一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法与应用
专利汇可以提供一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种新型CpGISS 疫苗 佐剂的制备方法与应用，采用 发酵 法大量生产CpG ISS，并采用金 纳米粒子 作为载体 吸附 ，得到新型CpGISS疫苗佐剂。有益效果为：采用本发明的发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤 酵母 的增殖速度快，含未甲基化的CpG ISS解旋、复制速度快，CpG ISS的产量高；采用发酵的方式大量生产CpG ISS，成本低廉且安全性高；CpG ISS‑金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响CpG ISS的 生物 学功能；使用本发明疫苗佐剂，能缩短免疫期时间，免疫效果好，在动物养殖生产或人体中应用，提高成活率和免疫保护率。，下面是一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于以下步骤：
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中，调节转速和空气流量，发酵过程中流加氨水，并且分批补充培养基；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，用蒸馏水清洗后，在酵母泥中加入蒸馏水，水浴处理，处理完后冷却，并进行超声破碎处理，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液高速离心，弃去上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，轻轻吹打混合均匀，恒温振荡，然后加入PBS溶液，混合均匀，恒温振荡，离心，弃上清液，洗涤，加入PBS溶液，得到新型CpGISS疫苗佐剂；
所述的发酵培养基成份及其重量份为：蔗糖50 60份、酵母粉60 80份、蛋白胨10 15份、~ ~ ~
尿素30 45份、麦芽汁6 9份、KH2PO4 8 12份、K2HPO4·3H2O 5 7份、MgSO4·7H2O 0.2 0.3份、~ ~ ~ ~ ~
ZnSO4·7H2O 5 7.8份、MnSO4·4H2O 24 35份、生物素0.016 0.02份、核黄素磷酸钠0.003~ ~ ~ ~
0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.02 0.06份和去离子水1700 2000份。
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2.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为30 38%；发酵过程中通过流加氨水~
控制培养液pH为4.6 5.5，培养温度为26 29℃，期间分批补充培养基，11 12.5h后第一次补~ ~ ~
加培养基，并添加18 22%甘油，15 17h后第二次补加培养基，23 26h后第三次补加培养基，~ ~ ~
发酵至46 50h。
~
3.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤1中发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖300 400份、蛋白胨40 60份、MgSO4·7H2O10~ ~ ~
20份和去离子水1000 1200份。
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4.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤2中离心速率为4500 5800 r/min，离心17 23min，蒸馏水清洗3 5次，清洗后酵母泥与蒸~ ~ ~
馏水的料液比为1:3.5 4.6，将酵母悬浮液在95 100℃水浴环境下处理13 17min，并在3 5~ ~ ~ ~
℃冰浴冷却；超声破碎条件为：超声破碎功率为430 460W，破碎时间为17 23min，时间间隔~ ~
为10：8s/s。
5.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中金纳米粒子直径为10 20nm，浓度为50 60nM，在3 5℃，11000 13000rpm条件下离心17~ ~ ~ ~
23min，第一次弃去原来体积7/10 9/10的上清液。
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6.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中在含金纳米粒子的溶液中加入步骤2得到的滤液，使溶液中CpG ISS的浓度为2.6 3.4~
μM ，在23 27℃360 420rpm条件下振荡8 10h。
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7.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中缓慢加入0.8 1.2MPBS溶液，溶液中NaCl浓度为0.8 1.2M，PB浓度为0.08 0.12M，加入~ ~ ~
后最终浓度为0.08 0.12M，PBS溶液分5 6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在23 27~ ~ ~
℃360 420rpm条件下振荡22 26h。
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8.根据权利要求1所述的一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤3中在3 5℃，12000 14000rpm条件下离心17 23min，弃去全部上清液，并用0.08 0.12M的~ ~ ~ ~
PBS洗涤3 5次。
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9.一种新型CpGISS疫苗佐剂是动物免疫系统调节剂，用于增强疫苗的免疫原性的用途。
一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法与应用
技术领域
背景技术
发明内容
60份、酵母粉60~80份、蛋白胨10~15份、尿素30~45份、麦芽汁6~9份、KH2PO4 8~12份、K2HPO4·3H2O 5~7份、MgSO4·7H2O 0.2~0.3份、ZnSO4·7H2O 5~7.8份、MnSO4·4H2O 24~35份、生物素0.016 0.02份、核黄素磷酸钠0.003 0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.02 0.06份和~ ~ ~
去离子水1700 2000份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为30 38%；发酵过~ ~
程中通过流加氨水控制培养液pH为4.6 5.5，培养温度为26 29℃，期间分批补充培养基，11~ ~
12.5h后第一次补加培养基，并添加18 22%甘油，15 17h后第二次补加培养基，23 26h后第~ ~ ~ ~
三次补加培养基，发酵至46 50h。发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖300 400份、蛋白~ ~
胨40 60份、MgSO4·7H2O10 20份和去离子水1000 1200份。采用上述发酵培养基发酵培养，~ ~ ~
巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的CpG ISS解旋、复制速度快，CpG ISS的产量高；采用发酵的方式大量生产CpG ISS，成本低廉且安全性高；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为4500 5800 r/min，离心17~ ~
23min。用蒸馏水清洗3 5次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:3.5~ ~
4.6。水浴处理，在95 100℃水浴环境下处理13 17min。处理完后在3 5℃冰浴冷却，并进行~ ~ ~
超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为430 460W，破碎时间为17 23min，时间间~ ~
隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在3 5℃，11000 13000rpm条件下离心17 23min，金纳米粒子~ ~ ~
直径为10 20nm，浓度为50 60nM。弃去原来体积7/10 9/10的上清液，沉淀重悬，加入步骤2~ ~ ~
得到的滤液，使溶液中CpG ISS的浓度为2.6 3.4μM。轻轻吹打混合均匀，在23 27℃360~ ~ ~
420rpm条件下振荡8 10h，然后缓慢加入0.8 1.2MPBS溶液，溶液中NaCl浓度为0.8 1.2M，PB~ ~ ~
浓度为0.08 0.12M，加入后最终浓度为0.08 0.12M，PBS溶液分5 6次加入，间隔大于30min/~ ~ ~
次，混合均匀后，在23 27℃360 420rpm条件下振荡22 26h。在3 5℃，12000 14000rpm条件~ ~ ~ ~ ~
下离心17 23min，弃去全部上清液，并用0.08 0.12M的PBS洗涤3 5次。加入PBS溶液，得到新~ ~ ~
型CpGISS疫苗佐剂。金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；
具有很高的比表面积，为ISS在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；CpG ISS-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响CpG ISS的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的CpG ISS不受核酸酶的降解，最大限度的保持了CpG ISS的生物学活性。
一种新型CpGISS疫苗佐剂的制备方法，制备步骤为：
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其重量份为：蔗糖50~
60份、酵母粉60~80份、蛋白胨10~15份、尿素30~45份、麦芽汁6~9份、KH2PO4 8~12份、K2HPO4·3H2O 5 7份、MgSO4·7H2O 0.2 0.3份、ZnSO4·7H2O 5 7.8份、MnSO4·4H2O 24 35~ ~ ~ ~
份、生物素0.016 0.02份、核黄素磷酸钠0.003 0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.02 0.06份和~ ~ ~
去离子水1700 2000份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为30 38%；发酵过~ ~
程中通过流加氨水控制培养液pH为4.6 5.5，培养温度为26 29℃，期间分批补充培养基，11~ ~
12.5h后第一次补加培养基，并添加18 22%甘油，15 17h后第二次补加培养基，23 26h后第~ ~ ~ ~
三次补加培养基，发酵至46 50h。发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖300 400份、蛋白~ ~
胨40~60份、MgSO4·7H2O10~20份和去离子水1000~1200份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的CpG ISS解旋、复制速度快，CpG ISS的产量高；采用发酵的方式大量生产CpG ISS，成本低廉且安全性高；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为4500 5800 r/min，离心17~ ~
23min。用蒸馏水清洗3 5次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:3.5~ ~
4.6。水浴处理，在95 100℃水浴环境下处理13 17min。处理完后在3 5℃冰浴冷却，并进行~ ~ ~
超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为430 460W，破碎时间为17 23min，时间间~ ~
隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在3 5℃，11000 13000rpm条件下离心17 23min，金纳米粒子~ ~ ~
直径为10 20nm，浓度为50 60nM。弃去原来体积7/10 9/10的上清液，沉淀重悬，加入步骤2~ ~ ~
得到的滤液，使溶液中CpG ISS的浓度为2.6 3.4μM。轻轻吹打混合均匀，在23 27℃360~ ~ ~
420rpm条件下振荡8 10h，然后缓慢加入0.8 1.2MPBS溶液，溶液中NaCl浓度为0.8 1.2M，PB~ ~ ~
浓度为0.08 0.12M，加入后最终浓度为0.08 0.12M，PBS溶液分5 6次加入，间隔大于30min/~ ~ ~
次，混合均匀后，在23 27℃360 420rpm条件下振荡22 26h。在3 5℃，12000 14000rpm条件~ ~ ~ ~ ~
下离心17 23min，弃去全部上清液，并用0.08 0.12M的PBS洗涤3 5次。加入PBS溶液，得到新~ ~ ~
型CpGISS疫苗佐剂。金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；
具有很高的比表面积，为CpG ISS在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；
CpG ISS-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响CpG ISS的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的CpG ISS不受核酸酶的降解，最大限度的保持了CpG ISS的生物学活性。
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其最优选重量份为：蔗糖56份、酵母粉72份、蛋白胨13份、尿素40份、麦芽汁8份、KH2PO4 10份、K2HPO4·3H2O 6份、MgSO4·7H2O 0.25份、ZnSO4·7H2O 7.2份、MnSO4·4H2O 33份、生物素0.019份、核黄素磷酸钠0.005份、二十碳五烯酸乙酯0.04份和去离子水1800份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为36%；发酵过程中通过流加氨水控制培养液pH为5.0，培养温度为27℃，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加20%甘油，16h后第二次补加培养基，
24h后第三次补加培养基，发酵至48h。发酵补料培养基成份及其最优选重量份为：蔗糖380份、蛋白胨50份、MgSO4·7H2O15份和去离子水1100份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的CpG ISS解旋、复制速度快，CpG ISS的产量高；采用发酵的方式大量生产CpG ISS，成本低廉且安全性高；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为5000 r/min，离心20min。用蒸馏水清洗4次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:4.3。水浴处理，在
96℃水浴环境下处理15min。处理完后在4℃冰浴冷却，并进行超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为450W，破碎时间为20min，时间间隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在4℃，12000rpm条件下离心20min，金纳米粒子直径为15nm，浓度为56nM。弃去原来体积4/5的上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，使溶液中CpG ISS的浓度为3μM。轻轻吹打混合均匀，在25℃400rpm条件下振荡9h，然后缓慢加入1MPBS溶液，溶液中NaCl浓度为1M，PB浓度为0.1M，加入后最终浓度为0.1M，PBS溶液分6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在25℃，3400rpm条件下振荡24h。在4℃，13000rpm条件下离心
20min，弃去全部上清液，并用0.1M的PBS洗涤4次。加入PBS溶液，得到新型CpGISS疫苗佐剂。
金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；具有很高的比表面积，为CpG ISS在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；CpG ISS-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响CpG ISS的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的CpG ISS不受核酸酶的降解，最大限度的保持了CpG ISS的生物学活性。
1）对处于保藏状态的巴斯德毕赤酵母进行活化培养、一级种摇瓶培养和二级种摇瓶培养处理后，将菌种接种到消毒灭菌过的发酵罐中。发酵培养基成份及其重量份为：蔗糖54份、酵母粉72份、蛋白胨13份、尿素41份、麦芽汁7份、KH2PO4 10份、K2HPO4·3H2O6份、MgSO4·
7H2O 0.2份、ZnSO4·7H2O 6.5份、MnSO4·4H2O 30份、生物素0.017份、核黄素磷酸钠0.003份、二十碳五烯酸乙酯0.04份和去离子水1800份。调节转速和空气流量，控制培养液中溶解氧含量为35%；发酵过程中通过流加氨水控制培养液pH为5.0，培养温度为27℃，期间分批补充培养基，12h后第一次补加培养基，并添加20%甘油，16h后第二次补加培养基，24h后第三次补加培养基，发酵至48h。发酵补料培养基成份及其重量份为：蔗糖350份、蛋白胨50份、MgSO4·7H2O17份和去离子水1000份。采用上述发酵培养基发酵培养，巴斯德毕赤酵母的增殖速度快，含未甲基化的CpG ISS解旋、复制速度快，CpG ISS的产量高；采用发酵的方式大量生产CpG ISS，成本低廉且安全性高。核黄素磷酸钠和二十碳五烯酸乙酯能加快德毕赤酵母的增殖速度，并能促进未甲基化的CpG ISS进行解旋、复制，增加CpG ISS的产量；
2）发酵结束后，将发酵液离心，并收集菌体，离心速率为5000 r/min，离心20min。用蒸馏水清洗4次后，在酵母泥中加入蒸馏水，酵母泥与蒸馏水的料液比为1:4.3。水浴处理，在
96℃水浴环境下处理15min。处理完后在4℃冰浴冷却，并进行超声破碎处理，超声破碎条件为：超声破碎功率为450W，破碎时间为20min，时间间隔为10：8s/s，过滤，收集滤液；
3）将含金纳米粒子的溶液在4℃，12000rpm条件下离心20min，金纳米粒子直径为15nm，浓度为56nM。弃去原来体积4/5的上清液，沉淀重悬，加入步骤2得到的滤液，使溶液中CpG ISS的浓度为3μM。轻轻吹打混合均匀，在25℃400rpm条件下振荡9h，然后缓慢加入1MPBS溶液，溶液中NaCl浓度为1M，PB浓度为0.1M，加入后最终浓度为0.1M，PBS溶液分6次加入，间隔大于30min/次，混合均匀后，在25℃，3400rpm条件下振荡24h。在4℃，13000rpm条件下离心
20min，弃去全部上清液，并用0.1M的PBS洗涤4次。加入PBS溶液，得到新型CpGISS疫苗佐剂。
金纳米粒子尺寸相对均一，免疫原性和细胞毒性很低，生物相容性好；具有很高的比表面积，为CpG ISS在其表面修饰并设计形成不同的构型提供了多样的平台；CpG ISS-金纳米粒子复合物极易于进入细胞，而且不影响CpG ISS的生物学功能；金纳米粒子可以保护其表面上的CpG ISS不受核酸酶的降解，最大限度的保持了CpG ISS的生物学活性。
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