技术领域
[0001] 本
发明属于白及栽培技术领域，具体涉及一种快速诱导白及鳞茎的专用培养基及组培方法。
背景技术
[0002] 白及为兰科
植物白及(Bletilla striata(Thunb.)Reichb.f.，其假鳞茎为药用部位，具有收敛
止血、消肿生肌的功效，现研究发现白及在
治疗肺结核、胃病、
肿瘤等方面效果明显，同时还是优质的化学品材料。但白及植物被人为采挖、生镜破坏，野生资源十分稀少，现已被列为珍稀植物二级保护种。
[0003] 随着白及开发利用价值的发展需要，其市场需求量不断增加，而野生资源已经十分稀少了，白及自然条件下繁殖率较低，所以急需开展白及人工繁殖及规范化栽培的研究，从而较好的保护白及野生资源，并保障白及的市场需求和开发利用。
[0004] 传统栽培条件下，白及以分株繁殖为主，其繁殖速度慢，繁殖系数极低，且容易导致病害的积累和传播，难以适宜现代种植的需要。而白及果荚中
种子数量大，但因为种子结构特殊，自然条件下难以萌发，所以白及种苗稀缺成为其规模化发展的
瓶颈。而随着
生物技术的发展，白及组培技术得到了较快发展，一般都经过无菌
播种、丛生苗培养、壮苗培养、生根培养等多个环节，并耗工、耗时，通常情况下组培苗鳞茎分化率不高，组培苗的移栽成活率也不高，从而较大程度的影响了白及组培苗的生产应用。所以如何简化组培环节，减少成本，促进鳞茎的分化、快速生长成为影响组培苗移栽成活率及生产应用的重要因素。
[0005] 201110119312.0也公开了一种培养器皿内制备白及假鳞茎的方法及其专用培养基，其介绍了以白及种子为外植体的专用培养基，由种子萌发培养基，假鳞茎诱导培养基，假鳞茎增殖培养基和假鳞茎生根培养基组成。其每一个步骤需要一个特定的培养基，其培养方式如上所述具有耗工、耗时等
缺陷。
发明内容
[0006] 针对现有白及鳞茎组培技术的缺陷，本发明的目的在于提供一种快速诱导白及鳞茎的专用培养基及组培方法，所述方法操作简单，生产成本低，并且效果稳定。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 1、一种快速诱导白及鳞茎的专用培养基，所述专用培养基由白及种子萌发培养基和鳞茎高效诱导及壮苗培养基组成，其中：
[0009] 所述白及种子萌发培养基的配方为：1/2MS，NAA0.1mg/L，GA30.1mg/L，琼脂6.5～7.0g/L，白糖20g/L，pH5.8～6.0；所述和鳞茎高效诱导及壮苗培养基的配方为：1/2MS，NAA0.5～0.6mg/L，6-BA0.6～0.8mg/L，PP3330.4～0.5mg/L，白糖30～45g/L，香蕉泥25～
40g/L，
活性炭0.1g/L，pH5.8-6.0。
[0010] 优选的，所述鳞茎高效诱导及壮苗培养基的配方为：1/2MS，NAA0.6mg/L，6-BA0.8mg/L，PP3330.5mg/L，白糖40g/L，香蕉泥25g/L，活性炭0.1g/L，pH5.8-6.0。
[0011] 2、一种快速诱导白及鳞茎的组培方法，其特征在于，包括如下步骤：
[0012] 1)白及种子的消毒灭菌：将未开裂的白及种子用
质量分数为75％的酒精涂洗表面1-3min，然后在超净
工作台上将果荚置于0.1％的升汞中浸泡15～20min，再用无菌
水冲洗3～5次，无菌
滤纸吸干表面水分以备接种；
[0013] 2)在无菌工作条件下，将步骤1)消毒灭菌的白及种子接种到
权利要求1所述的种子萌发培养基中培养；
[0014] 3)当步骤2)所述白及种子萌发苗高0.8～1.2cm时转接至权利要求1所述的鳞茎高效诱导及壮苗培养基中培养。
[0015] 进一步优选的，步骤2)的培养条件为：光照1500～2000Lx，10～12h/天；
温度，24～28℃。
[0016] 进一步优选的，步骤3)的培养条件为：光照1500～2000Lx，12～15h/天；温度，24～28℃。
[0017] 进一步，上述方法中所述白及种子的采集及贮藏方法为：采集9-10月白及成熟、饱满果荚置于阴凉通
风的地方，摊凉2～3周；待果荚表皮变为浅棕色时，将果荚装于
牛皮纸袋中保存在
冰箱4℃冷藏室中，可保证白及组培苗周年生产所用。
[0018] 本发明中所用的NAA为
萘乙酸，GA3为赤霉素，6-BA为6-苄
氨基腺嘌呤，PP333为多效唑，
试剂均为分析纯，水为超纯水。
[0019] 本发明的有益效果在于：本方法以促进种子快速萌发为第一阶段培养，然后采用高效培养基，即以促进快速分化的
激素6-苄氨基腺嘌呤，调节根分化、生长的萘乙酸，以及调节植物激素平衡、提高抗逆性的多效唑，三种激素为配方，筛选适宜的浓度和比例，使其较好的调控白及组培假苗鳞茎、茎叶、根的分化和生长；并加入浓度适宜的营养原—白糖和香蕉泥，有效的促进了鳞茎的快速生长，而适当的活性炭能较好的促进根的生长，并能有效
吸附白及生长中产生的一些毒素。所以，该培养方法简化了白及假鳞茎组培苗的生产环节，集诱导假鳞茎、假鳞茎快速生长及生根壮苗培养于一步完成，从种子到移栽所需时间为90天内，缩短了培养时间，提高了假鳞茎分化率，促进了假鳞茎的快速生长，提高了组培苗的移栽成活率。
附图说明
[0020] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
[0021] 图1为一株白及假鳞茎的直径测试图；
[0022] 图2白及假鳞茎的株高测试图；
[0023] 图3白及假鳞茎的株高测试图；
[0024] 图4为一个培养皿培养60天后的白及假鳞茎生长情况；
[0025] 图5为移栽20天后的生长情况。
具体实施方式
[0026] 下面将结合附图，对本发明的优选
实施例进行详细的描述。
[0027] 以下实施例采用的是成熟未开裂的白及蒴果(采于重庆市药物种植研究所实验基地)，果荚保存方法，于8-10月采集微黄的果荚在室内
通风处晾5-10天，待果荚表皮变为浅棕色时，放入牛皮纸信封中，置于4℃冰箱保鲜室内，该方法能有效保存种子活
力并便于周年的生产。培养基在121℃条件下高压灭菌17min，备用。
[0028] 以下实施例中所用的种子果荚均按以下方式消毒及接种：将未开裂的果荚流水洗净，用75％的酒精涂洗表面1～3min，然后在超净工作台上将果荚置于质量分数为0.1％的升汞中浸泡15～20min，然后用无菌水冲洗3-5次，无菌滤纸吸干表面水分以备接种，在接种盘中将消毒过的果荚用无菌
剪刀剪开小口，以无菌接种环蘸取种子均匀的涂在萌发培养基上。
[0029] 白及无菌萌发培养基的筛选
[0030] 按照表1所示的配方设计，对白及种子无菌萌发进行观测，培养条件为：光照1500--2000Lx，10-12h/天；温度，24--28℃。4周时统计白及萌发苗高、根毛情况如表2所示：
[0031] 表1：白及无菌培养基的配方设计
[0032]
[0033] 表2：不同萌发培养基上白及种子萌发生长情况
[0034]
[0035] 从表2可以看出，在培养条件相同的条件下1/2MS较MS培养效果好，而几种培养基对比发现，(4)培养基配方在萌发启动，小苗生长方面优势明显，所以较为适宜白及快速萌发需要，较优的萌发培养基配方为：1/2MS+NAA0.1mg/L+GA30.1mg/L+白糖20g/L。
[0036] 鳞茎高效诱导及壮苗培养基筛选
[0037] 将高0.8～1.2cm的鳞茎转接到表3列举所示的培养基中进行转接培养，培养条件为pH5.8-6.0；光照1500--2000Lx，12-15h/天；温度，24--28℃；对对各个培养基的鳞茎生长情况进行观测及统计，记录于表4。
[0038] 表3鳞茎高效诱导及壮苗培养基配方设计
[0039]
[0040]
[0041] 表4鳞茎高效诱导、壮苗培养基筛选情况
[0042]
[0043] 由表4可看出，A配方根生长旺，影响了鳞茎的分化及生长；H培养基因多效唑浓度较高，出现分孽明显，而鳞茎、植株生长都受到抑制；D、E、F配方，根生长良好，但鳞茎分化和长势较差，分化较多纤细的小苗；B、C、G配方，因6-BA、PP333的浓度和配比较为适宜，其鳞茎分化及长势较好，其中以C配方在鳞茎诱导分化、鳞茎生长、壮苗方面效果最显著，所以适宜白及鳞茎高效诱导、壮苗培养的配方为1/2MS，NAA0.6mg/L，6-BA0.8mg/L，PP3330.5mg/L，白糖40g/L，香蕉泥25g/L，活性炭0.1g/L。
[0044] 进一步将表4培养而成的组培苗(转接60天)进行移栽，开瓶炼苗1周，移栽到
覆盖腐殖土3-5cm的垄上，并注意遮阴和保湿，移栽20天时统计成活率及长势，记录于表5所示：
[0045] 表5：移栽苗的成活率统计
[0046]
[0047]
[0048] “_”表示长势差，“+”表示长势较好。
[0049] 从表5可以看出，C配方的移栽苗生长势及生根情况较好。
[0050] 实施例1白及鳞茎快速诱导组培方法
[0051] 步骤1：果荚要求，采用变浅棕色、成熟白及果荚，常规保存的果荚极容易感染杂菌和破裂，无法满足白及组培苗周年生产所需，采用牛皮纸包住于冰箱冷藏是4℃保存；
[0052] 步骤2：将未开裂的果荚用70％的酒精涂洗表面1-3min，然后在超净工作台上将果荚置于质量分数为0.1％的升汞中浸泡15--20min，再用无菌水冲洗3--5次，无菌滤纸吸干表面水分以备接种；在超净工作台上，将消毒过的果荚用无菌剪刀剪开小口，用无菌接种环蘸取种子均匀的涂在高温灭菌的培养基上，培养基配方为1/2MS+NAA0.1mg/L+GA30.1mg/L+琼脂粉6.5-7.0g/L+白糖20g/L，pH5.8-6.0；培养条件为，培养条件为光照1500--2000Lx，10-12h/天；温度，24--28℃，培养4周左右，得到带1-2片小叶，株高0.8-1.2cm的小苗；
[0053] 步骤3：进行转接培养，培养基配方1/2MS+NAA0.6mg/L+6-BA0.8mg/L+PP3330.5mg/L+白糖40g/L+香蕉泥25g/L+活性炭0.1g/L，pH5.8-6.0，经灭菌后用；该培养基为白及假鳞茎诱导、快速生长，生根的壮苗培养基；培养条件：光照1500--2000Lx，12-15h/天；温度，24--28℃；在转接培养基上，假鳞茎诱导及快速生长观察：转接苗在假鳞茎高效培养基上，经过
2-3周培养，小的假鳞茎已经分化，4-5周时统计，鳞茎分化率在90％以上，且假鳞茎生长快速；到8周时，假鳞茎直径大于0.4cm的为90％以上，株高6-10cm,根须发达；图1为一株白及假鳞茎的直径测试图，从图1可看出其直径达到9.41mm，图2、图3为两株白及假鳞茎的株高测试图，图4为一个培养皿培养60天后的白及假鳞茎生长情况。
[0054] 步骤4：炼苗、移栽，将培养苗从培养室中移到常温环境下开瓶炼苗1周，洗净，定植到移苗地的箱面上，浇上定根水，并用遮阳率40-60％的
遮阳网遮阳，每3-5天浇水1次，保持湿度。30天左右，新根及新叶长出，统计成活率，图5为移栽20天后的生长情况。用以上方法培养，分别于2017年3月25日、2017年4月22日、2017年5月20日、2017年6月22日出苗移栽，成活率统计如下表6：
[0055] 表6：实施例1的组培苗的移栽成活率
[0056]
[0057]
[0058] 由表6可以看出，各日期移栽的株苗成活率均在85％以上，而且生长快速；而5月份，以腐殖土70％+珍珠岩30％为覆盖土上移栽成活率最好。
[0059] 进一步将实施例1所述白及鳞茎组培方法与现有方法进行对比，得到如表7所示的结论：
[0060] 表7现有方法与实施例1所述方法的比对
[0061]
[0062] 表中“——”表示无
[0063] 由表7可进一步反应出，本方法简化了白及假鳞茎组培苗的生产环节，诱导假鳞茎、促进假鳞茎快速生长，以及生根壮苗培养在同一步完成，从种子到移栽所需时间为90天内，缩短了培养时间，提高了假鳞茎分化率，促进了假鳞茎的快速生长，提高了组培苗的移栽成活率。
[0064] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
