抗微生物制剂
阅读：166发布：2020-05-28
专利汇可以提供抗微生物制剂专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及融合蛋白，其由以下组成/包含以下：具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌的细胞壁的活性的酶；以及在N-或C-末端融合至酶的至少两个肽段，其中所述肽段是相异的，并且选自下组：合成两亲性肽,合成阳离子肽、合成聚阳离子肽、合成疏 水 性肽、或天然存在的抗 微 生物 肽如寿司肽和防卫素。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体和包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融合蛋白用作药物、诊断手段、美容用物质、消毒剂或食物添加剂。本发明还涉及对食品的、食物加工设备的、食物加工工厂的、与食品 接触 的表面的、医疗装置的、医院中和 手术室 /诊疗室中的表面的革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌污染的处理或 预防 。，下面是抗微生物制剂专利的具体信息内容。
1.一种融合蛋白，其由以下组成/包含以下(composed of)：具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌的细胞壁的活性的酶；以及在N-或C-末端融合至酶的至少两个肽段，其中所述肽段是相异的，并选自下组：合成两亲性肽,合成阳离子肽、合成聚阳离子肽、合成疏水性肽、或天然存在的抗微生物肽如寿司肽和防卫素。
2.根据权利要求1的融合蛋白，其中所述酶是内溶素、自溶素或细菌素。
3.根据权利要求1或2的融合蛋白，其中所述合成肽或天然存在的肽具有6到39个氨基酸残基的长度。
4.根据之前任一项权利要求的融合蛋白，其中所述革兰氏阴性细菌选自下组：
肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，
特别是埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、摩根氏菌属(Morganella)、变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)和耶尔森氏菌属(Yersinia)，
假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，
特别是假单胞菌属(Pseudomonas)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和丛毛单胞菌属(Comamonas)，
奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌属(Gardnerella)，螺旋体科(Spirochaetaceae)，
特别是密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋体属(Borrelia)，
钩端螺旋体科(Leptospiraceae)，弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)，
类杆菌科(Bacteroidaceae)，
特别是拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属(Prevotella)和卟啉单胞菌属(Porphyromonas)，和
不动杆菌属(Acinetobacter)，
特别是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)；并且
其中所述革兰氏阳性细菌选自下组：单核细胞增多性利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎 肠 球 菌 (Enterococcus faecium)、肺 炎 链 球 菌 (Streptococcus pneumoniae)、酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、马链球菌(Streptococcus equi)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium botulinum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium avium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium diphteriae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、放线菌属(Actinomyce)。
5.根据之前任一项权利要求的融合蛋白，其中所述酶呈现根据SEQ ID NO:1到18的氨基酸序列。
6.根据之前任一项权利要求的融合蛋白，其中所述抗微生物肽呈现根据SEQ ID NO:44至62和78至98的氨基酸序列，或其中所述寿司肽呈现根据SEQ ID NO:63的氨基酸序列；
或其中所述疏水性肽呈现根据SEQ ID NO:65和/或66的氨基酸序列；或其中所述两亲性肽呈现根据SEQ ID NO:64、68和/或69的氨基酸序列。
7.根据之前任一项权利要求的融合蛋白，其中所述融合蛋白呈现根据SEQ ID NO:70至
77和127至147的氨基酸序列。
8.一种分离的核酸分子，其编码根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白。
9.一种载体，其包含根据权利要求8的核酸分子。
10.一种宿主细胞，其包含根据权利要求8的核酸分子或根据权利要求9的载体。
11.根据权利要求10的宿主细胞，其中所述细胞是细菌细胞或酵母细胞。
12.根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白，其用作药物、诊断手段、美容用物质、消毒剂或食物添加剂。
13.根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白，其用于治疗和/或预防与革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌关联的病症、疾病或病况。
14.根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白，其根据权利要求13使用，其中所述病症、疾病或病况是由革兰氏阴性细菌的细菌组、科、属或种造成的，所述革兰氏阴性细菌包括对人或动物有致病性的菌株，特别是肠杆菌科(埃希氏菌属尤其是大肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属特别是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae)、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)、假单胞菌科(假单胞菌属特别是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、伯克霍尔德氏菌属、寡养单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞菌属)、奈瑟氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、布鲁氏菌属、弗朗西丝氏菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴尔通氏体属、考克斯氏体属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、曼氏菌属、放线杆菌属、加德纳氏菌属、螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属、螺杆菌属、螺菌属、链杆菌属、类杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属)、不动杆菌属特别是鲍氏不动杆菌，或者其中所述病症、疾病或病况是由革兰氏阳性细菌的细菌组、科、属或种造成的，所述所述革兰氏阳性细菌包括对人或动物有致病性的菌株，特别是单核细胞增多性利斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、变形链球菌、马链球菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、疮疱丙酸杆菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、白喉棒杆菌、肺炎支原体、放线菌属。
15.一种药物组合物，其包含根据权利要求1的融合蛋白。
16.一种用于产生融合蛋白的方法，其包括在支持所述融合蛋白表达的条件下培养根据权利要求10或11的宿主细胞。
17.一种用于在受试者中治疗由革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌所造成的病症、疾病或病况的方法，其包括向所述受试者施用根据权利要求1的融合蛋白。
18.一种根据权利要求17的治疗方法，其中所述病症、疾病或病况是由革兰氏阳性细菌和/或革兰氏阴性细菌所造成的细菌感染。
19.一种用于去除、减少和/或预防食品的、食物加工设备的、食物加工工厂的、与食品接触的表面的、医疗装置的、医院和手术室/诊疗室中的表面的革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌污染的方法，包括将所述食品、食物加工设备、食物加工工厂、与食品接触的表面、医疗装置、或医院中的表面与根据权利要求1的融合蛋白接触。
20.一种用于检测来自受试者的样品中的、或食物或饲料中的、或环境样品的细菌的方法，其包括使所述样品接触根据权利要求1的融合蛋白。
21.根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白用于处理或预防食品的、食物加工设备的、食物加工工厂的、与食品接触的表面的、医疗装置的、医院中和手术室/诊疗室中的表面的革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌污染的用途。
22.根据权利要求1至7的任一项的融合蛋白作为在医药、食物或饲料、或环境诊断的诊断手段中的用途。
抗微生物制剂
[0001] 本发明涉及融合蛋白，其由以下组成/包含以下(composed of)：具有降解革兰氏阴性细菌和/或革兰氏阳性细菌的细胞壁的活性的酶；以及在N-或C-末端融合至酶
的至少两个肽段(peptide streches)，其中所述肽段是相异的，并且选自下组：合成两
亲性肽(amphipathic peptide),合成阳离子肽(cationic peptide)、合成聚阳离子肽
(polycationic peptide)、合成疏水性肽、或天然存在的抗微生物(antimicrobial)肽如寿司肽(sushi peptide)和防卫素。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体和包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融
合蛋白作为药物、诊断手段、美容用物质、消毒剂或食物添加剂的用途。本发明还涉及对食品的、食物加工设备的、食物加工工厂的、与食品接触的表面的、医疗装置的、医院中和手术室/诊疗室(surgeries)中的表面的革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌污染的处理或预
防。
的至少两个肽段(peptide streches)，其中所述肽段是相异的，并且选自下组：合成两
亲性肽(amphipathic peptide),合成阳离子肽(cationic peptide)、合成聚阳离子肽
(polycationic peptide)、合成疏水性肽、或天然存在的抗微生物(antimicrobial)肽如寿司肽(sushi peptide)和防卫素。而且，本发明涉及编码所述融合蛋白的核酸分子、包含所述核酸分子的载体和包含所述核酸分子或所述载体的宿主细胞。此外，本发明涉及所述融
合蛋白作为药物、诊断手段、美容用物质、消毒剂或食物添加剂的用途。本发明还涉及对食品的、食物加工设备的、食物加工工厂的、与食品接触的表面的、医疗装置的、医院中和手术室/诊疗室(surgeries)中的表面的革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌污染的处理或预
防。
[0002] 革兰氏阴性细菌拥有外膜(outer membrane)，其具有作为标志的特征性不对称双分子层(asymmetric bilayer)。外膜双分子层由内单分子层和外单分子层组成，其中内单
分子层含有磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine))，而外单分子层主
要包含/组成为(composed of)由单一糖脂(glycolipid)，脂多糖(lipopolysaccharide，
LPS)。在细菌界(bacterial kingdom)中LPS结构有极大的多样性且LPS结构可以响应
于主要的环境条件而受修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要是
2+ 2+
通过二价离子(Mg ,Ca )与LPS的阴离子部分(脂质A(lipid A)中的磷酸基团以及内核
(inner core)和KDO的羧基基团)的静电相互作用而达成的。另外，由不饱和脂肪酸的缺
乏促进的脂质A的疏水部分的紧密和有序的排列，形成了具有高粘度的刚性结构(rigid
structure)。这使得它对亲脂性分子具有更少的透过性(less permeable)并赋予外膜
(OM)额外的稳定性。
分子层含有磷脂(主要是磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine))，而外单分子层主
要包含/组成为(composed of)由单一糖脂(glycolipid)，脂多糖(lipopolysaccharide，
LPS)。在细菌界(bacterial kingdom)中LPS结构有极大的多样性且LPS结构可以响应
于主要的环境条件而受修饰。LPS层的稳定性以及不同LPS分子之间的相互作用主要是
2+ 2+
通过二价离子(Mg ,Ca )与LPS的阴离子部分(脂质A(lipid A)中的磷酸基团以及内核
(inner core)和KDO的羧基基团)的静电相互作用而达成的。另外，由不饱和脂肪酸的缺
乏促进的脂质A的疏水部分的紧密和有序的排列，形成了具有高粘度的刚性结构(rigid
structure)。这使得它对亲脂性分子具有更少的透过性(less permeable)并赋予外膜
(OM)额外的稳定性。
[0003] 与革兰氏阴性细菌形成对比，革兰氏阳性细菌不拥有外膜。其细胞膜是由可达25nm厚的肽聚糖(peptidoglycan)(对与革兰氏阴性细菌其仅可达5nm)层所包围，该层形
成细胞壁。革兰氏阳性细菌的细胞壁的主要用途是维持细菌的形状以及抵消内细菌细胞压
力(internal bacterial cell pressure)。肽聚糖或叫胞壁质(murein)是由糖和氨基酸
组成的聚合物。糖组分是由β-(1,4)连接的组分N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)
和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)(它们构成糖组分)残基的交替的残基所组成
的。三到五个氨基酸的肽链附于N-乙酰胞壁酸。所述肽链可以交联至另一股(another
strand)的肽链形成3D网状层。所述肽链可以含有D-和L-氨基酸残基并且其组成成分可
以对于不同细菌而变化。
成细胞壁。革兰氏阳性细菌的细胞壁的主要用途是维持细菌的形状以及抵消内细菌细胞压
力(internal bacterial cell pressure)。肽聚糖或叫胞壁质(murein)是由糖和氨基酸
组成的聚合物。糖组分是由β-(1,4)连接的组分N-乙酰葡糖胺(N-acetylglucosamine)
和N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramic acid)(它们构成糖组分)残基的交替的残基所组成
的。三到五个氨基酸的肽链附于N-乙酰胞壁酸。所述肽链可以交联至另一股(another
strand)的肽链形成3D网状层。所述肽链可以含有D-和L-氨基酸残基并且其组成成分可
以对于不同细菌而变化。
[0004] 已知多种具有杀细菌或抑细菌活性的制剂，例如抗生素、内溶素(endolysins)、抗微生物肽(antimicrobial peptides)和防卫素(defensins)。然而，逐渐提高的对抗生素的微生物抗性正在治疗越来越多的细菌所致的感染中造成困难。由革兰氏阴性细菌如铜绿
假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)以及由革兰氏
阳性细菌例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠球菌属(Enterococci)、链球
菌属(Streptococci)、单核细胞增多性利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和艰难梭
菌(Clostridium difficile)所造成的感染带来了特别的困难，尤其是例如甲氧西林抗性
(Methicillin-resistant)的金黄色葡萄球菌和万古霉素抗性(Vancomycin-resistant)
的肠球菌属所造成的困难。
假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)和肠杆菌科(Enterobacteriaceae)以及由革兰氏
阳性细菌例如金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠球菌属(Enterococci)、链球
菌属(Streptococci)、单核细胞增多性利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)和艰难梭
菌(Clostridium difficile)所造成的感染带来了特别的困难，尤其是例如甲氧西林抗性
(Methicillin-resistant)的金黄色葡萄球菌和万古霉素抗性(Vancomycin-resistant)
的肠球菌属所造成的困难。
[0005] 内溶素是由噬菌体(或细菌病毒)所编码的肽聚糖水解酶。它们是在噬菌体倍增的裂解周期中在后期基因表达期间合成的，且其通过降解细菌的肽聚糖而介导子代病毒
体从感染的细菌细胞的释放。它们是β(1,4)-糖基酶(glycosylase)、糖基转移酶、酰胺
酶或内肽酶。内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)所提示。虽然
长久以来已知内溶素的杀灭能力，但是这些酶作为抗细菌剂的用途由于抗生素的成功和支
配地位而被忽视。仅在多抗生素抗性细菌(multiple antibiotic resistant bacteria)
出现后该以内溶素和人病原体斗争的概念才受到兴趣。出现了开发全新种类的抗细菌剂
的引人瞩目的需求，而将内溶素用作“酶抗生素(enzybiotics)”(“酶(enzyme)”和“抗
生素(antibiotics)”的杂交术语)似乎满足了这一需求。在2001年，Fischetti及其
同事第一次阐明了噬菌体C1内溶素对A组链球菌属的治疗潜力(Nelson等,2001)。从
那时其许多出版物已经确立了内溶素作为对控制细菌感染，特别是由革兰氏阳性细菌感
染的有吸引力的和补充性的替代手段。之后，针对其他革兰氏阳性病原体如肺炎链球菌
(Streptococcus pneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)
(Schuch等,2002)、无乳链球菌(S.agalactiae)(Cheng等,2005)和金黄色葡萄球菌
(Rashel等,2007)的不同的内溶素已经证明了其作为酶抗生素的功效。如今，对内溶素治
疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌对内溶素的外源作用的不敏感性，因为外膜遮蔽了
内溶素对肽聚糖的接触。这在当前阻止了有效的内溶素的范围向重要的革兰氏阴性病原体
的扩展。然而，也已知内溶素可以在一些情况下(例如高离子强度)，产生稳定的原生质体，在此情况下细菌细胞内压力不足以导致细胞爆开(cell burst)。在这些情况下细胞壁可以
再生且细菌会存活。因此直至现在内溶素还没有资格替代抗生素。
体从感染的细菌细胞的释放。它们是β(1,4)-糖基酶(glycosylase)、糖基转移酶、酰胺
酶或内肽酶。内溶素的抗微生物应用已经在1991年由Gasson(GB2243611)所提示。虽然
长久以来已知内溶素的杀灭能力，但是这些酶作为抗细菌剂的用途由于抗生素的成功和支
配地位而被忽视。仅在多抗生素抗性细菌(multiple antibiotic resistant bacteria)
出现后该以内溶素和人病原体斗争的概念才受到兴趣。出现了开发全新种类的抗细菌剂
的引人瞩目的需求，而将内溶素用作“酶抗生素(enzybiotics)”(“酶(enzyme)”和“抗
生素(antibiotics)”的杂交术语)似乎满足了这一需求。在2001年，Fischetti及其
同事第一次阐明了噬菌体C1内溶素对A组链球菌属的治疗潜力(Nelson等,2001)。从
那时其许多出版物已经确立了内溶素作为对控制细菌感染，特别是由革兰氏阳性细菌感
染的有吸引力的和补充性的替代手段。之后，针对其他革兰氏阳性病原体如肺炎链球菌
(Streptococcus pneumoniae)(Loeffler等,2001)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)
(Schuch等,2002)、无乳链球菌(S.agalactiae)(Cheng等,2005)和金黄色葡萄球菌
(Rashel等,2007)的不同的内溶素已经证明了其作为酶抗生素的功效。如今，对内溶素治
疗法最重要的挑战在于革兰氏阴性细菌对内溶素的外源作用的不敏感性，因为外膜遮蔽了
内溶素对肽聚糖的接触。这在当前阻止了有效的内溶素的范围向重要的革兰氏阴性病原体
的扩展。然而，也已知内溶素可以在一些情况下(例如高离子强度)，产生稳定的原生质体，在此情况下细菌细胞内压力不足以导致细胞爆开(cell burst)。在这些情况下细胞壁可以
再生且细菌会存活。因此直至现在内溶素还没有资格替代抗生素。
[0006] 抗微生物肽(antimicrobial peptide，AMP)代表了广范围的短的、阳离子的或两亲性的由基因所编码的肽抗微生物剂，其可以在几乎所有生物体中找到。不同的AMP显示
不同的性质，并且已经对这个类别中的很多肽不仅作为抗微生物剂，而且作为用于细胞穿
透肽的模板进行了大量的研究。尽管其共享一些共同的特征(例如阳离子性、两亲性和较
短的大小)，AMP序列差别很大，且已经提出了至少四个结构组(α-螺旋、β-折叠、延展
和环状)以容纳观察到的AMP构象的多样性。同样地，已经提出了几种作为抗微生物剂的
作用的模型，并且显示了，例如，很多的这些肽的主要靶物是细胞膜，而对于其它的肽其主要目标是细胞质侵入和对核心代谢功能的破坏。虽然其缺乏特异性的靶物结合，AMP可以
变得足够浓缩以呈现协同活性；例如，通过在膜中形成孔，如对于多数AMP的情况。然而，该现象仅在模型磷脂双分子层中观察到，且在一些情况中，需要高达每六个磷脂分子一个
肽的膜中AMP浓度以使这些事件发生。这些浓度已经接近，如果不是已经达到，完全膜饱
和。由于AMP的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)通常在低微摩
尔范围，可理解地产生了对于这些临界点与其体内重要性的相关性的怀疑(Melo等，Nature reviews,Microbiology,2009,245)。
不同的性质，并且已经对这个类别中的很多肽不仅作为抗微生物剂，而且作为用于细胞穿
透肽的模板进行了大量的研究。尽管其共享一些共同的特征(例如阳离子性、两亲性和较
短的大小)，AMP序列差别很大，且已经提出了至少四个结构组(α-螺旋、β-折叠、延展
和环状)以容纳观察到的AMP构象的多样性。同样地，已经提出了几种作为抗微生物剂的
作用的模型，并且显示了，例如，很多的这些肽的主要靶物是细胞膜，而对于其它的肽其主要目标是细胞质侵入和对核心代谢功能的破坏。虽然其缺乏特异性的靶物结合，AMP可以
变得足够浓缩以呈现协同活性；例如，通过在膜中形成孔，如对于多数AMP的情况。然而，该现象仅在模型磷脂双分子层中观察到，且在一些情况中，需要高达每六个磷脂分子一个
肽的膜中AMP浓度以使这些事件发生。这些浓度已经接近，如果不是已经达到，完全膜饱
和。由于AMP的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)通常在低微摩
尔范围，可理解地产生了对于这些临界点与其体内重要性的相关性的怀疑(Melo等，Nature reviews,Microbiology,2009,245)。
[0007] 防卫素是一大家族的小型、阳离子性或两亲性的富-半胱氨酸和富-精氨酸的抗微生物肽，其可在脊椎动物和无脊椎动物中找到。防卫素根据半胱氨酸的空间样式分为五
个组：植物、无脊椎、α-、β-、和θ-防卫素。后三者多数在哺乳动物中发现。α-防卫素是可在嗜中性粒细胞(neutrophils)和肠上皮(intestinal epithelia)中找到的蛋白。
β-防卫素是最广泛地分布的，并由许多种类的白细胞和上皮细胞分泌。θ-防卫素到目前
仅在例如猕猴(rhesus macaques)的白细胞中罕有地找到。防卫素针对细菌、真菌和许多
有包膜和无包膜病毒是有活性的。然而，对于有效杀灭细菌所需的浓度大多是较高的，即，在微摩尔的范围中。在存在生理盐条件、二价阳离子和血清的情况下许多肽的活性可能受
限。取决于疏水性氨基酸残基的含量防卫素也显示出溶血活性。
个组：植物、无脊椎、α-、β-、和θ-防卫素。后三者多数在哺乳动物中发现。α-防卫素是可在嗜中性粒细胞(neutrophils)和肠上皮(intestinal epithelia)中找到的蛋白。
β-防卫素是最广泛地分布的，并由许多种类的白细胞和上皮细胞分泌。θ-防卫素到目前
仅在例如猕猴(rhesus macaques)的白细胞中罕有地找到。防卫素针对细菌、真菌和许多
有包膜和无包膜病毒是有活性的。然而，对于有效杀灭细菌所需的浓度大多是较高的，即，在微摩尔的范围中。在存在生理盐条件、二价阳离子和血清的情况下许多肽的活性可能受
限。取决于疏水性氨基酸残基的含量防卫素也显示出溶血活性。
[0008] 因此，存在对于新的抗微生物制剂的需求。
[0010] 以下的图用于例示本发明。
[0011] 图1显示了表现名为PK(SEQ ID NO:23)的聚阳离子肽在不同浓度相比于缓冲液(10mM HEPES,0.5mM EDTA;pH7.4)和一种抗微生物肽(AMP=SMAP-29;SEQ ID NO:45)的抗细
菌活性的柱状图。将抗细菌活性作为相对灭活在y-轴上以对数单位给出。
菌活性的柱状图。将抗细菌活性作为相对灭活在y-轴上以对数单位给出。
[0012] 图2显示了表现名为PK2(SEQ ID NO:34)的聚阳离子肽在不同浓度相比于缓冲液(10mM HEPES,0.5mM EDTA;pH7.4)和一种抗微生物肽(AMP=SMAP-29;SEQ ID NO:45)的抗细
菌活性的柱状图。将抗细菌活性作为相对灭活在y-轴上以对数单位给出。
菌活性的柱状图。将抗细菌活性作为相对灭活在y-轴上以对数单位给出。
[0013] 图3显示了表现名为PK(SEQ ID NO:23)的聚阳离子肽和名为PK2(SEQ ID NO:34)的聚阳离子肽在3μM/L的浓度相比于缓冲液(10mM HEPES,0.5mM EDTA;pH7.4)的抗细菌
活性的柱状图。将抗细菌活性作为相对灭活在y-轴上以对数单位给出。
活性的柱状图。将抗细菌活性作为相对灭活在y-轴上以对数单位给出。
[0014] 如本文所使用的术语“蛋白质/蛋白”指代以特定序列由肽键相连的氨基酸的线性多聚物。蛋白质的氨基酸残基可以通过例如多种如糖和磷酸基团的共价附加而修饰。其
它的物质，如血红素(heme)或脂质，可以更加松散地与蛋白质结合，得到缀合的蛋白质，其也包括在本文所使用的术语“蛋白质/蛋白”中。已经阐明了蛋白折叠的多种方式，特别是有关α-螺旋和β-折叠片(pleated sheet）的存在。本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”
指代所有四类的蛋白：全α、全β、α/β、和α加β。另外，术语“蛋白质/蛋白”指代复合物，其中复合物指代同型聚体(homomer)。
它的物质，如血红素(heme)或脂质，可以更加松散地与蛋白质结合，得到缀合的蛋白质，其也包括在本文所使用的术语“蛋白质/蛋白”中。已经阐明了蛋白折叠的多种方式，特别是有关α-螺旋和β-折叠片(pleated sheet）的存在。本文中使用的术语“蛋白质/蛋白”
指代所有四类的蛋白：全α、全β、α/β、和α加β。另外，术语“蛋白质/蛋白”指代复合物，其中复合物指代同型聚体(homomer)。
[0015] 如本文中所使用的术语“融合蛋白”指代产生自三个核酸序列的融合物的表达产物。这类蛋白质可以，例如，在重组DNA表达系统中产生。另外，如本文中所使用的术语“融合蛋白”指代第一氨基酸序列例如，内溶素，与第二和第三氨基酸序列的融合物。所述第二和第二氨基酸序列优选是肽段，特别是选自下组的肽段：阳离子性、聚阳离子性、疏水性、两亲性、寿司和抗微生物肽。优选地，所述第二和第三氨基酸序列是相对于第一氨基酸序列外来并且与之任何的域都不基本上同源。另外，本发明的融合蛋白还指代产生自至少三个核
酸序列的融合物的表达产物。融合蛋白还指代第一氨基酸序列例如内溶素，与多于两个其
它编码肽段的氨基酸序列的融合物。所述编码融合蛋白的肽段的氨基酸序列可以彼此相异
或相同。
酸序列的融合物的表达产物。融合蛋白还指代第一氨基酸序列例如内溶素，与多于两个其
它编码肽段的氨基酸序列的融合物。所述编码融合蛋白的肽段的氨基酸序列可以彼此相异
或相同。
[0016] 本文中使用的术语“肽段”指代任何种类的连接至蛋白的肽，如内溶素。特别地，如本文中所使用的术语“肽段”指代阳离子肽、聚阳离子肽、两亲性肽、疏水性肽、寿司肽和/或抗微生物肽。然而，本发明的含义中的肽段不指代例如His-标签，优选His5-标签、His6-标签、His7-标签、His8-标签、His9-标签、His10-标签、His11-标签、His12-标签、His16-标签和His20-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、Gst-标签、JS-标签、半胱氨酸(cystein)-标签、FLAG-标签或其它领域内所知的标签、硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋
白(MBP)。与本文中使用的术语“肽段”形成对比，术语“标签”指代肽，其对于促进多肽的表达和/或亲和纯化、将多肽固定至表面或作为用于检测多肽的标志物或标记部分(例如，
通过在不同ELISA测定法中的抗体结合)是有用的，只要是使标签对于以上列出的促进有
用的功能不是由所述肽的正电荷所引起的即可。然而，取决于相应的pH，His6-标签可能也带正电荷，但是由于其是与固定的二价阳离子结合而用作亲和纯化的工具，且不作为根据
本发明的肽段而使用。
白(MBP)。与本文中使用的术语“肽段”形成对比，术语“标签”指代肽，其对于促进多肽的表达和/或亲和纯化、将多肽固定至表面或作为用于检测多肽的标志物或标记部分(例如，
通过在不同ELISA测定法中的抗体结合)是有用的，只要是使标签对于以上列出的促进有
用的功能不是由所述肽的正电荷所引起的即可。然而，取决于相应的pH，His6-标签可能也带正电荷，但是由于其是与固定的二价阳离子结合而用作亲和纯化的工具，且不作为根据
本发明的肽段而使用。
[0017] 如本文中使用的术语“第一肽段”指代肽段，其在酶的N-或C-末端连接至所述酶。
[0018] 如本文中使用的术语“第二肽段”指代肽段，其在第一肽段的N-或C-末端连接至所述第一肽段。
[0019] 如本文中所使用的术语“肽”指代短的多肽，其由从大约2个到大约100个氨基酸残基、更加优选地从大约4个到大约50个氨基酸残基、更加优选地从大约5个到大约30
个氨基酸残基组成，其中一个氨基酸残基的氨基基团通过肽键连接至另一个氨基酸残基的
羧基基团。肽可以具有特定功能。肽可以是天然存在的肽或合成设计并产生的肽。肽可
以是，例如，通过酶或化学切割从天然蛋白质衍生或去除，或可以使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(见Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))制备。优选的天然
存在的肽是，例如，抗微生物肽、防卫素、和寿司肽。优选的合成产生的肽是，例如，聚阳离子性、两亲性或疏水性肽。在本发明的含义中肽不指代His-标签、Strep-标签、硫氧还蛋白
或麦芽糖结合蛋白(MBP)等，其是用于纯化或定位蛋白。
个氨基酸残基组成，其中一个氨基酸残基的氨基基团通过肽键连接至另一个氨基酸残基的
羧基基团。肽可以具有特定功能。肽可以是天然存在的肽或合成设计并产生的肽。肽可
以是，例如，通过酶或化学切割从天然蛋白质衍生或去除，或可以使用常规肽合成技术(例如固相合成)或分子生物学技术(见Sambrook,J.等,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989))制备。优选的天然
存在的肽是，例如，抗微生物肽、防卫素、和寿司肽。优选的合成产生的肽是，例如，聚阳离子性、两亲性或疏水性肽。在本发明的含义中肽不指代His-标签、Strep-标签、硫氧还蛋白
或麦芽糖结合蛋白(MBP)等，其是用于纯化或定位蛋白。
[0020] 如本文中所使用的术语“内溶素”指代酶，其具有肽聚糖降解作用并由噬菌体或细菌病毒天然地编码，并且其适于降解细菌细胞壁。“内溶素”包含至少一个“酶活性
域”(EAD)，其具有至少一种以下的活性：内肽酶(endopeptidase)、N-乙酰胞壁酰-L-丙
氨酸酰胺酶(N-acetyl-muramoyl-L-alanine-amidase，amidase)、N-乙酰胞壁质酶
(N-acetyl-muramidase)、N-乙酰葡糖胺酶(N-acetyl-glucosaminidase)或糖基转移酶
(transglycosylases)。此外，内溶素还可以含有区域，所述区域无酶活性且结合宿主细菌细胞的细胞壁，其中所述区域是CBD(细胞壁结合域，cell wall binding domain)。内溶素可以含有两个或多个CBD。一般地，细胞壁结合域能够结合细菌表面上的不同组分。优选
地，细胞壁结合域是肽聚糖结合域并结合细菌的肽聚糖结构。内溶素的不同域可以由域接
头相连。
域”(EAD)，其具有至少一种以下的活性：内肽酶(endopeptidase)、N-乙酰胞壁酰-L-丙
氨酸酰胺酶(N-acetyl-muramoyl-L-alanine-amidase，amidase)、N-乙酰胞壁质酶
(N-acetyl-muramidase)、N-乙酰葡糖胺酶(N-acetyl-glucosaminidase)或糖基转移酶
(transglycosylases)。此外，内溶素还可以含有区域，所述区域无酶活性且结合宿主细菌细胞的细胞壁，其中所述区域是CBD(细胞壁结合域，cell wall binding domain)。内溶素可以含有两个或多个CBD。一般地，细胞壁结合域能够结合细菌表面上的不同组分。优选
地，细胞壁结合域是肽聚糖结合域并结合细菌的肽聚糖结构。内溶素的不同域可以由域接
头相连。
[0021] 如本文中所使用的术语“域接头”指代氨基酸序列，其功能是使单个蛋白域与另一个蛋白域相连。通常而言，域接头不形成或仅形成一些规则的二级结构，例如α-螺
旋或β-折叠，并可以根据相应的结构环境而占据不同的构象。检测域接头的方法和接
头序列的属性是本领域内熟知的，如在Bae等,2005,Bioinformatics,21,2264-2270或
George&Heringa,2003,Protein Engineering,15,871-879中所描述的。
旋或β-折叠，并可以根据相应的结构环境而占据不同的构象。检测域接头的方法和接
头序列的属性是本领域内熟知的，如在Bae等,2005,Bioinformatics,21,2264-2270或
George&Heringa,2003,Protein Engineering,15,871-879中所描述的。
[0022] 如本文中所使用的术语“删除”指代从相应的起始序列中去除1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
[0023] 如本文中所使用的术语“插入”或“添加”指代向相应的起始序列中插入或添加1、2、3、4、5或更多个氨基酸残基。
[0024] 如本文中所使用的术语“取代”指代将位于某个位置的氨基酸残基替换为不同的氨基酸残基。
[0025] 如本文中所使用的词语“细胞壁”指代形成革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的外围细胞外壳并因此保障其完整性的所有成分。特别地，如本文中所使用的术语“细胞壁”指代肽聚糖、具有脂多糖的革兰氏阴性细菌的外膜、细菌细胞膜，还指代沉积在肽聚糖上的额外的层，如，例如，荚膜(capsule)、外蛋白层(outer protein layer)或粘膜(slime)。
[0026] 如本文中所使用的术语“EAD”指代内溶素的酶活性域。EAD负责水解细菌的肽聚糖。其呈现至少一种内溶素的酶活性。EAD还可以包含以下/由以下组成：多于一种酶活
性组件(module)。本文使用的术语“EAD”与术语“催化域”同义。
性组件(module)。本文使用的术语“EAD”与术语“催化域”同义。
[0027] 如本文所使用的，术语“阳离子肽”指代合成肽，其具有带正电荷的氨基酸残基。优选地阳离子肽具有9.0或更大的pKa-值。通常，至少四种阳离子肽的氨基酸残基可以是带正电荷的，例如，赖氨酸或精氨酸。“带正电荷”指代氨基酸残基的侧链在大约生理条件具有净正电荷。如本文中所使用的术语“阳离子肽”还指代聚阳离子肽。
[0028] 如本文中所使用的术语“聚阳离子肽”指代合成产生的肽，其包含以下/由以下组成：多数为带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基。包含或组成为大多数为带正电荷的氨基酸残基的肽的至少大约20、30、40、50、60、70、75、80、85、90、95或大约
100%的氨基酸残基是带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基。是不带正
电荷的氨基酸残基的氨基酸残基可以是中性的氨基酸残基和/或带负电的氨基酸残基和/
或疏水性氨基酸残基。优选地，不是带正电的氨基酸残基的氨基酸残基是中性氨基酸残基，特别是丝氨酸和/或甘氨酸。
100%的氨基酸残基是带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基。是不带正
电荷的氨基酸残基的氨基酸残基可以是中性的氨基酸残基和/或带负电的氨基酸残基和/
或疏水性氨基酸残基。优选地，不是带正电的氨基酸残基的氨基酸残基是中性氨基酸残基，特别是丝氨酸和/或甘氨酸。
[0029] 如本文中所使用的术语“抗微生物肽”(AMP)指代任何天然存在的肽，其具有对例如细菌、病毒、真菌、酵母、支原体和原生动物的杀微生物(microbicidal)和/或抑微生物(microbistatic)活性。因此，如本文中所使用的术语“抗微生物肽”特别指代任何具
有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生虫、抗原生动物、抗病毒、抗传染(anti-infectious)、抗感染(anti-infective)和/或杀菌的(germicidal)、杀藻类的(algicidal)、杀变形虫的
(amoebicidal)、杀微生物的、杀细菌的、杀真菌的、杀寄生虫的(parasiticidal)、杀原生动物的(protozoacidal/protozoicidal)性质的肽。抗微生物肽可以是RNA酶A超家族
的成员、防卫素、cathelicidin、粒溶素(granulysin)、富组蛋白(histatin)、psoriasin、dermicidine或hepcidin。抗微生物肽可以天然存在于昆虫、鱼、植物、蛛类、脊椎动物或哺乳动物中。优选地抗微生物肽可以天然存在于昆虫、鱼、植物、蛛类、脊椎动物或哺乳动物中。优选地抗微生物肽可以天然存在于以下中：萝卜(radish)；蚕蛾(silk moth)；狼蛛(wolf spider)；蛙，优选地非洲爪蟾(Xenopus laevis)；蛙属的蛙(Rana frogs)，更优选地美国牛蛙(Rana catesbeiana)；蟾蜍(toad)，优选地亚洲蟾蜍(Asian toad)中华大蟾
蜍(Bufo bufo gargarizans)；蝇(fly)，优选地果蝇属(Drosophila)，更加优选地黑腹果
蝇(Drosophila melanogaster)；埃及伊蚊(Aedes aegypti)；蜜蜂；大黄蜂(bumblebee)，优选地牧熊蜂(Bombus pascuorum)；食肉蝇(flesh fly)，优选地麻蝇(Sarcophaga
peregrine)；蝎子；鲎(horseshoe crab)；鲇(catfish)，优选地鲶鱼(Parasilurus
asotus)；牛；猪(pig)；绵羊；猪类(porcine)；牛类(bovine)；猴子；和人。
有抗细菌、抗真菌、抗霉菌、抗寄生虫、抗原生动物、抗病毒、抗传染(anti-infectious)、抗感染(anti-infective)和/或杀菌的(germicidal)、杀藻类的(algicidal)、杀变形虫的
(amoebicidal)、杀微生物的、杀细菌的、杀真菌的、杀寄生虫的(parasiticidal)、杀原生动物的(protozoacidal/protozoicidal)性质的肽。抗微生物肽可以是RNA酶A超家族
的成员、防卫素、cathelicidin、粒溶素(granulysin)、富组蛋白(histatin)、psoriasin、dermicidine或hepcidin。抗微生物肽可以天然存在于昆虫、鱼、植物、蛛类、脊椎动物或哺乳动物中。优选地抗微生物肽可以天然存在于昆虫、鱼、植物、蛛类、脊椎动物或哺乳动物中。优选地抗微生物肽可以天然存在于以下中：萝卜(radish)；蚕蛾(silk moth)；狼蛛(wolf spider)；蛙，优选地非洲爪蟾(Xenopus laevis)；蛙属的蛙(Rana frogs)，更优选地美国牛蛙(Rana catesbeiana)；蟾蜍(toad)，优选地亚洲蟾蜍(Asian toad)中华大蟾
蜍(Bufo bufo gargarizans)；蝇(fly)，优选地果蝇属(Drosophila)，更加优选地黑腹果
蝇(Drosophila melanogaster)；埃及伊蚊(Aedes aegypti)；蜜蜂；大黄蜂(bumblebee)，优选地牧熊蜂(Bombus pascuorum)；食肉蝇(flesh fly)，优选地麻蝇(Sarcophaga
peregrine)；蝎子；鲎(horseshoe crab)；鲇(catfish)，优选地鲶鱼(Parasilurus
asotus)；牛；猪(pig)；绵羊；猪类(porcine)；牛类(bovine)；猴子；和人。
[0030] 如本文中所使用的术语“寿司肽””指代具有短共同重复序列(short consensus repeats)的补体调控蛋白(complement control proteins，CCP)。寿司肽的寿司模块(sushi module)在很多蛋白中作为蛋白-蛋白相互作用域起作用。含有寿司域的肽已经显
示出具有抗微生物活性。优选地，寿司肽是天然存在的肽。
示出具有抗微生物活性。优选地，寿司肽是天然存在的肽。
[0031] 如本文中所使用的术语“两亲性肽”指代合成的肽，其具有亲水性和疏水性官能团。优选地，如本文中所使用的术语“两亲性肽”指代肽，其具有亲水性和疏水性基团的确定的排列，例如，两亲性肽可以是例如α-螺旋，其非极性侧链主要沿着螺旋的一侧而极性残基沿着其表面的其余部分。
[0032] 如本文中使用的术语“疏水性基团”指代化学基团如氨基酸侧链，其基本上不溶于水，但是溶于油相，在油相中的溶解度高于在水中或水相中的溶解度。在水中，具有疏水性侧链的氨基酸残基相互之间作用以生成非水性的环境。具有疏水性侧链的氨基酸残基是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基。
[0033] 术语“自溶素”指代酶，其与内溶素相关但由细菌所编码，其牵涉在例如细胞分裂中。自溶素的综述可在“Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.Vollmer W,Joris B,Charlier P,Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008Mar;32(2):259-86”中找到。
[0034] 如本文中所使用的术语“细菌素”指代蛋白样或肽样物质，其能够抑制其他细菌的生长。一些细菌素能够降解细菌的细胞壁，如溶葡萄球菌素(Lysostaphin)(降解葡萄球菌属Staphylococcus的细胞壁)、变溶菌素(Mutanolysin)(降解链球菌属Streptococcus的
细胞壁)和Enterolysin(降解肠球菌属Enterococcus的细胞壁)。优选地所述抑制是特
异性地通过将所述其它细菌吸收到细菌素的特异性受体的方式。一般地，细菌素是由微生
物所产生的。然而，如本文中所使用的术语“细菌素”既指代由微生物产生的分离的形式或合成产生的形式，也指代变体，其基本上保留了其亲本细菌素的活性，但其序列已经通过一个或多个氨基酸残基的插入或删除而改变了。
细胞壁)和Enterolysin(降解肠球菌属Enterococcus的细胞壁)。优选地所述抑制是特
异性地通过将所述其它细菌吸收到细菌素的特异性受体的方式。一般地，细菌素是由微生
物所产生的。然而，如本文中所使用的术语“细菌素”既指代由微生物产生的分离的形式或合成产生的形式，也指代变体，其基本上保留了其亲本细菌素的活性，但其序列已经通过一个或多个氨基酸残基的插入或删除而改变了。
[0035] 本发明涉及针对革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的新的抗细菌制剂，特别涉及融合蛋白，其包含/组成为具有降解革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的细胞壁的活性的
酶以及两个或更多个肽段。这些肽段可以是相同或是相异的。这些肽段连接至根据本发明
的融合蛋白的酶的N-或C-末端。本领域技术人员理解根据本发明的融合蛋白包含2、3、4、
5、或更多个肽段。
酶以及两个或更多个肽段。这些肽段可以是相同或是相异的。这些肽段连接至根据本发明
的融合蛋白的酶的N-或C-末端。本领域技术人员理解根据本发明的融合蛋白包含2、3、4、
5、或更多个肽段。
[0036] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白包含/组成为具有降解革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的细胞壁的活性的酶以及融合至酶的N-或C-末端的两个肽
段。优选地，其中肽段是彼此相异或相同的。
段。优选地，其中肽段是彼此相异或相同的。
[0037] 本发明人发现，根据本发明的融合蛋白考虑到要作用的物种而显示不同的谱(show different spectra in view of the species to be effected)。
[0038] 在本发明的一个方面，具有降解革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌的细胞壁的活性的酶是内溶素、自溶素或细菌素。根据本发明的融合蛋白的酶不是溶菌酶(lysozyme)。
在一个优选的实施方案中根据本发明的融合蛋白的酶是由噬菌体或细菌病毒而编码的，特
别是内溶素。
在一个优选的实施方案中根据本发明的融合蛋白的酶是由噬菌体或细菌病毒而编码的，特
别是内溶素。
[0039] 将根据本发明的优选的融合蛋白在SEQ ID NO:70至77和127至147中描述，其可以在N-末端包含一个或多个额外的氨基酸残基。优选地，所述额外的氨基酸残基是甲硫
氨酸。
氨酸。
[0040] 优选地，内溶素是由特异于革兰氏阴性细菌的噬菌体所编码的，所述革兰氏阴性细菌如包含对人或动物病原性的菌株的细菌组(bacterial group)、科、属或种的革兰氏
阴性细菌，其如：肠杆菌科(埃希氏菌属(Escherichia)，尤其是大肠杆菌(E.coli)、沙
门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华
氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌
属(Klebsiella)，尤其是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae),摩根氏菌属(Morganella)、
变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔
森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)，
尤其是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa),伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌
属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、
丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、
弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌
属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体
属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属
(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌
属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋
体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺
杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科
(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属
(Prevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)，尤其是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
阴性细菌，其如：肠杆菌科(埃希氏菌属(Escherichia)，尤其是大肠杆菌(E.coli)、沙
门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、柠檬酸杆菌属(Citrobacter)、爱德华
氏菌属(Edwardsiella)、肠杆菌属(Enterobacter)、哈夫尼菌属(Hafnia)、克雷伯氏菌
属(Klebsiella)，尤其是肺炎克雷伯氏菌(K.pneumoniae),摩根氏菌属(Morganella)、
变形杆菌属(Proteus)、普罗维登斯菌属(Providencia)、沙雷氏菌属(Serratia)、耶尔
森氏菌属(Yersinia))、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)(假单胞菌属(Pseudomonas)，
尤其是铜绿假单胞菌(P.aeruginosa),伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、寡养单胞菌
属(Stenotrophomonas)、希瓦氏菌属(Shewanella)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、
丛毛单胞菌属(Comamonas))、奈瑟氏菌属(Neisseria)、莫拉氏菌属(Moraxella)、
弧菌属(Vibrio)、气单胞菌属(Aeromonas)、布鲁氏菌属(Brucella)、弗朗西丝氏菌
属(Francisella)、博德特氏菌属(Bordetella)、军团菌属(Legionella)、巴尔通氏体
属(Bartonella)、考克斯氏体属(Coxiella)、嗜血菌属(Haemophilus)、巴斯德氏菌属
(Pasteurella)、曼氏菌属(Mannheimia)、放线杆菌属(Actinobacillus)、加德纳氏菌
属(Gardnerella)、螺旋体科(Spirochaetaceae)(密螺旋体属(Treponema)和疏螺旋
体属(Borrelia))、钩端螺旋体科(Leptospiraceae)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、螺
杆菌属(Helicobacter)、螺菌属(Spirillum)、链杆菌属(Streptobacillus)、类杆菌科
(Bacteroidaceae)(拟杆菌属(Bacteroides)、梭杆菌属(Fusobacterium)、普雷沃氏菌属
(Prevotella)、卟啉单胞菌属(Porphyromonas))、不动杆菌属(Acinetobacter)，尤其是鲍氏不动杆菌(A.baumanii)。
[0041] 优选地，自溶素是由特异于革兰氏阴性细菌的噬菌体所编码的，所述革兰氏阴性细菌如包含对人或动物病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阴性细菌，其如上面所列出。
[0042] 细菌素优选地特异于如上所列出的革兰氏阴性细菌，但也可以具有更低的特异性。
[0043] 根据本发明的酶具有针对革兰氏阴性细菌的细胞壁降解活性，所述革兰氏阴性细菌是包含对人或动物具有病原性的菌株的细菌组、科、属或种，其如上面所列出。
[0044] 在另一个优选的实施方案中，内溶素是由特异于革兰氏阳性细菌的噬菌体所编码，所述革兰氏阳性细菌如包含对人或动物病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阳性细菌，如在下表中所列出。
[0045] 表1：
[0046] I.放线菌门(Phylum Actinobacteria)
[0047] 纲:放线菌纲(Actinobacteridae)
[0048] 目：放线菌目(Actinomycetales)
[0049] 科:
[0050] 放线菌亚目(Actinomycineae):放线菌科(Actinomycetaceae)(放线菌属(Actinomyces)、动弯杆菌(Mobiluncus))
[0051] 棒杆菌亚目(Corynebacterineae):分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)(分枝杆菌（Mycobacterium）)、诺卡氏菌科（Nocardiaceae）,
[0052] 棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)
[0053] 弗兰克氏菌亚目(Frankineae):弗兰克菌科(Frankiaceae)
[0054] 微球菌亚目(Micrococcineae):短杆菌科(Brevibacteriaceae)
[0055] 丙酸杆菌科(Propionibacteriaceae)(丙酸菌属(Propionibacterium))
[0056] 目:双歧杆菌目（Bifidobacteriales）
[0057] 科:
[0058] 双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）(双岐杆菌属（Bifidobacterium）、镰弧菌（Falcivibrio）、加德纳菌属（Gardnerella）)
[0059] 其它亚纲：酸微菌亚纲（Acidimicrobidae）、红蝽菌亚纲（Coriobacteridae）、红色杆菌亚纲（Rubrobacteridae）、球形杆菌亚纲（Sphaerobacteridae）
[0060] II.硬壁菌门（Phylum Firmicutes）
[0061] 纲：芽胞杆菌纲（Bacilli）
[0062] 目:芽孢杆菌目（Bacillales）
[0063] 科:
[0064] 芽胞杆菌科（Bacillaceae）(芽胞杆 菌属（Bacillus)）、利斯特氏菌 科（Listeriaceae）(利斯特氏菌属（Listeria）)、葡萄球菌科（Staphylococcaceae）(葡萄球菌属（Staphylococcus）、兼性双球菌属（Gemella）、Jeotgalicoccus)
[0065] 目：乳杆菌目（Lactobacillales）
[0066] 科：肠球菌科（Enterococcaceae）(肠球菌属（Enterococcus）)、乳杆菌科（Lactobacillaceae）(乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）)、明串珠菌科（Leuconostocaceae）(明串珠菌属（Leuconostoc）)、链球菌科（Streptococcaceae）(乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）)
[0067] 纲：梭菌纲（Clostridia）
[0068] 目：梭 菌 目（Clostridiales）(梭 菌 属（Clostridium）、消 化 链 球 菌 属（Peptostreptococcus）、月形单胞菌属（Selenomonas）)
[0069] 目：盐厌氧菌目（Halanaerobiales）
[0070] 目：Thermoanaerobacterales
[0071] 纲:无壁菌纲（Tenericutes）/柔膜体纲（Mollicutes）
[0072] 目：支 原 体 目（Mycoplasmatales）( 支 原 体 属（Mycoplasma）、脲 原 体 属（Ureaplasma）)
[0073] 目：虫原体目（Entomoplasmatales）(螺原体属（Spiroplasma）)
[0074] 目：厌氧支原体目（Anaeroplasmatales）(丹毒丝菌属（Erysipelothrix）)
[0075] 目：无胆甾原体目Acholeplasmatales(无胆甾原体属（Acholeplasma）)
[0076] 目：Haloplasmatales(Haloplasma)
[0077] 在另一个优选的实施方案中，自溶素或细菌素是由革兰氏阳性细菌所编码的，所述革兰氏阳性细菌如包含对人或动物有病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阳性
细菌，其如表1中所列出。
细菌，其如表1中所列出。
[0078] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的酶具有针对革兰氏阳性细菌的细胞壁降解活性，所述革兰氏阳性细菌如包含对人或动物有病原性的菌株的细菌组、科、属或
种的革兰氏阳性细菌，其如：单核细胞增多性利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎
肠球菌(Enterococcus faecium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链
球菌(Streptococcus pyogenes)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、马链球菌
(Streptococcus equi)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium
botulinum)、破 伤 风 梭 菌(Clostridium tetani)、产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、疮疱丙酸杆菌疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium
avium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium
diphteriae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、放线菌属(Actinomyce)
种的革兰氏阳性细菌，其如：单核细胞增多性利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)、
金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎
肠球菌(Enterococcus faecium)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、酿脓链
球菌(Streptococcus pyogenes)、变形链球菌(Streptococcus mutans)、马链球菌
(Streptococcus equi)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、肉毒梭菌(Clostridium
botulinum)、破 伤 风 梭 菌(Clostridium tetani)、产 气 荚 膜 梭 菌 (Clostridium perfringens)、炭疽芽孢杆菌(Bacillus anthracis)、蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)、疮疱丙酸杆菌疮疱丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)、鸟分枝杆菌(Mycobacterium
avium)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、白喉棒杆菌(Corynebacterium
diphteriae)、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)、放线菌属(Actinomyce)
[0079] 将内溶素部分的实例在下表中列出：
[0080] 表2：
[0081]
[0082]
[0083]
[0084] 还优选的内溶素部分衍生自：铜绿假单胞菌噬菌体ΦKZ和EL的内溶素、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）噬菌体的内溶素、大肠杆菌噬菌体N4的内溶素、噬菌体
LUZ24的内溶素、gp61胞壁质酶、STM0016内溶素、PSP3内溶素和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritis）噬菌体PVPSE1的内溶素。
LUZ24的内溶素、gp61胞壁质酶、STM0016内溶素、PSP3内溶素和肠炎沙门氏菌（Salmonella enteritis）噬菌体PVPSE1的内溶素。
[0085] 进一步优选的内溶素是利斯特氏菌（Listeria）噬菌体内溶素PlyA118、PlyA500、PlyPSA、PlyA511、PlyP35、PlyP40，葡萄球菌噬菌体Phi11内溶素、Phi MR11内溶素、LysK，产气荚膜梭菌PlyS6、Ply3626，艰难梭菌:CD27L内溶素，链球菌:B30内溶素、噬菌体Dp-1Pal酰胺酶、C1内溶素、Cpl-1内溶素、PlyGBS，肠球菌:PlyV12，炭疽芽孢杆菌:噬菌
体gamma内溶素PlyG。
体gamma内溶素PlyG。
[0086] 优选 的 自溶 素 在“Bacterial peptidoglycan(murein)hydrolases.VollmerW,Joris B,Charlier P,Foster S.FEMS Microbiol Rev.2008Mar;32(2):259-86.
Epub2008Feb11.综述.”中描述。优选的自溶素的实例是AtlA自溶素。
Epub2008Feb11.综述.”中描述。优选的自溶素的实例是AtlA自溶素。
[0087] 优选的细菌素是溶葡萄球菌素(降解葡萄球菌属的细胞壁)、变溶菌素(降解链球菌属的细胞壁)和Enterolysin(降解肠球菌属的细胞壁)。
[0088] 内溶素部分的进一步的实例选自下组：根据SEQ ID NO:1的Cpl-1、根据SEQ IDNO:2的Ply511、根据SEQ ID NO:3的LysK、根据SEQ ID NO:4的溶葡萄球菌素、根据SEQ
ID NO:5的PA6-gp20、根据SEQ ID NO:6的phiKZgp144、根据SEQ ID NO:7的ELgp188、根
据SEQ ID NO:8的沙门氏菌属内溶素、根据SEQ ID NO:9的肠细菌噬菌体T4内溶素、根据
SEQ ID NO:10的鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）内溶素、根据SEQ ID NO:11的大肠杆菌噬菌体K1F内溶素、根据SEQ ID NO:12的OBPgpLYS、根据SEQ ID NO:13的PSP3
沙门氏菌内溶素(PSP3gp10)、根据SEQ ID NO:14的大肠杆菌噬菌体P2内溶素(P2gp09)、
根据SEQ ID NO:15的鼠伤寒沙门氏菌胞壁质酶STM0016、根据SEQ ID NO:16的大肠杆菌噬
菌体N4胞壁质酶N4-gp61和根据SEQ ID NO:17的N4-gp61trunc.、根据SEQ ID NO:18的
KZ144。
ID NO:5的PA6-gp20、根据SEQ ID NO:6的phiKZgp144、根据SEQ ID NO:7的ELgp188、根
据SEQ ID NO:8的沙门氏菌属内溶素、根据SEQ ID NO:9的肠细菌噬菌体T4内溶素、根据
SEQ ID NO:10的鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）内溶素、根据SEQ ID NO:11的大肠杆菌噬菌体K1F内溶素、根据SEQ ID NO:12的OBPgpLYS、根据SEQ ID NO:13的PSP3
沙门氏菌内溶素(PSP3gp10)、根据SEQ ID NO:14的大肠杆菌噬菌体P2内溶素(P2gp09)、
根据SEQ ID NO:15的鼠伤寒沙门氏菌胞壁质酶STM0016、根据SEQ ID NO:16的大肠杆菌噬
菌体N4胞壁质酶N4-gp61和根据SEQ ID NO:17的N4-gp61trunc.、根据SEQ ID NO:18的
KZ144。
[0089] 在另一个本发明优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白的内溶素、自溶素和细菌素包含氨基酸序列的修饰和/或改变。这类的改变和/或修饰可以包括突变，如缺
失、插入和添加、取代或其组合，和/或氨基酸残基的化学改变，如生物素化、乙酰化、聚乙二醇化，氨基-、SH-或羰基-基团的化学改变。所述根据本发明的融合蛋白的内溶素、自
溶素和细菌素呈现代表性野生型内溶素、自溶素和细菌素的裂解活性。然而，所述活性可
以与代表性野生型内溶素、自溶素和细菌素相同、相比更高或相比更低。所述活性可以是
相应的野生型内溶素、自溶素和细菌素的活性的大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、
110、120、130、140、150、160、170、180、190或大约200%或甚至更高。活性可以通过领域内熟知的测定法由本领域技术人员测定，如例如平板裂解测定法（plate lysis assay）其
在 Briers 等 .,J.Biochem.Biophys Methods70:531-533,(2007)or Donovan DM,Lardeo
M,Foster-Frey J.FEMS Microbiol Lett.2006Dec;265(1)或类似的出版物中描述。
失、插入和添加、取代或其组合，和/或氨基酸残基的化学改变，如生物素化、乙酰化、聚乙二醇化，氨基-、SH-或羰基-基团的化学改变。所述根据本发明的融合蛋白的内溶素、自
溶素和细菌素呈现代表性野生型内溶素、自溶素和细菌素的裂解活性。然而，所述活性可
以与代表性野生型内溶素、自溶素和细菌素相同、相比更高或相比更低。所述活性可以是
相应的野生型内溶素、自溶素和细菌素的活性的大约10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、
110、120、130、140、150、160、170、180、190或大约200%或甚至更高。活性可以通过领域内熟知的测定法由本领域技术人员测定，如例如平板裂解测定法（plate lysis assay）其
在 Briers 等 .,J.Biochem.Biophys Methods70:531-533,(2007)or Donovan DM,Lardeo
M,Foster-Frey J.FEMS Microbiol Lett.2006Dec;265(1)或类似的出版物中描述。
[0090] 根据本发明的融合蛋白的肽段可以通过添加的氨基酸残基，例如由于克隆的原因，连接至酶。根据本发明的融合蛋白的肽段可以通过添加的氨基酸残基连接至彼
此。优选地，所述添加的氨基酸残基可以不为蛋白酶所识别和/或切割。优选地，所述肽
段可以通过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个添加的氨基酸残基连接至彼此和/或连接至酶。在一个优选的实施方案中所述第二肽段连接至第一肽段，所述第一肽段通过添加
的氨基酸残基甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸（Gly-Ser-Ser），甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)而融合至酶的N-或C-末端。此外，融合至根据本发明的融合蛋白的第一肽
段的N-末端的第二肽段进一步在其N-末端包含添加的氨基酸。优选地，肽段包含氨基酸甲
硫氨酸（Met），或甲硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸（Met-Gly-Ser）。在另一个优选的实施方案中第一肽段通过添加的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸（Gly-Ser）连接至酶的N-末端，并且第二肽段通过添加的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸（Gly-Ser）或甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸（Gly-Ser-Ser）连接至第一肽段的N-末端。在另一个优选的实施方案中第二肽
段通过添加的氨基酸残基甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)连接至第一肽段的N-或C-末端。在另一个优选的实施方案中第
一肽段通过添加的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)连接至酶的C-末端，并
且第二肽段通过额外的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)连接至第一肽段的
C-末端。
此。优选地，所述添加的氨基酸残基可以不为蛋白酶所识别和/或切割。优选地，所述肽
段可以通过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个添加的氨基酸残基连接至彼此和/或连接至酶。在一个优选的实施方案中所述第二肽段连接至第一肽段，所述第一肽段通过添加
的氨基酸残基甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸（Gly-Ser-Ser），甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)而融合至酶的N-或C-末端。此外，融合至根据本发明的融合蛋白的第一肽
段的N-末端的第二肽段进一步在其N-末端包含添加的氨基酸。优选地，肽段包含氨基酸甲
硫氨酸（Met），或甲硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸（Met-Gly-Ser）。在另一个优选的实施方案中第一肽段通过添加的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸（Gly-Ser）连接至酶的N-末端，并且第二肽段通过添加的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸（Gly-Ser）或甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸（Gly-Ser-Ser）连接至第一肽段的N-末端。在另一个优选的实施方案中第二肽
段通过添加的氨基酸残基甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)连接至第一肽段的N-或C-末端。在另一个优选的实施方案中第
一肽段通过添加的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)连接至酶的C-末端，并
且第二肽段通过额外的氨基酸残基，特别是甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)连接至第一肽段的
C-末端。
[0091] 根据本发明的融合蛋白的肽段优选地共价连接至酶。优选地，所述肽段是由至少5个，更有选地，其由至少6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、
76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99个或至少100个氨基酸残基组成。尤其优选的是包含大约5个到大约100个氨基酸，大约5到大
约50个或大约5到大约30个氨基酸残基的肽段。更加优选的是大约6到大约42个氨基
酸残基、大约6到大约39个氨基酸残基、大约6到大约38个氨基酸残基、大约6到大约31
个氨基酸残基、大约6到大约25个氨基酸残基、大约6到大约24个氨基酸残基、大约6到
大约22个氨基酸残基、大约6到大约21个氨基酸残基、大约6到大约20个氨基酸残基、大
约6到大约19个氨基酸残基、大约6到大约16个氨基酸残基、大约6到大约14个氨基酸
残基、大约6到大约12个氨基酸残基、大约6到大约10个氨基酸残基或大约6到大约9个
氨基酸残基的肽段。
51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、
76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99个或至少100个氨基酸残基组成。尤其优选的是包含大约5个到大约100个氨基酸，大约5到大
约50个或大约5到大约30个氨基酸残基的肽段。更加优选的是大约6到大约42个氨基
酸残基、大约6到大约39个氨基酸残基、大约6到大约38个氨基酸残基、大约6到大约31
个氨基酸残基、大约6到大约25个氨基酸残基、大约6到大约24个氨基酸残基、大约6到
大约22个氨基酸残基、大约6到大约21个氨基酸残基、大约6到大约20个氨基酸残基、大
约6到大约19个氨基酸残基、大约6到大约16个氨基酸残基、大约6到大约14个氨基酸
残基、大约6到大约12个氨基酸残基、大约6到大约10个氨基酸残基或大约6到大约9个
氨基酸残基的肽段。
[0092] 优选地，所述肽段不是标签，如His-标签、Strep-标签、Avi-标签、Myc-标签、Gst-标签、JS-标签、半胱氨酸-标签、FLAG-标签或其它本领域内已知的标签，且不是硫氧还蛋白或麦芽糖结合蛋白（MBP）。然而，根据本发明的融合蛋白可以额外地包含一个或多个这类标签。
[0093] 更加优选地，肽段具有以下功能：其引导融合蛋白通过外膜，但是当没有融合至所述酶而施用时可以具有活性或可以不具有活性或仅具有较低的活性。引导融合蛋白通过革兰氏阴性细菌的外膜的功能是由所述肽段的外膜或LPS破坏、透化（permeabilising）或去稳定化（destabilizing）活性造成的。肽段的这类外膜或LPS破坏、透化或去稳定化活性
可以在如下方法中测定：将待处理的细菌细胞在液体培养基中或琼脂板上培养。然后分别
将液体培养基中的细菌细胞的浓度在OD600nm以光量法(photometrically)测定，或对琼
脂板上的菌落计数。此时，对液体培养基中或在平板上的细菌细胞以根据本发明的融合蛋
白处理。在培育后再次在OD600nm以光量法测定或对琼脂板上的菌落计数。如果融合蛋白
呈现这类外膜或LPS破坏或透化或去稳定化活性，细菌细胞由于用融合蛋白处理而裂解，
因此液体培养基中细菌细胞的浓度或琼脂板上细菌菌落的数量减少。因此，在以融合蛋白
处理后细菌细胞浓度的降低或细菌群落数量的降低指示融合蛋白的外膜或LPS破坏或透
化或去稳定化活性。
可以在如下方法中测定：将待处理的细菌细胞在液体培养基中或琼脂板上培养。然后分别
将液体培养基中的细菌细胞的浓度在OD600nm以光量法(photometrically)测定，或对琼
脂板上的菌落计数。此时，对液体培养基中或在平板上的细菌细胞以根据本发明的融合蛋
白处理。在培育后再次在OD600nm以光量法测定或对琼脂板上的菌落计数。如果融合蛋白
呈现这类外膜或LPS破坏或透化或去稳定化活性，细菌细胞由于用融合蛋白处理而裂解，
因此液体培养基中细菌细胞的浓度或琼脂板上细菌菌落的数量减少。因此，在以融合蛋白
处理后细菌细胞浓度的降低或细菌群落数量的降低指示融合蛋白的外膜或LPS破坏或透
化或去稳定化活性。
[0094] 在一个优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白的肽段选自下组：阳离子肽、聚阳离子肽、疏水性肽、抗微生物肽、寿司肽和两亲性肽。在根据本发明的融合蛋白的N-或C-末端的两个或更多个肽段可以是相异的阳离子肽或聚阳离子肽或抗微生物肽或两亲性
肽或疏水性肽。在根据本发明的融合蛋白的N-或C-末端的两个或更多个肽段可以是阳离
子肽、聚阳离子肽、疏水性肽、抗微生物肽、寿司肽和两亲性肽的任意组合。
肽或疏水性肽。在根据本发明的融合蛋白的N-或C-末端的两个或更多个肽段可以是阳离
子肽、聚阳离子肽、疏水性肽、抗微生物肽、寿司肽和两亲性肽的任意组合。
[0095] 尤其优选的是阳离子和/或聚阳离子肽段，其包含至少一个根据SEQ IDNO:19(KRKKRK)的基序。特别的，优选包含至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16个或17个根据SEQ ID NO:19(KRKKRK)基序的阳离子肽段。更加优选包含至少一个KRK基
序(lys-arg-lys)的，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32个或33个KRK基序阳离子肽段。
序(lys-arg-lys)的，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、
21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32个或33个KRK基序阳离子肽段。
[0096] 在另一个本发明优选的实施方案中，阳离子肽段除了带正电荷的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸残基外，还包含中性的氨基酸残基，特别是甘氨酸和/或丝氨酸残
基。优选的阳离子肽段是由以下组成的：大约70%到大约100%、或大约80%到大约95%、或大约85%到大约90%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸，更优选赖
氨酸和/或精氨酸，以及大约0%到大约30%、或大约5%到大约20%、或大约10%到大约20%中
性氨基酸残基，特别是甘氨酸和/或丝氨酸残基。优选的多肽段由以下组成：大约4%到大约
8%丝氨酸残基、大约33%到大约36%精氨酸残基和大约56%到大约63%赖氨酸残基。特别
优选的多肽段包含至少一个根据SEQ ID NO:20(KRXKR)的基序，其中X是除赖氨酸、精氨酸
和组氨酸以外的任何氨基酸。特别优选的多肽段包含至少一个根据SEQ ID NO:21(KRSKR)
的基序。更优选阳离子肽段，其包含至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19个或大约20个根据SEQ ID NO:20(KRXKR)或SEQ ID NO:21(KRSKR)的基序。
基。优选的阳离子肽段是由以下组成的：大约70%到大约100%、或大约80%到大约95%、或大约85%到大约90%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸，更优选赖
氨酸和/或精氨酸，以及大约0%到大约30%、或大约5%到大约20%、或大约10%到大约20%中
性氨基酸残基，特别是甘氨酸和/或丝氨酸残基。优选的多肽段由以下组成：大约4%到大约
8%丝氨酸残基、大约33%到大约36%精氨酸残基和大约56%到大约63%赖氨酸残基。特别
优选的多肽段包含至少一个根据SEQ ID NO:20(KRXKR)的基序，其中X是除赖氨酸、精氨酸
和组氨酸以外的任何氨基酸。特别优选的多肽段包含至少一个根据SEQ ID NO:21(KRSKR)
的基序。更优选阳离子肽段，其包含至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、
17、18、19个或大约20个根据SEQ ID NO:20(KRXKR)或SEQ ID NO:21(KRSKR)的基序。
[0097] 还优选多肽段，其由以下组成：大约9到大约16%甘氨酸残基、大约4到大约11%丝氨酸残基、大约26到大约32%精氨酸残基和大约47到大约55%赖氨酸残基。尤其优选
多肽段，其包含至少一个根据SEQ ID NO:22(KRGSG)的基序。更优选阳离子肽段，其包含
至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或大约20个根据SEQ ID NO:22(KRGSG)的基序。
多肽段，其包含至少一个根据SEQ ID NO:22(KRGSG)的基序。更优选阳离子肽段，其包含
至少大约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19个或大约20个根据SEQ ID NO:22(KRGSG)的基序。
[0098] 在本发明的另一个优选的实施方案中阳离子肽段除了带正电荷的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸残基外，还包含疏水性氨基酸残基，特别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。优选的阳离子肽段由以下组成：大约70%到100%、或大约80%到95%、或大约85%到
90%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸，以及大约0%到30%、或大约5%到
20%、或大约10%到20%疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
90%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸，以及大约0%到30%、或大约5%到
20%、或大约10%到20%疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
[0099] 将阳离子和聚阳离子肽段的实例在下表中列出：
[0100] 表3：
[0101]
[0102] 在本发明进一步的方面至少一种融合的肽段是抗微生物肽，其包含净正电荷和大约50%疏水性氨基酸。抗微生物肽是两亲性的，具有大约12到大约50个氨基酸残基的长
度。抗微生物肽天然存在于昆虫、鱼、植物、蛛类、脊椎动物或哺乳动物中。优选地抗微生物肽可以天然存在于以下中：萝卜；蚕蛾；狼蛛；蛙，优选地非洲爪蟾；蛙属的蛙，更优选地牛蛙；蟾蜍，优选地亚洲蟾蜍中华大蟾蜍；蝇，优选地果蝇属，更加优选地黑腹果蝇；埃及伊蚊；蜜蜂；大黄蜂，优选地牧熊蜂；食肉蝇，优选地麻蝇；蝎子；鲎；鲇，优选地鲶鱼；牛；猪(pig)；绵羊；猪类(porcine)；牛类；猴子；和人。
度。抗微生物肽天然存在于昆虫、鱼、植物、蛛类、脊椎动物或哺乳动物中。优选地抗微生物肽可以天然存在于以下中：萝卜；蚕蛾；狼蛛；蛙，优选地非洲爪蟾；蛙属的蛙，更优选地牛蛙；蟾蜍，优选地亚洲蟾蜍中华大蟾蜍；蝇，优选地果蝇属，更加优选地黑腹果蝇；埃及伊蚊；蜜蜂；大黄蜂，优选地牧熊蜂；食肉蝇，优选地麻蝇；蝎子；鲎；鲇，优选地鲶鱼；牛；猪(pig)；绵羊；猪类(porcine)；牛类；猴子；和人。
[0103] 在本发明的另一个优选的实施方案中抗微生物肽段是由以下组成的：大约0%到大约5%、或大约0%到大约35%、或大约10%到大约35%、或大约15%到大约45%、或大约20%
到大约45%的带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸，以及大约50%到大约
80%、或大约60%到大约80%、或大约55%到大约75%、或大约70%到大约90%的疏水性氨基酸
残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
到大约45%的带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸，以及大约50%到大约
80%、或大约60%到大约80%、或大约55%到大约75%、或大约70%到大约90%的疏水性氨基酸
残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
[0104] 在本发明的另一个优选的实施方案中，本发明的抗微生物肽段由以下组成：大约4%到大约58%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸残基以及大约33%到大
约89%的疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
约89%的疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
[0105] 将根据本发明的抗微生物肽的实例在下表中列出。
[0106] 表4：
[0107]
[0108]
[0109]
[0110] 在本发明的进一步的方面，至少一种融合的肽段是寿司肽，其由“Ding JL,LiP,Ho B Cell Mol Life Sci.2008Apr;65(7-8):1202-19The Sushi peptides:structural
characterization and mode of action against Gram-negative bacteria.”所描述。特别优选的是根据SEQ ID NO:63的寿司1肽（sushi1peptide）。
characterization and mode of action against Gram-negative bacteria.”所描述。特别优选的是根据SEQ ID NO:63的寿司1肽（sushi1peptide）。
[0111] 优 选 的 寿 司 肽 是 寿 司 肽S1 和S3以 及 其 倍 体（multiples）；“FASEB J.2000Sep;14(12):1801-13”。
[0112] 在本发明的进一步的方面，至少一种融合的肽段是疏水性肽，其包含以下：90%的疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸残基。在另一个优选的实施方案中融合至本发明的融合蛋白疏水性肽是由以下组成的：大约90%到大约95%、或大约90%到大约100%、或大约95%到大约100%疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
[0113] 优选的疏水性肽是具有根据SEQ ID NO:65的氨基酸序列的Walmagh1，以及具有Phe-Phe-Val-Ala-Pro(SEQ ID NO:66)的氨基酸序列的疏水性肽。
[0114] 在本发明的进一步的方面，至少一种融合肽段是两亲性肽，其包含一种或多种带正电荷的氨基酸残基赖氨酸、精氨酸和/或组氨酸，与疏水性氨基酸残基缬氨酸、异亮氨
酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸的一种或多种组合。氨基酸残基的侧链经导向以使阳离子和疏水
性表面簇集在肽的相反侧。优选地，在所述肽中多于大约30、40、50、60或70%的氨基酸是带正电荷的氨基酸。优选的地，在所述肽中多余多于大约30、40、50、60或70%的氨基酸是疏水性氨基酸残基。有利地，两亲性肽是融合至具有细胞壁降解活性的酶的N-末端或C-末
端的，因此增强了后者蛋白的两亲性。
酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸的一种或多种组合。氨基酸残基的侧链经导向以使阳离子和疏水
性表面簇集在肽的相反侧。优选地，在所述肽中多于大约30、40、50、60或70%的氨基酸是带正电荷的氨基酸。优选的地，在所述肽中多余多于大约30、40、50、60或70%的氨基酸是疏水性氨基酸残基。有利地，两亲性肽是融合至具有细胞壁降解活性的酶的N-末端或C-末
端的，因此增强了后者蛋白的两亲性。
[0115] 在本发明的另一个实施方案中，两亲性肽是由以下组成的：至少5个，更加优选地至 少 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49个或50个氨基酸残基。
在一个优选的实施方案中，所述两亲性肽的氨基酸残基的至少大约30、40、50、60或70%是精氨酸或赖氨酸，和/或所述两亲性肽的氨基酸残基的至少大约30、40、50、60或70%是疏
水性氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
在一个优选的实施方案中，所述两亲性肽的氨基酸残基的至少大约30、40、50、60或70%是精氨酸或赖氨酸，和/或所述两亲性肽的氨基酸残基的至少大约30、40、50、60或70%是疏
水性氨基酸缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和/或甘氨酸。
[0116] 在本发明的另一个优选的实施方案中，两亲性肽段除了带正电荷的氨基酸残基特别是赖氨酸和/或精氨酸外，还包含疏水性氨基酸残基，特别是缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。优选的两亲性肽段是由以下组成的：大约10%到大约50%、或大约20%到大约50%、或大约30%
到大约45%、或大约5%到大约30%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸，以
及大约50%到大约85%、或大约50%到大约90%、或大约55%到大约90%、或大约60%到大约
90%、或大约65%到大约90%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。在另一个优选的实施方案中两亲性肽段由以下组成：12%到大约50%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸
和/或精氨酸残基，以及大约50%到85%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
到大约45%、或大约5%到大约30%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸和/或精氨酸，以
及大约50%到大约85%、或大约50%到大约90%、或大约55%到大约90%、或大约60%到大约
90%、或大约65%到大约90%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。在另一个优选的实施方案中两亲性肽段由以下组成：12%到大约50%带正电荷的氨基酸残基，特别是赖氨酸
和/或精氨酸残基，以及大约50%到85%疏水性氨基酸残基，缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、酪氨酸、组氨酸、苏氨酸、丝氨酸、脯氨酸和甘氨酸残基，更加优选丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、和/或色氨酸残基。
[0117] 优选的两亲性肽是根据SEQ ID NO:68的T4溶菌酶的α4-螺旋和具有根据SEQID NO:64的氨基酸序列的WLBU2-变体以及根据SEQ ID NO:69的Walmagh2。
[0118] 在本发明的另一个优选的实施方案中，根据本发明的融合蛋白的肽段包含氨基酸序列的修饰和/或改变。这类的改变和/或修饰可以包含突变如缺失、插入和添加、取代或
其组合，和/或氨基酸残基的化学改变，例如生物素化、酰基化、聚乙二醇化，氨基-、SH-或羰基-基团的化学改变。
其组合，和/或氨基酸残基的化学改变，例如生物素化、酰基化、聚乙二醇化，氨基-、SH-或羰基-基团的化学改变。
[0119] 在一个优选的实施方案中根据本发明在融合蛋白N-或C-末端上的两个肽段是由与两亲性肽组合的聚阳离子肽组成的。两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:68的T4溶菌酶的
α4-螺旋和具有根据SEQ ID NO:64的氨基酸序列的WLBU2-变体以及根据SEQ ID NO:69的
Walmagh2。在一个优选的实施方案中聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽或根据SEQ
ID NO:34的肽。在另一个优选的实施方案中两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:68的T4-溶
菌酶的α4-螺旋且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案
中两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:69的Walmagh2且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23
的肽。在另一个优选的实施方案中两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:64的WLBU2-变体且聚
阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。根据本发明的融合蛋白的两亲性和聚阳离子肽
连续地排列在N-或C-末端。两亲性和聚阳离子肽在N-或C-末端的顺序无关紧要，例如，
在融合蛋白的N-末端开始是两亲性肽，其后是聚阳离子肽，再其后是酶；或者聚阳离子肽
之后是两亲性肽，其后是酶。或者，酶之后是聚阳离子肽，其后是两亲性肽；或酶之后是两亲性肽，其后是聚阳离子肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
α4-螺旋和具有根据SEQ ID NO:64的氨基酸序列的WLBU2-变体以及根据SEQ ID NO:69的
Walmagh2。在一个优选的实施方案中聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽或根据SEQ
ID NO:34的肽。在另一个优选的实施方案中两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:68的T4-溶
菌酶的α4-螺旋且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案
中两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:69的Walmagh2且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23
的肽。在另一个优选的实施方案中两亲性肽可以是根据SEQ ID NO:64的WLBU2-变体且聚
阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。根据本发明的融合蛋白的两亲性和聚阳离子肽
连续地排列在N-或C-末端。两亲性和聚阳离子肽在N-或C-末端的顺序无关紧要，例如，
在融合蛋白的N-末端开始是两亲性肽，其后是聚阳离子肽，再其后是酶；或者聚阳离子肽
之后是两亲性肽，其后是酶。或者，酶之后是聚阳离子肽，其后是两亲性肽；或酶之后是两亲性肽，其后是聚阳离子肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
[0120] 在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:68的T4-溶菌酶α4-螺旋的两亲性肽与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。在另一个优选的实施方案中，可以使
根据SEQ ID NO:69的Walmagh2两亲性肽与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。在另
一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:64的WLBU2-变体两亲性肽与根据SEQ ID
NO:23的聚阳离子肽组合。
根据SEQ ID NO:69的Walmagh2两亲性肽与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。在另
一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:64的WLBU2-变体两亲性肽与根据SEQ ID
NO:23的聚阳离子肽组合。
[0121] 在优选的实施方案中，根据本发明的在融合蛋白的N-或C-末端的两个肽段是由与疏水性肽组合的聚阳离子肽组成的。在优选的实施方案中，疏水性肽可以是根据SEQ ID NO:66的五肽（pentapeptide）或根据SEQ ID NO:65的Walmagh1。在优选的实施方案中，
聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽或根据SEQ ID NO:34的肽。在另一个优选的
实施方案中，疏水性肽可以是根据SEQ ID NO:66的五肽，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案中，疏水性肽可以是根据SEQ ID NO:65的Walmagh1，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。根据本发明的融合蛋白的疏水性肽和聚阳
离子肽是之后排列在N-或C-末端的。在N-或C-末端的疏水性和聚阳离子肽的顺序无关
紧要，例如，从融合蛋白的N-末端开始是疏水性肽，其后是聚阳离子肽，再其后是酶；或者聚阳离子肽之后是疏水性肽，其后是酶。另选地，酶之后是聚阳离子肽，其后是疏水性肽；或酶之后是疏水性肽，其后是聚阳离子肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽或根据SEQ ID NO:34的肽。在另一个优选的
实施方案中，疏水性肽可以是根据SEQ ID NO:66的五肽，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案中，疏水性肽可以是根据SEQ ID NO:65的Walmagh1，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。根据本发明的融合蛋白的疏水性肽和聚阳
离子肽是之后排列在N-或C-末端的。在N-或C-末端的疏水性和聚阳离子肽的顺序无关
紧要，例如，从融合蛋白的N-末端开始是疏水性肽，其后是聚阳离子肽，再其后是酶；或者聚阳离子肽之后是疏水性肽，其后是酶。另选地，酶之后是聚阳离子肽，其后是疏水性肽；或酶之后是疏水性肽，其后是聚阳离子肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
[0122] 在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:66的五肽疏水性肽与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:65
的Walmagh1疏水性肽与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。
的Walmagh1疏水性肽与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。
[0123] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的在融合蛋白的N-或C-末端的两个肽段是由与抗微生物肽组合的聚阳离子肽组成的。优选地，抗微生物肽可以是根据SEQ ID
NO:62的Parasin1、根据SEQ ID NO:61的Lycotoxin1、根据SEQ ID NO:44的LL37、根据
SEQ ID NO:60的Melittin、根据SEQ ID NO:5的Sarcotoxin IA、根据SEQ ID NO:58的
Pseudin1、根据SEQ ID NO:46的Indolicidin、根据SEQ ID NO:53的Buforin II、根据SEQ ID NO:49的Magainin、或根据SEQ ID NO:51的Cecropin A（埃及伊蚊）。在优选的实施方
案中，聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽或根据SEQ ID NO:34的肽。在另一个优选
的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:62的Parasin1，且聚阳离子肽可以是根
据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:61
的Lycotoxin1，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:45的SMAP-29，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23
的肽。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:51的Cecropin A
（埃及伊蚊），且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:34的肽。根据本发明的融合蛋白的抗微生物和聚阳离子肽是在N-或C-末端之后排列的。抗微生物和聚阳离子肽在N-或C-末
端的顺序无关紧要，例如，在融合蛋白的N-末端开始的是抗微生物肽，其后是聚阳离子肽，再其后是酶；或聚阳离子肽之后是抗微生物肽，其后是酶。另选地，酶之后是聚阳离子肽，其后是抗微生物肽；或酶之后是抗微生物肽，其后是聚阳离子肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
NO:62的Parasin1、根据SEQ ID NO:61的Lycotoxin1、根据SEQ ID NO:44的LL37、根据
SEQ ID NO:60的Melittin、根据SEQ ID NO:5的Sarcotoxin IA、根据SEQ ID NO:58的
Pseudin1、根据SEQ ID NO:46的Indolicidin、根据SEQ ID NO:53的Buforin II、根据SEQ ID NO:49的Magainin、或根据SEQ ID NO:51的Cecropin A（埃及伊蚊）。在优选的实施方
案中，聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽或根据SEQ ID NO:34的肽。在另一个优选
的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:62的Parasin1，且聚阳离子肽可以是根
据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:61
的Lycotoxin1，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23的肽。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:45的SMAP-29，且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:23
的肽。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:51的Cecropin A
（埃及伊蚊），且聚阳离子肽可以是根据SEQ ID NO:34的肽。根据本发明的融合蛋白的抗微生物和聚阳离子肽是在N-或C-末端之后排列的。抗微生物和聚阳离子肽在N-或C-末
端的顺序无关紧要，例如，在融合蛋白的N-末端开始的是抗微生物肽，其后是聚阳离子肽，再其后是酶；或聚阳离子肽之后是抗微生物肽，其后是酶。另选地，酶之后是聚阳离子肽，其后是抗微生物肽；或酶之后是抗微生物肽，其后是聚阳离子肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
[0124] 在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:62的抗微生物肽Parasin1与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:61的抗微生物肽Lycotoxin1与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。在另一个优选
的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:45的抗微生物肽SMAP-29与根据SEQ ID NO:23的
聚阳离子肽组合。在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:51的抗微生物肽
Cecropin A（埃及伊蚊）与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。
的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:45的抗微生物肽SMAP-29与根据SEQ ID NO:23的
聚阳离子肽组合。在另一个优选的实施方案中，可以使根据SEQ ID NO:51的抗微生物肽
Cecropin A（埃及伊蚊）与根据SEQ ID NO:23的聚阳离子肽组合。
[0125] 在另一个优选的实施方案中，根据本发明的在融合蛋白的N-或C-末端的两个肽段是由相异的抗微生物肽组成的。优选地，抗微生物肽可以是根据SEQ ID NO:62的
Parasin1、根据SEQ ID NO:61的Lycotoxin1、根据SEQ ID NO:44的LL37、根据SEQ ID
NO:60的Melittin、根据SEQ ID NO:5的Sarcotoxin IA、根据SEQ ID NO:58的Pseudin1、
根据SEQ ID NO:46的Indolicidin、根据SEQ ID NO:53的Buforin II、根据SEQ ID NO:49
的Magainin、或根据SEQ ID NO:51的Cecropin A（埃及伊蚊）。在另一个优选的实施方
案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:45的抗微生物肽SMAP-29组合的根据SEQ ID
NO:44的LL37。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:60的抗
微生物肽Melittin组合的根据SEQ ID NO:45的SMAP-29。在另一个优选的实施方案中，
抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:54的抗微生物肽Sarcotoxin IA组合的根据SEQ ID
NO:45的SMAP-29。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:46
的抗微生物肽Indolicidin组合的根据SEQ ID NO:58的Pseudin1。在另一个优选的实施
方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:49的抗微生物肽Maginin组合的根据SEQ ID
NO:53的BuforinII。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:44
的抗微生物肽LL37组合的根据SEQ ID NO:58的Pseudin1。根据本发明的融合蛋白的抗微
生物肽是在N-或C-末端之后排列的。在N-或C-末端的抗微生物肽的顺序无关紧要，例
如，在融合蛋白的N-末端开始时抗微生物肽，其后是不同的抗微生物肽，其后是酶；或不同的抗微生物肽之后是抗微生物肽，其后是酶。另选地，酶之后是抗微生物肽，其后是不同的抗微生物肽；或酶之后是不同的抗微生物肽，其后是抗微生物肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
Parasin1、根据SEQ ID NO:61的Lycotoxin1、根据SEQ ID NO:44的LL37、根据SEQ ID
NO:60的Melittin、根据SEQ ID NO:5的Sarcotoxin IA、根据SEQ ID NO:58的Pseudin1、
根据SEQ ID NO:46的Indolicidin、根据SEQ ID NO:53的Buforin II、根据SEQ ID NO:49
的Magainin、或根据SEQ ID NO:51的Cecropin A（埃及伊蚊）。在另一个优选的实施方
案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:45的抗微生物肽SMAP-29组合的根据SEQ ID
NO:44的LL37。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:60的抗
微生物肽Melittin组合的根据SEQ ID NO:45的SMAP-29。在另一个优选的实施方案中，
抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:54的抗微生物肽Sarcotoxin IA组合的根据SEQ ID
NO:45的SMAP-29。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:46
的抗微生物肽Indolicidin组合的根据SEQ ID NO:58的Pseudin1。在另一个优选的实施
方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:49的抗微生物肽Maginin组合的根据SEQ ID
NO:53的BuforinII。在另一个优选的实施方案中，抗微生物肽可以是与根据SEQ ID NO:44
的抗微生物肽LL37组合的根据SEQ ID NO:58的Pseudin1。根据本发明的融合蛋白的抗微
生物肽是在N-或C-末端之后排列的。在N-或C-末端的抗微生物肽的顺序无关紧要，例
如，在融合蛋白的N-末端开始时抗微生物肽，其后是不同的抗微生物肽，其后是酶；或不同的抗微生物肽之后是抗微生物肽，其后是酶。另选地，酶之后是抗微生物肽，其后是不同的抗微生物肽；或酶之后是不同的抗微生物肽，其后是抗微生物肽，使得两个肽都排列在酶的C-末端。
[0126] 在本发明的实施方案中，融合蛋白是由以下组成的：根据SEQ ID NO:19到69和78到98的两个或更多个肽段，以及根据SEQ ID NO:1到18的酶。在本发明优选的实施方
案中，融合蛋白含有两个或更多个选自SEQ ID NO:19到69和78到98的肽段和选自一组
根据SEQ ID NO:1到18的酶的酶。在本发明的另一个优选的实施方案中，融合蛋白含有两
个或更多个选自SEQ ID NO:19到69和78到98的肽段和选自一组根据SEQ ID NO:1到18
的酶的酶，其中肽段融合至酶的N-或C-末端。
案中，融合蛋白含有两个或更多个选自SEQ ID NO:19到69和78到98的肽段和选自一组
根据SEQ ID NO:1到18的酶的酶。在本发明的另一个优选的实施方案中，融合蛋白含有两
个或更多个选自SEQ ID NO:19到69和78到98的肽段和选自一组根据SEQ ID NO:1到18
的酶的酶，其中肽段融合至酶的N-或C-末端。
[0127] 将根据本发明的融合蛋白的具体的实例在下表列出：
[0128] 表3：
[0129]
[0130]
[0131] 根据本发明的融合蛋白，特别是尤其优选的根据SEQ ID NO:70到77和127和147的融合蛋白，可以额外地在N-末端包含甲硫氨酸。
[0132] 根据本发明的融合蛋白，特别是尤其优选的根据SEQ ID NO:70到77和127和147的融合蛋白可以额外地包含标签，例如用于纯化。优选His6-标签，优选地在融合蛋
白的N-末端和/或C-末端。所述标签可以通过额外的氨基酸残基，例如由于克隆的原因
连接至融合蛋白。优选的，所述标签可以通过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或10个额外的氨基酸残基连接至融合蛋白。优选的，所述额外的氨基酸残基可以不被蛋白酶所识别或裂
解。在优选的实施方案中，融合蛋白在C-末端包含His6-标签，其由额外的氨基酸残基赖
氨酸和甘氨酸（Lys-Gly）或亮氨酸和谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白。优选地，所述额外的氨基酸残基可以不被蛋白酶所识别或裂解。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白
在N-末端包含His6-标签，其由额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸（Lys-Gly）或亮氨酸和
谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白在N-和C-段
包含His6-标签，其由额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸（Lys-Gly）或亮氨酸和谷氨酸
（Leu-Glu）连接至融合蛋白。
白的N-末端和/或C-末端。所述标签可以通过额外的氨基酸残基，例如由于克隆的原因
连接至融合蛋白。优选的，所述标签可以通过至少1、2、3、4、5、6、7、8、9个或10个额外的氨基酸残基连接至融合蛋白。优选的，所述额外的氨基酸残基可以不被蛋白酶所识别或裂
解。在优选的实施方案中，融合蛋白在C-末端包含His6-标签，其由额外的氨基酸残基赖
氨酸和甘氨酸（Lys-Gly）或亮氨酸和谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白。优选地，所述额外的氨基酸残基可以不被蛋白酶所识别或裂解。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白
在N-末端包含His6-标签，其由额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸（Lys-Gly）或亮氨酸和
谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白在N-和C-段
包含His6-标签，其由额外的氨基酸残基赖氨酸和甘氨酸（Lys-Gly）或亮氨酸和谷氨酸
（Leu-Glu）连接至融合蛋白。
[0133] 在更加优选的实施方案中，融合蛋白在C末端包含His6-标签，其由额外的亮氨酸和谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白，并且根据本发明的的融合蛋白的第二肽段连接至第一肽段的N-末端，其通过额外的氨基酸残基甘氨酸和丝氨酸(Gly-Ser)，甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)和/或以及融合蛋
白在N-末端包含额外的氨基酸残基甲硫氨酸(Met)或甲硫氨酸和甘氨酸(Met-Gly)或甲
硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Met-Gly-Ser)。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白在C末端
包含His6-标签，其由额外的亮氨酸和谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白，并且根据本发明的的融合蛋白的第二肽段连接至第一肽段的N-末端，其通过额外的氨基酸残基甘氨酸和
丝氨酸(Gly-Ser)，甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，并且第一肽段融合至酶的N-末端，其通过额外的氨基酸残基甘氨酸
和丝氨酸(Gly-Ser)，甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，和/或融合蛋白在N-末端包含额外的氨基酸残基甲硫氨酸(Met)
或甲硫氨酸和甘氨酸(Met-Gly)或甲硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Met-Gly-Ser)。
白在N-末端包含额外的氨基酸残基甲硫氨酸(Met)或甲硫氨酸和甘氨酸(Met-Gly)或甲
硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Met-Gly-Ser)。在另一个优选的实施方案中，融合蛋白在C末端
包含His6-标签，其由额外的亮氨酸和谷氨酸（Leu-Glu）连接至融合蛋白，并且根据本发明的的融合蛋白的第二肽段连接至第一肽段的N-末端，其通过额外的氨基酸残基甘氨酸和
丝氨酸(Gly-Ser)，甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，并且第一肽段融合至酶的N-末端，其通过额外的氨基酸残基甘氨酸
和丝氨酸(Gly-Ser)，甘氨酸、丝氨酸和丝氨酸(Gly-Ser-Ser)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala)，甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)或甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸、丙氨酸、甘氨酸和丙氨酸(Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala-Gly-Ala)，和/或融合蛋白在N-末端包含额外的氨基酸残基甲硫氨酸(Met)
或甲硫氨酸和甘氨酸(Met-Gly)或甲硫氨酸、甘氨酸和丝氨酸(Met-Gly-Ser)。
[0134] 融合蛋白是通过使用标准克隆技术，如由“Sambrook等2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual”所描述的，通过连接至少三个核酸序列而构建的。可以，例如在重组DNA表达系统中，产生这类蛋白。根据本发明的这类融合蛋白可以通过融合内溶
素和相应的肽段的核酸而获得。
素和相应的肽段的核酸而获得。
[0135] 根据本发明的融合蛋白可以融合或连接至其他额外的蛋白。这些额外蛋白的实例是硫氧还蛋白。
[0136] 本发明进一步涉及编码根据本发明的融合蛋白的分离的核酸分子。本发明进一步涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。所述载体可以提供所述根据本发明的融合蛋白的
组成型或诱导型表达。
组成型或诱导型表达。
[0137] 本发明还涉及用于从微生物，如遗传修饰的合适的宿主细胞获得所述融合蛋白的方法，其中所述宿主细胞表达所述融合蛋白。所述宿主细胞可以是微生物如细菌或酵母或
动物细胞如，例如哺乳动物细胞，特别是人细胞。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）细胞。可以仅仅基于生物工程的原因，例如产率、可溶性、成本等等而选择宿主，但是也可以从医学的角度来选择，例如非病理性细菌或酵母、人细胞。本发明的一个方面提及用于产生融合蛋白的方法，其包括在支持所述融合蛋白的表
达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸序列。
动物细胞如，例如哺乳动物细胞，特别是人细胞。在本发明的一个实施方案中，宿主细胞是巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）细胞。可以仅仅基于生物工程的原因，例如产率、可溶性、成本等等而选择宿主，但是也可以从医学的角度来选择，例如非病理性细菌或酵母、人细胞。本发明的一个方面提及用于产生融合蛋白的方法，其包括在支持所述融合蛋白的表
达的条件下培养宿主细胞，所述宿主细胞包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸序列。
[0138] 本发明的另一个方面涉及为了获得根据本发明的融合蛋白的表达而遗传转化合适的宿主细胞的方法，其中通过向宿主细胞中引入编码所述融合蛋白的遗传材料而遗传修
饰宿主细胞，以及通过本领域技术人员所熟知的基因工程方法获得其翻译与表达。
饰宿主细胞，以及通过本领域技术人员所熟知的基因工程方法获得其翻译与表达。
[0139] 在进一步的方面中，本发明涉及组合物，优选药物组合物，其包含根据本发明的融合蛋白和/或宿主细胞，所述宿主细胞用包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸序列的核酸分子或载体转化。
[0140] 在本发明的一个优选的实施方案中，组合物额外地包含透化革兰氏阴性细菌的外膜的制剂，如金属螯合剂，如例如EDTA、TRIS、乳酸、乳铁蛋白（lactoferrin）、多 粘 菌 素（polymyxin）、柠 檬 酸 和 /或 其 它 物 质，如 由 Vaara（Agents that increase the permeability of the outer membrane.Vaara M.Microbiol.
Rev.1992Sep;56(3):395-441）所描述的。还优选组合物，其包含上述透化制剂的组合。尤其优选组合物，其包含大约10μM到大约100mM EDTA、更优选大约50μM到大约10mM EDTA、更优选大约0.5mM到大约10mM EDTA、更优选大约0.5mM到大约2mM EDTA、更优选大约0.5mM
到1mM EDTA。然而，包含大约10μM到大约0.5mM EDTA的组合物也是优选的。还优选包
含大约0.5mM到大约2mM EDTA，更优选大约1mM EDTA以及额外的大约10mM到大约100mM
TRIS的组合物。
Rev.1992Sep;56(3):395-441）所描述的。还优选组合物，其包含上述透化制剂的组合。尤其优选组合物，其包含大约10μM到大约100mM EDTA、更优选大约50μM到大约10mM EDTA、更优选大约0.5mM到大约10mM EDTA、更优选大约0.5mM到大约2mM EDTA、更优选大约0.5mM
到1mM EDTA。然而，包含大约10μM到大约0.5mM EDTA的组合物也是优选的。还优选包
含大约0.5mM到大约2mM EDTA，更优选大约1mM EDTA以及额外的大约10mM到大约100mM
TRIS的组合物。
[0141] 本发明还涉及以下作为药物的用途：根据本发明的融合蛋白和/或用包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸转化的宿主。在进一步的方面中本发明涉及根据本发明的融合
蛋白和/或以包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸转化的宿主在制备用于治疗和/或预
防与革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌相关的病症、疾病或病况的药物中的用途。特别是
治疗和/或预防由包含对人或动物有病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阴性细
菌所造成的病症、疾病或病况，所述革兰氏阴性细菌如肠杆菌科(埃希氏菌属,尤其是大
肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属，尤其是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)、假单胞菌科(假单胞菌属,尤其是铜绿假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属、寡养单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞菌属)、奈瑟氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、布鲁氏菌属、弗朗西丝氏菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴尔通氏体属、考克斯氏体属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、曼氏菌属、放线杆菌属、加德纳氏菌属、螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属、螺杆菌属、螺菌属、链杆菌属、类杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属)、不动杆菌属，尤其是鲍氏不动杆菌。特别是治疗和/或预防包含对人或动物有病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阳性细菌所造成的病症、疾病或病况，所述革兰氏阳性细菌如单核细胞增多性利斯特
氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、变形链球菌、马链球菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、疮疱丙酸杆菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、白喉棒杆菌、肺炎支原体、放线菌属。
蛋白和/或以包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸转化的宿主在制备用于治疗和/或预
防与革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌相关的病症、疾病或病况的药物中的用途。特别是
治疗和/或预防由包含对人或动物有病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阴性细
菌所造成的病症、疾病或病况，所述革兰氏阴性细菌如肠杆菌科(埃希氏菌属,尤其是大
肠杆菌、沙门氏菌属、志贺氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、哈夫尼菌属、克雷伯氏菌属，尤其是肺炎克雷伯氏菌、摩根氏菌属、变形杆菌属、普罗维登斯菌属、沙雷氏菌属、耶尔森氏菌属)、假单胞菌科(假单胞菌属,尤其是铜绿假单胞菌、伯克霍尔德氏菌属、寡养单胞菌属、希瓦氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、丛毛单胞菌属)、奈瑟氏菌属、莫拉氏菌属、弧菌属、气单胞菌属、布鲁氏菌属、弗朗西丝氏菌属、博德特氏菌属、军团菌属、巴尔通氏体属、考克斯氏体属、嗜血菌属、巴斯德氏菌属、曼氏菌属、放线杆菌属、加德纳氏菌属、螺旋体科(密螺旋体属和疏螺旋体属)、钩端螺旋体科、弯曲杆菌属、螺杆菌属、螺菌属、链杆菌属、类杆菌科(拟杆菌属、梭杆菌属、普雷沃氏菌属、卟啉单胞菌属)、不动杆菌属，尤其是鲍氏不动杆菌。特别是治疗和/或预防包含对人或动物有病原性的菌株的细菌组、科、属或种的革兰氏阳性细菌所造成的病症、疾病或病况，所述革兰氏阳性细菌如单核细胞增多性利斯特
氏菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、肺炎链球菌、酿脓链球菌、变形链球菌、马链球菌、艰难梭菌、肉毒梭菌、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、炭疽芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、疮疱丙酸杆菌、鸟分枝杆菌、结核分枝杆菌、白喉棒杆菌、肺炎支原体、放线菌属。
[0142] 本发明还涉及药物，其包含根据本发明的融合蛋白和/或宿主，所述宿主用包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化。
[0143] 在进一步的方面中本发明涉及在需要治疗和/或预防的受试者中治疗病症、疾病或病况的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据本发明的融合蛋白和/或有
效量的以包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主细胞或根据本
发明的组合物。受试者可以是人或动物。
效量的以包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主细胞或根据本
发明的组合物。受试者可以是人或动物。
[0144] 特别地，所述治疗方法可以用于治疗或预防由革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌所造成的病症、疾病或病况，热别是由革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌所造成的细菌感
染。
染。
[0145] 特别地，所述治疗方法可以用于治疗和/或预防皮肤的、软组织的、呼吸系统的、肺的、消化道的、眼的、耳的、牙齿的、鼻咽的、口的、骨的、阴道的、菌血症（bacteraemia）的伤口的感染、和/或心内膜炎（endocarditis），其是由革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌造成的，特别是由如上面所列出的革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌造成的。
[0146] 根据本发明的治疗（或预防（prophylaxis））方法中使用的剂量和给药途径依赖于待治疗的具体疾病/感染位点。给药途径可以是，例如口腔、局部的（topical）、鼻咽、肠胃外、静脉、直肠、或任意其它给药途径。
[0147] 对于将根据本发明的融合蛋白和/或有效量的以包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主细胞或根据本发明的组合物施用在感染的位点或
有感染危险的位点，可以使用保护活性化合物免受环境影响的配制物，所述环境影响如
蛋白酶、氧化、免疫应答等，直到其到达感染的位点。因此，配制物可以是胶囊、糖衣片
（dragee）、药丸（pill）、粉末、栓剂、乳剂（emulsion）、悬浊液（suspension）、凝胶（gel）、洗剂（lotion）、乳膏（cream）、药膏（salve）、可注射溶液、糖浆（syrup）、喷雾剂（spray）、吸入剂（inhalant）或任意其它医学合理的盖仑制剂（galenic formulation）。优选的，盖伦制剂可以包含合适的载体（carriers）、稳定剂（stabilizers）、调味剂（flavourings）、缓冲液（buffers）或其它合适的试剂。例如，对于局部施用，配制物可以是洗剂、乳膏、凝胶、药膏或硬膏剂（plaster），对于鼻咽施用，配制物可以是经由向鼻中喷雾而施用的盐水溶液。对于在治疗和/或预防特定的感染位点（例如肠中）的情况中的口腔施用，可以有必要保护根据本发明的融合蛋白使其不受肠胃道的苛刻的消化环境的影响直至到达感染的位点。因此，
可以使用细菌作为载体，其可以在胃中的消化初始步骤存活并之后向肠环境中分泌根据本
发明的融合蛋白。
有感染危险的位点，可以使用保护活性化合物免受环境影响的配制物，所述环境影响如
蛋白酶、氧化、免疫应答等，直到其到达感染的位点。因此，配制物可以是胶囊、糖衣片
（dragee）、药丸（pill）、粉末、栓剂、乳剂（emulsion）、悬浊液（suspension）、凝胶（gel）、洗剂（lotion）、乳膏（cream）、药膏（salve）、可注射溶液、糖浆（syrup）、喷雾剂（spray）、吸入剂（inhalant）或任意其它医学合理的盖仑制剂（galenic formulation）。优选的，盖伦制剂可以包含合适的载体（carriers）、稳定剂（stabilizers）、调味剂（flavourings）、缓冲液（buffers）或其它合适的试剂。例如，对于局部施用，配制物可以是洗剂、乳膏、凝胶、药膏或硬膏剂（plaster），对于鼻咽施用，配制物可以是经由向鼻中喷雾而施用的盐水溶液。对于在治疗和/或预防特定的感染位点（例如肠中）的情况中的口腔施用，可以有必要保护根据本发明的融合蛋白使其不受肠胃道的苛刻的消化环境的影响直至到达感染的位点。因此，
可以使用细菌作为载体，其可以在胃中的消化初始步骤存活并之后向肠环境中分泌根据本
发明的融合蛋白。
[0148] 在本发明的具体的实施方案中，根据本发明的融合蛋白和/或以包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸的载体而转化的宿主用在生产药物中，所述药物用于
治疗和/或预防由假单胞菌属造成的，特别是由铜绿假单胞菌造成的病症、疾病或
病况，特别是肠病变，特别是在婴儿中，脑膜的感染，例如出血性脑膜炎（meningitis
haemorrhagica），中耳、皮肤（坏疽性深脓疱（Ecthyma gangraenosum））的感染，特别是烧伤，泌尿道，鼻炎，菌血性肺炎（bacteremic pneumonia），特别是当患者患有囊性纤
维化病或血液恶性肿瘤（hematologic malignancies）如白血病，或患有来自免疫抑制
性治疗法（immunosuppressive therapy）的嗜中性白血球减少症（neutropenia），败
血病（septicemia），特别是因为长期静脉或尿道导管插入（intravenous or urinary
catheterization），有创性外科手术（invasive surgical procedures）和严重烧伤，
心内膜炎，特别是其中患者是静脉药物使用者或是具有来自心脏直视手术（open heart
surgery）的并发症的患者，具有高度破坏性眼部感染（highly destructive ocular
infections），特别是使用污染的眼科溶液（ophthalmologic solutions）后或严重脸部烧伤后，骨软骨炎（osteochondritis），特别是由于通过污染的衣物的严重创伤或刺伤。
治疗和/或预防由假单胞菌属造成的，特别是由铜绿假单胞菌造成的病症、疾病或
病况，特别是肠病变，特别是在婴儿中，脑膜的感染，例如出血性脑膜炎（meningitis
haemorrhagica），中耳、皮肤（坏疽性深脓疱（Ecthyma gangraenosum））的感染，特别是烧伤，泌尿道，鼻炎，菌血性肺炎（bacteremic pneumonia），特别是当患者患有囊性纤
维化病或血液恶性肿瘤（hematologic malignancies）如白血病，或患有来自免疫抑制
性治疗法（immunosuppressive therapy）的嗜中性白血球减少症（neutropenia），败
血病（septicemia），特别是因为长期静脉或尿道导管插入（intravenous or urinary
catheterization），有创性外科手术（invasive surgical procedures）和严重烧伤，
心内膜炎，特别是其中患者是静脉药物使用者或是具有来自心脏直视手术（open heart
surgery）的并发症的患者，具有高度破坏性眼部感染（highly destructive ocular
infections），特别是使用污染的眼科溶液（ophthalmologic solutions）后或严重脸部烧伤后，骨软骨炎（osteochondritis），特别是由于通过污染的衣物的严重创伤或刺伤。
[0149] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由类鼻疽伯克霍尔德氏菌属（Burkholderia pseudomallei）造成的，特别是惠特莫尔氏病（Whitmore’s
Disease）、慢性肺炎、败血病、特别是其中患者具有创伤性皮肤病损（traumatized skin lesion）。
Disease）、慢性肺炎、败血病、特别是其中患者具有创伤性皮肤病损（traumatized skin lesion）。
[0150] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella thyphimurium）和肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)造成的，特别是急性胃肠炎和局部化脓过程（local purulent processes），特别是骨髓炎、心内膜炎、胆囊炎以及尤其是由鼠伤寒沙门氏菌造成的脑膜炎，特别是其中患者是小于两岁。
[0151] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由伤寒沙门菌（Salmonella typhi）造成的，特别是伤寒（typus）。
[0152] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由副伤寒沙门氏菌（Salmonell paratyphi）造成的，特别是副伤寒（paratyphus）。
[0153] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由鲍氏不动杆菌（Acinetobacter baumannii）造成的，特别是支气管炎、肺炎、伤口感染和败血病，特别是由于静脉导管插入（intravenous catheterization）造成的。
[0154] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由大肠杆菌（Escherichia coli）造成的，特别是肠外感染（extra intestinal infections）、特别是阑尾炎、化脓性胆囊炎（purulent cholecystitis）、腹膜炎（peritonitis）、化脓性脑膜炎（purulent meningitis）和泌尿道的感染、肠内大肠杆菌感染，特别是流行性肠炎、以及与痢疾相似的感染疾病、败血病、肠源性毒血症（enterotoxemia）、乳腺炎和痢疾。
[0155] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由肺炎克雷伯氏杆菌（Klebsiella pneumoniae）造成的，特别是肺炎、菌血症、脑膜炎和泌尿道的感染。
[0156] 在本发明的一个具体的实施方案中，将根据本发明的融合蛋白和/或以包含核酸分子（其包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列）的载体转化的宿主细胞用于生产
药物，所述药物用于治疗和/或预防由单核细胞增多性利斯特氏菌所造成的病症、疾病或
病况，特别是婴儿脓毒性肉芽肿（Granulomatosis infantiseptica）（新生儿的利斯特菌病（listeriosis））、单核细胞增多症（mononucleosis）、结膜炎（conjunctivitis）、脑膜炎、脓毒性肉芽肿（granulomatosis septica）和怀孕妇女的利斯特菌病。
药物，所述药物用于治疗和/或预防由单核细胞增多性利斯特氏菌所造成的病症、疾病或
病况，特别是婴儿脓毒性肉芽肿（Granulomatosis infantiseptica）（新生儿的利斯特菌病（listeriosis））、单核细胞增多症（mononucleosis）、结膜炎（conjunctivitis）、脑膜炎、脓毒性肉芽肿（granulomatosis septica）和怀孕妇女的利斯特菌病。
[0157] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由金黄色葡萄球菌造成的，特别是皮肤的感染如脓皮病（pyoderma），特别是毛囊炎（folliculitis），疖（furuncle），痈（carbuncle），汗腺的脓肿和天疱疮（abscesses of the sweat glands and pemphigus）,以及类似的皮肤烫伤样综合征（scaled skin syndrome）。皮肤烫伤样
综合征可以以三种临床现象出现：剥脱性皮炎（dermatitis exfoliativa）、大疱性脓疱病（impetigo bullosa）以及猩红热样红皮病（scarlatiniform erythroderma）。此外，由金黄色葡萄球菌造成的病症、疾病或病况是葡萄球菌肺炎（Staphylococcus pneumonia），医务人员病（hospitalism），特别是手术伤口感染，产褥期乳腺炎（mastitis puerperalis）和小肠结肠炎（enterokolitis），以及食物中毒。
综合征可以以三种临床现象出现：剥脱性皮炎（dermatitis exfoliativa）、大疱性脓疱病（impetigo bullosa）以及猩红热样红皮病（scarlatiniform erythroderma）。此外，由金黄色葡萄球菌造成的病症、疾病或病况是葡萄球菌肺炎（Staphylococcus pneumonia），医务人员病（hospitalism），特别是手术伤口感染，产褥期乳腺炎（mastitis puerperalis）和小肠结肠炎（enterokolitis），以及食物中毒。
[0158] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由酿脓链球菌造成的，特别是扁桃体炎（tonsillitis）、咽炎（pharyngitis）、猩红热（scarlet）、丹 毒（erysipelas）、风 湿 热（rheumatic fever）以 及 急 性 肾 小 球 肾 炎（acute glomerulonephritis）。
[0159] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由肺炎链球菌造成的，特别是肺炎、匐行性角膜溃疡（ulcus serpens corneae）、中耳炎（otitis media）、脑膜炎、腹膜炎（peritonitis）、乳突炎（mastoiditis）和骨髓炎。
[0160] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由产气荚膜梭菌造成的，特别是气性坏疽（gas gangrene）、坏死溃疡性肠炎（enteritis necroticans
ulcerosa）以及食物中毒。
ulcerosa）以及食物中毒。
[0161] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由肉毒梭菌造成的，特别是肉毒中毒（botulism）。
[0162] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由艰难梭菌造成的，特别是假膜性小肠结肠炎（pseudomembranoes enterokolitis）。
[0163] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由炭疽芽孢杆菌造成的，特别是皮肤炭疽（cutaneous anthrax）、吸入性炭疽（inhalation anthrax）、以及胃肠炭疽（gastrointestinal anthrax）。
[0164] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由粪肠球菌或屎肠球菌造成的，如医院内感染（nosokomial infections）和心内膜炎（endokarditis）。
[0165] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由蜡样芽胞杆菌造成的，特别是食物中毒、支气管肺炎（bronchial pneumonia）、败血病和脑膜炎。
[0166] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由鸟分枝杆菌、副结核分枝杆菌（Mycobacterium paratuberculosis）和结核分枝杆菌造成的，特别是结核病。
[0168] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由放线菌造成的，特别是在人、家畜（cattle）、猫和狗中的放线菌病。
[0169] 在本发明的另一个具体的实施方案中，病症、疾病或病况是由白喉棒杆菌造成的，特别是扁桃体、鼻、鼻咽或中耳的局部白喉（localized diphtheria of the
tonsils,the nose,the nasopharynx or the middle ear），喉、气管和支气管的进行性白喉（progressive diphtheria of the larynx,the trachea and the bronchi），毒性或恶性白喉（toxic or maligne diphtheria），皮肤和伤口白喉。
tonsils,the nose,the nasopharynx or the middle ear），喉、气管和支气管的进行性白喉（progressive diphtheria of the larynx,the trachea and the bronchi），毒性或恶性白喉（toxic or maligne diphtheria），皮肤和伤口白喉。
[0170] 优选地，将根据本发明的融合蛋白用于医疗（medical treatment），如果要治疗或预防的感染室由多重抗性的细菌菌株造成的，特别是由针对以下抗生素的一种或多种有抗性的菌株：链霉素、四环素、头孢噻吩（cephalothin）、庆大霉素、头孢噻肟(cefotaxime)、头孢菌素(cephalosporin)、头孢他啶(ceftazidime)或亚胺培南（imipenem）。此外，可将根据本发明的融合蛋白用于治疗方法，即将融合蛋白与常规抗菌制剂，如抗生素、硫醚抗生素（lantibiotics）、细菌素或内溶素组合。
[0171] 本发明还涉及药物包（pharmaceutical pack），其包含一个或多个室（compartments），其中至少一个室包含一种或多种根据本发明的融合蛋白和/或一种或多种以包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列的核酸转化的宿主或根据本发明的组
合物。
合物。
[0172] 在另一个方面本发明涉及制备药物组合物的工艺，所述工艺包括使以下混合：根据本发明的一种或多种融合蛋白和/或以包含编码根据本发明的融合蛋白的核苷酸序列
的核酸转化的宿主，以及药用的稀释剂、赋形剂（excipient）或载体（carrier）。
的核酸转化的宿主，以及药用的稀释剂、赋形剂（excipient）或载体（carrier）。
[0173] 在甚至进一步的方面，根据本发明的组合物是美容用组合物（cosmeticcomposition）。几种细菌菌种可以对患者的身体的环境暴露的表面如皮肤造成刺激。为了预防这类刺激或为了消除所述细菌致病源的微小表现（minor manifestations），可以使用特定的美容用制备物，其包含足够量的根据本发明的融合蛋白以降解已经存在的或新移入
的病原性革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌。
的病原性革兰氏阴性和/或革兰氏阳性细菌。
[0174] 在进一步的方面本发明涉及将根据本发明的融合蛋白用于医药、食物或饲料或环境诊断中的诊断手段，特别是作为诊断特别由革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌造成的细
菌感染的诊断手段。在该方面，可以将根据本发明的融合蛋白用于特异性降解病原性细菌，特别是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性的病原性细菌的工具。根据本发明的融合蛋白的对细
菌细胞的降解可以由添加洗涤剂（detergents）如Triton X-100或其它弱化细菌细胞的细
胞被膜的添加剂如多粘霉素B（polymyxin B）所支持。需要特定的细胞降解作为初始步骤
以用于对细菌使用的以下方法进行后续的特异性检测：基于核酸的方法如PCR、核酸杂交
或NASBA（基于核酸序列的扩增（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）），免疫方法如IMS、免疫荧光法或ELISA技术，或其它依靠细菌细胞的细胞内容物的方法，如使用特
异于相异的细菌组或种的蛋白的酶测定法，例如对于肠杆菌的β-半乳糖苷酶、对于凝固
酶阳性菌株的凝固酶。
菌感染的诊断手段。在该方面，可以将根据本发明的融合蛋白用于特异性降解病原性细菌，特别是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性的病原性细菌的工具。根据本发明的融合蛋白的对细
菌细胞的降解可以由添加洗涤剂（detergents）如Triton X-100或其它弱化细菌细胞的细
胞被膜的添加剂如多粘霉素B（polymyxin B）所支持。需要特定的细胞降解作为初始步骤
以用于对细菌使用的以下方法进行后续的特异性检测：基于核酸的方法如PCR、核酸杂交
或NASBA（基于核酸序列的扩增（Nucleic Acid Sequence Based Amplification）），免疫方法如IMS、免疫荧光法或ELISA技术，或其它依靠细菌细胞的细胞内容物的方法，如使用特
异于相异的细菌组或种的蛋白的酶测定法，例如对于肠杆菌的β-半乳糖苷酶、对于凝固
酶阳性菌株的凝固酶。
[0175] 在进一步的方面本发明涉及将根据本发明的融合蛋白用于处理、去除、减少或预防革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌对食品；食物加工设备；食物加工工厂；与食品接触的表面如货架和食物存放区域的污染；以及所有其它情景中的污染，其中病原性、条件病原性（facultative pathogenic）或其它不合意的细菌可以潜在地侵染（infest）食物材料；医疗装置；以及对医院中和手术室/诊疗室中的所有种类的表面的污染。
[0176] 在进一步的方面本发明涉及方法，其用于处理、去除、减少或预防革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌对食品；食物加工设备；食物加工工厂；与食品接触的表面如货架和食物存放区域的污染；以及所有其它情景中的污染，其中病原性、条件病原性或其它不合意的细菌可以潜在地侵染食物材料；对医疗装置；以及医院中和手术室/诊疗室中的所有种类
的表面的污染，所述方法包括使所述食品、食物加工设备、食物加工工厂、与食品接触的表面、医疗装置、医院中和手术室/诊疗室中的表面与根据本发明的融合蛋白接触。
的表面的污染，所述方法包括使所述食品、食物加工设备、食物加工工厂、与食品接触的表面、医疗装置、医院中和手术室/诊疗室中的表面与根据本发明的融合蛋白接触。
[0177] 本发明的另一个方面涉及方法，其用于在来自受试者的样品中或在食物或饲料中，或环境样品检测细菌，所述方法包括使所述样品与根据本发明的融合蛋白接触。本发明的融合蛋白所检测的细菌可以是革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌。受试者的样品，特别
是人或动物的样品，可以是任意的体液，如血清和尿液，以及其它器官和组织。
是人或动物的样品，可以是任意的体液，如血清和尿液，以及其它器官和组织。
[0178] 特别地，本发明的融合蛋白可以预防地用作消毒制剂（sanitizing agent）。所述消毒制剂可以在外科手术之前或之后使用，或在例如血液透析（hemodialysis）期间使用。此外可以用根据本发明的融合蛋白来治疗未成熟儿（premature infants）和免疫妥协的人（immunocompromised persons），或需要假体装置（prosthetic devices）的受试者。所述治疗可以是预防性的或在急性感染期间进行。在同样的情况中，对于医院内感染，尤其是由耐抗生素菌株如铜绿假单胞菌(FQRP)，不动杆菌属菌种和肠杆菌科如大肠杆菌,沙门氏菌
属,志贺氏菌属,柠檬酸杆菌属,爱德华氏菌属,肠杆菌属,哈夫尼菌属,克雷伯氏菌属,
摩根氏菌属,变形杆菌属,普罗维登斯菌属,沙雷氏菌属,耶尔森氏菌属菌种,甲氧西林
抗性金黄色葡萄球菌,万古霉素抗性粪肠球菌,万古霉素抗性屎肠球菌,肺炎链球菌,疮
疱丙酸杆菌,多重抗性结核分枝杆菌的感染，可以以本发明的融合蛋白预防性地治疗或在
急性期（acute phase）期间治疗。因此，根据本发明的融合蛋白还可以与其它消毒溶液中有用的成分如洗涤剂、表面活性剂（tensids）、溶剂、抗生素、硫醚抗生素（lanthibiotics）或细菌素组合用作消毒剂。
属,志贺氏菌属,柠檬酸杆菌属,爱德华氏菌属,肠杆菌属,哈夫尼菌属,克雷伯氏菌属,
摩根氏菌属,变形杆菌属,普罗维登斯菌属,沙雷氏菌属,耶尔森氏菌属菌种,甲氧西林
抗性金黄色葡萄球菌,万古霉素抗性粪肠球菌,万古霉素抗性屎肠球菌,肺炎链球菌,疮
疱丙酸杆菌,多重抗性结核分枝杆菌的感染，可以以本发明的融合蛋白预防性地治疗或在
急性期（acute phase）期间治疗。因此，根据本发明的融合蛋白还可以与其它消毒溶液中有用的成分如洗涤剂、表面活性剂（tensids）、溶剂、抗生素、硫醚抗生素（lanthibiotics）或细菌素组合用作消毒剂。
[0179] 对于根据本发明的融合蛋白作为消毒剂，例如在医院中、牙外科（dentalsurgery）、兽医、厨房或浴室种的用途，可以将融合蛋白以以下的形式制备：例如流体、粉末、凝胶、或者湿纸巾或消毒片产品的成分。所述组合物可以为其相应的用途和形式，分别额外包含合适的载体（carrier）、添加剂、稀释剂和/或赋形剂-但还可以包含支持抗微
生物活性的制剂如EDTA或增强融合蛋白的抗微生物活性的制剂。融合蛋白还可以与通常
的消毒剂一起使用，所述消毒剂如醇、醛、氧化剂、酚类化合物（phenolics）、季铵类化合物（quaternary ammonium compounds）或紫外光。对于消毒例如表面、物体和/或装置，可将融合蛋白施用于所述表面、物体和/或装置上。施用可以例如以下列方式进行：以任何手段如布（cloth）或擦布（rag），通过喷洒、倾倒，来润湿消毒组合物，。融合蛋白可以取决于相应的应用和意图获得完全的抗微生物活性的“反应时间”而以变化的浓度使用。
生物活性的制剂如EDTA或增强融合蛋白的抗微生物活性的制剂。融合蛋白还可以与通常
的消毒剂一起使用，所述消毒剂如醇、醛、氧化剂、酚类化合物（phenolics）、季铵类化合物（quaternary ammonium compounds）或紫外光。对于消毒例如表面、物体和/或装置，可将融合蛋白施用于所述表面、物体和/或装置上。施用可以例如以下列方式进行：以任何手段如布（cloth）或擦布（rag），通过喷洒、倾倒，来润湿消毒组合物，。融合蛋白可以取决于相应的应用和意图获得完全的抗微生物活性的“反应时间”而以变化的浓度使用。
[0180] 在进一步的方面本发明涉及将根据本发明的融合蛋白用作食物添加剂。
[0181] 本发明的另一个方面是本发明可以类似工具箱（tool box）而使用，即上面公开的任何肽段和抗微生物肽可以融合至本文中公开的任何内溶素、自溶素或细菌素。因此，可能组合相应的肽段，其使融合蛋白能够与相应的细菌以及内溶素、自溶素或细菌素结合，其抑制了相应的细菌的生长。因此，有可能对任意应该消除的细菌构建合适的融合蛋白。
[0182] 本发明的进一步的适用性的范围将会通过以下给出的详细的描述而显出，然而，应该理解，详细的描述和具体的例子虽然指示了本发明的优选的实施方案，但其仅仅是通
过例示性的方式给出，因为在本发明的精神和范围之中的多种改变和修改将会通过该详细
的描述而对于本领域技术人员是明显的。应当理解，前述的一般性的表述和下面的详细的
描述仅仅是例示性和解释性的，而非限制如寻求保护的本发明。
过例示性的方式给出，因为在本发明的精神和范围之中的多种改变和修改将会通过该详细
的描述而对于本领域技术人员是明显的。应当理解，前述的一般性的表述和下面的详细的
描述仅仅是例示性和解释性的，而非限制如寻求保护的本发明。
[0183] 下面的实施例解释本发明，但不应理解为限制性的。除非不同指示，使用了分子生物学的标准方法，如，例如由Sambrock等，1989,Molecular Cloning:A Laboratory
Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New
York所描述的。
Manual,2nd edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New
York所描述的。
[0184] 实施例1：抗菌肽标签N-端融合到PK-修饰的恶臭假单胞菌噬菌体OBP的内溶素（PK-OBPgpLys）
[0185] 将PK-OBPgpLys，带有根据SEQ ID NO:23的N-末端聚阳离子肽的恶臭假单胞菌噬菌体OBP的修饰的内溶素变体，N-端融合至天然抗菌肽标签、两亲性和疏水性肽段（表4）以研究其抗革兰氏阴性活性。
[0186] 表4：融合至PK-OBPgpLYS的抗菌肽标签的列表
[0187]
[0188]
[0189] *Matthews,B.W.和Remington,S.J.(1974).The three dimensional structureof the lysozyme from bacteriophage T4.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,71:4178-4182
[0190] **In Yup Park,Chan Bae Park,Mi Sun Kim,Sun Chang Kim(1998).ParasinI,an antimicrobial peptide derived from histone H2A in the Parasilurus
asotus.FEBS Letters437258-262
asotus.FEBS Letters437258-262
[0191] ***Yan,L and Adams,M.A.(1998).Lycotoxins,antimicrobial peptides fromVenom of the Wolf Spider,Lycosa carolinensis J.Biol.Chem,273:2059-2066
[0192] PK-OBPgpLys的标签修饰的方法
[0193] 为了获得α4-、Walmagh1-、Walmagh2-、Lycotoxin1-和Parasin1-PK-OBPgplysORF，将对应的肽段（通过引物对的杂交而创建，见表5）使用改进版（adapted version）的不依赖连接克隆（Ligation Independent Cloning(LIC)）技术融合至编码PK-OBPgpLYS的
ORF。首先，将独特的Ecl136II限制性位点（粗体）通过tail PCR插入PK修饰的OBPgpLys
ORF，所述tail PCR是以特异性设计、编码限制性位点的5’引物其（5’GGAATGGGGAGCTCCTCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAA AAATAGCGAGAAT3’;SEQ ID NO:119），以及标准OBPgpLys反向引物（5’AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT3’;SEQ ID NO:120），在纯化的噬菌体OBP的基因组DNA上进行的。然后将该延伸的片段根据生产者的TA克隆规程连接至pEXP5CT/TOPO
表达载体（Invitrogen,Carlsbad,CA，USA）。将纯质粒酶切割一次（Ecl136II）并将杂交的肽盒（peptide cassettes）不经过连接步骤（LIC）插入进入经切割的质粒。
ORF。首先，将独特的Ecl136II限制性位点（粗体）通过tail PCR插入PK修饰的OBPgpLys
ORF，所述tail PCR是以特异性设计、编码限制性位点的5’引物其（5’GGAATGGGGAGCTCCTCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAAA AAATAGCGAGAAT3’;SEQ ID NO:119），以及标准OBPgpLys反向引物（5’AACTATTCCGAGTGCTTTCTTTGT3’;SEQ ID NO:120），在纯化的噬菌体OBP的基因组DNA上进行的。然后将该延伸的片段根据生产者的TA克隆规程连接至pEXP5CT/TOPO
表达载体（Invitrogen,Carlsbad,CA，USA）。将纯质粒酶切割一次（Ecl136II）并将杂交的肽盒（peptide cassettes）不经过连接步骤（LIC）插入进入经切割的质粒。
[0194] 为了将PK-肽段融合至带有单个标签的α4-和五肽-OBPgpLys ORF的前方，分别对纯化的pEXP5-CT/α4-OBPgpLys和pEXP5-CT/五肽-OBPgpLys质粒DNA，用编码该PK肽
段的延伸的5’引物（对于PK-α4-OBPgpLys5’引物是5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAGGCTCCTCCCCGAACCGTGCA3’;SEQ ID NO:121，和对于PK-五肽-OBPgpLys，5’引物是
5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAG AAACGCAAAGCCTCCTCCTTCTTCGTAGCA3’(SEQ ID NO:122)）和标准3’OBPgpLys反向引物施以tail PCR。然后将获得的PCR片段重克隆进pEXP5CT/
TOPO 表达载体。在将构建体引入合适的大肠杆菌BL21(DE3)pLys表达菌株前以测序分
析法验证了表达载体中的片段的正确插入。
段的延伸的5’引物（对于PK-α4-OBPgpLys5’引物是5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAGAAACGCAAAGGCTCCTCCCCGAACCGTGCA3’;SEQ ID NO:121，和对于PK-五肽-OBPgpLys，5’引物是
5’ATGGGATCCAAACGCAAGAAACGTAAG AAACGCAAAGCCTCCTCCTTCTTCGTAGCA3’(SEQ ID NO:122)）和标准3’OBPgpLys反向引物施以tail PCR。然后将获得的PCR片段重克隆进pEXP5CT/
TOPO 表达载体。在将构建体引入合适的大肠杆菌BL21(DE3)pLys表达菌株前以测序分
析法验证了表达载体中的片段的正确插入。
[0195] 表5：用于抗菌肽标签与编码PK-OBPgpLYS的ORF的杂交而使用的的引物对，其中抗菌肽标签用于N-末端融合
[0196]
[0197] 大规模重组表达修饰的PK-OBPgpLYS融合变体
[0198] 在溶菌培养液（Lysogeny Broth，LB）中在以1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside）诱导的指数生长的细胞（OD600nm=0.6）中进行标准表达。表达参数如温度、时间和表达菌株基于特定的蛋白而变化以优化修饰的内溶素的
可溶表达水平（见表6）。
可溶表达水平（见表6）。
[0199] 对于纯化，将来自表达培养物（500-600ml）的细胞收获（4500rpm,30min,4℃）并在1/25体积的裂解缓冲液(10mM咪唑,20mM NaH2PO4,0.5M NaCl,pH7.4)中重悬。在声裂法（sonication）（8x30s,Vibra CellTM，Sonics,Dandurry,CT,美国，幅度40%）之前将该悬浊液冻/融三次，并通过0.45和0.22μm Durapore膜滤器（Millipore,Billerica,MA,
2+
美国）过滤。根据生产者的说明书使用Ni -亲和性层析（HisTrap HP1ml柱,GE
Healthcare,Buckinghamshire,UK）通过一步规程进行带His-标签的融合蛋白的纯化。以
2+
4个后续的步骤进行Ni 亲和层析，所有步骤都是在室温进行。
2+
美国）过滤。根据生产者的说明书使用Ni -亲和性层析（HisTrap HP1ml柱,GE
Healthcare,Buckinghamshire,UK）通过一步规程进行带His-标签的融合蛋白的纯化。以
2+
4个后续的步骤进行Ni 亲和层析，所有步骤都是在室温进行。
[0200] 1.以10倍柱体积的洗涤缓冲液（Washing Buffer）(60mM咪唑,0.5mM NaCl和20mM NaH2PO4-NaOH，pH7.4)以0.5ml/min的流速平衡Histrap HP1ml柱(GE Healthcare)。
[0201] 2.将总细胞裂解物（含有所需的内溶素）以0.5ml/min的流速加载于HistrapHP1ml柱上。
[0202] 3.以1ml/min的流速以15倍柱体积的洗涤缓冲液洗涤柱。
[0203] 4.以0.5ml/min的流速以10倍柱体积的洗脱缓冲液(500mM咪唑,5mM NaCl和20mM NaH2PO4-NaOH，pH7.4)从柱上洗脱结合的内溶素。
[0204] 洗涤缓冲液含有低咪唑浓度，其基于特定的蛋白而变化以确保蛋白的高纯度（见表6）。还将每升大肠杆菌表达培养物的总产率在表6中显示。所述值通过在280nm的分光
光度计测量蛋白浓度和纯化的母液的体积而测定。纯化的母液如在SDS-PAGE凝胶上目测
确定为至少95%纯。
光度计测量蛋白浓度和纯化的母液的体积而测定。纯化的母液如在SDS-PAGE凝胶上目测
确定为至少95%纯。
[0205] 表6：N-末端修饰的PK-OBPgpLys的变体的表达参数以及获得的每升表达培养物的产率
[0206]
[0207]
[0208] 修饰的PK-OBPgpLys融合变体的体外抗细菌活性和宿主范围
[0209] 将指数生长的革兰氏阴性细菌细胞(OD600nm=0.6)在5mM HEPES pH7.4中稀释6
100倍至10 细胞/ml的终密度并在室温与不同的修饰的OBPgpLYS变体（在洗脱缓冲液中，
且终浓度为1500nM）一起不振荡地温育30分钟。在温育后将细胞悬液以及作为对照的没
有添加修饰的OBPgpLYS变体的未处理的细菌细胞在1x浓度的PBS缓冲液中稀释三次（分
5 4 3
别是10-10-10 细胞/ml），并将100μl每种稀释物在LB-培养基上铺板。在37℃过夜温
育后对琼胶板上的细菌菌落计数。基于计数的细胞数量，将抗细菌活性作为相对失活以对
数单位（=log10N0/Ni，其中N0=未处理的细胞（对照）的数量，且Ni=处理的细胞的数量，都是在温育后计数）计算（表7）。在以融合蛋白处理后减少的细菌菌落的数量指示不同的修饰的OBPgpLYS变体的抗微生物活性，因为细菌细胞由于融合蛋白的处理而裂解。将所有样品
重复三次。展示了平均+/-标准差。
100倍至10 细胞/ml的终密度并在室温与不同的修饰的OBPgpLYS变体（在洗脱缓冲液中，
且终浓度为1500nM）一起不振荡地温育30分钟。在温育后将细胞悬液以及作为对照的没
有添加修饰的OBPgpLYS变体的未处理的细菌细胞在1x浓度的PBS缓冲液中稀释三次（分
5 4 3
别是10-10-10 细胞/ml），并将100μl每种稀释物在LB-培养基上铺板。在37℃过夜温
育后对琼胶板上的细菌菌落计数。基于计数的细胞数量，将抗细菌活性作为相对失活以对
数单位（=log10N0/Ni，其中N0=未处理的细胞（对照）的数量，且Ni=处理的细胞的数量，都是在温育后计数）计算（表7）。在以融合蛋白处理后减少的细菌菌落的数量指示不同的修饰的OBPgpLYS变体的抗微生物活性，因为细菌细胞由于融合蛋白的处理而裂解。将所有样品
重复三次。展示了平均+/-标准差。
[0210] 表7：没有（A）和有额外添加的外膜透化剂EDTA（0.5mM）的不同N-末端修饰的PK-OBPgpLYS融合变体对一系列指数生长的革兰氏阴性菌种的体外抗细菌活性。初始
6
密度是10 细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。平均对数减少值（average log
reduction values）与标准偏差（stdev）一同显示。
6
密度是10 细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。平均对数减少值（average log
reduction values）与标准偏差（stdev）一同显示。
[0211] A
[0212]
[0213]
[0214] B
[0215]
[0216] 实施例2：具有两个肽段的恶臭假单胞菌噬菌体OBP的内溶素（PK-OBPgpLys）的融合蛋白的抗微生物活性与仅具有一个肽段的恶臭假单胞菌噬菌体OBP的内溶素
（PK-OBPgpLys）的融合蛋白的比较
（PK-OBPgpLys）的融合蛋白的比较
[0217] 产生具有一个肽段的OBPgpLys的方法
[0218] 除了五肽外，将所有肽段使用不依赖连接克隆(LIC)的改进版，如在Berrow等,2007中所描述的，融合至编码OBPgpLYS衍生物的ORF。这里，将独特的Ecl136II限
制性位点插入至WT内溶素基因的前端，其是通过以特别设计的5’引物(5’-GGAATGGG
GAGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG-3’;SEQ ID NO:123)和标准OBPgpLys衍生物反向引物
(5’-AACTATTCCGTGTGCTTTCT TTGT-3’;SEQ ID NO:124)在噬菌体OBP的纯基因组DNA上
以tail PCR进行的。然后将该延伸的片段通过依照生产者的TA克隆规程连接入pEXP5CT/
TOPO 表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)。在Ecl136II限制性消化中切割纯
质粒一次，并将杂交的肽盒（由引物对的杂交而创建，见表8）不经过必需的连接步骤（LIC）插入进入已经切割的质粒。对于N-末端五肽标签融合，以编码该五肽的延伸的5'引物
（5’-ATGGGATCCTTCTTCGTAGCA CCGGGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG-3’;SEQ ID NO:125）和标准OBPgpLys衍生物反向引物(5’-AACTATTCCGTGTGCTTTCTTTGT-3’;SEQ ID NO:126)在噬菌体
OBP基因组DNA上施以tail PCR。在将构建物引入合适的大肠杆菌BL21(DE3)pLys表达菌
株前以测序分析法验证表达载体中片段的正确插入。
制性位点插入至WT内溶素基因的前端，其是通过以特别设计的5’引物(5’-GGAATGGG
GAGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG-3’;SEQ ID NO:123)和标准OBPgpLys衍生物反向引物
(5’-AACTATTCCGTGTGCTTTCT TTGT-3’;SEQ ID NO:124)在噬菌体OBP的纯基因组DNA上
以tail PCR进行的。然后将该延伸的片段通过依照生产者的TA克隆规程连接入pEXP5CT/
TOPO 表达载体(Invitrogen,Carlsbad,CA,美国)。在Ecl136II限制性消化中切割纯
质粒一次，并将杂交的肽盒（由引物对的杂交而创建，见表8）不经过必需的连接步骤（LIC）插入进入已经切割的质粒。对于N-末端五肽标签融合，以编码该五肽的延伸的5'引物
（5’-ATGGGATCCTTCTTCGTAGCA CCGGGCTCCTCCAAAAATAGCGAGAAG-3’;SEQ ID NO:125）和标准OBPgpLys衍生物反向引物(5’-AACTATTCCGTGTGCTTTCTTTGT-3’;SEQ ID NO:126)在噬菌体
OBP基因组DNA上施以tail PCR。在将构建物引入合适的大肠杆菌BL21(DE3)pLys表达菌
株前以测序分析法验证表达载体中片段的正确插入。
[0219] 表8：用于将抗细菌肽标签杂交至编码OBPgpLys衍生物的ORF而使用的引物对
[0220]
[0221] 带有两个肽段的OBPgpLys的产生在上面的实施例1中描述。此外，融合蛋白的纯化和抗微生物活性测定法是如已在实施例1中所描述而进行的。抗微生物活性测定法的结
果在表9中给出。
果在表9中给出。
[0222] 表9：带有一个或两个肽段的OBPgpLYS融合变体对带有额外添加的外膜透化剂6
EDTA（0.5mM）的一系列指数生长的革兰氏阴性菌种的体外抗细菌活性。初始密度为10 细
胞/ml，并在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值（average log reduction values）。
EDTA（0.5mM）的一系列指数生长的革兰氏阴性菌种的体外抗细菌活性。初始密度为10 细
胞/ml，并在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值（average log reduction values）。
[0223]
[0224]
[0225] 缩写：+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0226] 实施例3：带有两个肽段的铜绿假单胞菌噬菌体内溶素KZ144(噬菌体phiKZ)和EL188(噬菌体EL)的融合蛋白的的抗微生物活性与仅带有一个肽段或不带肽段的的铜绿
假单胞菌噬菌体的内溶素KZ144和EL188的融合蛋白的比较
假单胞菌噬菌体的内溶素KZ144和EL188的融合蛋白的比较
[0227] 融合蛋白的纯化和抗微生物活性测定法如实施例1中所描述而进行。抗微生物活性的结果在表10中给出。
[0228] 表10：带有一个或两个肽段的KZ144和EL188融合变体对于一系列具有额外添加的外膜透化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的假单胞菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度
是106细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
是106细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
[0229]蛋白质 假单胞菌
KZ144(SEQ ID NO:18) +/-
KZ144-PK(SEQ ID NO:148) +
KZ144-SMAP29(SEQ ID NO:149) ++
KZ144-SMAP29-PK(SEQ ID NO:140) +++
EL188(SEQ ID NO:7) +/-
EL188-SMAP29(SEQ ID NO:150) +
EL188-PK(SEQ ID NO:151) +
EL188-PK-SMAP29(SEQ ID NO:141) +++
KZ144(SEQ ID NO:18) +/-
KZ144-PK(SEQ ID NO:148) +
KZ144-SMAP29(SEQ ID NO:149) ++
KZ144-SMAP29-PK(SEQ ID NO:140) +++
EL188(SEQ ID NO:7) +/-
EL188-SMAP29(SEQ ID NO:150) +
EL188-PK(SEQ ID NO:151) +
EL188-PK-SMAP29(SEQ ID NO:141) +++
[0230] 缩写：-:无log减少;+/-:<1log;+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0231] 实施例4：带有两个肽段的内溶素STM0016的融合蛋白的抗微生物活性与仅带有一个肽段或不带有肽段的内溶素STM0016的融合蛋白的比较
[0232] 融合蛋白的提纯和抗微生物活性测定法如实施例1中所描述而进行。抗微生物活性测定法的结果在表11中给出。
[0233] 表11：带有一个或两个肽段的STM0016融合变体对于一系列具有额外添加的外膜透化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的沙门氏菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度是106细
胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
[0234]蛋白质 沙门氏菌
STM0016(SEQ ID NO:15) -
STM0016-SMAP29(SEQ ID NO:152) +
STM0016-LL37(SEQ ID NO:153) +
STM0016-Melittin(SEQ ID NO:154) +/-
STM0016-LL37-SMAP29(SEQ ID NO:142) +++
STM0016-SMAP29-Melittin(SEQ ID NO:143) ++
STM0016(SEQ ID NO:15) -
STM0016-SMAP29(SEQ ID NO:152) +
STM0016-LL37(SEQ ID NO:153) +
STM0016-Melittin(SEQ ID NO:154) +/-
STM0016-LL37-SMAP29(SEQ ID NO:142) +++
STM0016-SMAP29-Melittin(SEQ ID NO:143) ++
[0235] 缩写：-:无log减少;+/-:<1log;+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0236] 实施例5：带有两个肽段的内溶素溶葡萄球菌素的融合蛋白的抗微生物活性与仅带有一个肽段或不带有肽段的内溶素溶葡萄球菌素的融合蛋白的比较
[0237] 融合蛋白的提纯和抗微生物活性测定法如实施例1中所描述而进行。抗微生物活性测定法的结果在表12中给出。
[0238] 表12：带有一个或两个肽段的溶葡萄球菌素融合变体对于一系列具有额外添加的外膜透化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的葡萄球菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度
是106细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
是106细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
[0239]
[0240] 缩写：-:无log减少;+/-:<1log;+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0241] 实施例6：带有两个肽段的内溶素Cpl1的融合蛋白的抗微生物活性与仅带有一个肽段或不带有肽段的内溶素Cpl1的融合蛋白的比较
[0242] 融合蛋白的提纯和抗微生物活性测定法如实施例1中所描述而进行。抗微生物活性测定法的结果在表13中给出。
[0243] 表13：带有一个或两个肽段的Cpl1融合变体对于一系列带有额外添加的外膜透6
化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的链球菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度是10 细胞/
ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的链球菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度是10 细胞/
ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
[0244]蛋白质 链球菌
Cpl1(SEQ ID NO:1) +
Cpl1-Indolicidin(SEQ ID NO:159) ++
Cpl1-Pseudin1(SEQ ID NO:160) ++
Cpl1-Pseudin1-Indolicidin(SEQ ID NO:145) +++
Cpl1(SEQ ID NO:1) +
Cpl1-Indolicidin(SEQ ID NO:159) ++
Cpl1-Pseudin1(SEQ ID NO:160) ++
Cpl1-Pseudin1-Indolicidin(SEQ ID NO:145) +++
[0245] 缩写：-:无log减少;+/-:<1log;+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0246] 实施例7：带有两个肽段的内溶素Ply511的融合蛋白的抗微生物活性与仅带有一个肽段或不带有肽段的内溶素Ply511的融合蛋白的比较
[0247] 融合蛋白的提纯和抗微生物活性测定法如实施例1中所描述而进行。抗微生物活性测定法的结果在表14中给出。
[0248] 表14：带有一个或两个肽段的Ply511融合变体对于一系列带有额外添加的外膜6
透化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的利斯特氏菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度是10
细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
透化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的利斯特氏菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度是10
细胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
[0249]蛋白质 利斯特氏菌
Ply511(SEQ ID NO:2) +
Ply511-Magainin(SEQ ID NO:161) ++
Ply511-BuforinII(SEQ ID NO:162) ++
Ply511-BuforinII-Magainin(SEQ ID NO:146) +++
Ply511(SEQ ID NO:2) +
Ply511-Magainin(SEQ ID NO:161) ++
Ply511-BuforinII(SEQ ID NO:162) ++
Ply511-BuforinII-Magainin(SEQ ID NO:146) +++
[0250] 缩写：-:无log减少;+/-:<1log;+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0251] 实施例8：带有两个肽段的内溶素LysK的融合蛋白的抗微生物活性与仅带有一个肽段或不带有肽段的内溶素LysK的融合蛋白的比较
[0252] 融合蛋白的提纯和抗微生物活性测定法如实施例1中所描述而进行。抗微生物活性测定法的结果在表15中给出。
[0253] 表15：带有一个或两个肽段的LysK融合变体对于一系列带有额外添加的外膜透化剂EDTA（0.5mM）的指数生长的葡萄球菌属细菌的体外抗细菌活性。初始密度是106细
胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
胞/ml且在室温不振荡地进行温育30分钟。显示平均对数减少值。
[0254]蛋白质 葡萄球菌
LysK(SEQ ID NO:3) +
PK2-LysK(SEQ ID NO:163) ++
Cecropin A(A.aegyptii)-LysK(SEQ ID NO:164) ++
PK2-Cecropin A(A.aegyptii)-LysK(SEQ ID NO:147) +++
LysK(SEQ ID NO:3) +
PK2-LysK(SEQ ID NO:163) ++
Cecropin A(A.aegyptii)-LysK(SEQ ID NO:164) ++
PK2-Cecropin A(A.aegyptii)-LysK(SEQ ID NO:147) +++
[0255] 缩写：-:无log减少;+/-:<1log;+:1log;++:2-3log;+++:4或更多log
[0256] 实施例9：不同肽段的抗微生物活性
[0257] 将指数的铜绿假单胞菌PAO1p细胞（烧伤分离株(Burn would isolate)，Queen Astrid Hospital,Brussels;Pirnay JP 等 (2003),http://www.ncbi.nlm.
nih.gov/pubmed/12624051?ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.
Pubmed_ResultsPanel.Pub med_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum J Clin
Microbiol.,41(3):1192-1202）在10mM HEPES,pH7.4中洗涤并在10mM HEPES,0.5mM
EDTA,pH7.4中1:10稀 释。 将 细 菌 在 缓 冲 液 中（15mM HEPES,250mM NaCl,250μM
EDTA;pH7.4）在室温与对应的肽、根据SEQ ID NO:23的称为PK的聚阳离子肽、根据SEQ ID NO:34的聚阳离子肽PK2或根据SEQ ID NO:45的称为SMAP-29的抗微生物肽温育，其中浓
度对于聚阳离子肽为0.3μmol/L,3μmol/L,30μmol/L和150μmol/L，对于抗微生物肽为
3μmol/L。在30分钟后将细胞悬液系列稀释（1:10）并在LB上铺板。此外，使用缓冲液
（15mM HEPES,250mM NaCl,250μM EDTA;pH7.4）铺板阴性对照。在37℃过夜温育后对在
琼胶板上的细菌菌落计数。基于计数的细胞数量，将抗细菌活性作为相对灭活以对数单位
（=log10N0/Ni，其中N0=未处理的细胞（对照）的数量，且Ni=处理的细胞的数量，都是在温育后计数）计算。以融合蛋白处理后细菌菌落的数量的减少指示肽段的抗微生物活性，因为细菌细胞由于用肽段处理而裂解。将所有样品重复四次。
nih.gov/pubmed/12624051?ordinalpos=3&itool=EntrezSystem2.PEntrez.Pubmed.
Pubmed_ResultsPanel.Pub med_DefaultReportPanel.Pubmed_RVDocSum J Clin
Microbiol.,41(3):1192-1202）在10mM HEPES,pH7.4中洗涤并在10mM HEPES,0.5mM
EDTA,pH7.4中1:10稀 释。 将 细 菌 在 缓 冲 液 中（15mM HEPES,250mM NaCl,250μM
EDTA;pH7.4）在室温与对应的肽、根据SEQ ID NO:23的称为PK的聚阳离子肽、根据SEQ ID NO:34的聚阳离子肽PK2或根据SEQ ID NO:45的称为SMAP-29的抗微生物肽温育，其中浓
度对于聚阳离子肽为0.3μmol/L,3μmol/L,30μmol/L和150μmol/L，对于抗微生物肽为
3μmol/L。在30分钟后将细胞悬液系列稀释（1:10）并在LB上铺板。此外，使用缓冲液
（15mM HEPES,250mM NaCl,250μM EDTA;pH7.4）铺板阴性对照。在37℃过夜温育后对在
琼胶板上的细菌菌落计数。基于计数的细胞数量，将抗细菌活性作为相对灭活以对数单位
（=log10N0/Ni，其中N0=未处理的细胞（对照）的数量，且Ni=处理的细胞的数量，都是在温育后计数）计算。以融合蛋白处理后细菌菌落的数量的减少指示肽段的抗微生物活性，因为细菌细胞由于用肽段处理而裂解。将所有样品重复四次。
[0258] 聚阳离子肽PK和PK2都显示了依赖于所用的肽的浓度而提高的针对铜绿假单胞菌的抗微生物活性。PK2显示了比PK更高的针对铜绿假单胞菌的抗微生物活性。而且，
以150μmol/L的浓度使用的PK2显示了与以3μmol/L浓度使用的SMAP-29相同的针对
铜绿假单胞菌的抗微生物活性。对于PK和PK2，必须使用更多的肽以达到与SAMP-29相同
的针对铜绿假单胞菌的抗微生物活性。等摩尔浓度的PK或PK2(3μM/L)的使用与AMP或
Artilysin相比不显示或仅显示较小的抗微生物效果。
以150μmol/L的浓度使用的PK2显示了与以3μmol/L浓度使用的SMAP-29相同的针对
铜绿假单胞菌的抗微生物活性。对于PK和PK2，必须使用更多的肽以达到与SAMP-29相同
的针对铜绿假单胞菌的抗微生物活性。等摩尔浓度的PK或PK2(3μM/L)的使用与AMP或
Artilysin相比不显示或仅显示较小的抗微生物效果。
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