苦木生物碱作为吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂的用途
阅读：1035发布：2020-05-19
专利汇可以提供苦木生物碱作为吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂的用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了天然苦木 生物 碱 或其药学上可接受的盐作为IDO 抑制剂 的用途。苦木生物碱或其药学上可接受的盐作为IDO抑制剂，可用于制备 预防 和/或 治疗 由IDO过活化介导的色 氨 酸代谢途径的病理学特征 疾病 的药物、食品、保健品、 食品添加剂 或 营养补充剂 ，这些疾病选自癌症、 抑郁症 、阿尔兹海默症和帕金森症中的一种或多种。，下面是苦木生物碱作为吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂的用途专利的具体信息内容。
苦木生物碱作为吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂的用途
技术领域
[0001] 本发明属于医药应用领域，涉及苦木生物碱或其药学上可接受的盐的医药用途，尤其涉及苦木生物碱或其药学上可接受的盐作为IDO抑制剂的用途。
背景技术
[0002] 吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)是一种细胞内含亚铁血红素的酶，是人体肝外色氨酸代谢限速酶，可催化色氨酸分子中吲哚环氧化裂解，沿犬尿酸途径分解代谢。作为一种免疫调节酶，IDO与多种与色氨酸缺失密切相关的疾病发生有关，包括癌症、抑郁症、阿尔兹海默症、帕金森症、自身免疫性疾病等。
[0003] IDO在肿瘤微环境中可被肿瘤细胞、树突状细胞(DC)、巨噬细胞(MФ)、内皮细胞(EC)以及成纤维细胞(FB)等多种细胞高表达，导致局部色氨酸代谢异常及调节性T细胞形成，对T细胞的增殖、分化和活性产生影响，进而介导肿瘤局部的T细胞免疫耐受，在恶性肿瘤发生、发展和转移过程中发挥重要作用(Yeung AW,et al.Clin.Sci.,2015,129:601-672)。临床研究亦发现，癌症患者治愈后不良往往与IDO表达量上调密切相关(Pan K,et al.J Cancer Res.Clin.2008,134:1247-1253)，IDO因此被认为是癌症免疫治疗的关键机制之一，并成为新型抗癌药物设计的重要靶标。
[0004] IDO的过活化，使色氨酸沿犬尿酸途径分解代谢产生的喹啉酸水平上调，该通路代谢异常与神经系统炎症和神经退行性疾病的发生密切相关，例如阿尔兹海默症(AD)、帕金森症、抑郁症等。AD患者大脑中IDO含量比正常人丰富，IDO和喹啉酸在AD患者海马体皮质层的小胶质细胞、星形细胞及神经元细胞中均有表达，在老年斑周围的小胶质细胞、星形细胞中含量最高(Guillemin,G.J.et al.Neuropath.Appl.Neuro.,2005,31:395-404)。高表达IDO引起的色氨酸耗竭也降低了5-羟色胺的产生，与诸如喹啉酸的具有神经活性的犬尿氨酸代谢物的蓄积相结合，引起中枢特定部位的神经元病变，导致神经病学、精神病学病症的发生，而且是多种心境障碍以及一些慢性病相关症状的因素，例如AD、抑郁症、获得性免疫缺陷综合症等(Schroecksnadel K.,et al.,Clin.Exp.Immunol.,2005,140:41-45)。
[0005] 苦木科植物苦木Picrasma quassioides(D.Don)Benn是一种落叶小乔木，广泛分布在我国华南地区，其干燥枝、叶、茎皆可入药，具有清热、解毒、祛湿的功效，为历版《中国药典》收载。苦木含有多种生物碱成分，现已分离、鉴定生物碱类化合物近百种，均为来源于色氨酸的吲哚生物碱，涉及β-咔巴啉、铁屎米酮及二聚体的骨架结构。研究表明，苦木生物碱具有抗炎、抗菌、抗肿瘤等药理活性，是苦木清热、解毒的重要功效成分(Jiao W.H.,et al.,Chem.Pharm.Bull.,2011,59:359-364；Lai Z.Q.,et al.,Chem.Nat.Compd.,2014,50:884-888.)。
[0006] 迄今未见苦木生物碱作为IDO抑制剂应用的相关报道。
发明内容
[0007] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种苦木生物碱作为IDO抑制剂的应用。
[0008] 本发明所述的苦木生物碱包括天然苦木生物碱或其药学上可接受的盐。
[0009] 优选的苦木生物碱为1-甲酸-β-咔巴啉，其结构式为：
[0010]
[0011] 本发明所述的苦木生物碱包括苦木生物碱可以采用药学公知的制剂技术，加入药学上可接受的辅料，制成供口服、黏膜、注射或外用的制剂。
[0013] 图1为实施例1的1-甲酸-β-咔巴啉的抑制作用可逆性分析图。
[0014] 图2为实施例1的1-甲酸-β-咔巴啉的抑制剂类型分析图。
具体实施方式
[0015] 为了便于理解本发明，特列举实施例，以进一步诠释本发明，而不是对本发明的任何方式的限制。
[0016] 下述实施例中所使用的实验操作方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
[0017] 选用IDO竞争性抑制剂1-甲基色氨酸为参照。
[0018] 实施例1体外活性筛选及评价
[0019] 建立IDO生物活性检测体系，以体外重组纯化的IDO为研究模型，酶反应动力监测法测定苦木生物碱对IDO的抑制活性，计算Ki及IC50值，并针对活性化合物进一步考察抑制类型。实验研究的6种苦木生物碱化合物具有不同的结构骨架，化学结构如下：
[0020]
[0021] 1、IDO抑制活性检测
[0022] 反应条件：将100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素，200μg/mL过氧化氢酶，20μM亚甲基蓝，300mM底物L-色氨酸和100mM待测样品混合，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入IDO酶，反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸200μL使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酞犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm离心10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应生成的黄色产物可使用酶标仪在492nm检测。
[0023] 结果：对6种具有不同化学结构的生物碱与IDO的亲和力进行评估，包括3种β-咔巴啉型和3种铁屎米酮型。如表1所示，在相同的终浓度下，与阳性对照1-甲基色氨酸相比，所有的铁屎米酮型生物碱显示出较低的抑制作用，而三种β-咔巴啉型生物碱表现出显着较高的IDO抑制活性，尤其是在C-1处具有羧基取代的生物碱1-甲酸-β-咔巴啉具有最强的抑制作用。
[0024] 表1.苦木生物碱对IDO的抑制作用
[0025]
[0026]
[0027] 2、抑制作用可逆性分析
[0028] 在固定抑制剂浓度的情况下，用一系列不同浓度的酶与1-甲酸-β-咔巴啉反应并测定反应速度。以反应速度对酶浓度(v～[E])作图，根据曲线的特征可以判定1-甲酸-β-咔巴啉是否为可逆抑制剂。
[0029] 反应条件：在500μL的反应体系中，先加入100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素，200μg/mL过氧化氢酶，20μM亚甲基蓝，300mM底物L-色氨酸，同时加入100mM抑制剂，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内分别加入不同体积的IDO酶(加入酶的体积分别为1、2、5、8、10μL)，反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸200μL使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酞犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm离心
10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在492nm观测。根据酶动力学图确定是否为可逆抑制剂类型。
10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在492nm观测。根据酶动力学图确定是否为可逆抑制剂类型。
[0030] 如图1测试结果可知，加入抑制剂所得的曲线与不加抑制剂的曲线可在延长线上相交，斜率较低于不加抑制剂的曲线，即表示加入的抑制剂为可逆抑制剂，而不可逆抑制剂得到的是平行右移于不加抑制剂的曲线，因此，上述结果表明1-甲酸-β-咔巴啉为可逆抑制剂。
[0031] 3、抑制类型分析
[0032] 反应条件：在500μL的反应体系中，先加入100mM磷酸钾缓冲液(pH 6.5)，40mM维生素，200μg/mL过氧化氢酶，20μM亚甲基蓝，300mM底物L-色氨酸，在不同底物浓度下(100、200、300μM)，加入不同浓度的抑制剂(10、20、30、40、50μM)，混合液37℃保温5分钟，再向上述混合液内加入5μL的IDO酶(约10nM)，反应在37℃下进行30分钟，加入30％(w/v)三氯乙酸
200μL使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酞犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm离心10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在492nm观测。以Dixon作图法，以底物与反应速度的比值对抑制剂浓度(S/v～[i])作图判定生物碱的抑制剂类型，以反应速度的倒数对抑制剂浓度(1/v～[i])作图，可以得到抑制剂的Ki值。IC50值由软件拟合求出。
200μL使反应终止，反应体系在65℃加热15分钟，使之完成从甲酞犬尿氨酸到犬尿氨酸的转化，然后12000rpm离心10分钟，取上清与等体积2％(w/v)对-二甲氨基苯甲醛的乙酸溶液混合，犬尿氨酸与之反应产生的黄颜色可使用酶标仪在492nm观测。以Dixon作图法，以底物与反应速度的比值对抑制剂浓度(S/v～[i])作图判定生物碱的抑制剂类型，以反应速度的倒数对抑制剂浓度(1/v～[i])作图，可以得到抑制剂的Ki值。IC50值由软件拟合求出。
[0033] 图2结果可知，[S]/[v]～[i]作图下，随着底物浓度的增大，斜率不变，表明1-甲酸-β-咔巴啉为IDO的竞争性抑制剂。[1]/[v]～[i]作图下的曲线交点的横坐标的数值即为Ki值，表明1-甲酸-β-咔巴啉抑制作用的Ki和IC50值分别为9.4μM和32μM。
[0034] 实施例2体内活性评价
[0035] 针对体外筛选活性化合物，以肿瘤小鼠为研究模型，考察苦木生物碱对肿瘤生长的影响，HPLC检测血清中犬尿氨酸与色氨酸比值从而反映IDO活性的变化，筛选获得高效低毒的新型IDO抑制剂候选药物。
[0036] 1、1-甲酸-β-咔巴啉对肿瘤生长抑制作用研究
[0037] 取对数生长期的人肺癌A549细胞，细胞计数后装入50mL离心管中，重悬于50％PBS缓冲液(pH 7.4)及50％Matrigel中，调整细胞浓度至8×107细胞/mL，吹打细胞，使其分散均匀。吸取细胞悬液，注射到健康雌性Balb/C裸鼠前右侧乳腺脂肪垫，每只动物接种150μL(1.2×107细胞/mL只)。选取肿瘤直径达5mm、大小均匀、生长良好的荷瘤鼠30只，分成三组，每组10只。分别口服给予羧甲基纤维素钠(0.5％CMC)、1-甲酸-β-咔巴啉(200mg/kg)、1-甲基色氨酸(200mg/kg)，给药持续14天。于给药结束后称量体重，处死全部动物，剥取肿瘤，称重，计算肿瘤体积和肿瘤抑制率。其中，肿瘤体积按(长径×短径2)/2计算。
[0038] 如表2所示，1-甲酸-β-咔巴啉可以缩小肿瘤体积，减小肿瘤重量，而不会对体重产生明显变化，1-甲酸-β-咔巴啉的抗肿瘤效果优于1-甲基色氨酸。
[0039] 表2.苦木生物碱对肿瘤生长的抑制作用
[0040]
[0041]
[0042] 2、血清中犬尿氨酸与色氨酸检测
[0043] IDO活性可用犬尿氨酸与色氨酸的比值来反映。应用HPLC检测实验小鼠血清中犬尿氨酸(Kyn)与色氨酸(Trp)的含量，以间接反映各组小鼠血清的IDO活性。
[0044] 给药结束后取各组小鼠血清，4℃过夜，3000rmp离心15min后取上清，与5％高氯酸等体积混合后静置10min，12000rmp离心10min取上清，用0.45μm滤头过滤，4℃保存。HPLC测定条件包括：C18色谱柱，乙腈-水(15mM乙酸-乙酸钠)7：93(v/v)混合溶剂体系等度洗脱，流速1ml/min，检测波长225nm。
[0045] 由于IDO能催化底物Trp代谢生成产物Kyn，故Kyn/Trp比值可以反映IDO活性。如表3所示，空白赋形剂组小鼠血清内IDO活性高于其余两组。结果表明：1-甲酸-β-咔巴啉与1-甲基色氨酸可以降低血清内IDO活性，1-甲酸-β-咔巴啉的效果优于1-甲基色氨酸。
[0046] 表3.苦木生物碱对小鼠血清内IDO活性抑制作用
[0047]
[0048] 通过实施例1和2的体外、体内活性评价显示，1-甲酸-β-咔巴啉相比1-甲基色氨酸对吲哚胺-2,3-双加氧酶具有更优的抑制效果，并且体内活性试验也表明1-甲酸-β-咔巴啉可为吲哚胺-2,3-双加氧酶抑制剂，具备良好的成药性。
[0049] 分析原因在于苦木生物碱通过竞争性抑制IDO与底物色氨酸结合发挥IDO抑制作用，进一步分析在于在吡啶环上C-1存在羧酸取代的β-咔巴啉是苦木生物碱发挥IDO抑制作用的药效团。
[0050] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内的等同变换均属于本发明的保护范围。
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