一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法
阅读：86发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法，本发明应用胎盘组织通过冻干处理再进行二次 粉碎 得到胎盘组织干粉，避免了常规加热烘干干燥过程中胎盘组织容易发生变质导致毒素、细菌的滋生问题，再结合酸解，离心分离等，制得了酸 水 解 胎盘组织液，相对于常规反复冻融、过滤等，节约了纯化效率，更进一步通过蛋白 吸附 柱进行吸附、洗脱，得到了较纯的活性肽，提高了活性肽的纯度。该制备步骤简单，易于工业推广，具有较高的应用价值。不仅如此，经蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，所得人胎盘组织液中的活性物质的含量较高，在医疗中使用更加方便，并且可分装分别制得不同浓度的人胎盘组织液注射剂，更灵活方便。，下面是一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法专利的具体信息内容。
1.一种人胎盘组织液注射剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)选取健康的胎盘，清洗去血水和污物，在氯化钠溶液中进行漂洗，得到预处理的胎盘组织；
(2)将预处理的胎盘组织进行一次粉碎，然后采用真空冷冻干燥技术进行冻干处理，再进行二次粉碎，得到胎盘组织干粉；
(3)将胎盘组织干粉与注射用水混合，然后加入盐酸溶液，调节混合液的pH值为2.6～
3.6，得到酸混合液；
(4)将酸混合液加热进行水解，再进行离心分离，得酸水解胎盘组织液；
(5)将酸水解胎盘组织液通入蛋白吸附柱进行吸附、洗脱的步骤，得到纯化胎盘组织液；
(6)对纯化胎盘组织液用氢氧化钠调节pH至6.7-7.3，并灭菌。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，还包括将步骤(4)中得到的离心沉淀重复加入酸混合液中进行酸水解的步骤。
3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，步骤(3)中胎盘组织干粉与注射用水的重量比为1∶8-15。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其中，骤(3)中盐酸溶液的摩尔浓度为1～2mol/L。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其中，冻干处理的条件包括：将粉碎胎盘组织放入真空冷冻干燥机内，关闭密封门，打开真空泵开关及冷冻干燥器开关，抽真空至18kPa～
28kPa，同时启动制冷，在2～4小时内将真空冷冻干燥机的冷阱温度降至-45℃～-60℃，保持时间2～5小时；通过隔板下的加热系统对产品缓缓加温，供给制品在升华过程中所需的热量，在10～25小时内将粉碎胎盘组织升温至0～15℃，使粉碎胎盘组织干燥，得到胎盘组织干粉。
6.根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述步骤(4)中的水解条件包括温度为35～45℃，并保持温度水解40～50min。
7.根据权利要有1或2所述的制备方法，其中，所述蛋白吸附柱中的填料包括Sephadex系列凝胶过滤填料、Superdex系列凝胶过滤填料、Sephacryl系列凝胶过滤填料、Sepharose系列凝胶过滤填料、Superose系列凝胶过滤填料、Sepharose基架离子交换填料、Source基架离子交换填料、Capto基架离子交换填料和Sephadex基架离子交换填料中的一种。
8.根据权利要有1或2所述的制备方法，其中，步骤(6)中调节pH的步骤还包括当纯化胎盘组织液pH值小于6.7时，向纯化胎盘组织液中加入摩尔浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，使其pH值为6.7-7.3，
当纯化胎盘组织液pH值大于7.3时，向纯化胎盘组织液中加入摩尔浓度为1.0mol/L的盐酸，使其pH值为6.7-7.3。
9.根据权利要有1或2所述的制备方法，其中，灭菌方法为巴斯德消毒法、干热法、膜过滤法和低pH孵放法中的一种或多种。
10.根据权利要求1-9任一项所述的制备方法制备得到的人胎盘组织液注射剂。
一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明涉及人胎盘组织液，具体地，涉及一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 胎盘组织液是将健康母体的胎盘经检验检疫后，通过特殊的分离提取手段，将胎盘中的活性有效成分提取后制成的具有医用，保健，美容，养生等功效的注射用制剂。由于胎盘中含有8000多种原始生命物质，有270多种目前可以命名的人类原始酶类物质，所以对提取工艺有很高的要求。生产技术包括多分子分离过滤技术，纳米提纯技术，二氧化碳技术，在上述技术条件保障下，其最核心成分的分子量能达到小分子多肽的分子量，从而完全被人体所吸收。
[0003] 纯净的胎盘制剂是科技产品，经科学验证在美容方面具有祛除皱纹、抗疲劳、愈合伤口、祛除黄褐斑和各种色斑、暗疮等诸多功能，这些都已经被科学实验所证实。它的活性作用使组织细胞的新陈代谢功能增强，把身体的不良状态平衡到正常点，从而使身体免疫能力不断提高，延缓衰老。这种科学美容疗法优于目前市场上推广的美容方法，是值得我国美容界人士试用的新方法，也会成为21世纪国际绿色美容新潮流。
[0004] 而常规的人胎盘组织液的提取方法一般在酸碱分解后对组织液采用烘干结合多次冻融、多次过滤或超滤、超临界萃取等多种手段，以提取胎盘组织液中的活性多肽，但是，在此过程中，往往会导致有效活性多肽失活或有效成分含量的下降，造成珍贵的胎盘原料的浪费。因此，如何提供一种能够有效提取胎盘组织液中活性多肽，并且减少毒素、细菌滋生，提高人胎盘组织液中活性物质的含量的方法是目前亟待解决的问题。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种人胎盘组织液注射剂及其制备方法，该方法能够有效提取胎盘组织液中活性多肽，并且减少毒素、细菌滋生，提高人胎盘组织液中活性物质的含量和制剂中的浓度是目前亟待解决的问题。
[0006] 为了实现上述目的，本发明提供了一种人胎盘组织液注射剂的制备方法，包括以下步骤：(1)选取健康的胎盘，清洗去血水和污物，在氯化钠溶液中进行漂洗，得到预处理的胎盘组织；(2)将预处理的胎盘组织进行一次粉碎，然后采用真空冷冻干燥技术进行冻干处理，再进行二次粉碎，得到胎盘组织干粉；(3)将胎盘组织干粉与注射用水混合，然后加入盐酸溶液，调节混合液的pH值为2.6～3.6，得到酸混合液；(4)将酸混合液加热进行水解，再进行离心分离，得酸水解胎盘组织液；(5)将酸水解胎盘组织液通入蛋白吸附柱进行吸附、洗脱的步骤，得到纯化胎盘组织液；(6)对纯化胎盘组织液用氢氧化钠调节pH至6.7-7.3，并灭菌。
[0007] 在上述技术方案中，本发明应用预处理的胎盘组织通过真空冷冻干燥技术进行冻干处理再进行二次粉碎得到胎盘组织干粉，避免了常规加热烘干干燥过程中胎盘组织容易发生变质导致毒素、细菌的滋生问题，再结合酸解，离心分离等，制得了酸水解胎盘组织液，相对于常规反复冻融、过滤等，节约了纯化效率，更进一步通过蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，得到了较纯的活性肽，提高了活性肽的纯度。本发明制备步骤简单，易于工业推广，具有较高的应用价值。不仅如此，该制备方法经蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，所得人胎盘组织液中的活性物质的含量较高，可经分装分别制得不同浓度的人胎盘组织液注射剂，分装更灵活，在医疗中使用更加方便。
[0008] 本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
具体实施方式
[0009] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0010] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0011] 一种人胎盘组织液注射剂的制备方法，包括以下步骤：
[0012] (1)选取健康的胎盘，清洗去血水和污物，在氯化钠溶液中进行漂洗，得到预处理的胎盘组织；
[0013] (2)将预处理的胎盘组织进行一次粉碎，然后采用真空冷冻干燥技术进行冻干处理，再进行二次粉碎，得到胎盘组织干粉；
[0014] (3)将胎盘组织干粉与注射用水混合，然后加入盐酸溶液，调节混合液的pH值为2.6～3.6，得到酸混合液；
[0015] (4)将酸混合液加热进行水解，再进行离心分离，得酸水解胎盘组织液；
[0016] (5)将酸水解胎盘组织液通入蛋白吸附柱进行吸附、洗脱的步骤，得到纯化胎盘组织液；
[0017] (6)对纯化胎盘组织液用氢氧化钠调节pH至6.7-7.3，并灭菌。
[0018] 在上述技术方案中，本发明应用预处理的胎盘组织通过真空冷冻干燥技术进行冻干处理再进行二次粉碎得到胎盘组织干粉，避免了常规加热烘干干燥过程中胎盘组织容易发生变质导致毒素、细菌的滋生问题，再结合酸解，离心分离等，制得了酸水解胎盘组织液，相对于常规反复冻融、过滤等，节约了纯化效率，更进一步通过蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，得到了较纯的活性肽，提高了活性肽的纯度。本发明制备步骤简单，易于工业推广，具有较高的应用价值。不仅如此，该制备方法经蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，所得人胎盘组织液中的活性物质的含量较高，可经分装分别制得不同浓度的人胎盘组织液注射剂，分装更灵活，在医疗中使用更加方便。
[0019] 在本发明一种优选的实施方式中，还包括将步骤(4)中得到的离心沉淀重复加入酸混合液中进行酸水解的步骤。这样，可进一步对未提取完全的人胎盘组织，提高胎盘组织的利用率。
[0020] 在本发明一种优选的实施方式中，步骤(3)中胎盘组织干粉与注射用水的重量比为1∶8-15。这样，可提高胎盘组织的水解效率，并在后续的离心分离过程中，将提取液与组织碎片有效分离。
[0021] 在本发明一种优选的实施方式中，骤(3)中盐酸溶液的摩尔浓度为1～2mol/L，这样有利于对pH的有效控制。
[0022] 在本发明一种优选的实施方式中，冻干处理的条件包括：将粉碎胎盘组织放入真空冷冻干燥机内，关闭密封门，打开真空泵开关及冷冻干燥器开关，抽真空至18kPa～28kPa，同时启动制冷，在2～4小时内将真空冷冻干燥机的冷阱温度降至-45℃～-60℃，保持时间2～5小时；通过隔板下的加热系统对产品缓缓加温，供给制品在升华过程中所需的热量，在10～25小时内将粉碎胎盘组织升温至0～15℃，使粉碎胎盘组织干燥，得到胎盘组织干粉。
[0023] 在本发明一种优选的实施方式中，所述步骤(4)中的水解条件包括温度为35～45℃，并保持温度水解40～50min。在此过程中，既能使粉碎胎盘组织快速干燥，又能在干燥过程中防止细菌和毒素的产生，并且，保持胎盘组织中的活性物质的活性。
[0024] 在本发明一种优选的实施方式中，所述蛋白吸附柱中的填料包括Sephadex系列凝胶过滤填料、Superdex系列凝胶过滤填料、Sephacryl系列凝胶过滤填料、Sepharose系列凝胶过滤填料、Superose系列凝胶过滤填料、Sepharose基架离子交换填料、Source基架离子交换填料、Capto基架离子交换填料和Sephadex基架离子交换填料中的一种，这些为市售品，不再赘述。这样，经吸附、洗脱，可有效分离活性蛋白或多肽，并且在洗脱过程中，通过色谱分析方法，对洗脱吸收峰进行集中收集，提高收集液中活性物质的浓度，有利于后期制剂的分装或浓度的配比。
[0025] 而对于洗脱过程中的洗脱液，可在较宽范围内进行选择，例如，洗脱液为pH 1.0～11.0的缓冲溶液，包括下列一种或者多种：马来酸缓冲液、丙二酸缓冲液、柠檬酸缓冲液、乳酸缓冲液、甲酸缓冲液、丁二酸缓冲液、乙酸缓冲液、丙二酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、哌嗪缓冲液、L-组氨酸缓冲液、Tris缓冲液、三乙醇胺缓冲液、二乙醇胺缓冲液、乙醇胺缓冲液以及双胺丙烷缓冲液。这些，可根据吸附填充材料的说明，进行针对的选择，在此不再赘述。
[0026] 在本发明一种优选的实施方式中，步骤(6)中调节pH的步骤还包括当纯化胎盘组织液pH值小于6.7时，向纯化胎盘组织液中加入摩尔浓度为0.5mol/L的氢氧化钠溶液，使其pH值为6.7-7.3，
[0027] 当纯化胎盘组织液pH值大于7.3时，向纯化胎盘组织液中加入摩尔浓度为1.0mol/L的盐酸，使其pH值为6.7-7.3。这样，制得的制剂的pH与人体的pH接近，可直接支撑直接的注射制剂，也可添加生理盐水等对制剂的浓度进行调整。
[0028] 在本发明一种优选的实施方式中，灭菌方法可以为巴斯德消毒法、干热法、膜过滤法和低pH孵放法中的一种或多种，这些均为常规技术手段，在后文的实施例中，为了节约实验时间，仅采用一种实施方式进行说明。
[0029] 本发明还提供一种根据前文所述的制备方法制备得到的人胎盘组织液注射剂。
[0030] 在上述技术方案中，本发明应用预处理的胎盘组织通过真空冷冻干燥技术进行冻干处理再进行二次粉碎得到胎盘组织干粉，避免了常规加热烘干干燥过程中胎盘组织容易发生变质导致毒素、细菌的滋生问题，再结合酸解，离心分离等，制得了酸水解胎盘组织液，相对于常规反复冻融、过滤等，节约了纯化效率，更进一步通过蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，得到了较纯的活性肽，提高了活性肽的纯度。本发明制备步骤简单，易于工业推广，具有较高的应用价值。不仅如此，该制备方法经蛋白吸附柱进行吸附、洗脱，所得人胎盘组织液中的活性物质的含量较高，可经分装分别制得不同浓度的人胎盘组织液注射剂，分装更灵活，在医疗中使用更加方便。
[0031] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。下述人胎盘组织液注射剂中的蛋白质含量的应用BCA法测定蛋白质含量，即先以标准蛋白质溶液和吸光度值绘制标准曲线，然后以待测溶液的吸光度值计算出待测溶液中的蛋白质浓度。此为本领域的常规技术手段，在此不再赘述。
[0032] 实施例1
[0033] 一种人胎盘组织液注射剂的制备方法，包括以下步骤：
[0034] (1)收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒检验后，筛选病毒检验结果为阴性的胎盘作为原料，备用，清洗去血水和污物，在氯化钠溶液中进行漂洗，得到预处理的胎盘组织；
[0035] (2)将预处理的胎盘组织进行一次粉碎，然后采用真空冷冻干燥技术进行冻干处理，冻干处理的条件包括：将粉碎胎盘组织放入真空冷冻干燥机内，关闭密封门，打开真空泵开关及冷冻干燥器开关，抽真空至18kPa，同时启动制冷，在2小时内将真空冷冻干燥机的冷阱温度降至-45℃，保持时间5小时；通过隔板下的加热系统对产品缓缓加温，供给制品在升华过程中所需的热量，在10小时内将粉碎胎盘组织升温至0℃，使粉碎胎盘组织干燥，再进行二次粉碎，得到胎盘组织干粉；
[0036] (3)将胎盘组织干粉与注射用水以重量比为1∶8混合，然后加入1mol/L盐酸溶液，调节混合液的pH值为2.6，得到酸混合液；
[0037] (4)将酸混合液于35℃进行水解40min，再进行以15000rpm离心分离，得酸水解胎盘组织液；离心沉淀重复加入酸混合液中进行酸水解；
[0038] (5)调节酸水解胎盘组织液的pH值至4.0，采用SP-Sepharose HP装柱，层析柱体积40mL。先用pH 4.0的甲酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，以浓度为0至4M的pH 4.0甲酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰，得到纯化胎盘组织液；
[0039] (6)对纯化胎盘组织液用氢氧化钠调节pH至6.7，并将胎盘组织液以每瓶1ml定量分装于1.5ml的安瓿瓶中，然后于2小时内置于整体灭菌柜中，进行灭菌处理，得胎盘组织液注射剂，其中灭菌处理温度为114℃，灭菌时间为30分钟。
[0040] 制得的胎盘组织液注射剂的pH为6.7，蛋白质含量为28mg/mL。
[0041] 实施例2
[0042] 一种人胎盘组织液注射剂的制备方法，包括以下步骤：
[0043] (1)收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒检验后，筛选病毒检验结果为阴性的胎盘作为原料，备用，清洗去血水和污物，在氯化钠溶液中进行漂洗，得到预处理的胎盘组织；
[0044] (2)将预处理的胎盘组织进行一次粉碎，然后采用真空冷冻干燥技术进行冻干处理，冻干处理的条件包括：将粉碎胎盘组织放入真空冷冻干燥机内，关闭密封门，打开真空泵开关及冷冻干燥器开关，抽真空至28kPa，同时启动制冷，在4小时内将真空冷冻干燥机的冷阱温度降至-60℃，保持时间2小时；通过隔板下的加热系统对产品缓缓加温，供给制品在升华过程中所需的热量，在25小时内将粉碎胎盘组织升温至15℃，使粉碎胎盘组织干燥，再进行二次粉碎，得到胎盘组织干粉；
[0045] (3)将胎盘组织干粉与注射用水以重量比为1∶15混合，然后加入2mol/L盐酸溶液，调节混合液的pH值为3.6，得到酸混合液；
[0046] (4)将酸混合液于45℃进行水解50min，再进行以15000rpm离心分离，得酸水解胎盘组织液；离心沉淀重复加入酸混合液中进行酸水解；
[0047] (5)调节酸水解胎盘组织液的pH值至7.8，采用Q琼脂糖装柱，层析柱体积50mL，先用pH 7.8的磷酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，以浓度为0至2M的pH 7.8磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰，得到纯化胎盘组织液；
[0048] (6)对纯化胎盘组织液用氢氧化钠调节pH至7.3，并将胎盘组织液以每瓶1ml定量分装于1.5ml的安瓿瓶中，然后于2小时内置于整体灭菌柜中，进行灭菌处理，得胎盘组织液注射剂，其中灭菌处理温度为114℃，灭菌时间为30分钟。
[0049] 制得的胎盘组织液注射剂的pH为7.3，蛋白质含量为32mg/mL。
[0050] 实施例3
[0051] 一种人胎盘组织液注射剂的制备方法，包括以下步骤：
[0052] (1)收集健康产妇足月分娩的胎盘，经乙肝、丙肝、艾滋病、梅毒等病毒检验后，筛选病毒检验结果为阴性的胎盘作为原料，备用，清洗去血水和污物，在氯化钠溶液中进行漂洗，得到预处理的胎盘组织；
[0053] (2)将预处理的胎盘组织进行一次粉碎，然后采用真空冷冻干燥技术进行冻干处理，冻干处理的条件包括：将粉碎胎盘组织放入真空冷冻干燥机内，关闭密封门，打开真空泵开关及冷冻干燥器开关，抽真空至23kPa，同时启动制冷，在3小时内将真空冷冻干燥机的冷阱温度降至50℃，保持时间3.5小时；通过隔板下的加热系统对产品缓缓加温，供给制品在升华过程中所需的热量，在18小时内将粉碎胎盘组织升温至8℃，使粉碎胎盘组织干燥，再进行二次粉碎，得到胎盘组织干粉；
[0054] (3)将胎盘组织干粉与注射用水以重量比为1∶12混合，然后加入1.5mol/L盐酸溶液，调节混合液的pH值为3，得到酸混合液；
[0055] (4)将酸混合液于40℃进行水解45min，再进行以15000rpm离心分离，得酸水解胎盘组织液；离心沉淀重复加入酸混合液中进行酸水解；
[0056] (5)调节酸水解胎盘组织液的pH值至8.0，采用DEAE-Sepharose FF装柱，层析柱体积40mL。先用pH 8.0的磷酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，以浓度为0至3M的pH 8.0磷酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰，得到纯化胎盘组织液；
[0057] (6)对纯化胎盘组织液用氢氧化钠调节pH至7，并将胎盘组织液以每瓶1ml定量分装于1.5ml的安瓿瓶中，然后于2小时内置于整体灭菌柜中，进行灭菌处理，得胎盘组织液注射剂，其中灭菌处理温度为114℃，灭菌时间为30分钟。
[0058] 制得的胎盘组织液注射剂的pH为7，蛋白质含量为25mg/mL。
[0059] 实施例4
[0060] 制备方法与实施例3中相同，不同的是步骤(5)如下进行：
[0061] 调节酸水解胎盘组织液的pH值至10.0，采用Q-Sepharose FF装柱。先用pH 10.0的磷酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，以浓度为0至2M的pH 10.0磷酸缓冲液进行线性梯度洗脱，根据图谱收集各峰，得到纯化胎盘组织液。
[0062] 制得的胎盘组织液注射剂的pH为7，蛋白质含量为36mg/mL。
[0063] 实施例5
[0064] 制备方法与实施例3相同，不同的是，步骤(5)按照下述进行：
[0065] 调节酸水解胎盘组织液的pH值至2.0，采用S-SOURCE 30装柱，层析柱体积40mL。先用pH 2.0的马来酸缓冲液平衡柱子，平衡10个柱体积，以浓度为0至10M的pH 2.0马来酸缓冲液进行梯度洗脱，收集图谱上的各峰，得到纯化胎盘组织液。
[0066] 制得的胎盘组织液注射剂的pH为7，蛋白质含量为24g/L。
[0067] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0068] 另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0069] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
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