一种可同时积累油脂和分泌氨基酸的微藻及其应用
阅读：617发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种可同时积累油脂和分泌氨基酸的微藻及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种能同时积累油脂和分泌 氨 基酸的微藻，所述微藻于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M 2016673；还涉及所述微藻在生产微藻藻油和氨基酸中的应用；还涉及一种利用FGFS培养上述微藻以生产微藻藻油和氨基酸的方法。本发明的微藻能够将培养基中的无机氮转 化成 有机氮，从而有效提高了对培养基中的无机氮的去除速率，同时又提高了藻培养物的产品附加值。可将微藻积累的油脂提取用做 生物 柴油 ，也可将藻细胞与培养液中的氨基酸一起用于制备 饲料 的用途。藻细胞中的不饱和 脂肪酸 和培养液中氨基酸也可提取用于制备食品、 营养品 或药品的用途。，下面是一种可同时积累油脂和分泌氨基酸的微藻及其应用专利的具体信息内容。
1.一种利用FGFS培养微藻以生产微藻藻油和氨基酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：将所述FGFS作为氮源添加至BG11培养基中培养所述微藻，使所述微藻积累油脂并分泌氨基酸；
S2：培养结束后，从所述微藻培养物收集藻细胞和无细胞培养液；
S3：从所述藻细胞中提取微藻藻油，从所述无细胞培养液中提取氨基酸；
所述微藻为2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M
2016673的微藻；
S1包括以下步骤：
S11：将所述微藻接种于装有含有FGFS的BG11培养基的透光容器中，所述BG11培养基中还含有有机碳源，所述FGFS的起始浓度20-30g/L，所述有机碳源为葡萄糖，起始浓度为1-
3g/L；
S12：进行培养，得到微藻培养物，培养过程中控制培养条件，所述培养条件包括光暗周期以及所述微藻培养物的pH值，实时监测和调节所述微藻培养物的pH值，将所述pH值控制为6.0-7.0，所述光暗周期为持续12小时光照和12小时黑暗交替。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养过程中，将所述微藻培养物中的溶解氧控制为不低于5％。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，通过向所述微藻培养物中通空气并搅拌所述微藻培养物来控制溶解氧，通空气的速率为0.8vvm，搅拌速率为150-500r·min-1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，培养过程中，光照时光量子通量密度保持为112-118μmol photon m-2·s-1，培养温度保持为25-30℃。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，S1的培养时间为10-16天。
一种可同时积累油脂和分泌氨基酸的微藻及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及环保和生物能源领域，更特别地，涉及一种能同时积累油脂和分泌氨基酸的微藻；还涉及所述微藻在生产微藻藻油和氨基酸中的应用，或在制备饲料、食品或药物中的应用；还涉及一种利用FGFS培养上述微藻以生产微藻藻油和氨基酸的方法。
背景技术
[0002] 化石能源的燃烧所排放的烟道气包含超过100种不同的成分，由于燃烧过程需要空气参与，其中含氮成分超过70％。燃烧过程中，会有少量氮气被氧化为有害废气氮氧化物NOx，而这些废气是法律规定必须限制排放的，排放之前必须经过达标处理。NO在NOx中占比超过95％，水溶性很低，并且在空气中能被氧化为NO2；NO和NO2都是NOx中的主要成分，能引发一系列的环境问题，包括光化学烟雾，酸雨，并且能形成雾霾中的悬浮颗粒，破坏平流层臭氧层，加速全球气候变暖。此外，空气中的NO和NO2能对人体健康产生不利影响。因此，高效低成本的脱硝(DeNOx)技术也是全球许多国家和地区所亟需的，尤其是在中国那些牺环境而引入高能耗高排放产业以快速发展经济的地区。
[0003] 常规NOx处理工艺，如物理脱硝法，主要包括选择性催化还原法(SCR)和选择性催化氧化法(SCO)，成本高并且/或者会产生二次污染，还需要进一步的处理才能排放。SCR是利用氨气作为还原剂，脱硝效果超过95％，从而成为常规NOx处理工艺中应用最广的方法。然而，氨气变为气态时是易燃的，增加了操作设备的危险性。其他处理方法，如湿法氧化脱硝，吸收法，洗涤法都成本高昂或者会产生二次污染而需要进一步处理。
[0004] 微藻由于能生产多种实际的和潜在的代谢产物，而成为一种生物原材料，如提供食品、药物成分、油脂、酶、生物质、多聚物、毒物和色素等。并且氮元素含量约占微藻总生物量10％，基于微藻的生物脱硝(bio-DeNOx)成为用于一种极具潜力的烟道气处理方法。
[0005] 然而，微藻培养是一个昂贵的过程，由于需要大量的水，无机盐成分(主要是氮和磷酸盐(P))，以及CO2。
[0006] 有研究显示，使用100-300ppm(v/v)的NO模拟烟道气中的NOx，多种微藻对NOx的去除率能达到50-90％。但是，高NOx去除率的能力取决于较低的NOx流量和较高的生物量浓度(0.7-1.5g·L-1细胞干重)，这使得微藻难以进行工业化应用。对于利用微藻去除NOx，烟道气中的NOx首先溶解于水相中，之后NOx被氧化和被微藻细胞所吸收。但是NOx中的主要成分NO，是微溶于水的。NO在微藻培养液中的溶解性也被认为是微藻处理NOx的限速步骤。
[0007] 将微藻产藻油与废水及烟道气处理相结合，能同时解决环保和能源的问题，使成本略有降低。同时在培养过程中能够得到附加值更高的产品，以提高成本效率和经济效益。
[0008] 因此，首先需要一种既具有脱硝能力又具有合成油脂能力并且生长速度快，适于大规模培养的藻种，这样的藻株在生长和积累油脂过程中最好还能分泌高附加值的产品。
发明内容
[0010] 基于以上发现，本发明提供了一种能同时积累油脂和分泌氨基酸的微藻，所述微藻于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2016673。
[0011] 本发明还提供了上述微藻在利用FGFS进行积累油脂和分泌氨基酸中的应用。
[0012] 本发明还提供了一种利用FGFS培养上述微藻以生产微藻藻油和氨基酸的方法，其包括以下步骤：
[0013] S1：将所述FGFS作为氮源添加至BG11培养基中培养上述微藻，使所述微藻积累油脂并分泌氨基酸；
[0014] S2：培养结束后，从所述微藻培养物收集藻细胞和无细胞培养液；
[0015] S3：从所述藻细胞中并提取微藻藻油，从所述无细胞培养液中提取氨基酸。
[0016] 进一步地，S1包括以下步骤：
[0018] S22：进行培养，得到微藻培养物，培养过程中控制培养条件，所述培养条件包括光暗周期以及所述微藻培养物的pH值，实时监测和调节所述微藻培养物的pH值，将所述pH值控制为6.0-7.0。
[0019] 优选地，所述FGFS的起始浓度20-30g/L。
[0020] 优选地，培养过程中，所述有机碳源为葡萄糖，起始浓度为1-3g/L。
[0021] 优选地，培养过程中，将所述微藻培养物中的溶解氧控制为不低于5％。
[0022] 优选地，通过向所述微藻培养物中通空气并搅拌所述微藻培养物来控制溶解氧，通空气的速率为0.8vvm，搅拌速率为150-500r·min-1。
[0024] 优选地，S1中培养时间为10-16天。
[0025] 本发明的微藻能够将培养基中的无机氮转化成有机氮，从而有效提高了对培养基中的无机氮的去除速率，同时又提高了藻培养物的产品附加值。可将微藻培养过程中积累的油脂提取用做生物柴油，也可将藻细胞与培养液中的氨基酸一起用于制备饲料的用途。藻细胞中的不饱和脂肪酸和培养液中氨基酸也可提取用于制备食品、营养品或药品的用途。
[0026] 微生物保藏
[0027] 本发明所述涉及的微藻从野外采集的水样分离得到，经18S rDNA测序鉴定，该微藻属于绿藻门小球藻属。该微藻已于2016年11月24日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2016673，拉丁学名为Chlorella sp.C2。附图说明
[0028] 图1为小球藻Chlorella sp.C2的光学显微镜照片；
[0029] 图2为小球藻Chlorella sp.C2在不同pH值下培养的生物量变化统计图；
[0030] 图3为小球藻Chlorella sp.C2在不同的初始FGFS浓度下的生物量变化统计图；
[0031] 图4为小球藻Chlorella sp.C2在不同的初始FGFS浓度下的培养16天后无细胞培养液中的总氨基酸浓度统计图；
[0032] 图5为小球藻Chlorella sp.C2在不同的初始FGFS浓度下的培养16天后藻细胞含油率的统计图；
[0033] 图6为小球藻Chlorella sp.C2在不同的初始葡萄糖浓度下的生物量变化统计图。
具体实施方式
[0034] 以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0035] 1.小球藻Chlorella sp.C2的获得
[0036] 本发明的小球藻Chlorella sp.C2通过从野外采集的含藻水样分离得到，其细胞形态如图1所示，细胞成圆形或椭圆形，绿色，无鞭毛，有核，并且养到后期在细胞内积累脂滴。经18S rDNA测序鉴定，该微藻属于绿藻门小球藻属。该微藻已于2016年11月24日保藏于中国湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO:M2016673，拉丁学名为Chlorella sp.C2。
[0037] 2.培养条件的优化
[0038] 1)接种培养准备
[0039] 小球藻Chlorella sp.C2首先进行自养培养，当微藻培养液在700nm下的光密度(OD700)达到0.8时，取2mL微藻培养液接入到含有1g·L-1葡萄糖的1L培养基中。第3天，兼养培养的小球藻处于对数生长期，此时OD700约为9，2000g离心5min收集。小球藻沉淀用灭菌水洗两次，离心参数是2000g和5min。洗涤后的小球藻即可用于扩大培养。
[0040] 2)培养流程和培养条件的优化
[0041] 在进行培养之前，5L规格(BIOTECH-5GG/2002)和50L规格(BIOTECH-50BSG/3000PLC)的圆柱式光生物反应器(生产商：中国上海保兴生物工程设备有限公司)的内壁经过清洗，然后校准pH和溶氧传感器。5L规格的光生物反应器在灭菌锅内进行121℃灭菌
30min。50L规格的光生物反应器采用通蒸汽进入反应器灭菌，反应器内部维持121℃达
30min。
30min。50L规格的光生物反应器采用通蒸汽进入反应器灭菌，反应器内部维持121℃达
30min。
[0042] 接种之前，提前将反应器内温度调至28.0±0.5℃。准备完毕之后，所有接种操作和培养基组分添加均为无菌操作，需要在超净台和/或点燃的接种火环上进行。
[0043] 初始接种量以OD700计算，为1.0±0.1。初始培养阶段，搅拌速率设置为150r·min-1，光照由环绕在反应器周围的发光二极管LED灯提供，光量子通量密度为115±3μmol photon m-2·s-1，LED灯与罐体有约0.03m的距离，采用风扇进行散热。
[0044] 在培养过程中，严格执行各项操作，保证无菌。采用经0.22μm孔径滤器过滤-10.01g·L 氯霉素Chloromycetin，添加到培养基中防止染菌。
[0045] 对培养超过10天的微藻培养液进行采样，样品在超净工作台内用灭菌水进行适当稀释，涂布于BG11固体培养基培养皿和LB固体培养基培养皿上，分别在约50μmol photon m-2·s-1光照下28℃中培养24h以上，和37℃培养箱内无光照培养24h以上，以BG11培养基上长出绿色藻且LB培养基无菌落长出视为无菌。
[0046] 采用以硝酸盐为氮源的常规BG11进行培养来优化培养条件，逐一进行优化，以期达到最高生长速率。
[0047] 采用优化的培养条件后，开始在5L光生物反应器内用以烟道气固定氮盐为氮源的培养基进行微藻培养。通过自动调整搅拌速率将溶氧维持在5％以上，且搅拌速率的上限设为500r·min-1。
[0048] a.pH的优化：培养过程中用乙酸实时调控培养物中的pH，分别将pH值控制为6.0和7.0，培养结果如图2所示，该小球藻在pH控制在6.0和7.0下生长都很快，在以后的实验中，均选择pH 7.0在进行条件优化。
[0049] b.FGFS浓度优化：培养基中分别添加FGFS，浓度分别调节为5、10、15、20、25、30g/L，在pH 7.0下进行培养，观察生长状况。结果如图3所示，藻株在15-25g/L的FGFS浓度下生长较快，在低浓度的FGFS下生长较慢。因此，本发明的藻株比较适应高FGFS浓度。
[0050] 在培养16天后，将藻细胞从培养液中分离，检测无细胞培养液中的氨基酸浓度和藻细胞含油率。
[0051] 无细胞培养液的氨基酸浓度如图4所示，当FGFS浓度在20-30g/L时，胞外总氨基酸含量较高。可见，在这个FGFS浓度范围内更有利于藻细胞分泌氨基酸。
[0052] 藻细胞含油率如图5所示，随着FGFS浓度升高，藻细胞含油率略有降低，但是降低幅度不大，考虑到氨基酸的附加值更高，将培养基中FGFS浓度调节在20-30g/L范围内为最佳。
[0053] c.葡萄糖浓度的优化：培养基中的葡萄糖浓度分别调节为1、2、3、4、5g/L，在pH 7.0，FGFS浓度为20g/L下进行培养，观察生长状况。结果如图6所示，藻株在1-5g/L的葡萄糖浓度下生长均良好，并且在1-3g/L生长较快。因此，本发明的藻株比较适应1-3g/L的葡萄糖浓度。
[0054] 作为附加值产品，以烟道气中的氮氧化物制备的氮盐为氮源获得的生物质，提取的总脂使用高效液相色谱(HPLC，high-performance liquid chromatography)分析其脂肪酸。脂肪酸的主要组分是C14-C20，其中C16和C18占比超过60％，其中不饱和脂肪酸占总脂含量的20％左右。即使将培养规模从5L规格光生物反应器扩大到50L规格光生物反应器，尽管除光量子通量密度降低外，其他培养条件控制到一致，但是培养环境可能会由于细胞对光和培养基组分利用的下降而改变，最终导致脂肪酸组分和油脂产量的差异。
[0055] 相对于工业烟道气脱硝，微藻生物脱硝的实际可行性取决于整体NOx的去除能力和处理方法。早前一些学者的研究表明，基于微藻的生物脱硝具有巨大潜力，但都遭遇了一个严重的障碍，那就是NOx在液体生长培养基中的溶解度低。与其直接向培养基中通入NOx，不如通入NOx固定液变成氮盐。本发明提供了一种既能脱除培养环境中的硝酸盐和亚硝酸盐又能在细胞内积累油脂的小球藻Chlorella sp.C2，在逐步优化培养条件和操作流程后，扩大到50L规格的光生物反应器能使氮去除率达到96.10±2.11％，氮消耗速率达到0.45±-1 -10.013g·L ·d ，充分证明了小球藻Chlorella sp.C2在工业烟道气生物脱硝的应用价值。
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