2的起点。
实施例19：XPA.10.064.06的纯化：
可以使用下列程序纯化表达XPA.10.064.06或其片段的细胞，如实施例18中该的CHO-K1细胞。发酵完成后，澄清细胞培养物并通过包含深度过滤器(CUNO，Meriden，CT)和荷电膜滤器以及无菌0.2μm过滤器的过滤系列的过滤后收获。将无细胞的澄清培养液上样至蛋白质A亲和层析柱，然后用平衡缓冲液冲洗。用pH范围在3-4的低pH缓冲液洗脱抗体，然后在pH 3.8±0.2进行最长60分钟的病毒灭活。调整病毒灭活池的pH和电导率，然后以流通模式上样至阴离子交换柱，借此抗体流过该柱而杂质与其结合。将从阴离子交换柱流过的液体用疏水相互作用色谱(HIC)柱进一步纯化，除去诸如聚集体、DNA和宿主细胞蛋白质的杂质，然后再通过纳米滤器过滤，如常规流动细小病毒(NFP)过滤器(Millipore)以除去病毒颗粒。使用超滤和渗滤(UF/DF)，将经过纳滤的抗体配制成目标浓度并将缓冲液交换成剂型缓冲液以产生大量药物物质(BDS)。
上述内容仅用于举例说明本发明的各种实施方式。不能将上述讨论的特定变形视为对本发明范围的限制。可以在不背离本发明范围的情况下做出各种等同替换、改变和变形，这对本领域技术人员将是显而易见的，并且应理解这样的等价实施方式将包括在本文中。如同在本文中提供一样，本文引用的所有参考文献以它们的整体并入作为参考。
相关申请
本专利申请要求于2007年10月22日提交的美国临时申请No.60/981,808和于2008年4月18日提交的美国临时申请No.61/046,370的优选权。将这些申请所公开的全部内容，包括附图并入本文作为参考。
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<213>人类

<400>1
Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys
1                   5               10              15
Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu
            20                  25              30
Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys
        35                  40              45
Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu
    50                  55              60
Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile
65                  70                  75                  80
Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe
                85                  90                  95
Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg
            100                 105                 110
Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe
        115                 120                 125
Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser
    130                 135                 140
Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys
145                 150                 155                 160
Asp Lys Pro Arg Arg
                165

<210>2
<211>119
<212>蛋白质
<213>人类
<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>2
Arg Leu Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
l               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Ala Arg Gln Ala Pro Glv Gln Glv Leu Glu Trn Mat
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp His Arg Ile Val Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>3
<211>110
<212>蛋白质
<213>人类

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(26)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(51)..(57)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(90)..(100)
<223>CDR3

<400>3
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Leu Gly Ser Asn
            20                  25                  30
Phe Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn His Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile SerGly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Arg Val Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
            100                 105                 110

<210>4
<211>119
<212>蛋白质
<213>人类

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>4
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp His Arg Ile Val Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>5
<211>110
<212>蛋白质
<213>人类

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(23)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(51)..(57)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(90)..(100)
<223>CDR3

<400>5
Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln
1               5                   10                  15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn
            20                  25                  30
Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Arg Asn Asp Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg
65                  70                  75                  80
Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu
                85                  90                  95
Ser Gly Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu
            100                 105                 110

<210>6
<211>5
<212>蛋白质
<213>人类

<400>6
Gly His Tyr Ile His
1               5

<210>7
<211>17
<212>蛋白质
<213>人类

<400>7
Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe Gln
1               5                   10                  15
Gly

<210>8
<211>10
<212>蛋白质
<213>人类

<400>8
Asp His Arg Ile Val Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>9
<211>10
<212>蛋白质
<213>人类

<400>9
Ser Ser Asn Leu Gly Ser Asn Phe Val Tyr
1               5                   10

<210>10
<211>7
<212>蛋白质
<213>人类

<400>10
Arg Asn His Gln Arg Pro Ser
1               5

<210>11
<211>11
<212>蛋白质
<213>人类

<400>11
Ala Ser Trp Asp Asp Ser Leu Arg Val Val Val
1               5                   10

<210>12
<211>13
<212>蛋白质
<213>人类

<400>12
Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ile Asn Tyr Val Tyr
1               5                   10

<210>13
<211>7
<212>蛋白质
<213>人类

<400>13
Arg Asn Asp Gln Arg Pro Ser
1               5

<210>14
<211>11
<212>蛋白质
<213>人类

<400>14
Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Val Val
1               5                   10

<210>15
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>15
Asp Gln Met Val His Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>16
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>16
Asp Glu Met Gln Asn Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>17
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>17
Asp Glu Met Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>18
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>18
Asp Glu Met His Val Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>19
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>19
Asp Glu Met Val Trp Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>20
<211>119
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的重链

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>20
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
             20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Gln Met Val His Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>21
<211>119
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的重链

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>21
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Glu Met Gln Asn Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>22
<211>119
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的重链

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>22
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Glu Met Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>23
<211>119
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的重链

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>23
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser GlyAla Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Glu Met His Val Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>24
<211>119
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>亲和性成熟的XPA.10.064的重链

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(31)..(35)
<223>CDR1

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(50)..(66)
<223>CDR2

<220>
<221>MISC FEATURE
<222>(99)..(108)
<223>CDR3

<400>24
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Arg Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly His
            20                  25                  30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Trp Ile Asn Pro Tyr Ser Gly Gly Thr Asn Phe Pro Arg Glu Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Val Asn Thr Val Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Asp Asp Thr Ser Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Glu Met Val Trp Gly Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115

<210>25
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>具有另外的氨基酸取代基的亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3
<400>25
Asp Glu Ala Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>26
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>具有另外的氨基酸取代基的亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>26
Asp Glu Lys Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>27
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>具有另外的氨基酸取代基的亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>27
Asp Glu Pro Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>28
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>具有另外的氨基酸取代基的亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>28
Asp Glu Thr Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

<210>29
<211>10
<212>蛋白质
<213>人工序列

<220>
<223>具有另外的氨基酸取代基的亲和性成熟的XPA.10.064的HCDR3

<400>29
Asp Glu Leu Thr Arg Gly Gly Leu Asp Tyr
1               5                   10

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