当前使用的和正在研制的治疗细菌感染的大部分抗生素对微生 物施加选择性压力且已导致形成广泛的抗生素抗性。因此，开发治疗 微生物感染的替代方案是非常有益的。
细菌中的多药耐药性通常是由于获得了携带有不同耐药性机制 的遗传决定子的多个转座子和质粒(Gold等，1996.N.Engl.J.Med. 335：1445)。但是，已开始有人提出对赋予多药耐药性的内在机制的解 释。其中的第一个是大肠杆菌(Escherichia coli)中染色体编码的多抗生 素抗性(mar)位点(George和Levy，1983.J.Bacteriol.155：531；George 和Levy 1983 J.Bacteriol.155：541)。大肠杆菌的Mar突变体以10-6～10-7 的频率出现且通过在四环素或氯霉素的亚抑制水平上的生长进行选 择(George和Levy，同上)。这些突变体表现出对四环素类、氯霉素、 青霉素类、头孢菌素类、嘌呤霉素、萘啶酸和利福平的抗性(George 和Levy，同上)。后来，抗性表型扩展到包括氟喹诺酮类(Cohen等， 1989.Antimicrob.Agents Chemother.33：1318)和氧化应激剂(oxidative stress agent)(Ariza等，1994.J.Bacteriol.176：143；Greenberg等，1991. J.Bacteriol.73：4433)，并且最近扩展到有机溶剂(White等，1997.J.of Bacteriology 179：6122；Asako等，1997.J.Bacteriol.176：143)和家用 消毒剂(例如松油和/或)(McMurry等，1998.FEMS Microbiology Letters 166：305；Moken等，1997.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，41：2770)。
在大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)和其它肠 杆菌(Entrobacteriacae)中，所述mar位点由两个位置分开的转录单元 组成，该转录单元侧邻共同的启动子/操纵基因区域(Alekshun和Levy. 1997，Antimicrobial Agents and Chemother.41：2067)。一个操纵子编码 MarC，后者是尚无任何显见功能的推定的内膜组成性蛋白，但是在 某些菌株中其显示出对Mar表型有作用。另一操纵子包含marRAB， 其编码Mar阻遏物(MarR)：其结合marO并反向调节marRAB的表达 (Cohen等，1994.J.Bacteriol.175：1484；Martin和Rosner，1995.PNAS 92：5456；Seoane和Levy.1995 J.Bacteriol.177：530)；激活物(MarA)： 其控制染色体上其它基因如mar调节子的表达(Cohen等，1994 J. Bacteriol.175：1484；Gambino等，1993.J.Bacteriol.175：2888；Seoane 和Levy，1995 J.Bacteriol.177：530)；和未知功能的推定小蛋白(MarB)。
将大肠杆菌暴露于多种化学物质(包括四环素和氯霉素(Hachler 等，1991，J Bacteriol 173(17)：5532-8；Ariza，1994，J Bacteriol； 176(1)：143-8)、水杨酸钠及其衍生物(Cohen，1993，J Bacteriol； 175(24)：7856-62)和氧化应激剂(Seoane等，1995.J Bacteriol； 177(12)：3414-9))诱导出Mar表型。这些化学物质中的一些通过与阻遏 物相互作用并抑制其功能而直接对MarR的水平产生影响(Alekshun， 1999.J.Bacteriol.181：3303-3306)，而其它化学物质(抗生素，例如四 环素和氯霉素)表现为通过替代的机制诱导mar表达(Alekshun，1999.J. Bacteriol.181：3303-3306)，例如通过信号转导途径。
一旦表达，MarA将激活构成大肠杆菌mar调节子的几个基因的 转录(Alekshun，1997，Antimicrob.Agents Chemother.41：2067-2075； Alekshun，1999，J.Bacteriol.181：3303-3306)。对于抗生素易感性的降 低来说，AcrAB/TolC多药排出系统表达的增加(Fralick，1996，J Bacteriol.178(19)：5803-5；Okusu，1996J Bacteriol；178(1)：306-8)和 OmpF(外膜蛋白)合成的降低(Cohen，1988，J Bacteriol.； 170(12)：5416-22)起到主要作用。然而，有机溶剂耐受是由于MarA介 导的AcrAB、TolC、OmpX和77kDa蛋白的表达增加(Aono，1998， Extremophiles；2(3)：239-48；Aono，1998，J Bacteriol；180(4)：938-44.)， 但是与OmpF的水平无关(Asako，1999，Appl Environ Microbiol； 65(1)：294-6)。
MarA是转录激活因子XylS/AraC家族的成员(Gallegos等，1993. Nucleic Acids Res.21：807)。在XylS/AraC家族中存在超过100种蛋白 质且这组蛋白质的界定特征(defining characteristic)是存在两个螺旋- 转角-螺旋(HTH)的DNA结合基序。该家族中的蛋白质激活许多不同 的基因，其中的一些产生抗生素和氧化应激抗性或控制微生物的新陈 代谢和毒力(Gallegos等，同上)。
发明内容
本发明鉴定了微生物中作为毒力因子的微生物转录因子，例如 AraC-XylS家族的转录因子，且表明抑制这些因子降低了微生物细胞 的毒力。因为这些转录因子控制毒力而不控制必需的细胞过程，因此 产生抗性的可能性要小得多。因此，一个方面，本发明涉及防止对象 受微生物感染的方法，包括：对有感染风险的对象施用调节微生物转 录因子的表达或活性的化合物，由此防止对象的感染。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法。所述方法包括：将所述细胞与通式(I) 的转录因子调节化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此 降低所述微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R1为羟基、OCOCO2H；直链或支链C1-C5烷氧基；或者直链或支 链C1-C5烷基；
A、B、D、E、W、X、Y和Z各自独立地为碳或氮；
其中，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为碳时，R2、R3、R4、 R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为 氮时，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地不存在或为羟 基；
R10、R11、R12和R13各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳 氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、 烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当A、B、C、D、E、W、X、Y和Z各个为碳时，R6、 R7、R8和R9中的一个不为氢。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(I)的转录因子调节化合物及其药学 上可接受的盐、酯和前药接触，由此调节转录：

其中：
R1为羟基、OCOCO2H；直链或支链C1-C5烷氧基；或者直链或支 链C1-C5烷基；
A、B、D、E、W、X、Y和Z各自独立地为碳或氮；
其中，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为碳时，R2、R3、R4、 R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为 氮时，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地不存在或为羟 基；以及
R10、R11、R12和R13各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳 氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、 烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨 基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳氨基、肟、烷基 肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳时，R6、R7、 R8和R9中的一个不为氢。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(II)的转录因 子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R1a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、 R13b、R13c、R13d和R13e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳 氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、 烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨 基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷 基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e为氢时，R13c不为 氢、氟、二甲基氨基、氰基、羟基、甲基或甲氧基；以及
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b和R13d为氢时，R13c和R13e不 为氟。
在再另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转 录的方法，包括：将转录因子与通式(II)的转录因子调节化合物及其 酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R1a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、 R13b、R13c、R13d和R13e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e为氢时，R13c不为 氢、氟、二甲基氨基、氰基、羟基、甲基或甲氧基；以及
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b和R13d为氢时，R13c和R13e不 为氟。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(III)的转录因 子调节化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R14为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
G、J、K、L、M、Q、T和U各自独立地为碳或氮；
其中，当G、J、K、L、M、Q、T和U为碳时，R15、R16、R17、 R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳 基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当G、J、K、 L、M、Q、T和U为氮时，R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、 R23和R24各自独立地不存在或为羟基；
R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳时，R15、R16、 R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24中的一个不为氢。
在再另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转 录的方法，包括：将转录因子与通式(III)的转录因子调节化合物及其 药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此调节转录：

其中：
R14为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
G、J、K、L、M、Q、T和U各自独立地为碳或氮；
其中，当G、J、K、L、M、Q、T和U为碳时，R15、R16、R17、 R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳 基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当G、J、K、 L、M、Q、T和U为氮时，R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、 R23和R24各自独立地不存在或为羟基；
R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳时，R15、R16、 R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24中的一个不为氢。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(IV)的转录因 子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R14a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R15a、R16a、R17a、R18a、R19a、R20a、R21a、R22a、R23a以及R24a、 R24b、R24c、R24d和R24e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：R24a、R24b、R24c、R24d和R24e中的至少两个不为氢。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(IV)的转录因子调节化合物及其酯、 前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R14a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R15a、R16a、R17a、R18a、R19a、R20a、R21a、R22a、R23a以及R24a、 R24b、R24c、R24d和R24e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；或者R24c和R24d连接形成环；
条件是：R24a、R24b、R24c、R24d和R24e中的至少两个不为氢。
在进一步的实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低 微生物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(V)的转 录因子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低 所述微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R25为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34、R35a、R35b、R35c、 R35d和R35e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、 氨基肟或卤素；
条件是：R26、R27、R28和R29中的至少两个不为氢。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(V)的转录因子调节化合物及其酯、 前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R25为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34、R35a、R35b、R35c、 R35d和R35e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、 氨基肟或卤素；
条件是：R26、R27、R28和R29中的至少两个不为氢。
在一个实施方式中，本发明涉及一种降低微生物细胞的抗生素抗 性的方法，包括：将所述细胞与通式(VI)的转录因子调节化合物及其 酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述微生物细胞的抗生 素抗性：

其中：
R25’为取代的直链或支链C1-C5烷氧基；
R26’、R27’、R28’、R29’、R30’、R31’、R32’、R33’、R34’、R35a’、R35b’、 R35c、R35d’和R35e’各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰 基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳 基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素。
在另一实施方式中，本发明涉及一种调节转录的方法，包括：将 转录因子与通式(VI)的转录因子调节化合物及其酯、前药和药学上可 接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R25’为取代的直链或支链C1-C5烷氧基；
R26’、R27’、R28’、R29’、R30’、R31’、R32’、R33’、R34’、R35a’、R35b’、 R35c、R35d’和R35e’各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰 基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳 基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(VII)的转录因 子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R36为羟基；
R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46a、R46b、R46d和R46e 各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷 氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、 烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳 基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰 基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤 素；
R38为氰基、硝基、肟、烷基肟、芳基肟、杂芳基、氨基肟或氨基 羰基；
R46c为氢、酰基、氟、吡嗪基(pyrizinyl)、吡啶基、氰基、咪唑基、 二烷基氨基羰基或二烷基氨基；
条件是：当R38为硝基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基、酰基或氢； 以及
条件是：当R38为氰基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基。
在进一步的实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节 转录的方法，包括：将转录因子与通式(VII)的转录因子调节化合物及 其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录；

其中：
R36为羟基；
R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46a、R46b、R46d和R46e 各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷 氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、 烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳 基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰 基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤 素；
R38为氰基、硝基、肟、烷基肟、芳基肟、杂芳基、氨基肟或氨基 羰基；
R46c为氢、酰基、氟、吡嗪基，吡啶基、氰基、咪唑基、二烷基 氨基羰基或二烷基氨基；
条件是：当R38为硝基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基、酰基或氢； 以及
条件是：当R38为氰基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基。
在进一步的实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低 微生物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(VIII)的 转录因子调节化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此降 低所述微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R47为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R48、R49、R50、R51、R52和R53各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、 肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
Ar为芳基。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(VIII)的转录因子调节化合物及其 药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此调节转录：

其中：
R47为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R48、R49、R50、R51、R52和R53各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、 肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
Ar为芳基。
在一个实施方式中，所述转录因子为转录因子AraC-XylS家族的 成员。
在一个实施方式中，所述转录因子为转录因子MarA家族的成员。
在另一实施方式中，所述方法进一步包括施用抗生素。
在另一个方面，本发明涉及一种防止对象的微生物尿路感染的方 法，包括：对有发生尿路感染风险的对象施用调节微生物转录因子的 表达或活性的化合物，由此防止对象感染。在一个实施方式中，所述 转录因子为转录因子AraC-XylS家族的成员。在一个实施方式中，所 述转录因子为转录因子MarA家族的成员。在另一实施方式中，所述 方法进一步包括施用抗生素。
在又另一方面，本发明涉及一种降低微生物毒力的方法，包括： 对有发生微生物感染风险的对象施用调节微生物转录因子的表达或 活性的化合物，由此降低微生物的毒力。
在另一方面，本发明涉及一种治疗对象的微生物感染的方法，包 括：对具有微生物感染的对象施用调节转录因子的表达或活性的化合 物，由此治疗对象的感染。在一个实施方式中，所述转录因子为转录 因子AraC-XylS家族的成员。在一个实施方式中，所述转录因子为转 录因子MarA家族的成员。在另一实施方式中，所述方法进一步包括 施用抗生素。
在另一方面，本发明涉及一种评价调节微生物转录因子的表达或 活性的化合物抑制微生物毒力的效力的方法，包括：用微生物感染非 人类的动物，其中所述微生物在非人类的动物中建立感染的能力需要 该微生物定居(colonize)到该动物中；对该非人类的动物施用调节微生 物转录因子表达或活性的化合物；以及测定非人类动物的感染水平， 其中化合物降低动物感染水平的能力表明所述化合物对抑制微生物 的毒力是有效的。在一个实施方式中，所述转录因子为转录因子 AraC-XylS家族的成员。在一个实施方式中，所述转录因子为转录因 子MarA家族的成员。在另一实施方式中，所述方法进一步包括施用 抗生素。
在再另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过测量所述微生 物定居到非人类动物的组织中的能力进行测定。
在另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过计算非人类动物 组织中存在的微生物的数目进行测定。
在另一方面中，本发明涉及一种鉴别用于治疗微生物感染的化合 物的方法，包括：用微生物接种非人类的动物，其中所述微生物在非 人类的动物中建立感染的能力需要该微生物定居到该动物中；对该动 物施用降低微生物转录因子的表达或活性的化合物；以及测定所述测 试化合物对该微生物定居到该动物中的能力的影响，由此鉴别出用于 治疗微生物感染的化合物。在一个实施方式中，所述转录因子为转录 因子AraC-XylS家族的成员。在一个实施方式中，所述转录因子为转 录因子MarA家族的成员。在另一实施方式中，所述方法进一步包括 施用抗生素。
在又另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过测量所述微生 物定居到非人类动物组织中的能力进行测定。
在另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过计算非人类动物 组织中存在的微生物的数目进行测定。
在另一方面中，本发明涉及一种鉴别用于降低微生物毒力的化合 物的方法，包括：用微生物接种非人类的动物，其中所述微生物在非 人类的动物中建立感染的能力需要该微生物定居到该动物中；对该动 物施用降低微生物转录因子表达或活性的化合物；以及测定所述测试 化合物对该微生物定居到该动物中的能力的影响，由此鉴别用于降低 微生物毒力的化合物。在一个实施方式中，所述转录因子为转录因子 AraC-XylS家族的成员。在一个实施方式中，所述转录因子为转录因 子MarA家族的成员。在另一实施方式中，所述方法进一步包括施用 抗生素。
在又另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过测量所述微生 物定居到非人类动物组织中的能力进行测定。
在另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过计算非人类动物 组织中存在的微生物的数目进行测定。
在另一方面，本发明涉及一种鉴别促进微生物毒力的转录因子的 方法，包括：建立其中待测试的转录因子错误表达的微生物；将所述 微生物引入到非人类动物中，其中所述微生物在非人类的动物中建立 感染的能力需要该微生物定居到该动物中；以及测定所述微生物定居 到该动物中的能力，其中与野生型微生物细胞相比，所述细胞定居到 该动物中的能力的降低将确认所述转录因子为促进微生物毒力的转 录因子。在另一实施方式中，所述转录因子为转录因子AraC-XylS家 族的成员。在另一实施方式中，所述转录因子为转录因子MarA家族 的成员。
在另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过测量所述微生物 定居到非人类动物组织中的能力进行测定。
在另一实施方式中，非人类动物的感染水平通过计算非人类动物 组织中存在的微生物的数目进行测定。
在另一方面中，本发明涉及一种降低微生物粘附到非生物表面上 的能力的方法，包括：将所述非生物表面或所述微生物与调节转录因 子活性的化合物接触，由此降低所述微生物粘附到非生物表面上的能 力。在一个实施方式中，所述转录因子为转录因子AraC-XylS家族的 成员。在另一实施方式中，所述转录因子为转录因子MarA家族的成 员。
在又另一实施方式中，所述方法进一步包括：将所述非生物表面 或所述微生物与有效控制该微生物生长的第二药物接触。
在再另一实施方式中，所述非生物表面选自支架、导管和假体装 置。
在一个方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含调节微生物转 录因子的活性或表达的化合物以及药学上可以接受的载体，其中所述 化合物降低微生物的毒力。
在另一方面，本发明涉及一种药物组合物，其包含药学上可接受 的载体中的调节微生物转录因子的活性或表达的化合物和抗生素。
本发明鉴别转录因子调节化合物(例如，但不限于螺旋-转角-螺 旋蛋白调节化合物)，并提供新的可用于鉴别调节微生物转录因子(例 如MarA家族多肽和AraC家族多肽)的化合物的分析方法，因而本 发明与现有技术相比表现出先进性。通过调节转录因子(例如包含螺 旋-转角-螺旋域的蛋白质)引起的基因转录的调节可以控制多种不同 的细胞过程。例如，在原核细胞中，可以控制如新陈代谢、耐药性和 毒力的过程。
鉴别能够调节细菌转录因子的化合物的分析法在识别可用于控 制原核和真核细胞中的基因转录的激动剂和拮抗剂方面将非常有用。
在一个实施方式中，本发明涉及一种降低细胞(例如真核或原核 细胞)的抗生素抗性的方法。在优选的实施方式中，所述细胞为微生 物细胞。在一个实施方式中，本发明涉及一种通过将细胞与转录因子 调节化合物接触以降低该细胞抗生素抗性的降低微生物细胞抗生素 抗性的方法。
在另一实施方式中，本发明还包括鉴别转录因子调节化合物的方 法。所述方法包括将微生物细胞与测试化合物在允许该化合物和该微 生物细胞相互作用的条件下接触，并测量该测试化合物影响细胞的能 力。所述微生物细胞包含在转录因子应答元件直接控制下的选择性标 志和转录因子。
在又另一实施方式中，本发明包括鉴别转录因子调节化合物的方 法。所述方法包括：将包含1)转录因子应答元件控制下的选择性标志 和2)转录因子的微生物细胞与测试化合物在允许该化合物和该微生 物细胞相互作用的条件下接触，并测量该测试化合物影响微生物细胞 生长(例如，体外或体内)或存活的能力，其中使所述转录因子失活 导致体外或体内细胞存活率下降。本发明还涉及相似的方法，其中使 所述转录因子失活导致细胞存活率的增加；以及其中激活所述转录因 子导致细胞存活率增加或，可选择地，细胞存活率降低的方法。
在另一实施方式中，本发明还涉及通过将包含1)guaB或purA基 因的染色体缺失、2)在转录因子效应启动子控制下的异源性guaB或 purA基因和3)转录因子的微生物细胞在允许该化合物与该微生物细 胞相互作用的条件下与测试化合物接触而鉴别转录因子调节化合物 的方法。所述方法进一步包括以下步骤：测量该化合物影响报道基因 的基因表达或微生物细胞的生长或存活的能力来作为所述化合物是 否调节转录因子活性的指示。所述化合物调节转录因子活性的能力导 致可能影响细胞生长或存活的基因表达的改变。
本发明涉及通过本发明的方法鉴别的转录因子调节化合物、HTH 蛋白调节化合物和MarA家族调节化合物、使用这些化合物的方法以 及包含这些化合物的药物组合物。本发明的转录因子调节化合物包 括，但不限于，通式(I)-(VIII)和表2的化合物。
本发明还涉及(至少部分涉及)一种包含微生物细胞的用于鉴别 调节转录因子多肽活性的转录因子调节化合物的试剂盒。所述试剂盒 包括：1)转录因子应答元件控制下的选择性标志和2)转录因子。
本发明还涉及(至少部分涉及)药物组合物，其包含有效量的转 录因子调节化合物，以及任选地药学上可接受的载体。
本发明还涉及一种通过施用包含转录因子调节化合物的组合物 来抑制生物膜的抑制生物膜的方法。
在另一实施方式中，本发明涉及一种药物组合物，其包含药学上 可接受的载体和转录因子调节化合物。所述转录因子调节化合物可以 是通式(I)-(VIII)和表2的化合物。

本发明鉴别微生物中作为毒力因子的微生物转录因子(例如 AraC-XylS家族的转录因子)，且表明抑制这些因子降低微生物细胞 的毒力。因为这些转录因子控制毒力，而不控制必需的细胞过程，所 以调节这些因子应该不会促进微生物的耐药性。
在细菌中发现的转录因子的一些主要家族包括螺旋-转角-螺旋转 录因子(HTH)(Harrison，S.C.和A.K.Aggarwal，1990.Annual Review of Biochemistry.59：933-969)，例如AraC、MarA、Rob、SoxS和LysR、 翅状螺旋(winged helix)转录因子(Gajiwala，K.S.和S.K.Burley，2000. 10：110-116)，例如MarR、Sar/Rot家族和OmpR(Huffman，J.L.，和R.G. Brennan，2002.Curr Opin Struct Biol.12：98-106，Martínez-Hackert，E.， 和A.M.Stock，1997.Structure.5：109-124)和环状铰合螺旋 (looped-hinge helix)转录因子(Huffman，J.L.和R.G.Brennan，2002 Curr Opin Struct Biol.12：98-106)，例如AbrB蛋白家族。
转录因子AraC-XylS家族包括许多成员。MarA、SoxS、Rma和 Rob是转录因子AraC-XylS家族中的蛋白质的实例。这些因子属于 AraC-XylS家族中过去被认为起到促进多种抗生素的耐药性的作用而 不被认为是毒力因子的一个亚类。实际上，marA在毒力中的作用已 经在小鼠感染模型中采用肠道沙门氏菌伤寒杆菌血清型(S. typhimurium)的marA无效突变体进行了测试(Sulavik等，1997.J. Bacteriology 179：1857)，而没有发现这类作用。在另一个模型(使用 共感染实验或粗略统计)中已证实marA无效突变体在鸡中仅具有微 弱的影响(Randall等，2001.J.Med.Microbiol.50：770)。与这些早期工 作相反，本发明基于(至少部分)以下发现：微生物导致宿主感染的 能力可以通过抑制微生物转录因子的表达和/或活力而进行抑制。因 此，本发明证实了微生物转录因子作为治疗靶点的用途。
本发明涉及(至少部分涉及)调节转录因子(例如，螺旋-转角- 螺旋(HTH)蛋白、AraC家族多肽、MarA家族多肽等)的化合物、鉴别 转录因子调节化合物(例如，HTH蛋白调节化合物、AraC家族多肽调 节化合物、MarA家族多肽调节化合物等)的方法和使用该化合物的方 法。
I.转录因子
术语“转录因子”包括参与原核和真核生物的基因调节的蛋白质。 在一个实施方式中，转录因子可对基因表达具有正效应，因此可以被 称作“激活物”或“转录激活因子”。在另一实施方式中，转录因子可以 负向影响基因表达，因此可以被称作“阻遏物”或“转录阻遏因子”。激 活物或阻遏物是常用的术语，且本领域技术人员了解其功能。
此处使用的术语“传染性”或“毒力”包括病原微生物定居于宿主的 能力，这是为了在宿主上生长所需的第一步。微生物需要传染性和毒 力以成为病原体。此外，有毒力的微生物是能够引起严重感染的微生 物。此处使用的术语“病原体”包括专性生物体和机会生物体。微生物 抵抗抗生素的能力在促进其在宿主中的生长方面也是重要的，然而， 在一个实施方式中，抗生素抗性并不包括在此处使用的术语“传染性” 或“毒力”中。因此，在一个实施方式中，本发明涉及降低微生物的传 染性或毒力而不影响(例如，增加或降低)抗生素抗性的方法。优选地， 此处使用的术语“传染性或毒力”包括生物体通过规避宿主的屏障和 免疫学防御而在宿主中构建自身的能力。
术语“AraC家族多肽”、“AraC-XylS家族多肽”或“AraC-XylS家族 肽”包括含有超过100种不同蛋白质的本领域公认的原核转录因子的 组(Gallegos等，(1997)Micro.Mol.Biol.Rev.61：393；Martin和Rosner， (2001)Curr.Opin.Microbiol.4：132)。AraC家族多肽包括在 PROSITE(PS)数据库中定义为特征文件(profile)PS01124的蛋白质。所 述AraC家族多肽也包括在PS0041、HTH AraC家族1和PS01124， 以及HTH AraC家族2中描述的多肽。AraC-XylS家族多肽、HTH AraC 家族1和HTH AraC家族2的多重序列对比分别示于图1-3中。在一 个实施方式中，AraC家族多肽通常(在初级序列水平上)含有被认 为负责这一蛋白质的DNA结合活性的约100个氨基酸的保守伸展段 (Gallegos等，(1997)Micro.Mol.Biol.Rev.61：393；Martin和Rosner， (2001)Curr.Opin.Microbiol.4：132)。AraC家族多肽也可以包含两个 螺旋-转角-螺旋DNA结合基序(Martin和Rosner，(2001)Curr.Opin. Microbiol.4：132；Gallegos等，(1997)Micro.Mol.Biol.Rev.61：393； Kwon等，(2000)Nat.Struct.Biol.7：424；Rhee等，(1998)Proc.Natl. Acad.Sci.U.S.A.95：10413)。该术语包括MarA家族多肽和HTH蛋白。 在一个实施方式中，本发明涉及一种通过使AraC家族多肽与测试化 合物接触而调节AraC家族多肽的方法，测试化合物与参与DNA结 合的多肽的一部分发生相互作用。在进一步的实施方式中，测试化合 物与图2中示出的HTH AraC家族1蛋白的保守氨基酸残基(大写的) 相互作用。
术语“螺旋-转角-螺旋蛋白”、“HTH蛋白”、“螺旋-转角-螺旋多肽” 和“HTH多肽”包括含有一个或多个螺旋-转角-螺旋域的蛋白质。螺旋 -转角-螺旋域是本领域中已知的且参与DNA结合(Ann Rev.of Biochem.1984.53：293)。螺旋-转角域的共有序列的实例可以在 Brunelle和Schleif (1989.J.Mol.Biol.209：607)中找到。该域通过序列 XXXPhoAlaXXPhoGlyPhoXXXXPhoXXPhoXX示出，其中X为任意 的氨基酸且Pho为疏水的氨基酸。
螺旋-转角-螺旋域是被识别的第一个DNA结合蛋白质基序。虽 然最初是在细菌蛋白质中识别出了HTH域，但是后来在真核生物和 原核生物的数百个DNA结合蛋白质中发现了HTH域。它由通过短的 氨基酸伸展链(其构成“转角”)连接的两个α螺旋构成。
在一个实施方式中，包含螺旋-转角-螺旋域的蛋白为MarA家族 多肽。术语“MarA家族多肽”包括许多天然存在的HTH蛋白，例如具 有与MarA的序列相似性且包含MarA家族标签序列模式(signature pattern)(其也称作XylS/AraC标签序列模式)的转录调节蛋白。定义 MarA家族多肽的示例性标签序列模式示于如PROSITE且通过序列： [KRQ]-[LIVMA]-X(2)-[GSTALIV]-{FYWPGDN}X(2)-[LIVMSA]-X(4， 9)-[LIVMF]-X(2)-[LIVMSTA]-X(2)-[GSTACIL]-X(3)-[GANQRF]-[LIV MFY]-X(4，5)-[LFY]-X(3)-[FYIVA]-{FYWHCM}-X(3)-[GSADENQKR] -X-[NSTAPKL]-[PARL]表示，其中X为任意氨基酸。MarA家族多肽 具有两个“螺旋-转角-螺旋”域。该标签序列模式源自跟随第一个(大多 数为氨基末端)螺旋-转角-螺旋域(HTH 1)且包括第二个(大多数为羧基 末端)螺旋-转角-螺旋域(HTH2)的全部区域(参见PROSITE PS00041)。
蛋白质MarA家族(“MarA家族多肽”)代表AraC-XylS家族多肽的 一个亚集且包括如MarA、SoxS、Rob、Rma、AarP和PqrA等的蛋白。 MarA家族多肽通常涉及对于抗生素、有机溶剂和氧化应激剂的抗性 的调节(Alekshun和Levy，(1997)Antimicrob.Agents.Chemother.41： 2067)。像其他的AraC-XylS家族多肽一样，MarA样蛋白通常也包含 两个HTH基序，如通过MarA和Rob晶体结构举例说明的(Kwon等， (2000)Nat.Struct.Biol.7：424；Rhee等，(1998)Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A.95：10413)。MarA家族成员可由本领域技术人员识别且一般通 过具有与MarA的氨基酸30-76和77-106的同源性的蛋白质表示(SEQ ID.NO.1)。
优选地，MarA家族多肽或其部分包含第一MarA家族HTH域 (HTH1)(Brunelle，1989，J Mol Biol；209(4)：607-22)。在另一实施方式 中，MarA多肽包含第二MarA家族HTH域(HTH2)(Caswell，1992， Biochem J.；287：493-509.)。在优选的实施方式中，MarA多肽同时包 含第一和第二MarA家族HTH域。
MarA家族多肽序列与一种或多种已知的MarA家族成员“结构上 相关”，优选与MarA相关。这种相关性可以通过两个MarA家族多肽 序列之间或确定这类多肽的两个MarA家族核苷酸序列之间的序列或 结构相似性来展示。序列相似性可以通过例如使用用于比较目的的序 列对齐程序最优化地对齐MarA家族成员序列并比较相应的位置来展 示。为了确定序列之间相似性的程度，它们将为了最佳比较的目的而 对齐(例如，为了实现与其他蛋白质或核酸分子的最佳对齐，可以将 间隔引入到一个蛋白或核酸分子的序列中)。然后将氨基酸残基或碱 基与相应的氨基酸位置或碱基进行比较。当一个序列中的一个位置被 与其他序列中相应位置的相同的氨基酸残基或相同的碱基占据时，则 分子在该位置是相同的。如果氨基酸残基不相同，它们可能是相似的。 如此处使用的，如果两个氨基酸残基是具有相似侧链的同一残基家族 的成员，那么一个氨基酸残基与另一氨基酸残基“相似”。具有相似侧 链的氨基酸残基家族已在本领域中定义(参见，例如，Altschul等，1990. J.Mol.Biol.215：403)，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、 酸性侧链(例如，天门冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如， 甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、 非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、 苯丙氨酸、蛋氨酸、色氨酸)、β-分枝侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、 异亮氨酸)和芳香侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。因此，序 列之间相似性的程度(百分比)为两个序列共有的相同或相似位置数 目的函数(即，％同源性＝(相同或相似的位置的数目/总位置数 目)×100)。对齐策略在本领域是公知的；对于最佳的序列对齐，参见 例如，Altschul等，同上。
MarA家族多肽可能共有一些与MarA的氨基酸序列的相似性。 MarA和其它的MarA家族多肽的核酸和氨基酸序列在本领域是已知 的。例如，在基因库(登录号M96235)或在Cohen等，1993.J.Bacteriol. 175：1484中，或者在SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2中可以找到MarA 的核酸和氨基酸序列。
MarA的核酸和/或氨基酸序列可用作“查询序列”以对数据库(例 如，公共的或专用的数据库)进行检索，从而例如，识别具有相关序 列的其它MarA家族成员。这些检索可以例如，使用Altschul等，(1990) J.Mol.Biol.215：403-10的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。 BLAST核苷酸检索可用NBLAST程序(评分(score)＝100，字长＝12)进 行以获得与MarA家族核酸分子同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质检 索可以用XBLAST程序(评分＝50，字长＝3)进行以获得与本发明的 MarA蛋白分子同源的氨基酸序列。为了比较目的而获得间隔对齐， 可以如Altschul等，(1997)Nucleic Acids Res.25(17)：3389-3402中描述 的利用间隔(gapped)BLAST。当利用BLAST和间隔BLAST程序时， 可以使用各自程序(例如，XBLAST和NBLAST)的缺省参数。
也可以由于它们特异性地与确定MarA的核酸序列杂交的能力相 似而识别MarA家族成员。这些严格条件是本领域技术人员已知的且 可以找到(例如，在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中)。严格杂交条件的优选的、非限制 性的实例为在6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)中于45℃杂交，接着以0.2X SSC、0.1％SDS在50-65℃洗涤一次或多次。杂交的条件主要取决于 解链温度Tm，其为基本上纯的双链核酸群体中的一半分子观察到的 温度。Tm为给定序列的半数分子熔化或单链化时的温度(以摄氏度 计)。对于11～23碱基序列的核酸，Tm以摄氏度计可以估算为2(A+T 残基的数目)+4(C+G残基的数目)。核酸分子的杂交或退火应该在低 于Tm的温度下进行，例如，低于Tm 15℃、20℃、25℃或30℃。 也可以计算盐浓度(以NaCl的M计)的效应，参见例如，Brown，A.， “Hybridization”pp.503-506，在The Encyclopedia of Molec.Biol.，J. Kendrew，Ed.，Blackwell，Oxford(1994)中。
优选地，以这种方式识别的MarA家族成员的核酸序列与MarA 核苷酸序列至少约10％、20％，更优选地至少约30％，更优选地至少 约40％相同，且优选至少约50％或60％相同。在优选的实施方式中， MarA家族成员的核酸序列与MarA核苷酸序列至少约70％，80％， 优选至少约90％，更优选至少约95％相同。优选地，MarA家族成员 具有与MarA氨基酸序列至少约20％，优选至少约30％，更优选至少 约40％相同且优选至少约50％或60％或以上相同的氨基酸序列。在优 选的实施方式中，MarA家族成员的核酸序列至少约70％、80％，更 优选至少约90％，或更优选至少约95％与MarA核苷酸序列相同。但 是，应当理解的是：即使是同一家族的成员，基因转录的微生物调节 子之间的序列相似性水平也不必然是高的。在变异基因组(divergent genome)(其中序列同一性的水平可能较低，例如，低于20％)的情 况下，这一点特别地真实(例如B.burgdorferi，与例如B.subtilis比较)。 因此，MarA家族成员间的结构相似性也可以基于氨基酸残基的“三维 对应”来确定。如此处使用的，术语“三维对应”意思是包括空间上对 应的(例如，通过例如x-ray晶体学测定为在MarA家族多肽成员相同 的位置上)，但是当使用线性对齐程序对齐时可能不对应的残基。术 语“三维对应”也包括通过例如，突变分析确定为执行相同功能(例如， 结合DNA或结合相同的辅因子)的残基。
代表性的MarA家族多肽示于表1中以及在Prosite(PS00041)中显 示，且包括：AarP、Ada、AdaA、AdiY、AfrR、AggR、AppY、AraC、 CafR、CelD、CfaD、CsvR、D90812、EnvY、ExsA、FapR、HrpB、 InF、InvF、LcrF、LumQ、MarA、MelR、MixE、MmsR、MsmR、 OrfR、Orf_f375、PchR、PerA、PocR、PqrA、RafR、RamA、RhaR、 RhaS、Rns、Rob、SoxS、S52856、TetD、TcpN、ThcR、TmbS、U73857、 U34257、U21191、UreR、VirF、XylR、XylS、Xys1、2、3、4、Ya52、 YbbB、YfiF、YisR、YzbC和YijO。大肠杆菌Rob分子的核苷酸和 氨基酸序列分别示于SEQ ID NO：3和4中。
表1.一些细菌的MarA同源物a
革兰氏阴性菌                             革兰氏阳性菌
大肠杆菌         肺炎克雷伯氏菌          瑞士乳杆菌
                 (Kiebsiella             (Lactobacillus
                 pneumoniae)             helveticus)
MarA(1)          RamA(27)                U34257(38)
OrfR(2，3)
SoxS(4，5)       流感嗜血杆菌            茎廇固氮根廇菌
                 (Haemophilus            (Azorhizobium
                 influenzae)             caulinodans)
AfrR(6)          Ya52(28)                S52856(39)
AraC(7)
CelD(8)          取尔森氏菌属某些种      链霉菌属某些种
                 (Yersinia spp.)         (Streptomyces spp.)
D90812(9)        CafR(29)                U21191(40)
FapR(10，11)     LcrF(30)或VirF(30)      AraL(41)
MelR(12)
ORF f375(13，14) 斯氏普罗威登斯菌        变形链球菌
                 (Providencia stuartii)  (Streptococcus mutans)
RhaR(15，16，17)    AarP(31)             MsmR(42)
RhaS(18)
Rob(19)             假单胞菌属某些种     戊糖片球菌
                    (Pseudomonas spp.)   (Pediococcus
                                         pentosaceus)
U73857(20)          MmsR(32)             RafR(43)
XylR(21)            TmbS(33)
YijO(22)            XylS(34)             鳆鱼发光杆菌
                                         (Photobacterium
                                         leiognathi)
                    Xys1，2，3，4(35，36)LumQ(44)
普通变形杆菌
(Proteus vulgaris)
PqrA(23)            蓝细菌               枯草杆菌
                                         (Bacillus subtilis)
                    集胞藻属某些种       AdaA(45)
                    (Synechocystis spp.)
鼠伤寒沙门氏菌      LumQ(37)             YbbB(46)
MarA(24)            PchR(37)             YfiF(47)
InvF(25)                                 YisR(48)
PocR(26)                                 YznC(49)
a黑体字表示较小的MarA同源物，大小范围为 87(U34257)～138(OrfR)个氨基酸残基。参考文献在括弧中给出并在下 面列出。
表1的参考文献：
(1)S.P.Cohen等，1993.J.Bacteriol.175：1484-1492
(2)G.M.Braus等，1984.J.Bacteriol.160：504-509
(3)K.Schollmeier等，1984.J.Bacteriol.160：499-503
(4)C.F.Amabile-Cuevas等，1991.Nucleic Acids Res. 19：4479-4484
(5)J.Wu等，1991.J.Bacteriol.173：2864-2871
(6)M.K.Wolf等，1990.Infect.Immun.58：1124-1128
(7)C.M.Stoner等，1982.J.Mol.Biol.153：649-652
(8)L.L.Parker等，1990.Genetics 123：455-471
(9)H.Mori，1996.Unpublished data taken from the NCBI databases
(10)P.Klaasen等，1990.Mol.Microbiol.4：1779-1783
(11)M.Ahmed等，1994.J.Biol.Chem 269-28506-28513
(12)C.Webster等，1989.Gene 83：207-213
(13)G.Plunkett，III.1995.Unpublished
(14)C Garcia-Martin等，1992.J.Gen.Microbiol.138：1109-1116
(15)G.Plunkett，III.等，1993.Nucleic Acids Res.21：3391-3398
(16)C.G.Tate等，1992.J.Biol.Chem.267：6923-6932
(17)J.F.Tobin等，1987.J.Mol.Biol.196：789-799
(18)J.Nishitani，1991.Gene 105：37-42
(19)R.E.Benz  等，1993.Zentralbl.Bakteriol.Parasitenkd. Infektionskr.Hyg.Abt.1 Orig.278：187-196
(20)M.Duncan等，1996.Unpublished data
(21)H.J.Sofia等，1994.Nucleic Acids Res.22：2576-2586
(22)F.R.Blattner等，1993.Nucleic Acids Res.21：5408-5417
(23)H.Ishida等，1995.Antimicrob.Agents Chemother.39：453-457
(24)M.C.Sulavik等，1997.J.Bacteriol.179：1857-1866
(25)K.Kaniga等，1994.Mol.Microbiol.13：555-568
(26)J.R.Roth等，1993.J.Bacteriol.175：3303-3316
(27)A.M.George等，1983.J.Bacteriol.155：541-548
(28)R.D.Fleischmann等，1995.Science 269：469-512
(29)E.E.Galyov等，1991.FEBS Lett.286：79-82
(30)N.P.Hoe等，1992.J.Bacteriol.174：4275-4286
(31)G.Cornelis等，1989.J.Bacteriol.171：254-262
(32)D.R.Macinga等，1995.J.Bacteriol.177：3407-3413
(33)M.I.Steele等，1992.J.Biol.Chem.267：13585-13592
(34)G.Deho等，1995.Unpublished data
(35)N.Mermod等，1984.EMBO J.3：2461-2466
(36)S.J.Assinder等，1992.Nucleic Acids Res.20：5476
(37)S.J.Assinder等，1993.J.Gen.Microbiol.139：557-568
(38)E.G.Dudley等，1996.J.Bacteriol.178：701-704
(39)D.Geelen等，1995.Unpublished data
(40)J.Kormanec等，1995.Gene 165：77-80
(41)C.W.Chen等，1992.J.Bacteriol.174：7762-7769
(42)R.R.Russell等，1992.J.Biol.Chem，267：4631-4637
(43)K.K.Leenhouts等，1995.Unpublished data
(44)J.W.Lin等，1995.Biochem.Biophys.Res.Commun. 217：684-695
(45)F.Morohoshi等，1990.Nucleic Acids Res.18：5473-5480
(46)M.Rosenberg等，1979.Annu.Rev.Genet.13：319-353
(47)H.Yamamoto等，1996.Microbiology 142：1417-1421
(48)L.B.Bussey等，1993.J.Bacteriol.175：6348-6353
(49)P.G.Quirk等，1994.Biochim.Biophys.Acta 1186：27-34
术语“转录因子调节化合物”或“转录因子调节剂”包括HTH蛋白 调节化合物、HTH蛋白调节剂。转录因子调节化合物包括与一种或多 种转录因子发生相互作用，由此调节(例如，增强或抑制)所述转录 因子活性的化合物。该术语也包括AraC家族调节化合物和MarA家 族调节化合物。在一个实施方式中，所述转录因子调节化合物为转录 因子(例如，原核转录因子或真核转录激活因子)的抑制化合物。在一 个实施方式中，所述转录因子调节化合物调节转录因子的活性，该活 性通过本领域已知的测定方法或LANCE测定方法(例如U.S.S.N. 11/115024的实施例8中描述的那些，该文献以参阅的方式引入这里) 进行测量。在一个实施方式中，与没有转录因子调节化合物时的转录 因子活性相比，转录因子调节化合物抑制特定的转录因子约10％或更 多、约40％或更多、约50％或更多、约60％或更多、约70％或更多、 约80％或更多、约90％或更多、约95％或更多或者约100％的活性。 在另一实施方式中，转录因子调节化合物抑制生物膜的形成。在一个 实施方式中，如通过本领域已知的测定方法或U.S.S.N.11/115024(以 参阅的方式引入这里)的实施例7中描述的结晶紫(Crystal Violet)测 定方法测量的，转录因子调节化合物抑制生物膜的形成。在一个实施 方式中，与没有转录因子调节化合物时的生物膜形成相比，本发明的 转录因子抑制约25％或更多、50％或更多、75％或更多、80％或更多、 90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％或更多、98％或更多、99％ 或更多、99.9％或更多、99.99％或更多或者100％的生物膜形成。
术语“HTH蛋白调节化合物”或“HTH蛋白调节剂”包括与一种或 多种HTH蛋白相互作用而由此调节(例如，增强或抑制)所述HTH 蛋白活性的化合物。在一个实施方式中，HTH蛋白调节化合物为MarA 家族多肽调节化合物。在一个实施方式中，当HTH蛋白与HTH蛋白 调节化合物相互作用时，HTH蛋白的活性提高。例如，HTH蛋白的 活性与没有HTH调节化合物存在时的HTH蛋白活性相比可以提高超 过10％、超过20％、超过50％、超过75％、超过80％、超过90％或 100％。在另一实施方式中，HTH蛋白与HTH蛋白调节化合物相互作 用时活性降低。在一个实施方式中，当与HTH蛋白没有使用此处描 述的技术和测试方法与本发明的HTH调节化合物接触时的HTH蛋白 的蛋白质活性相比，HTH蛋白的活性降低约25％或更多、50％或更多、 75％或更多、80％或更多、90％或更多、95％或更多、96％或更多、97％ 或更多、98％或更多、99％或更多、99.9％或更多、99.99％或更多或 者100％。此处包括的值和范围和/或此处给出的值的中间值也包括在 本发明的范围之内。
术语“MarA家族多肽调节化合物”或“MarA家族调节化合物”包括 与一种或多种MarA家族多肽相互作用，由此增强或抑制所述MarA 家族多肽的活性的化合物。在一个实施方式中，MarA家族多肽调节 化合物为抑制化合物。在进一步的实施方式中，MarA家族抑制化合 物为MarA、Rob和/或SoxS的抑制剂。在另一实施方式中，MarA家 族多肽调节化合物在U.S.S.N.11/115024(以参阅的方式引入这里) 的实施例9中描述的萤光素酶测试方法中调节萤光素酶的表达。在一 个实施方式中，MarA家族多肽调节化合物降低萤光素酶的表达超过 10％、超过20％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过 70％、超过80％、超过90％或约100％。
术语“多肽”指的是包含通过肽键或变形肽键彼此连接的两个或 多个氨基酸的肽或蛋白质。“多肽”包括短链(通常指称作肽、寡肽和 寡聚体)和长链(通常称作蛋白质)。多肽可以包含20个基因编码 氨基酸之外的氨基酸。“多肽”包括通过自然过程(例如加工和其它的 翻译后修饰)和通过化学修饰技术修饰的多肽。这些修饰在基础文献 里和更加详细的专题论文中以及大量的研究文献中进行了很好的描 述，且是本领域技术人员公知的。应当理解的是：相同类型的修饰在 给定多肽的几个位点上可以以相同或不同的程度存在。另外，给定的 多肽可以包含多种类型的修饰。修饰可以发生在多肽中的任何地方， 包括肽骨架、氨基酸侧链和氨基或羧基端。修饰包括，例如乙酰化、 酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、核黄素的共价连接、血红素部分的 共价连接、核苷酸或核苷酸衍生物的共价连接、脂类或脂类衍生物的 共价连接、磷脂酰肌醇的共价连接、交联、环化、二硫键形成、脱甲 基化、形成共价交联、形成半胱氨酸、形成焦谷氨酸、甲酰化、γ-羧 化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、豆蔻酰化、氧化、 蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、消旋化、糖基化、脂质连接、 硫酸化、谷氨酸残基的γ-羧化、羟基化和ADP-核糖基化、硒基化 (selenoylation)、硫酸化、转移RNA介导的蛋白质的氨基酸添加(例如 精氨酰化)和泛素化。参见，例如Proteins-Structure And Molecular Properties，第二版，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York(1993)和Wold，F.，Posttranslational Protein Modifications： Perspectives and Prospects，1-12页，Posttranslational Covalent Modification Of Proteins，B.C.Johnson编辑，Academic Press，New York(1983)；Seifter等，Meth.Enzymol.182：626-646(1990)和Rattan 等，Protein Synthesis：Posttranslational Modifications and Aging，Ann. N.Y.Acad.Sci.663：48-62(1992)。多肽可以是分枝的或环状的，具有 或不具有分支。环状的、分枝的和分枝环状的多肽可以由翻译后的自 然过程获得或者也可以通过完全合成的方法制备。
此处使用的术语“翅状螺旋”包括二聚的转录因子，其中各个单体 包含伴随一个或两个发夹状翅的螺旋-转角-螺旋基序(Brennan.1993. Cell.74：773；Gajiwala和Burley.2000.Curr.Opin.Struct.Biol. 10：110)。虽然已证明在结构上有一些变化，但是典型的翅状螺旋基序 在序列H1-B1-H2-T-H3-B2-W1-B3-W2(其中H为螺旋，B为β链，T 为转角，以及W为翅)中包含两个翅、三个α螺旋和三个β链(Huffman 和Brennan.2002.Current Opinion in Structural Biology.12：98)。
此处使用的术语“环状铰合螺旋”包括在没有DNA存在时显示出 由四链的β片组成的二聚体N-末端区域和包含一个α螺旋和“环状铰 合”的C-末端DNA结合区域的转录因子(例如AbrB)(参见例如， Huffman和Brennan.2002 Current Opinion in Structural Biology 12：98)。对应AbrB的R23和R24的残基对于DNA识别是关键的且 有助于DNA结合区域的带正电特性。
优选的多肽(以及对它们进行编码的核酸分子)为“自然发生”的。 如此处使用的，“自然发生”的分子指的是具有自然界存在的氨基酸 或核苷酸序列的分子(例如，天然多肽)。此外，提供了保持与自然发 生的多肽相同的功能活性(例如，结合靶核酸分子(例如，包含marbox) 或结合多肽(例如，RNA聚合酶)的能力)的多肽和核酸分子的自然或 非自然发生的变异体。通过例如变异体结合MarA家族多肽应答元件 的能力可以表现出这种免疫交叉反应性。这些变异体可以例如使用本 领域已知的技术通过突变而制备。或者，变异体可以化学合成。
此时使用的术语“变异体”包括序列与基准核酸分子或多肽不同， 但保持其本质特性的核酸分子或多肽。变异体的核苷酸序列的变化可 能改变或不改变由基准核酸分子编码的多肽的氨基酸序列。核苷酸或 氨基酸的变化可能导致自然发生的基准序列编码的多肽中的氨基酸 置换、添加、缺失、融合和截断。典型的多肽变异体与基准多肽的氨 基酸序列不同。通常，其差异受到限制以使基准多肽和变异体的序列 总体上密切相似且在许多区域是相同的。变异体和基准多肽的氨基酸 序列可以通过任意组合的一个或多个置换、添加和/或缺失而不同。
核酸分子或多肽的变异体可以是自然发生的(例如等位基因变异 体)，或者它可以是不被认为是自然发生的变异体。核酸分子和多肽 的非自然发生的变异体可以通过诱变技术、直接合成和技术人员知晓 的其他重组方法由基准核酸分子或多肽制得。或者，变异体可以化学 合成。例如，功能相当(例如，具有与MarA家族多肽应答元件相互 作用的能力)的自体多肽的人工或突变形式可以使用本领域公知的技 术制得。
突变可以包括，例如可引起置换，或至少一个缺失或插入的至少 一个离散的点突变。例如，突变也可以通过随机诱变或使用盒式诱变 获得。对于前者，分子的整个编码区通过几种方法(化学方法、PCR、 掺杂的寡核苷酸合成)中的一种进行诱变，且随机突变分子的收集样 品进行选择或筛选程序。在后者中，对应于或者确定结构或者功能决 定子的多肽的离散区域进行饱和的或半随机的诱变，且这些诱变的盒 再次引入到另外的野生型等位基因前后。在一个实施方式中，可以使 用PCR诱变。例如，可以使用Megaprimer PCR(O.H.Landt，1990.Gene 96：125-128)。
在优选的实施方式中，MarA家族多肽排除XylS、AraC和MelR 中的一种或多种。在其他优选的实施方式中，MarA家族多肽涉及抗 生素抗性。在特别优选的实施方式中，MarA家族多肽选自：MarA、 RamA、AarP、Rob、SoxS和PqrA。
术语“转录因子的活性”包括转录因子与DNA相互作用(例如与转 录因子效应启动子结合或者由该启动子启动转录)的能力。该术语明 确地包括AraC家族多肽、HTH蛋白和MarA家族多肽的活性。
术语“MarA家族多肽的活性”包括MarA家族多肽与DNA相互作 用(例如，结合MarA家族多肽效应启动子或者由该启动子启动转录) 的能力。MarA同时起到转录激活剂(例如，向上调节例如inaA、galT、 micF等的基因)和阻遏物(例如，向下调节例如fecA、purA、guaB等 的基因)的作用(Alekshun，1997，Antimicrob.Agents Chemother. 41：2067-2075；Barbosa & Levy，J.Bact.2000，Vol.182，p.3467-3474； Pomposiello等，J.Bact.2001，Vol 183，p.3890-3902)。
术语“转录因子应答元件”包括可与参与启动微生物中操纵子转 录的转录因子(例如，启动子或增强子或操纵基因)相互作用的核酸序 列。本领域中已知对各种转录因子作出响应的转录因子应答元件且另 外的应答元件可以由本领域中的普通技术人员进行识别。例如，可以 使用微阵列分析识别由目标转录因子调控的基因。例如，转录因子调 控的基因在野生型细胞中与所述转录因子缺失的细胞相比以更高的 水平进行表达。此外，响应于给定的转录因子的基因在其启动子区域 中包含一个或多个对所述转录因子作出响应的靶序列(Lyons等，2000. PNAS 97：7957)。示例性的应答元件包括：araBAD、araE、araFGH(对 AraC作出响应)；melBAD(对MelR作出响应)；rhaSR(对RhaR作出 响应)；rahBAD、rhaT(对RhaS作出响应)；Pm(对XylS作出响应)； fumC、inaA、micF、nfo、pai5、sodA、tolC、acrAB、fldA、fpr、mar、 poxB、ribA和zwf(对MarA、SoxS、Rob作出响应)；以及coo、rns(对 Rns作出响应)。
术语“marA家族多肽应答元件”包括可以与marA相互作用的核 酸序列，例如参与微生物中核酸序列转录的调节的启动子或增强子。 MarA应答元件包含约16个碱基对的marbox序列，该序列对于MarA 和其靶点的结合是关键的。此外，处于初级marbox的上游的次级位 点(附属的marbox)有助于基础的和去阻遏的mar转录。Marbox可以 位于向前或向后的方向(Martin，1999，Mol.Microbiol.34：431-441)。在 marRAB操纵子中，marbox处于向后的方向且由此相对于marRAB位 于有义链上(Martin，1999，Mol.Microbiol.34：431-441)。特定启动子的 marbox序列中的细微差别可能导致MarA和其它相关转录因子(例 如，SoxS和Rob)的差异调节(Martin，2000，Mol Microbiol； 35(3)：623-34)。在一个实施方式中，MarA家族应答元件为结构上或功 能上与marA启动子相关的启动子，例如，与MarA或MarA相关蛋 白相互作用。优选地，marA家族多肽应答元件为marRAB启动子。 例如，在mar操纵子中，数个启动子为此处定义的marA家族多肽效 应启动子，例如，来自marO区域的405-bp ThaI片段为marA家族效 应启动子(Cohen等，1993.J.Bact.175：7856)。此外，MarA已显示与 16bp MarA结合位点(称作marO中的“marbox”)结合(Martin等，1996. J.Bacteriol.178：2216)。MarA也影响acrAB、micF、mlr 1，2，3、slp、 nfo、inaA、fpr、sodA、soi-17，19、zwf、fumC或rpsF启动子的转录 (Alekshun和Levy.1997.Antimicrobial Agents and Chemother. 41：2067)。其它的marA家族效应启动子在本领域中是已知的且包括： 被AraC激活的araBAD、araE、araFGH和araC，被XylS激活的Pm， 被MelR激活的melAB以及Rob结合的oriC。
术语“MarA家族多肽效应启动子”还包括在与MarA家族成员蛋 白相互作用时足以激活转录的上述启动子的部分。本领域普通技术人 员可以容易地(例如使用诱变)确定任何MarA家族多肽效应启动子满 足其活性最低需要的部分。示例性的技术由Gallegos等(1996，J. Bacteriol.178：6427)描述。“MarA家族多肽效应启动子”也包括与自然 发生的MarA家族启动子具有相同功能的MarA家族多肽效应启动子 的非自然发生的变异体。优选地，这些变异体与自然发生的MarA家 族多肽效应启动子具有至少30％或以上、40％或以上或者50％或以上 的核苷酸序列同一性。在优选的实施方式中，这些变异体与自然发生 的MarA家族多肽效应启动子具有至少约70％的核苷酸序列同一性。 在更优选的实施方式中，这些变异体与自然发生的MarA家族多肽效 应启动子具有至少约80％的核苷酸序列同一性。在特别优选的实施方 式中，这些变异体与自然发生的MarA家族多肽效应启动子具有至少 约90％的核苷酸序列同一性且优选至少约95％的核苷酸序列同一性。 在其它的实施方式中，编码MarA家族多肽效应启动子的变异体的核 酸分子能够在严格条件下与编码自然发生的MarA家族多肽效应启动 子的核酸分子杂交。
在一个实施方式中，此处描述的方法可采用识别为响应本发明的 转录因子的分子，即，其表达受到转录因子控制的调节子中的分子。 例如，对微生物转录因子(例如，marA家族转录因子)直接调节的基因 的转录进行调节的化合物可用于调节微生物的毒力或调节微生物引 起的感染。在另一实施方式中，使用此处描述的方法可以确认这些基 因在控制毒力方面是重要的。如此处使用的，术语“调节子”包括由共 同的阻遏物或激活剂蛋白调节其表达的两个或多个不同的操纵子中 的两个或多个位点。
术语“相互作用”包括引起可测量的效应的分子间紧密接触，例 如，一个分子与另一个分子结合。例如，MarA家族多肽可以与MarA 家族多肽应答元件相互作用并改变DNA的转录水平。同样，化合物 可以与MarA家族多肽相互作用并改变MarA家族多肽的活性。
术语“诱导型启动子”包括经活化以诱导它们控制的基因进行合 成的启动子。如此处使用的，术语“组成型启动子”包括不需要诱导物 存在的启动子，例如，持续活动的启动子。
术语“异源DNA”或“异源核酸”包括在其所存在的细胞中非自然 发生的DNA(例如，为基因组的一部分)，或者与自然发生的相比在基 因组中存在一个或多个位置不同的DNA，或者可操作地连接到自然 状态下一般不连接的DNA上的DNA(如，可操作性地连接到异源启 动子的基因)。异源DNA为：1)在特定位置(例如，在基因组中的特 定位置)非自然发生或2)对于所引入的细胞是非内源性的，而是从另 一个细胞获得。异源DNA可以来自相同的物种或来自不同的物种。 本领域技术人员公认或认为对于表达细胞为异源的或外来的任何 DNA在这里都包括在术语异源DNA中。
术语“异源蛋白”、“重组蛋白”和“外源性蛋白”在整个说明书中可 互换使用且指的是通过重组DNA技术制备的多肽，其中通常，编码 多肽的DNA插入到合适的表达载体中，表达载体随后用于转化宿主 细胞来产生异质蛋白。也就是说，所述多肽由异质核酸分子表达。
术语“微生物”包括表达或使得表达转录因子、araC家族多肽、 HTH蛋白或marA家族多肽的微生物。“微生物”具有某些经济意义， 例如，环境上的重要性或作为重要的人类病原体。例如，在一个实施 方式中，微生物引起环境问题(例如污垢或酸败)或发挥有用的功能 (例如分解植物物质)。在另一实施方式中，微生物为生活在哺乳动 物体内或表面的有机体且在医学上是重要的。优选地微生物为单细胞 的且包括细菌、真菌或原生动物。在另一实施方式中，在本发明中适 合使用的微生物为多细胞的，例如寄生虫或真菌。在优选的实施方式 中，微生物对人、动物或植物是致病性的。微生物可以以完整的细胞 使用或对于无细胞分析方法作为材料来源使用。在一个实施方式中， 微生物包括原核生物。在其它实施方式中，微生物包括真核生物。含 有MarA同源物的代表性细菌包括：
MarA


术语“选择性标志”包括可用作指示剂的多肽，例如，当细胞表达 时提供可选择的或可筛选的性状。术语“选择性标志”包括可选择的标 志和可反向选择的标志。如此处使用的，术语“可选择的标志”包括当 满足分析的测试参数的化合物或分子存在时引起生长优势的标志。术 语“可反向选择的标志”包括引起生长不利条件的标志，除非破坏利于 所述可反向选择标志表达的条件的化合物或分子存在。代表性的选择 性标志包括细胞毒性基因产物、赋予抗生素抗性的基因产物、生长必 需的基因产物、在特定代谢底物存在的情况下进行表达时赋予选择性 生长不利条件的基因产物(例如，在5-氟乳清酸的存在下，URA3基 因的表达赋予生长不利条件)。
如此处使用的术语“报道基因”包括编码易于检测的产物的任何 基因，其可操作地连接到调节序列，例如，连接到转录因子效应启动 子。可操作连接意思是在适合的条件下，RNA聚合酶可以结合调节 区的启动子并开始转录核苷酸序列，由此所述报道基因被转录。在优 选的实施方式中，报道基因包括连接在报道基因框中的转录因子效应 启动子。但是，在某些实施方式中，可能希望在报道基因构成中包括 其它的序列，例如转录调节序列。例如，可以通过改变结合启动子区 的RNA聚合酶或者可选择地，通过干扰转录的开始或mRNA的延长 影响启动子活性的调节。因此，报道基因构成中也可以包括此处总称 为转录调节元件或序列的序列。此外，该构成可以包括改变所得的 mRNA的翻译的核苷酸序列，由此改变报道基因产物的量。
报道基因的实例包括，但不限于CAT(氯霉素乙酰转移酶)(Alton 和Vapnek(1979)，Nature 282：864-869)、萤光素酶和其它的酶检测系 统，例如β-半乳糖苷酶、萤火虫萤光素酶(deWet等，(1987)，Mol.Cell. Biol.7：725-737)、细菌萤光素酶(Engebrecht和Silverman(1984)，PNAS 1：4154-4158；Baldwin等，(1984)，Biochemistry 23：3663-3667)、PhoA、 碱性磷酸酶(Toh等，(1989)Eur.J.Biochem.182：231-238；Hall等， (1983)J.Mol.Appl.Gen.2：101)、人胎盘分泌的碱性磷酸酶(Cullen和 Malim，(1992)Methods in Enzymol.216：362-368)和绿色荧光蛋白(美国 专利5,491,084；WO96/23898)。
在本发明的某些实施方式中，希望获得“分离的或重组的”核酸分 子转录因子或其突变体形式。术语“分离的或重组的”包括被例如(1) 通过例如多聚酶链式反应(PCR)在体外扩增，(2)通过克隆重组生成， 或(3)如通过裂解和凝胶分离进行纯化或(4)通过例如化学合成而被合 成的核酸分子。这一核酸分子与基因组中天然侧邻的序列分离和与细 胞组分分离。
在本发明的其它实施方式中，希望获得基本上纯的或重组的转录 因子。这些多肽可以，例如从被工程化以表达编码转录因子的分离或 重组核酸分子的细胞进行纯化。例如，如下面更加详细地描述的，细 菌细胞可用编码转录因子的质粒转化。然后转录因子可以从细菌细胞 纯化且用在例如此处描述的或本领域已知的无细胞分析中。
如此处使用的，术语“抗生素”包括从天然来源分离的或化学合成 的抗微生物剂。术语“抗生素”指的是在人体治疗中使用的抗微生物 剂。优选的抗生素包括：四环素、氟喹诺酮类、氯霉素、青霉素类、 头孢菌素类、嘌呤霉素、萘啶酸和利福平。
术语“测试化合物”包括在本发明的分析中使用且通过例如结合 多肽或结合与它发生相互作用的分子而测定其影响转录因子(例如， AraC家族多肽、HTH蛋白或MarA家族多肽)活性的能力的任何试 剂或测试物。在筛选实验中，可以同时测试多于一个的化合物(例如 多个化合物)对转录因子(例如，AraC家族多肽、HTH蛋白或MarA 家族多肽)活性进行调节的能力。在有利的实施方式中，测试化合物 为MarA家族调节化合物。
可以在主体分析(subject assay)中测试的测试化合物包括抗生素 和非抗生素化合物。在一个实施方式中，测试化合物包括候选的清洁 剂或消毒剂化合物。可以进行活性筛选的代表性测试化合物包括，但 不限于肽、非肽的化合物、核酸、糖类、小的有机分子(例如，聚酮 化合物)以及天然产物提取物库。术语“非肽的测试化合物”包括(至少 部分)由不同于通过天然肽键连接的自然发生的L-氨基酸残基的分子 结构组成的化合物。但是，“非肽的测试化合物”也包括(全部或部分) 由拟肽结构组成的化合物(例如D-氨基酸、非自然发生的L-氨基酸、 修饰的肽骨架等)，以及(全部或部分)由与通过天然肽键连接的自 然发生的L-氨基酸残基不相关的分子结构组成的化合物。“非肽的测 试化合物”也有意包括天然产物。
在一个实施方式中，小分子可以用作测试化合物。术语“小分子” 为本领域的术语且包括小于约1000分子量或小于约500分子量的分 子。在一个实施方式中，小分子并不专门地包括肽键。在另一实施方 式中，小分子不为低聚物。可进行活性筛选的代表性的小分子化合物 包括，但不限于肽、拟肽、核酸、糖、小的有机分子(例如，聚酮化 合物)(Cane等，1998.Science 282：63)和天然产物的提取物库。在另一 实施方式中，所述化合物为小的、有机的非肽化合物。在进一步的实 施方式中，小分子不是生物合成的。
术语“拮抗剂”包括通过结合并使转录因子(例如，AraC家族调节 化合物、MarA家族多肽调节化合物等)失活，通过结合与转录因子相 互作用的核酸靶点(例如，对于MarA来说，marbox)，通过破坏负责 激活特定调节子的信号传导途径(例如，对于Mar来说，MarR的失活 或MarA合成的激活)，和/或通过破坏关键的蛋白-蛋白相互作用(例 如，MarA发挥转录因子功能所需要的MarA-RNA聚合酶相互作用) 来抑制转录因子的活性的转录因子调节化合物(例如，AraC家族多肽 调节化合物、HTH蛋白调节化合物、MarA家族多肽调节化合物等)。 拮抗剂可以包括，例如天然或化学合成的化合物，如可透过细胞的小 的有机分子、核酸间螯合物(interchelator)、肽等。
术语“激动剂”包括通过结合并激活转录因子(例如，AraC家族调 节化合物、MarA家族多肽调节化合物等)，通过结合与转录因子相互 作用的核酸靶点(例如，对于MarA来说，marbox)，通过促进负责激 活特定调节子的信号传导途径(例如，对于Mar来说，MarR的失活或 MarA合成的激活)，和/或通过促进关键的蛋白-蛋白相互作用(例如， MarA发挥转录因子功能所需要的MarA-RNA聚合酶相互作用)来促 进转录因子的活性的转录因子调节化合物(例如，AraC家族多肽调节 化合物、HTH蛋白调节化合物、MarA家族多肽调节化合物等)。激动 剂可以包括，例如，天然或化学合成的化合物，如可透过细胞的小的 有机分子、核酸间螯合物、肽等。
II.MarA家族多肽螺旋-转角-螺旋域
螺旋-转角-螺旋域在本领域是已知的且参与DNA结合(Ann Rev. of Biochem.1984.53：293)。可以在Brunelle和Schleif(1989，J.Mol.Biol. 209：607)中找到螺旋-转角域的共有序列的实例。所述域通过下述序列 表示：XXXPhoAlaXXPhoGlyPhoXXXXPhoXXPhoXX，其中X为任何 氨基酸且Pho为疏水的氨基酸。
MarA的晶体结构已被测定且MarA的第一(大多数为氨基 端)HTH域确认为包括约31位氨基酸到约52位氨基酸，并且MarA 的第二HTH域确认为包括约79位氨基酸到约102位氨基酸(Rhee 等，1998.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.95：10413)。
本领域技术人员很容易找到其它MarA家族成员以及其它HTH 蛋白中的螺旋-转角-螺旋域的位置。例如使用MarA蛋白序列和对齐 程序(例如，本领域中已知的ProDom程序或其它程序)，MarA氨基酸 序列的一部分(例如包括MarA的一个或两个HTH域)(例如，从MarA 的约30位氨基酸到约107位氨基酸)以产生对齐。使用这样的对齐， 可以在其他的MarA家族成员蛋白中识别与MarA的HTH域相对应的 氨基酸序列。MarA家族多肽的第一螺旋-转角-螺旋域的代表性共有 序列显示为：XXXXAXXXXXSXXXLXXXFX，其中X为任意氨基酸。 MarA家族多肽第二螺旋-转角-螺旋域的代表性共有序列显示为： XXIXXIAXXXGFXSXXXFXXX[F/Y]，其中X为任意氨基酸。优选 地，MarA家族多肽的第一螺旋-转角-螺旋域包含共有序列 E/D-X-V/L-A-D/E-X-A/S-G-X-S-X3-L-Q-X2-F-K/R/E-X2-T/I。优选地， MarA家族多肽的第二螺旋-转角-螺旋域包含共有序列 I-X-D-I-A-X3-G-F-X-S-X2-F-X3-F-X4。
在一个实施方式中，MarA家族成员HTH域为MarA HTH域。 MarA的第一和第二螺旋-转角-螺旋域分别为 EKVSERSGYSKWHLQRMFKKET和 ILYLAERYGFESQQTLTRTFKNYF。其他代表性的MarA家族螺旋- 转角-螺旋域包括：MelR的约210位氨基酸至约229位氨基酸和约259 位氨基酸至约278位氨基酸、AraC的约196位氨基酸至约215位氨 基酸和约245位氨基酸至约264位氨基酸、以及XylS的约230位氨 基酸至约249位氨基酸(或233-253)和约281位氨基酸至约301位氨 基酸(或282-302)(参见，例如，Brunelle等，1989.J.Mol.Biol.209：607； Niland等，1996.J.Mol.Biol.264：667；Gallegos等，1997.Microbiology and Molecular Biology Reviews.61：393)。
“MarA家族多肽螺旋-转角-螺旋域”源自上述的MarA家族多肽中 发现的螺旋-转角-螺旋区域或与其同源。在优选的实施方式中，MarA 家族多肽排除XylS、AraC和MelR中的一个或多个。在特别优选的 实施方式中，MarA家族多肽选自MarA、RamA、AarP、Rob、SoxS 和PqrA。
MarA家族多肽中存在的两个螺旋-转角-螺旋域都在蛋白质的羧 基末端。在本方法中可以使用包含这些域中的一个或两个的蛋白质或 其部分。在某些实施方式中，用于筛选化合物的多肽包含与其所来源 的MarA家族多肽的羧基末端最接近的螺旋-转角-螺旋域(HTH2)。在 其他实施方式中，这种多肽包含与其来源的MarA家族多肽的氨基末 端最接近的螺旋-转角-螺旋域(HTH1)。在一个实施方式中，也可以存 在其他的多肽序列，例如可能有助于使所述域固定在载体上的序列， 或者可选择地，可能有助于所述域的纯化的序列。
在一个实施方式中，这种多肽基本上由最接近其来源的MarA家 族多肽的羧基末端的螺旋-转角-螺旋域组成。在其他优选的实施方式 中，这种多肽基本上由最接近其来源的MarA家族多肽的氨基末端的 螺旋-转角-螺旋域组成。
在一个实施方式中，这种多肽由最接近其来源的AraC家族多肽 或MarA家族多肽的羧基末端的螺旋-转角-螺旋域组成。在其他优选 的实施方式中，这种多肽由最接近其来源的AraC家族多肽或MarA 家族多肽的氨基末端的螺旋-转角-螺旋域组成。
MarA家族多肽或AraC家族多肽螺旋-转角-螺旋域可以使用本领 域已知的技术制得。转录因子(例如MarA家族多肽)的核酸和氨基 酸序列可以从例如，GenBank得到。使用这一信息、螺旋-转角-螺旋 共有基序和此处提供的突变分析，本领域的普通技术人员可以识别 MarA家族或AraC家族多肽螺旋-转角-螺旋域。
在本发明的某些实施方式中，希望获得编码转录因子或其部分 (例如，HTH蛋白螺旋-转角-螺旋域、AraC家族螺旋-转角-螺旋域、 MarA家族螺旋-转角-螺旋域或其突变体形式)的“分离的或重组的”核 酸分子。“分离的或重组的”意为(1)通过例如多聚酶链式反应(PCR)在 体外扩增，(2)通过克隆重组地生成，或(3)如通过裂解和凝胶分离纯 化或(4)通过例如化学合成被合成的核酸分子。这种核酸分子与基因组 中其天然侧邻的序列分离并与细胞组分分离。
如下面进一步讨论的，编码转录因子(例如，HTH蛋白螺旋-转角 -螺旋域、AraC家族螺旋-转角-螺旋域、MarA家族螺旋-转角-螺旋域 或其突变体形式)的分离的或重组体核酸分子然后可以例如，在结合 分析中使用，可以在细胞中表达或者可以在噬菌体表面上表达。
在本发明的其他实施方式中，希望获得基本上纯化的或重组体 HTH蛋白螺旋-转角-螺旋域(例如，MarA家族螺旋-转角-螺旋域或其 突变体形式)。例如，这些多肽可以从工程化以表达编码HTH蛋白螺 旋-转角-螺旋域(例如，MarA家族螺旋-转角-螺旋域或其突变体形式) 的分离的或重组的核酸分子的细胞进行纯化。例如，如下面更加详细 地描述的，细菌细胞可以使用编码MarA家族螺旋-转角-螺旋域的质 粒进行转化。然后所述MarA家族螺旋-转角-螺旋蛋白可以从所述细 菌细胞纯化并用在例如此处描述的无细胞分析中。
使用本领域已知的技术可以完成HTH蛋白螺旋-转角-螺旋域(例 如，MarA家族螺旋-转角-螺旋域)的纯化。例如，可以使用柱色谱法， 或者可以在例如柱上或在淘洗分析中使用对该域或对与该域融合的 多肽特异性的抗体。
在优选的实施方式中，进行纯化的用于表达HTH蛋白螺旋-转角 -螺旋域(例如，MarA家族螺旋-转角-螺旋域或其突变体形式)的细胞， 例如宿主细胞，包含使任何内源性HTH蛋白非功能化或致使内源性 蛋白不被表达的突变。在其他实施方式中，突变也可以在宿主细胞的 MarR或相关基因中产生，从而与MarA家族多肽相同的启动子结合 的阻遏蛋白不被宿主细胞表达。
在本发明的某些实施方式中，希望使用HTH蛋白螺旋-转角-螺旋 域的突变体形式，例如具有活性改变(例如，未保持野生型MarA家族 多肽螺旋-转角-螺旋域的活性，或者当与野生型MarA家族多肽螺旋- 转角-螺旋域比较时具有较低的活性或者更加活跃)的MarA家族螺旋- 转角-螺旋域的非自然发生的形式。
可以使用本领域公知的技术制得这些突变体形式。例如可以使用 随机诱变。使用随机诱变时，可以诱变整个分子或可以通过盒式诱变 进行诱变。在前一情况下，分子的整个编码区域通过几种方法(化学 方法、PCR、掺杂的寡核苷酸合成)中的一种进行诱变，且对随机突变 分子的收集样品进行选择或筛选过程。在第二种途径中，对与确定的 结构或功能决定子(例如，螺旋-转角-螺旋域的第一或第二α螺旋)对 应的蛋白质离散区域进行饱和或半随机的诱变，且这些诱变的基因盒 被再次引入到另外的野生型等位基因的上下。
在优选的实施方式中，使用PCR诱变。例如，U.S.S.N.11/115024 的实施例2描述了Megaprimer PCR(O.H.Landt，Gene 96：125-128)用于 将NheI限制位点引入到marA基因的螺旋A(位置1989)和螺旋B(位 置2016)两个区域的中心的用途。
在一个实施方式中，这些突变的螺旋-转角-螺旋域在最接近MarA 家族多肽分子的羧基末端的螺旋-转角-螺旋域(HTH2)中包含一个或 多个突变。在优选的实施方式中，所述突变包含在最接近MarA家族 多肽的羧基末端的螺旋-转角-螺旋域的螺旋A和螺旋B中的插入。在 一个实施方式中，这些突变螺旋-转角-螺旋域在最接近MarA家族多 肽分子的氨基末端的螺旋-转角-螺旋域(HTH1)中包含一个或多个突 变。在优选的实施方式中，所述突变包含在最接近MarA家族多肽的 氨基末端的螺旋-转角-螺旋域的螺旋A和螺旋B中的插入。在特别优 选的实施方式中，所述突变选自：对应于MarA的约位置33的氨基 酸插入和对应于MarA约位置42的氨基酸插入。“对应的”氨基酸 可以使用例如，螺旋-转角-螺旋域的对齐进行测定。
MarA家族螺旋-转角-螺旋基序的这些突变体形式可用作对照以 验证抗感染化合物对MarA家族螺旋-转角-螺旋域的特异性，或者作 为识别影响抗感染药抗性的基因位点的对照。例如，在所附的实施例 中描述的突变体MarA家族螺旋-转角-螺旋域表明：在第一HTH域的 螺旋A或螺旋B任一处MarA的插入性失活可以消除大肠杆菌和耻垢 分支杆菌(M.smegmatis)的多药抗性表型。通过使用例如实施例2中 (其表明MarA家族多肽螺旋-转角-螺旋域提高抗生素抗性的能力，以 及这些域的突变体形式没有相同的效果)描述的分析系统，人们可以 清楚的看出：所识别的任何基因位点的响应对MarA家族螺旋-转角- 螺旋域是特异性的。
III.多肽或其部分的表达
可以使用载体在细胞内表达编码转录因子(例如AraC家族多肽)、 HTH蛋白(例如MarA家族多肽)或可选择的标志(或保持全长多肽的 活性的部分，例如能够结合转录因子应答元件或保持其指示功能)的 核酸。可以使用几乎任何常规的递运载体。这些载体可广泛地从商业 途径获得且选择适合用于给定的微生物细胞的载体在本领域技术人 员的知识和判断之内。编码这些域的序列可以在自我复制的载体上引 入到细胞内或者可以使用同源重组或通过例如转座子的插入元件引 入到微生物的染色体中。
可以使用标准技术将这些核酸引入到微生物细胞中，例如通过使 用氯化钙或电穿孔进行转化。用于将DNA引入到微生物中的这些技 术在本领域是公知的。在一个实施方式中，通过例如多聚酶链式反应 (PCR)在体外扩增、通过克隆重组生成、或通过如裂解和凝胶分离进 行纯化或通过例如化学合成方法合成的核酸分子可用于产生MarA家 族多肽(George，A.M.& Levy，S.B.(1983)J.Bacteriol.155，541-548； Cohen，S.P.等，(1993)J Infect.Dis.168，484-488；Cohen，S.P等，(1993) J Bacteriol.175，1484-1492；Sulavick，M.C.等，(1997)J.Bacteriol.179， 1857-1866)。
宿主细胞可以进行遗传工程化以整合本发明的核酸分子。在一个 实施方式中，确定转录因子的核酸分子可以置于载体中。术语“载体” 指的是能够输送其连接的另一核酸分子的核酸分子。术语“表达载体” 或“表达系统”包括包含处于适合通过细胞表达的形式(例如，连接到启 动子上)的基因构建体的任何载体(例如，质粒、粘粒或噬菌体染色体)。 在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用，因为质粒为通常使用的 载体的形式。此外，本发明意图包括发挥等效功能的其他载体。很多 种表达系统可用于产生本发明的多肽。这些载体特别包括染色体的、 附加体的和病毒源的载体，例如源自细菌质粒、噬菌体、转座子、酵 母附加体、插入元件、酵母染色体元件、病毒(例如杆状病毒、如SV40 的乳多空病毒、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、伪狂犬病病毒和反转 录病毒)的载体，以及源自其组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗 传元件的那些载体，例如粘粒和噬菌粒。
适当的载体可广泛地从商业途径获得且选择适合用于给定的宿 主细胞的载体在本领域技术人员的知识和判断之内。编码转录因子 (例如，举个例子，MarA家族多肽)的序列可以在自我复制的载体 上引入到细胞内或者可以使用同源重组或通过如转座子的插入元件 引入到微生物的染色体中。
表达系统的构成可以包含调节表达的控制区。“转录调节序列”为 总称，指的是诱导或控制多肽编码序列转录的DNA序列(例如起始信 号、增强子、操纵基因和启动子)，该DNA序列与多肽编码序列可操 作地连接。也应当理解的是，编码转录因子基因(例如，HTH蛋白基 因或AraC家族多肽，如MarA家族多肽)的重组体基因可在转录调 节序列的控制下，该转录调节序列与控制自然发生转录因子基因的转 录的那些序列相同或不同。代表性的调节序列描述于Goeddel；Gene Expression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press， San Diego，CA(1990)中。例如，当与DNA序列操作连接时控制DNA 序列表达的大范围表达控制序列中的任一种可以用于这些载体中以 表达编码多肽的DNA序列。
通常，就这点来考虑，适合在宿主中保持、增殖或表达核酸分子 和/或表达多肽的任何系统或载体都可用于表达。适当的DNA序列可 以通过许多种公知的和常规的技术中的任一种插入到表达系统，例 如，举个例子，那些在Sambrook等，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，(同上)中描述的技术。
用于在细菌(例如，革兰氏阳性、革兰氏阴性)中、或在简单的 真核真菌(例如，酵母(Saccharomyces)或毕赤酵母(Pichia))的细胞中、 或在真核生物(例如昆虫、鸟、哺乳动物或植物)的细胞中表达编码 多肽的基因且能够复制的典型表达载体在本领域是已知的。这些载体 可以携带用于表达宿主(例如链霉菌属(Streptomyces))和基因操作和载 体构建宿主(例如大肠杆菌)的两种功能性的复制指定序列(复制子)， 参见，例如，U.S.4,745,056。适合于多种有机体的载体描述在Ausubel， F.等，Short Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York(1995)中， 且例如，对于毕赤酵母，可以从Invitrogen(Carlsbad，CA)获得。
有用的表达控制序列包括，例如SV40的早期和晚期启动子、腺 病毒或巨细胞病毒的直接早期启动子、lac系统、trp系统、TAC或 TRC系统，表达受到T7RNA聚合酶调控的T7启动子、噬菌体λ的 主要操纵基因和启动子区、fd被覆多肽(coat polypeptide)的控制区、 3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶的启动子、酸性磷酸酯酶(例如， Pho5)的启动子、酵母α交配因子的启动子、杆状病毒系统的多面体 启动子和已知控制原核或真核细胞或它们的病毒的基因表达的其他 序列，及其各种组合。可用的翻译的增强子序列描述在U.S.4,820,639 中。
在一个实施方式中，使用诱导型启动子表达本发明的多肽。例如， 在一个实施方式中，可以在细菌细胞中使用trp(通过色氨酸诱导)、 tac(通过乳糖诱导)或tet(通过四环素诱导)，或者可以在酵母细胞中使 用GAL1(通过半乳糖诱导)。
在另一实施方式中，组成型启动子可以用于表达本发明的多肽。
应当理解的是，表达载体的设计可能取决于如待转化的宿主细胞 的选择和/或希望表达的多肽的类型的因素。适当的宿主的代表性实例 包括细菌细胞(例如革兰氏阳性、革兰氏阴性细胞)、真菌细胞(例如酵 母细胞和曲霉菌细胞)、昆虫细胞(例如果蝇S2和夜蛾Sf9细胞)、动 物细胞(例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、293和Bowes 黑色素瘤细胞)以及植物细胞。
在一个实施方式中，用于表达本发明的异质多肽的细胞包含使得 一种或多种内源性转录因子(例如，AraC家族多肽或MarA家族多肽) 非功能化或导致一种或多种内源性多肽不被表达的突变。以这种方式 对遗传背景进行操作使得能够筛选调节特定转录因子(例如MarA家 族成员或AraC家族成员)或超过一种转录因子的化合物。
在其他实施方式中，突变也可以在宿主细胞的其他相关基因中形 成，以使得不会干扰内源性的宿主位点。在再另一实施方式中，突变 在染色体的基因中形成以产生异养生物。
将核酸分子引入到宿主细胞(“转化”)可以通过在许多标准实验手 册中描述的方法完成，例如Davis等，Basic Methods In Molecular Biology，(1986)和Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)。其实例包括磷酸钙转染、DAEA-葡聚糖介导的 转染、转位、微注射、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、划痕 标记(scrape loading)、冲击引入(ballistic introduction)和感染。
多肽(例如重组体表达的多肽)的纯化可以使用本领域已知的技术 完成。例如，如果多肽以细胞分泌的形式表达，则可以收集培养基。 或者，如果多肽以细胞保持的方式表达，则宿主细胞可以被溶解以释 放多肽。这些用过的培养基或细胞溶解产物可用于浓缩和纯化所述多 肽。例如，培养基或溶解产物可通过柱子(例如，已结合了对多肽特 异性的抗体的柱)。或者，这些抗体可以是对与第一多肽融合的第二 多肽(例如，作为标记物)特异性的，从而帮助纯化第一多肽。其他纯 化多肽的方式在本领域是已知的。
IV.识别调节转录因子活性的抗感染化合物的方法
转录因子激动剂和拮抗剂可以多种方式进行分析。例如，在一个 实施方式中，本发明提供例如通过测量化合物与转录因子核酸分子或 转录因子多肽相互作用的能力或者化合物调节转录因子多肽的活性 或表达的能力来识别调节转录因子的化合物的方法。此外，可以测试 化合物调节转录因子多肽或转录因子核酸分子与它们正常结合的分 子(例如，核酸或蛋白质分子)的结合的能力。
在一个实施方式中，转录因子和它的同源DNA序列可以存在于 无细胞的系统中，例如细胞溶解产物中，且可以使用本领域中已知的 技术测量化合物对该相互作用的影响。
在优选的实施方式中，分析系统为基于细胞的系统。使用主体方 法识别的化合物可用于例如干扰微生物在宿主中的能力生长和/或降 低微生物毒力，并由此可用于降低微生物在宿主中引起感染的能力。
可以多种方式测定测试化合物调节转录因子表达和/或活性的能 力。可以在本分析方法中使用的代表性的方法在本领域是已知的且描 述在例如，5,817,793和WO 99/61579中。其他的示例性方法在下面 进行更详细的描述。
在一个实施方式中，本发明提供通过将表达转录因子(或其部分) 的细胞与测试化合物在允许所述测试化合物与所述细胞相互作用的 条件下接触而识别调节转录因子(例如，HTH蛋白、MarA家族多肽、 AraC家族多肽等)的表达和/或活性的测试化合物的方法。
分析方法
在一个实施方式中，在表达marA的细胞中，赋予选择性生长不 利条件或致死性的可选择标志的表达置于MarA应答元件的直接控制 下。
在一个实施方式中，marA为质粒编码的。在一个实施方式中， 宿主生物体的遗传背景是被操作以例如，删除一个或多个染色体的 marA基因或marA同源基因。
在一个实施方式中，marA的表达通过高度调节的和诱导型的启 动子控制。例如，在一个实施方式中，可以使用选自细菌细胞中的trp、 tac或tet或者酵母中的GAL1的启动子。
在另一实施方式中，marA的表达是组成型的。
在一个实施方式中，选择性标志为细胞毒性基因产物(例如， ccdB)。
在另一实施方式中，选择性标志为赋予抗生素抗性的基因(例如， kan、cat或bla)。
在另一实施方式中，选择性标志为必需基因(例如，嘌呤或鸟嘌 呤异养生物中的purA或guaB)。
在再另一实施方式中，选择性标志为在特定代谢底物存在时赋予 选择性生长不利条件的基因(例如在酵母中，在5-氟代乳清酸[5-FOA] 存在的情况下URA3的表达)。
在一个实施方式中，使用单杂交筛选分析来识别调节转录因子 (例如，HTH蛋白，AraC家族多肽或MarA家族多肽)的化合物。如此 处使用的，此处术语“单杂交筛选”包括检测蛋白-核酸相互作用的破坏 的分析方法。这些分析方法将识别干扰转录因子(例如，HTH蛋白、 AraC家族多肽或MarA家族多肽)与特定靶标(例如，对于MarA为 含有marbox的DNA)以靶标本身的水平结合的物质，例如通过与靶 标结合并阻止转录激活因子与该位点的相互作用或与该位点的结合。
在另一实施方式中，使用双杂交筛选分析识别本发明的化合物。 如此处使用的，此处术语“双杂交筛选”包括检测对蛋白-蛋白相互作用 的破坏的分析方法。该双杂交分析方法可用于干扰关键的蛋白-转录 因子相互作用(例如，HTH蛋白相互作用、AraC家族多肽相互作用、 MarA家族多肽相互作用)。一个实例是阻止RNA聚合酶-MarA家族 多肽的接触，这对于MarA家族多肽发挥转录因子的功能(正向作用或 负向作用)是必需的。
在再另一实施方式中，使用三杂交筛选分析识别本发明的化合 物。如此处使用的，此处术语“三杂交筛选”包括检测对特定的目标调 节子激活必需的信号转导途径的破坏的分析。在一个实施方式中，三 杂交筛选用于检测Mar调节子激活(即，MarA的合成)需要的信号 转导途径的破坏(Li和Park.J.Bact.181：4824)。该分析方法可以用于 识别负责激活转录因子表达的化合物，例如抗生素的Mar诱导可以这 种方式进行。
在该分析方法的一个实施方式中，选择性标志(例如，ccdB、cat、 bla、kan、guaB、URA3)的表达置于可激活的MarA应答可激活启动 子(例如，inaA、galT、micF)的直接控制下。在MarA不存在时，选 择性标志的表达将是静止的。例如，在对细胞毒性基因ccdB进行调 节的情况下，基因将是静止的且细胞存活。在适合的宿主中由可诱导 的质粒合成MarA将导致MarA应答可激活启动子的激活和选择性标 志的表达。在ccdB的情况下，基因将被表达且导致细胞死亡。抑制 MarA的化合物将被识别为允许细胞在MarA表达的条件下存活的那 些化合物。
在另一实施方式中，例如当MarA应答可激活启动子的表达调节 如URA3的基因时，可获得不同的结果。在这种情况下，MarA不存 在并因此没有URA3的表达，细胞将在5-FOA存在的条件下生长。 一旦激活MarA的表达并由此导致URA3合成，细胞将在5-FOA被 URA3转变成毒性代谢产物之后死亡。
在另一实施方式中，可选择的标志置于可抑制MarA应答启动子 (例如，fecA)的直接控制下。在这个实例中，在组成型MarA合成的 条件下，例如在组成型mar(marc)突变体中，可选择标志的表达是静 止的。在ccdB的情况下，这意味着细胞将保持活力。在MarA失活 之后，可选择的标志将被启动，导致细胞死亡。
在另一实施方式中，可通过在大肠杆菌内灭活染色体guaB或 purA基因构建嘌呤或鸟嘌呤异养生物。然后guaB或purA基因在其 天然启动子的控制下被克隆到适合的载体中。然后这种构建体被转化 到异养的宿主中。如果MarA表达为组成型的且如果细胞在缺少嘌呤 或鸟嘌呤的基上培养，所述异养生物将不生长。这可能是由于MarA 介导的guaB或purA合成的抑制。MarA的候选抑制化合物可被识别 为恢复生长(即缓解MarA介导的guaB或purA表达的抑制)的化合物。 在另一实施方式中，在体内生长所需要的基因，例如在动物感染模型 中。
在优选的实施方式中，可以包括对照以确保使用主体分析方法识 别的任何化合物不只是因为它们抑制蛋白合成而表现为调节转录因 子的活性。例如，如果化合物表现为抑制由RNA(其在MarA家族应 答元件激活时被转录)翻译的蛋白质的合成，则可能希望表明对照(例 如由不是在MarA家族应答元件激活时转录的RNA翻译的蛋白质)的 合成不会由于加入相同的化合物而受到影响。例如，使制得的MarA 家族多肽的量与制得的内源性蛋白质的量相当。在另一实施方式中， 微生物可用包含非MarA家族应答启动子的启动子或与该启动子可操 作地连接的蛋白的另一质粒转化。对照蛋白的表达可用于使化合物存 在或缺少的情况下产生的蛋白质的量标准化。
V.适合于测试的微生物
多种不同的微生物均适合在本测定方法中用于测试。如此，它们 可以完整的细胞使用或用作材料(例如，此处描述的核酸分子或多肽) 的来源。
在优选的实施方式中，在主张的方法中使用的微生物为细菌(革 兰氏阴性或者革兰氏阳性细菌)。更具体地，在主张的方法中优选使 用已显示出抗生素抗性(例如显示Mar表型的)或者有传染性的或潜在 地有传染性的任何细菌。
适合测试的微生物的实例包括，但不限于：绿脓杆菌、荧光假单 胞菌(Pseudomonas fluorescens)、食酸假单胞菌(Pseudomonas acidovorans)、产碱假单胞菌(Pseudomonas alcaligenes)、恶臭假单胞 菌(Pseudomonas putida)、嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、嗜水气单胞 菌(Aeromonas hydrophilia)、大肠杆菌、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)、鼠伤寒沙门氏菌、伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)、副伤寒 沙门氏菌(Salmonella paratyphi)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、志贺氏痢疾杆菌(Shigella dysenteriae)、弗氏志贺氏菌 (Shigella flexneri)、索氏志贺氏菌(Shigella sonnei)、阴沟肠杆菌 (Enterobacter cloacae)、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)、肺炎克 雷伯氏杆菌、产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca)、粘质沙雷氏杆菌 (Serratia marcescens)、土拉热弗朗西斯氏菌(Francisella tularensis)、 摩氏摩根氏菌(Morganella morganii)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、普通变形杆菌、产碱普罗威登斯菌(Providencia alcalifaciens)、雷氏普罗威登斯菌(Providencia rettgeri)、斯氏普罗威 登斯菌、醋酸钙不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、溶血不动杆菌 (Acinetobacter haemolyticus)、小肠结肠炎耶尔森氏菌、鼠疫耶尔森氏 菌、假结核耶尔森氏菌(Yersinia pseudotuberculosis)、中间耶尔森氏菌 (Yersinia intermedia)、百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌 (Bordetella parapertussis)、支气管败血性博德特氏菌、流感嗜血杆菌、 副流感嗜血杆菌(Haemophilus parainfluenzae)、溶血嗜血杆菌 (Haemophilus haemolyticus)、副溶血嗜血杆菌(Haemophilus parahaemolyticus)、杜克雷嗜血杆菌(Haemophilus ducreyi)、多杀巴斯 德氏菌(Pseudomonas acidovorans)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、卡他布兰汉氏球菌(Branhamella catarrhalis)、幽门螺旋 杆菌(Helicobacter pylori)、胚胎弯曲杆菌(Campylobacter fetus)、空肠 弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)、大肠弯曲杆菌(Campylobacter coli)、 伯氏包柔氏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、霍乱弧菌、副溶血弧菌 (Yibrio parahaemolyticus)、嗜肺性军团菌(Legionella pneumophila)、单 核细胞增多性李氏菌(Listeria monocytogenes)、淋病奈瑟氏菌 (Neisseria gonorrhoeae)、脑膜炎萘瑟氏菌、阴道加德纳氏菌 (Gardnerella vaginalis)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、吉氏拟杆菌 (Bacteroides distasonis)、拟杆菌属(Bacteroides)3452A同源组 (homology group)、普通拟杆菌(Bacteroides vulgatus)、卵形拟杆菌 (Bacteroides ovalus)、多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)、单形 拟杆菌(Bacteroides uniformis)、埃氏拟杆菌(Bacteroides eggerthii)、内 脏拟杆菌(Bacteroides splanchnicus)、艰难梭菌(Clostridium difficile)、 结核分枝杆菌、鸟结核分枝杆菌(Mycobacterium avium)、胞内分枝杆 菌(Mycobacterium intracellulare)、麻风分枝杆菌、白喉杆菌 (Corynebacterium diphtheriae)、溃疡棒杆菌(Corynebacterium ulcerans)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae)、酿脓链球菌、粪肠球菌、屎肠球菌 (Enterococcus faecium)、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermidis)、腐生葡萄球菌(Staphylococcus saprophyticus)、中间葡萄球菌(Staphylococcus intermedius)、猪葡萄球 菌猪亚种(Staphylococcus hyicus subsp.hyicus)、溶血葡萄球菌 (Staphylococcus haemolyticus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)和 解糖葡萄球菌(Staphylococcus saccharolyticus)。
在一个实施方式中，适合测试的微生物为来自肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)的细菌。在优选的实施方式中，化合物有效对抗 选自下列某一属中的细菌：埃希氏杆菌属(Escherichia)、变形杆菌属、 沙门氏菌属(Salmonella)、克雷伯氏菌属、普罗威登斯菌属 (Providencia)、肠杆菌属、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、假单胞细 菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、嗜血杆菌属 (Haemophilus)、耶尔森氏菌属、奈瑟氏菌属(Neisseria)和分枝杆菌属 (Mycobacteria)。
在其它的实施方式中，测试的微生物为革兰氏阳性细菌，且选自 下述的属中：乳酸杆菌属(Lactobacillus)、固氮根瘤菌属 (Azorhizobium)、链霉菌属、片球菌属(Pediococcus)、发光菌属 (Photobacterium)、芽胞杆菌属(Bacillus)、肠球菌属(Enterococcus)、葡 萄球菌属(Staphylococcus)、梭菌属(Clostridium)和链球菌属 (Streptococcus)。
在其它的实施方式中，待测试的微生物为真菌。在优选的实施方 式中，所述真菌来自毛霉菌属(Mucor)或念珠菌属(Candida)，例如， 总状毛霉菌(Mucor racmeosus)或白色念珠菌(Candida albicans)。
在其他实施方式中，待测试的微生物为原生动物。在优选的实施 方式中，所述微生物为疟疾或隐孢子虫寄生虫。
VI.转录因子调节化合物和测试化合物
在本方法中用于测试的化合物可以源自多种不同的来源，且可以 是已知的或可以是新的。在一个实施方式中，在本方法中测试化合物 文库以识别转录激活因子调节化合物，例如HTH蛋白调节化合物、 AraC家族多肽调节化合物、MarA家族多肽调节化合物等。在另一实 施方式中，在本方法中测试已知化合物以识别转录因子调节化合物 (例如，举个例子，HTH蛋白调节化合物、AraC家族多肽调节化合物、 MarA家族多肽调节化合物等)。在一个实施方式中，在本方法中测试 环境保护局(Environmental Protection Agency)一般认为安全(GRAS)的 化合物目录中的化合物。在另一实施方式中，调节化合物调节的转录 因子为原核微生物的转录因子。
药物化学中最近的趋势包括生成化合物的混合物，称为文库。虽 然在本领域中已很好的建立了肽文库的使用，但是已发展出允许产生 其他化合物的混合物的新技术，例如苯并二氮卓类(Bunin等，1992.J. Am.Chem.Soc.114：10987；DeWitt等，1993.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6909)、类肽(Zuckermann.1994.J.Med.Chem.37：2678)、寡聚氨基 甲酸酯类(Cho等，1993.Science.261：1303)和乙内酰脲类(DeWitt等， 同上)。Rebek等已描述了合成具有104-105的多样性的小有机分子分 子文库的途径(Carell等，1994.Angew.Chem.Int.Ed.Engl.33：2059； Carell等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.1994.33：2061)。
本发明的化合物可以通过使用本领域中已知的组合文库方法的 众多途径中的任意一种获得，包括：生物学文库、可空间定址的平行 固相或液相文库、需要重叠合的合成文库方法、“一珠一化合物”文库 方法以及使用亲和色谱选择的合成文库方法。生物学文库途径限于多 肽文库，而其他四种途径适用于肽、非肽的寡聚体或小分子的化合物 文库(Lam，K.S.Anticancer Drug Des.1997.12：145)。
可进行活性筛选的示例性化合物包括，但不限于肽、核酸、糖类、 小的有机分子和天然产物提取物文库。在一个实施方式中，测试化合 物为肽或拟肽。在另一优选实施方式中，化合物为小的、有机非肽化 合物。
在本领域中可以找到合成分子文库的其他示例性的方法，例如在 Erb等，1994.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91：11422；Horwell等，1996 Immunopharmacology 33：68；以及Gallop等，1994.J.Med.Chem. 37：1233中。
化合物文库可以存在于溶液(例如，Houghten(1992)Biotechniques 13：412-421)中，或在珠上(Lam(1991)Nature 354：82-84)、芯片上(Fodor (1993)Nature 364：555-556)、细菌上(Ladner USP 5,223,409)、孢子上 (Ladner USP′409)、质粒上(Cull等，(1992)Proc Natl Acad Sci USA 89：1865-1869)或噬菌体上(Scott和Smith(1990)Science 249：386-390)； (Devlin(1990)Science 249：404-406)；(Cwirla等，(1990)Proc.Natl. Acad.Sci.87：6378-6382)；(Felici(1991)J.Mol.Biol.222：301-310)； (Ladner，同上)。其他类型的肽文库也可以被表达，参见例如美国专利 5,270,181和5,292,646。在再另一实施方式中，组合多肽可以由cDNA 文库产生。
在其他实施方式中，化合物可以是核酸分子。在优选的实施方式 中，用于测试的核酸分子为小的寡核苷酸。这些寡核苷酸可以是随机 产生的寡核苷酸文库或可以是经特别设计以降低转录因子(例如， HTH蛋白、MarA家族多肽或者AraC家族多肽)的活性。例如，在 一个实施方式中，这些寡核苷酸是有义或反义的寡核苷酸。在一个实 施方式中，用于测试的寡核苷酸对于特定转录因子的结合位点(例如， MarA家族多肽螺旋-转角-螺旋域)是有义的。在给出特定转录因子 多肽(例如MarA家族多肽)的序列的情况下设计这类寡核苷酸的方 法是在本领域的技能之内。
在再另一实施方式中，计算机程序可用于识别具有调节转录因子 活性(例如HTH蛋白、AraC家族多肽或MarA家族多肽的活性)的 较大可能性的个别化合物或化合物的类。这类程序可筛选具有与选择 的转录因子的适当分子和化学互补性的化合物。以该方式，可以提高 上述分析中筛选转录因子调节化合物的效率。本发明本身不仅涉及识 别转录因子调节化合物的方法，而且涉及通过本发明的方法识别的化 合物，以及使用所述识别的化合物的方法。
VII.MarA家族调节化合物及其使用方法
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(I)的转录因子 调节化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此降低所述微 生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R1为羟基、OCOCO2H；直链或支链C1-C5烷氧基；或者直链或 支链C1-C5烷基；
A、B、D、E、W、X、Y和Z各自独立地为碳或氮；
其中，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为碳时，R2、R3、R4、 R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为 氮时，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地不存在或为羟 基；以及
R10、R11、R12和R13各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳 氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、 烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨 基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷 基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当A、B、C、D、E、W、X、Y和Z各个为碳时，R6、 R7、R8和R9中的一个不为氢。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(I)的转录因子调节化合物及其药学 上可接受的盐、酯和前药接触，由此调节转录：

其中：
R1为羟基、OCOCO2H；直链或支链C1-C5烷氧基；或者直链或 支链C1-C5烷基；
A、B、D、E、W、X、Y和Z各自独立地为碳或氮；
其中，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为碳时，R2、R3、R4、 R5、R6、R7、R8和R9各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当A、B、D、E、W、X、Y和Z为 氮时，R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8和R9各自独立地不存在或为羟 基；以及
R10、R11、R12和R13各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳 氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、 烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨 基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷 基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳时，R6、R7、 R8和R9中的一个不为氢。
在一个实施方式中，A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳， R1为羟基，R2、R4、R5、R10、R11和R12各个为氢，R3为硝基，R13 为芳基，例如卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯基)，R6为卤素(例如， 氟)，以及R7、R8和R9为氢。
在另一实施方式中，A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳， R1为羟基，R2、R4、R5、R10、R11和R12各个为氢，R3为硝基，R13 为芳基，卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯基)，R6、R7和R8为氢，以 及R9为卤素(例如，氟)。
在进一步的实施方式中，A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为 碳，R1为羟基，R2、R4、R5、R10、R11和R12各个为氢，R3为硝基， R13为芳基，如卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯基)，R6、R8和R9为 氢，以及R7为取代的烷基(例如，吗啉基甲基)或未取代的烷基(例如， 甲基)。
在再另一实施方式中，A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳，R1 为羟基，R2、R4、R5、R10、R11和R12各个氢，R3为硝基，R13为芳基， 如卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯基)，R6、R7和R9各个为卤素且 R8为烷氧基(例如，甲氧基)。
在一个实施方式中，A、B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳， R1为羟基，R2、R4、R5、R10、R11和R12各个为氢，R3为硝基且R13 为芳基，例如烷基取代的苯基(例如，4-甲基苯基)。在一个实施方式 中，R6、R8和R9各个为氢且R7为烷基(例如，乙基)。
在另一实施方式中，A、B、D、W、X、Y和Z各个为碳，E为 氮，R1为羟基，R2、R4、R5、R6、R7、R8、R10、R11和R12为氢，R3 为硝基，R9不存在且R13为芳基，例如卤素取代的苯基(例如，4-氟代 苯基或2，4-氟代苯基)。
在进一步的实施方式中，B、D、E、W、X、Y和Z各个为碳， A为氮，R1为羟基，R2、R4、R5、R7、R8、R9、R10、R11和R12为氢， R6不存在，R3为硝基且R13为芳基，例如卤素取代的苯基(例如，4- 氟代苯基或2，4-氟代苯基)。
在再另一实施方式中，A、B、D、E、X、Y和Z各个为碳，W 为氮，R1为羟基，R2、R4、R7、R8、R9、R10、R11和R12各个为氢， R3为硝基，R5不存在，R6为卤素(例如，氟)且R13为芳基，例如卤素 取代的苯基(例如，4-氟代苯基)。
在一个实施方式中，A、B、D、E、X、W和Z各个为碳，Y为 氮，R1为羟基，R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各个 为氢，R3为羟基且R13为芳基，例如卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯 基)。
在另一实施方式中，A、B、D、E、X、Y和Z各个为碳，W为 氮，R1为羟基，R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12各个 为氢，R5为羟基且R13为芳基，例如卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯 基)。
在进一步的实施方式中，A、B、D、E、W、X和Z各个为碳， Y为氮，R1为羟基，R2、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12 各个为氢，R3不存在且R13为芳基(例如，取代的苯基，例如4-氟代苯 基)。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(II)的转录因 子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R1a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、 R13b、R13c、R13d和R13e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳 基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳 氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、 烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨 基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷 基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e为氢时，R13c不为 氢、氟、二甲基氨基、氰基、羟基、甲基或甲氧基；以及
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b和R13d为氢时，R13c和R13e不 为氟。
在再另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转 录的方法，包括：将转录因子与通式(II)的转录因子调节化合物及其 酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R1a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、 R13b、R13c、R13d和R13e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e为氢时，R13c不为 氢、氟、二甲基氨基、氰基、羟基、甲基或甲氧基；以及
条件是：当R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、 R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b和R13d为氢时，R13c和R13e不 为氟。
在一个实施方式中，R1a为羟基，R3a为氰基且R2a、R4a、R5a、R6a、 R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13c、R13d和R13e各个为 氢。
在另一实施方式中，R1a为羟基，R3a为氰基，R2a、R4a、R5a、R6a、 R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e各个为氢且 R13c为卤素(例如，氟)、烷基(例如，甲基)或酰基。
在再另一实施方式中，R1a为羟基和R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、 R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R12a、R13a、R13b、R13c、R13d和R13e各个为 氢且R11a为芳基(例如，苯基)、卤素(例如，氟)或烷基(例如，甲基)。
在另一实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R2b、R4a、R5a、 R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e各个为氢， R13c为卤素(例如，氟)且R11a为烷基(例如，羟乙基或哌嗪基甲基)。
在进一步的实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、 R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e各个为 氢且R13c为烷基(例如，异丙基)、酰基或杂芳基(例如，三唑、咪唑或 噁唑)。
在一个实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、 R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b和R13d各个为氢且R13c 和R13e各个为烷氧基(例如，甲氧基)。
在另一实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R4a、R5a、R6a、 R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13d和R13e各个为氢以及R13b 为烷基(例如，膦酸或膦酸二烷基酯取代的烷基)，且R13e为卤素(例如， 氟)。
在一个实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R13c为卤素(例如， 氟)，R2a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d 和R13e各个为氢且R4a为烷基氨基(例如，二甲基氨基或二烷基氨基烷 基氨基)、烷基(例如，甲基)或烷氧基(例如，乙氧基、膦酸取代的烷 氧基、醚取代的烷氧基、烷基氨基取代的烷氧基或杂环取代的烷氧基， 例如，吗啉取代的烷氧基或哌嗪取代的烷氧基)或卤素(例如，氟)。
在再另一实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R13c为卤素(例如， 氟)，R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d 和R13e各个为氢且R2a为烷基氨基(例如，烷基氨基烷基氨基，例如二 甲基氨基乙基氨基)。
在进一步的实施方式中，R1a为取代或未取代的直链或支链C1-C5 烷氧基(例如，膦酸取代的烷氧基或膦酸二烷基酯烷氧基)，R3a为硝基， R13c为卤素(例如，氟)，R2a、R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、 R12a、R13a、R13b、R13d和R13e各个为氢。
在再另一实施方式中，R1a为羟基，R3a为硝基，R2a、R5a、R6a、 R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、R13b、R13d和R13e为氢，R13c 为酰基且R4a为烷氧基(例如，哌嗪基取代的烷氧基或吗啉取代的烷氧 基)。
在进一步的实施方式中，R1a为羟基，R3a为杂芳基(例如，咪唑基 或吡唑基)，R3a、R4a、R5a、R6a、R7a、R8a、R9a、R10a、R11a、R12a、R13a、 R13b、R13d和R13e各个为氢，且R13c为卤素(例如，氟)。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(III)的转录因 子调节化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R14为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
G、J、K、L、M、Q、T和U各自独立地为碳或氮；
其中，当G、J、K、L、M、Q、T和U为碳时，R15、R16、R17、 R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳 基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当G、J、K、 L、M、Q、T和U为氮时，R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、 R23和R24各自独立地不存在或为羟基；
R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳时，R15、R16、 R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24中的一个不为氢。
在再另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转 录的方法，包括：将转录因子与通式(III)的转录因子调节化合物及其 药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此调节转录：

其中：
R14为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
G、J、K、L、M、Q、T和U各自独立地为碳或氮；
其中，当G、J、K、L、M、Q、T和U为碳时，R15、R16、R17、 R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳 基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；或者，当G、J、K、 L、M、Q、T和U为氮时，R15、R16、R17、R18、R19、R20、R21、R22、 R23和R24各自独立地不存在或为羟基；
R23和R24各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 不存在、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：当G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳时，R15、R16、 R17、R18、R19、R20、R21、R22、R23和R24中的一个不为氢。
在一个实施方式中，G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳，R14 为羟基，R16为硝基，R24为芳基(例如，苯基，例如酰基取代的苯基)， R15、R17、R18、R19、R20和R21为氢且R22为卤素(例如，氟)。
在另一实施方式中，G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳，R14 为羟基，R16为硝基，R24为芳基(例如，苯基，例如酰基取代的苯基)， R15、R17、R18、R19、R21和R22为氢且R20为烷基(例如，甲基或乙基)。
在再另一实施方式中，G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳， R14为羟基，R16为硝基，R24为芳基(例如，苯基，例如酰基取代的苯 基)，R15、R17、R18、R19、R20和R22为氢且R21为烷氧基(例如，甲氧 基)。
在进一步的实施方式中，G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳， R14为羟基，R16为硝基，R24为芳基(例如，苯基，例如卤素取代的苯 基，例如，4-氟代苯基)，R15、R17、R18、R19、R20和R22为氢且R21 为卤素(例如，氟)或烷氧基(例如，甲氧基或膦酸取代的烷氧基)。
在一个实施方式中，G、J、K、L、M、Q、T和U各个为碳，R14 为羟基，R16为硝基，R24为芳基(例如，苯基，例如卤素取代的苯基， 例如，4-氟代苯基)，R15、R17、R18、R19、R21和R22为氢且R20为烷 基(例如，乙基)。
在一个实施方式中，G、J、K、L、Q、T和U各个为碳，M为 氮，R14为羟基，R16为硝基，R15、R17、R18、R20、R21、R22和R23各 个为氢，R19不存在且R24为芳基，例如，举个例子，取代的苯基，且 尤其是，卤素取代的苯基(例如，4-氟代苯基)或酰基取代的苯基(例如， 4-酰基取代的苯基)。
在另一实施方式中，G、J、K、L、M、Q和T各个为碳，U为 氮，R14为羟基，R16为硝基，R15、R17、R18、R19、R20、R21和R23各 个为氢，R22不存在且R24为芳基，例如，举个例子，苯基，例如卤素 取代的苯基(4-氟代苯基)。
在再另一实施方式中，其中J、K、L、M、Q、T和U各个为碳， G为氮，R14为羟基，R16为硝基，R15、R17、R19、R20、R21、R22和 R23各个为氢，R18不存在且R24为芳基，例如，举个例子，苯基，其 可以被卤素(例如，4-氟代苯基)或酰基(例如，4-酰基苯基)取代。
在一个实施方式中，G、J、L、M、Q、T和U各个为碳，K为 氮，R14为羟基，R16不存在，R15、R17、R18、R19、R20、R21、R22和 R23各个为氢且R24为芳基，例如，举个例子，苯基，其可以被卤素取 代(例如，4-氟代苯基)。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(IV)的转录因 子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R14a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R15a、R16a、R17a、R18a、R19a、R20a、R21a、R22a、R23a以及R24a、 R24b、R24c、R24d和R24e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；
条件是：R24a、R24b、R24c、R24d和R24e中的至少两个不为氢。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(IV)的转录因子调节化合物及其酯、 前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录：

其中
R14a为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R15a、R16a、R17a、R18a、R19a、R20a、R21a、R22a、R23a以及R24a、 R24b、R24c、R24d和R24e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、 杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基 羰基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基 羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、 芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素；或者R24c和R24d连接形成环；
条件是：R24a、R24b、R24c、R24d和R24e中的至少两个不为氢。
在一个实施方式中，R14a为羟基，R15a、R17a、R18a、R19a、R20a、 R21a、R22a、R23a、R24a、R24b和R24e为氢，R16a为硝基且R24c和R24d连 接形成环(例如，六元环，如环己酮)。
在另一实施方式中，R14a为羟基，R15a、R17a、R18a、R19a、R20a、 R21a、R22a、R23a、R24a、R24b和R24e为氢，R16a为硝基以及R24c为卤素 (例如，氟)且R24d为卤素(例如，氟)、烷基(例如，甲基)或烷氧基(例 如，甲氧基)。
在再另一实施方式中，R14a为羟基，R15a、R17a、R18a、R19a、R20a、 R21a、R22a、R23a、R24a、R24b和R24d为氢，R16a为硝基，R24c为卤素(例 如，氟)且R24e为烷氧基(例如，甲氧基)。
在进一步的实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低 微生物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(V)的转 录因子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低 所述微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R25为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34、R35a、R35b、R35c、 R35d和R35e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、 氨基肟或卤素；
条件是：R26、R27、R28和R29中的至少两个不为氢。
在另一实施方式中，本发明涉及一种调节转录的方法，包括：将 转录因子与通式(V)的转录因子调节化合物及其酯、前药和药学上可 接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R25为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或 支链C1-C5烷基；
R26、R27、R28、R29、R30、R31、R32、R33、R34、R35a、R35b、R35c、 R35d和R35e各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、 杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂 芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳 基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、 CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、 氨基肟或卤素；
条件是：R26、R27、R28和R29中的至少两个不为氢。
在一个实施方式中，R25为羟基，R26、R29、R30、R31、R32、R33、 R34、R35a、R35b、R35d和R35e各个为氢，R27为硝基，R28为烷基(例如， 甲基)且R35c为酰基或杂芳基(例如，噁唑)。
在一个实施方式中，本发明涉及一种降低微生物细胞的抗生素抗 性的方法，包括：将所述细胞与通式(VI)的转录因子调节化合物及其 酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述微生物细胞的抗生 素抗性：

其中：
R25’为取代的直链或支链C1-C5烷氧基；
R26’、R27’、R28’、R29’、R30’、R31’、R32’、R33’、R34’、R35a’、R35b’、 R35c’、R35d’和R35e’各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰 基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳 基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素。
在另一实施方式中，本发明涉及一种调节转录的方法，包括：将 转录因子与通式(VI)的转录因子调节化合物及其酯、前药和药学上可 接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R25’为取代的直链或支链C1-C5烷氧基；
R26’、R27’、R28’、R29’、R30’、R31’、R32’、R33’、R34’、R35a’、R35b’、 R35c’、R35d’和R35e’各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂 芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰 基、杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰 基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳 基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、 芳基肟、氨基肟或卤素。
在一个实施方式中，R26’、R28’、R29’、R30’、R31’、R32’、R33’、R34’、 R35a’、R35b’、R35d’和R35e’各个为氢，R27’为硝基，R35c’为卤素(例如，氟) 且R25’为膦酸取代的烷氧基、烷基膦酸取代的烷氧基、羧酸取代的烷 氧基或烷基氨基取代的烷氧基。
在另一实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低微生 物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(VII)的转录因 子调节化合物及其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此降低所述 微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R36为羟基；
R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46a、R46b、R46d和R46e 各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷 氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、 烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳 基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰 基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤 素；
R38为氰基、硝基、肟、烷基肟、芳基肟、杂芳基、氨基肟或氨 基羰基；
R46c为氢、酰基、氟、吡嗪基、吡啶基、氰基、咪唑基、二烷基 氨基羰基或二烷基氨基；
条件是：当R38为硝基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基、酰基或氢； 以及
条件是：当R38为氰基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基。
在进一步的实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节 转录的方法，包括：将转录因子与通式(VII)的转录因子调节化合物及 其酯、前药和药学上可接受的盐接触，由此调节转录：

其中：
R36为羟基；
R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、R46a、R46b、R46d和R46e 各自独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷 氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基羰基、芳氧基羰基、杂芳氧基羰基、 烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳 基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰 基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤 素；
R38为氰基、硝基、肟、烷基肟、芳基肟、杂芳基、氨基肟或氨 基羰基；
R46c为氢、酰基、氟、吡嗪基、吡啶基、氰基、咪唑基、二烷基 氨基羰基或二烷基氨基；
条件是：当R38为硝基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基、酰基或氢；
条件是：当R38为氰基且R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢时，R46c不为二烷基氨基。
在一个实施方式中，R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢，以及R38为氰基且R46c为酰基、氟、 氰基或咪唑基。
在另一实施方式中，R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢，以及R38为氨基肟且R46c为氟。
在进一步的实施方式中，R39、R39、R40、R41、R42、R43、R44、 R45、R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢，以及R38为硝基且R46c为吡嗪 基、吡啶基或二烷基氨基羰基(例如，二甲基氨基羰基)。
在另一实施方式中，R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢，以及R38为氨基羰基且R46c为卤素(例 如，氟)。
在一个实施方式中，R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢，以及R38为肟且R46c为二烷基氨基(例 如，二甲基氨基)。
在另一实施方式中，R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46b、R46c、R46d和R46e各个为氢，以及R38为硝基且R46a为羟基。
在另一实施方式中，R37、R39、R40、R41、R42、R43、R44、R45、 R46a、R46b、R46d和R46e各个为氢，以及R38为杂芳基(例如，咪唑基或 吡唑基)且R46c为酰基。
在进一步的实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种降低 微生物细胞的抗生素抗性的方法，包括：将所述细胞与通式(VIII)的 转录因子调节化合物及其药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此降 低所述微生物细胞的抗生素抗性：

其中：
R47为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R48、R49、R50、R51、R52和R53各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、 肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
Ar为芳基。
在一个实施方式中，本发明涉及(至少部分涉及)一种调节转录 的方法，包括：将转录因子与通式(VIII)的转录因子调节化合物及其 药学上可接受的盐、酯和前药接触，由此调节转录：

其中：
R47为羟基、OCOCO2H、直链或支链C1-C5烷氧基或者直链或支 链C1-C5烷基；
R48、R49、R50、R51、R52和R53各自独立地为氢、烷基、链烯基、 炔基、芳基、杂芳基、杂环基、烷氧基、芳氧基、杂芳氧基、烷氧基 羰基、芳氧基羰基杂芳氧基羰基、烷基磺酰基、芳基磺酰基、氨基 磺酰基、烷基羰基、芳基羰基、杂芳基羰基、酰基、酰基氨基、氨基、 烷基氨基、芳基氨基、CO2H、氰基、硝基、CONH2、杂芳基氨基、 肟、烷基肟、芳基肟、氨基肟或卤素；
Ar为芳基。
在一个实施方式中，R47为羟基，R48、R50、R51和R52各个为氢， Ar为呋喃基，且R53为链烯基，其可以被苯基取代，例如，举个例子， 卤素取代的苯基(例如，氟代苯基)。
在另一实施方式中，本发明涉及抑制转录，包括将转录因子与转 录因子调节化合物接触，由此抑制转录。在进一步的实施方式中，对 原核细胞的转录进行抑制。在另一进一步的实施方式中，转录因子调 节化合物为通式(I)-(VIII)的和表2的任意一种化合物。
术语“抗生素抗性”包括微生物细胞对抗生素化合物的抗性，尤其 是先前已成功用于处理相似的微生物有机体的抗生素化合物。
在一个实施方式中，转录因子调节化合物(例如，MarA家族多肽 调节化合物，AraC家族多肽调节化合物等)为通式(I)-(VIII)的和表2 的任意一种化合物。
在进一步的实施方式中，转录因子调节化合物为：
表2






在一个实施方式中，本发明的化合物(例如，通式I、II、III、IV、 V、VI、VII、VIII的化合物或表2的化合物)为药学上可接受的盐， 包括例如钠盐或钾盐。
使用U.S.S.N.11/115024(作为引证文件引入此处)的实施例12 中描述的分析方法可以测量转录因子调节化合物的EC50。在进一步的 实施方式中，转录因子调节化合物对SoxS活性的EC50小于约10μM， 小于约5μM，或小于约1μM。在进一步的实施方式中，转录因子调 节化合物对MarA活性的EC50可以小于约10μM，小于约5μM，或 小于约1μM。在再另一实施方式中，转录因子调节化合物对LcrF(VirF) 的EC50可以小于约10μM，小于约5μM，或小于约1μM。
在另一个进一步的实施方式中，所述转录因子调节引起肾脏组织 CFU/g的对数降低(log decrease)。这可以使用U.S.S.N.11/115024(作 为引证文件引入此处)的实施例13中描述的分析方法进行测量。在一 个实施方式中，转录因子调节化合物引起肾脏组织的CFU/g对数降低 超过1.0CFU/g。在进一步的实施方式中，所述化合物引起肾脏组织 的CFU/g对数降低超过2.5CFU/g。
在进一步的实施方式中，转录因子调节化合物不是芹甙元 (apigenin)。
术语“烷基”包括饱和的脂肪族基团，包括直链烷基(例如，甲基、 乙基、丙基、丁基、戊基、己基、庚基、辛基、壬基、癸基等)、支 链烷基(异丙基、叔丁基、异丁基等)、环烷(脂环族的)基团(环丙基、 环戊基、环己基、环庚基、环辛基)、烷基取代的环烷基和环烷基取 代的烷基。术语烷基进一步包括可以进一步包含替换烃主链的一个或 多个碳的氧、氮、硫或磷原子的烷基。在某些实施方式中，直链或支 链的烷基在主链上具有6个或更少的碳原子(例如，直链为C1-C6，支 链为C3-C6)，且更优选为4个或更少。同样，优选的环烷基在环状结 构中具有3-8碳原子，且更优选在环状结构中具有5或6个碳。术语 C1-C6包括含有1～6个碳原子的烷基。
此外，术语烷基包括“未取代的烷基”和“取代的烷基”，其中后者 指的是具有替换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的烷基结构 (moiety)。这类取代基可以包括：例如链烯基、炔基、卤素、羟基、 烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、 羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷氨基羰基、 二烷氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸酯、次膦酸酯 (phosphinato)、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、 二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰 基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫基、芳 基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酰基、氨磺酰基、 亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或 者芳族或杂芳族结构。环烷基可进一步被例如，上述的取代基取代。 “烷基芳基”或“芳基烷基”结构为芳基取代的烷基(例如，苯甲基(苄 基))。术语“烷基”也包括天然和非天然氨基酸的侧链。
术语“芳基”包括可能含有0～4个杂原子的5-和6-元单环芳香基 团的基团，例如，苯、苯基、吡咯、呋喃、噻吩、噻唑、异噻唑、咪 唑、三唑、四唑、吡唑、噁唑、异噁唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。 此外，术语“芳基”包括多环芳基，例如三环的、二环的芳基，例如萘、 苯并噁唑、苯并二噁唑、苯并噻唑、苯并咪唑、苯并噻吩、亚甲基二 氧基苯基、喹啉、异喹啉、萘啶(napthridine)、吲哚、苯并呋喃、嘌呤、 苯并呋喃、去氮杂嘌呤(deazapurine)或中氮茚(indolizine)。在环状结构 中具有杂原子的那些芳基基团也可以称作“芳基杂环”、“杂环”、“杂芳 基”或“杂芳族化合物”。此外，术语杂环包括可以在一个或多个环位 置上被上述的这些取代基取代的芳族环，例如，卤素、羟基、烷氧基、 烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、 羧酸酯、烷基羰基、烷基氨基羰基、芳基烷基氨基羰基、链烯基氨基 羰基、烷基羰基、芳基羰基、芳基烷基羰基、链烯基羰基、烷氧基羰 基、氨基羰基、烷基硫代羰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氰基、 氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳 基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基 和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、 硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酰基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三 氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或者芳族或杂芳族结构。 芳基也可以与非芳族的脂族环或杂环稠合或桥接以形成多环(例如， 萘满)。术语“芳基”也包括多环芳基，例如卟啉(porphrin)、酞菁等。
术语“链烯基”包括长度和可能取代与上述烷基类似，但是包含至 少一个双键的非饱和脂族基团。
例如，术语“链烯基”包括直链的链烯基(例如，乙烯基、丙烯基、 丁烯基、戊烯基、己烯基、庚烯基、辛烯基、壬烯基、癸烯基等)、 支链的链烯基环烯(脂环族的)基(环丙烯基、环戊烯基、环己烯基、环 庚烯基、环辛烯基)、烷基或链烯基取代的环烯基以及环烷基或环烯 基取代的链烯基。术语链烯基进一步包括含有替换烃主链的一个或多 个碳的氧、氮、硫或磷原子的链烯基。在某些实施方式中，直链或支 链的链烯基在主链上具有6个或更少的碳原子(例如，直链为C2-C6， 支链为C3-C6)。同样，环烯基在其环状结构中可以具有3-8个碳原子， 且更优选在环状结构中具有5或6个碳。术语C2-C6包括含有2～6 个碳原子的链烯基。
此外，术语链烯基包括“未取代的链烯基”和“取代的链烯基”，其 中的后者指的是具有替换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的 链烯基结构。这些取代基可以包括：例如烷基、炔基、卤素、羟基、 烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、 羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷氨基羰基、 二烷氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、 氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和 烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基 甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代 羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酰基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、 硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或者芳族或杂芳 族结构。
术语“炔基”包括长度和可能取代与上述烷基类似，但是包含至少 一个三键的非饱和的脂肪族基团。
例如，术语“炔基”包括直链的炔基(例如，乙炔基、丙炔基、丁炔 基、戊炔基、己炔基、庚炔基、辛炔基、壬炔基、癸炔基等)、支链 的炔基以及环烷基或环烯基取代的炔基。术语炔基进一步包括含有替 换烃主链的一个或多个碳的氧、氮、硫或磷原子的炔基。在某些实施 方式中，直链或支链的炔基在主链上具有6个或更少的碳原子(例如， 直链为C2-C6，支链为C3-C6)。术语C2-C6包括含有2～6个碳原子的炔 基。
此外，术语炔基包括“未取代的炔基”和“取代的炔基”，其中的后 者指的是具有替换烃主链的一个或多个碳上的氢的取代基的炔基结 构。这些取代基可以包括：例如，烷基、炔基、卤素、羟基、烷基羰 基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、 烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、烷氨基羰基、二烷氨 基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氰基、 氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳 基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基 和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、 硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酰基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三 氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基芳基或者芳族或杂芳族结构。
除非对碳的数目另外说明，此处使用的“低级烷基”意指如上述定 义的烷基，但是在其主链结构中具有1-5个碳原子。“低级链烯基”和 “低级炔基”具有例如2-5个碳原子的链长。
术语“酰基”包括含有酰基基团(CH3CO-)或羰基基团的化合物和 结构。术语“取代的酰基”包括其中的一个或多个氢原子被例如烷基、 炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基羰基氧基、 芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、烷氧基羰基、氨基 羰基、烷氨基羰基、二烷氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、磷酸酯、 膦酸酯、亚膦酸酯、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨基、芳基 氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰基氨基、 芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺基、巯基、烷基硫 基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基、磺酰基、氨磺 酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、烷基 芳基或者芳族或杂芳族结构替换的酰基。
术语“酰基氨基”包括其中酰基结构与氨基结合的结构。例如，该 术语包括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基。
术语“芳酰基”包括使芳基或杂芳基结构与羰基结合的化合物和 结构。芳酰基的实例包括苯基羧基、萘基羧基等。
术语“烷氧基烷基”、“烷基氨基烷基”和“硫代烷氧基烷基”包括如 上所述的烷基，其进一步包括替换烃主链的一个或多个碳的氧、氮或 硫原子，例如，氧、氮或硫原子。
术语“烷氧基”包括与氧原子共价连接的取代和未取代的烷基、链 烯基和炔基。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、丙氧基、 丁氧基和戊氧基。取代的烷氧基的实例包括卤代的烷氧基。烷氧基可 被例如，链烯基、炔基、卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、 烷氧基羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、芳基羰基、 烷氧基羰基、氨基羰基、烷氨基羰基、二烷氨基羰基、烷基硫代羰基、 烷氧基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氰基、氨基(包括烷基氨基、 二烷基氨基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包 括烷基羰基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)、脒基、亚胺 基、巯基、烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰 基、磺酰基、氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮 基、杂环基、烷基芳基或者芳族或杂芳族结构取代。卤素取代的烷氧 基的实例包括，但不限于氟代甲氧基、二氟甲氧基、三氟甲氧基、氯 代甲氧基、二氯甲氧基、三氯甲氧基等。
术语“胺”或“氨基”包括其中氮原子共价结合到至少一个碳或杂原 子上的化合物。术语“烷基氨基”包括其中氮结合至少一个附加的烷基 的基团和化合物。术语“二烷基氨基”包括氮原子结合至少两个附加的 烷基的基团。术语“芳基氨基”和“二芳基氨基”包括其中氮分别结合至 少一个或两个芳基的基团。术语“烷基芳基氨基”、“烷基氨基芳基”或 “芳基氨基烷基”指的是与至少一个烷基和至少一个芳基结合的氨基。 术语“烃基氨基烷基(alkaminoalkyl)”指的是烷基、链烯基或炔基与同 时结合烷基的氮原子结合。
术语“酰胺”或“氨基羧基”包括含有与羰基或硫代羰基的碳结合的 氮原子的化合物或结构。该术语包括含有与结合羧基的氨基结合的烷 基、链烯基或炔基的“烃基氨基羧基”基团。它包括含有与结合羰基或 硫代羰基的碳的氨基相结合的芳基或杂芳基结构的芳基氨基羧基。术 语“烷基氨基羧基”、“链烯基氨基羧基”、“炔基氨基羧基”和“芳基氨基 羧基”包含其中烷基、链烯基、炔基和芳基结构分别结合氮原子的结 构，该氮原子又与羰基的碳结合。
术语“羰基”或“羧基”包括含有通过双键与氧原子连接的碳的化合 物和结构。含有羰基的结构的实例包括醛、酮、羧酸、酰胺类、酯类、 酸酐等。
术语“硫代羰基”或“硫代羧基”包括含有通过双键与硫原子连接的 碳的化合物和结构。
术语“醚”包括含有与两个不同的碳原子或杂原子结合的氧的化 合物或结构。例如，该术语包括“烷氧基烷基”，其指的是与共价结合 另一烷基的氧原子共价结合的烷基、链烯基或炔基。
术语“酯”包括含有与结合羰基的碳的氧原子相结合的碳或杂原 子的化合物和结构。术语“酯”包括烷氧基羰基，例如甲氧基羰基、乙 氧基羰基、丙氧基羰基、丁氧基羰基、戊氧基羰基等。烷基、链烯基 或炔基定义如上。
术语“硫醚”包括含有与两个不同的碳或杂原子结合的硫原子的 化合物和结构。硫醚的实例包括，但不限于烃基硫代烷基、烃基硫代 链烯基和烃基硫代炔基。术语“烃基硫代烷基”包括具有与结合烷基的 硫原子相结合的烷基、链烯基或炔基的化合物。类似地，术语“烃基 硫代链烯基”和“烃基硫代炔基”指的是其中烷基、链烯基或炔基与共 价结合炔基的硫原子相结合的化合物或结构。
术语“羟基(hydroxy或hydroxyl)”包括具有-OH或-O-的基团。
术语“卤素”包括氟、溴、氯、碘等。术语“全卤化的”通常指的是 其中所有的氢被卤素原子替换的结构。
术语“多环基”或“多环的基团”指的是其中两个或更多个碳为两个 相邻的环共有的两个或更多个环状的环(例如，环烷基、环状链烯基、 环状炔基、芳基和/或杂环基)，例如，所述环为“稠环”。通过不相邻 的原子结合的环称作“桥接”环。多环的各个环可被如上所述的这些取 代基取代，例如卤素、羟基、烷基羰基氧基、芳基羰基氧基、烷氧基 羰基氧基、芳氧基羰基氧基、羧酸酯、烷基羰基、烷氧基羰基、烷基 氨基羰基、芳基烷基氨基羰基、链烯基氨基羰基、烷基羰基、芳基羰 基、芳基烷基羰基、链烯基羰基、氨基羰基、烷基硫代羰基、烷氧基、 磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氰基、氨基(包括烷基氨基、二烷基氨 基、芳基氨基、二芳基氨基和烷基芳基氨基)、酰基氨基(包括烷基羰 基氨基、芳基羰基氨基、氨基甲酰基和脲基)，脒基、亚胺基、巯基、 烷基硫基、芳基硫基、硫代羧酸酯、硫酸酯、烷基亚磺酰基，磺酰基、 氨磺酰基、亚磺酰氨基、硝基、三氟甲基、氰基、叠氮基、杂环基、 烷基、烷基芳基或者芳族的或杂芳族的结构。
术语“杂原子”包括碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子 为氮、氧、硫和磷。
术语“吸电子取代基”包括，但不限于铵(包括烷基铵、芳基铵和杂 芳基铵)、磺酰基(包括烷基磺酰基、芳基磺酰基和杂芳基磺酰基)、 卤素、全卤代的烷基、氰基、肟、羰基(包括烷基羰基、芳基羰基和 杂芳基羰基)以及硝基。
应当说明的是：本发明的某些化合物的结构包含不对称的碳原 子。因此应当理解：除非另有说明，这些不对称产生的异构体(例如， 所有的对映体和非对映体)包括在本发明的范围之内。通过经典的分 离技术和通过立体化学控制的合成可以获得这些异构体的基本上纯 的形式。此外，在本申请中述及的结构及其它的化合物和部分也包括 其所有的互变异构体。
结构式中，由表示的键意味着该键可以为单键或双键。
VIII.包含转录因子调节化合物的制剂
本发明提供包含治疗有效量或有效剂量的转录因子调节化合物 和/或采用本发明分析方法中的任意一种识别的化合物以及一种或多 种载体(例如，药学上可接受的添加剂和/或稀释剂)的组合物。本发明 的药物组合物可以包含在本申请中描述为转录因子调节化合物、AraC 家族多肽调节化合物、MarA家族多肽调节化合物、MarA家族抑制化 合物、MarA抑制化合物、通式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、 (VIII)或表2的化合物的任何化合物。这些化合物中的每一个可以单 独或组合地作为本发明的药物组合物的一部分使用。此外，该组合物 也可以包含第二种抗微生物剂，例如，抗生素。
本发明涉及包含有效量的转录因子调节化合物(例如，MarA家族 多肽调节化合物或AraC家族多肽调节化合物)和药学上可接受的载体 的药物组合物。在一个实施方式中，所述转录因子调节化合物为通式 (I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或表2的化合物。
在一个实施方式中，本发明提供包含药学上可接受的载体和转录 因子调节化合物的药物组合物，其中，所述化合物为通式(I)、(II)、(III)、 (IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)或表2的化合物。在另一实施方式中， 所述药物组合物可以进一步包含抗生素。在进一步的实施方式中，有 效量的药物组合物可有效治疗对象的与生物膜有关的状态。所述与生 物膜有关的状态可以包括例如，中耳感染、囊性纤维化、骨髓炎、痤 疮、牙龋洞、心内膜炎和前列腺炎。
在另一实施方式中，本发明提供用于预防对象与细菌有关的状态 的方法，包括给与对象有效量的转录因子调节化合物，由此抑制与细 菌有关的状态。在进一步的实施方式中，所述转录因子调节化合物为 通式(I)、(II)、(III)、(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VIII)的化合物或表2 的化合物。在进一步的实施方式中，所述转录因子调节化合物可以包 括例如，MarA家族多肽抑制剂和AraC家族多肽抑制剂。
术语“对象”包括能够患上与细菌有关的病症的植物和动物(例如 脊椎动物、两栖动物、鱼、哺乳动物，例如猫、狗、马、猪、牛、羊、 啮齿类、兔、松鼠、熊、灵长类(例如，黑猩猩、大猩猩和人))。术语 “对象”也包括免疫低下对象，其可能具有较高的感染风险。
术语“预防”指施用有效量的转录因子调节化合物以防止与细菌 有关的状态发生。
术语“与细菌有关的状态”包括特征在于具有可以通过施用本发 明的转录因子调节化合物而被抑制的细菌存在的状态。该术语包括与 生物膜有关的状态和其它感染或不希望的细菌在对象表面或体内的 存在。
如下面详细描述的，药物组合物可以配制成以固体或液体的形式 施用，包括适合下述方式的那些：(1)口服给药，例如水性或非水性的 溶液剂或混悬剂、片剂、大丸剂、散剂、颗粒剂、糊剂；(2)肠胃外给 药，以例如灭菌溶液或混悬液进行皮下、肌肉或静脉注射；(3)局部涂 敷，例如涂敷于皮肤的乳剂、软膏剂或喷雾剂；(4)阴道内或直肠内施 用，例如阴道栓、霜剂、泡沫剂或栓剂；或者(5)气雾剂，例如为水性 气雾剂、包含所述化合物的脂质体制剂或固体颗粒。
此处使用的短语“药学上可接受的载体”意指参与将抗感染药或 本发明的化合物从一个器官或身体的部分运送或运输到另一个器官 或身体的部分而不影响其生物学效应的药学上可接受的物质、组合物 或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料。 各载体在与组合物的其它成分相容和对对象无害的方面应当是“可接 受的”。可以用作药学上可接受的载体的物质的一些实例包括：(1)糖， 例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；(2)淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；(3) 纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素； (4)粉状的黄蓍胶；(5)麦芽；(6)明胶；(7)滑石；(8)赋形剂，例如可可 脂和栓剂蜡类；(9)油，例如花生油、棉花子油、红花油、芝麻油、橄 榄油、玉米油和大豆油；(10)二醇类，例如丙二醇；(11)多元醇类， 例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；(12)酯类，例如油酸乙酯 和月桂酸乙酯；(13)琼脂；(14)缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝； (15)海藻酸；(16)无热源水；(17)等渗的盐水；(18)林格氏溶液；(19) 乙醇；(20)磷酸盐缓冲溶液；和(21)可在药物组合物中使用的其它无 毒的相容性物质。适当的流动性可以通过使用包衣材料(例如卵磷脂)、 通过在分散的情况下维持需要的颗粒尺寸以及通过使用表面活性剂 来维持。
这些组合物也可以包含辅剂，例如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分 散剂。通过包含不同的抗细菌和抗真菌剂(例如，对羟苯甲酸酯、氯 叔醇、苯酚、山梨酸等)可以确保防止微生物的活动。也可能希望组 合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠等。此外，可注射药物形式的延 长吸收可以通过包含延迟吸收的试剂(例如单硬脂酸铝和明胶)而产 生。
在某些情况下，为了延长药物的效果，希望减慢皮下或肌内注射 药物的吸收。这可以通过使用具有弱水溶性的结晶或无定形物质的液 态混悬剂来实现。然后药物的吸收速率取决于其溶解的速率，而溶解 速率又可能取决于晶粒大小和晶体形式。或者，非经肠施用药物形式 的延迟吸收通过将所述药物溶解或悬浮在油性载体中实现。
本发明的药物组合物可以通过经口、非经肠、局部、经直肠、经 鼻、经阴道、经脑池的途径施用于身体的上皮表面。它们当然以适合 各种给药途径的方式施用。例如，它们以片剂或胶囊形式施用，以注 射剂、吸入剂、洗眼剂、软膏剂等施用，通过注射、注入或吸入施用； 通过洗剂或软膏剂局部施用；以及以直肠或阴道栓剂施用。
此处使用的短语“非经肠给药”和“非经肠地施用”意指除了肠内和 局部给药之外的施用形式，通常通过注射施用，且包括但不限于静脉 内的、肌内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮 内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、 蛛网膜下的、脊柱内的和胸骨内的注射和注入。
此处使用的短语“全身给药”、“全身施用”、“外周给药”和“外周施 用”意指施用蔗糖八硫酸酯和/或抗菌剂、药物或其它非直接进入中枢 神经系统的物质，由此它进入对象的全身并因此经历代谢和其它类似 过程，例如皮下给药。
在某些方法中，本发明的组合物可以局部施用到任何上皮表面。 根据本发明“上皮表面”定义为覆盖身体的外部表面或者衬在中空结 构中的组织区域，包括，但不限于表皮和粘膜的表面。这些上皮表面 包括口腔的、咽的、食管的、肺的、眼的、耳的、鼻的、颊的、舌的、 阴道的、颈的、生殖泌尿的、消化的和肛门直肠的表面。
组合物可以配制成用于局部给药的各种常规形式。这些形式包 括，例如，半固体和液体的剂型，例如液态的溶液剂或混悬剂、栓剂、 灌洗液、灌肠剂、凝胶剂、乳膏、乳液、洗剂、膏剂、散剂、喷雾剂、 唇膏、泡沫剂、糊剂、牙膏、软膏剂、药膏、香膏、冲洗液、滴剂、 含片、口香糖、锭剂、漱口剂、清洗剂。
用于局部涂敷的常规使用的载体包括果胶、明胶及其衍生物、聚 乳酸或聚乙醇酸聚合物或其共聚物、纤维素衍生物(例如甲基纤维素、 羧甲基纤维素或氧化纤维素)、瓜尔胶、阿拉伯胶、卡拉雅胶、黄蓍 胶、膨润土、琼脂、卡波姆、墨角藻、长角豆、葡聚糖及其衍生物、 印度树胶(ghatti gum)、锂蒙脱石、卵叶车前草果壳、聚乙烯吡咯烷酮、 二氧化硅及其衍生物、黄原胶、高岭土、滑石、淀粉及其衍生物、石 蜡、水、植物和动物油、聚乙烯、聚环氧乙烯、聚乙二醇、聚丙二醇、 甘油、乙醇、丙醇、丙二醇(二醇类、醇类)、不挥发性油、及钠、钾、 铝、镁或钙盐(例如氯化物、碳酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、葡糖酸 盐、乳酸盐、醋酸盐、葡庚糖酸盐或酒石酸盐)。
这些组合物可以特别地用于，例如治疗或预防有害的细胞(例如 阴道的淋病奈瑟氏菌)或口腔的感染(包括感冒疮)、眼、皮肤或下 肠道的感染。为了提高药物的持久性和滞留时间以及为了改善达到的 预防效果，用于局部药剂的标准组成策略可应用于抗感染化合物或其 药学上可接受的盐。
为了在下肠道或阴道内进行局部涂敷，可以使用直肠栓剂、合适 的灌肠剂、凝胶剂、软膏剂、溶液剂、混悬剂或插入物。也可以使用 局部透皮贴剂。透皮贴剂具有向身体提供可控本发明的组合物递送的 额外优点。这些剂型可以通过溶解或分散所述药剂到适合的介质中制 备。
本发明的组合物可以以直肠或阴道给药的栓剂的形式施用。这些 可以通过将所述药物与合适的非刺激的载体混合而制备，该合适的载 体在室温下为固体，但是在直肠温度下为液体并因此在直肠或阴道内 融化而释放药物。这些物质包括可可脂、蜂蜡、聚乙二醇类、栓剂蜡 或水杨酸盐，且其在室温下为固体但在体温下为液体，因此在直肠或 阴道腔中将融化并释放活性药物。
适合阴道给药的组合物也包括包含本领域中已知适合的载体的 阴道栓剂、卫生栓、乳膏、凝胶剂、糊剂、泡沫剂、软片(film)或喷 雾剂。在蔗糖八硫酸酯/避孕药中使用的载体应该与阴道给药和/或避 孕器具的涂覆相容。可以采用固体、半固体和液体剂型的组合，例如 隔膜、胶冻剂、灌洗液、泡沫剂、软片、软膏剂、乳膏、香膏、凝胶 剂、油膏剂、糊剂、膏剂、阴道栓剂、性交滑润剂和装置的覆层，例 如保险套、避孕海棉、宫颈帽和隔膜。
对于眼睛的应用，药物组合物可以配制成在等渗的、pH调节的 无菌盐水中的微粉化混悬剂，或者优选地制成在等渗的、pH调节的 无菌盐水中的溶液，具有或不具有如苯扎氯铵的防腐剂。可选择地， 为了眼睛使用，所述组合物可以配制成软膏剂，例如凡士林。示例性 的眼科组合物包括眼用软膏、散剂、溶液剂等。
除了蔗糖八硫酸酯和/或抗生素或避孕药物外，散剂和喷雾剂可以 包含载体，例如乳糖、滑石、氢氧化铝、硅酸钙和聚酰胺粉末，或这 些物质的混合物。喷雾剂可以另外包含常用的喷射剂，例如氯氟烃类 和挥发性的非取代烃类，例如丁烷和丙烷。
通常，水性气雾剂通过将药物的水性溶液或混悬液与常规的药学 上可接受的载体和稳定剂一起配制而制成。所述载体和稳定剂随特定 化合物的需要而不同，但是典型地包括非离子型表面活性剂(吐温类、 普兰尼克(Pluronic)类或聚乙二醇)、如血清白蛋白的蛋白质类、脱水 山梨糖醇酯类、油酸、卵磷脂、如甘氨酸的氨基酸类、缓冲液、盐、 糖或糖醇。气雾剂通常由等渗溶液制备。
本发明的组合物也可以任何口服可以接受的剂型进行口服给药， 包括，但不限于胶囊、扁胶囊、丸剂、片剂、锭剂(使用芳香基质， 通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄蓍胶)、散剂、颗粒剂，或者在水性或非 水性液体中为溶液剂或混悬剂，或为水包油的或油包水型的液体乳 剂，或为酏剂或糖浆剂，或为软锭剂(使用惰性基质，例如明胶和甘 油，或蔗糖和阿拉伯胶)和/或为口腔洗剂等，各自包含预定量的蔗糖 八硫酸酯和/或抗生素或避孕药物作为活性成分。化合物也可以以大丸 剂、药糖剂或糊剂施用。就口服的片剂而言，通常使用的载体包括乳 糖和玉米淀粉。通常也可以加入润滑剂，例如硬脂酸镁。对于胶囊形 式的口服给药，可用的稀释剂包括乳糖和干的玉米淀粉。当口服使用 需要水性混悬剂时，活性成分与乳化和悬浮剂组合。如果需要，也可 以加入特定的甜味剂、矫味剂或着色剂。
片剂以及其它的固体剂型，例如糖锭剂、胶囊剂、丸剂和颗粒剂， 可以加上或制备包衣和外壳，例如药剂学领域中公知的肠溶包衣和其 它的包衣。它们也可以经配制以提供缓慢或控制释放其中使用的有效 成分，例如提供希望的释放分布的不同比例的羟丙基甲基纤维素、其 它聚合物基质、脂质体和/或微球。它们可以通过例如细菌保持的滤器 过滤，或通过以能够溶解在无菌水中的无菌固体组合物的形式引入灭 菌剂或在使用前引入一些其它的无菌注射介质来灭菌。这些组合物也 可以任选地包含遮光剂且可以是任选地以迟延的方式释放活性成分 (或优先在胃肠道的特定部位)的组合物。可以使用的植入组合物的实 例包含聚合物质和蜡。如果合适，活性成分也可以是具有上述的一种 或多种赋形剂的微胶囊的形式。
用于口服给药的液体剂型包含药学上可以接受的乳剂、微乳剂、 溶液剂、混悬剂、糖浆剂和酏剂。除了活性成分外，所述液体剂型可 以包含本领域常用的惰性稀释剂，例如，举个例子，水或其它溶剂、 增溶剂和乳化剂，例如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、 苯甲酸苄酯、丙二醇、1，3-丁二醇、油类(尤其是，棉籽、花生、玉米、 胚芽、橄榄、蓖麻和芝麻油)、甘油、四氢呋喃甲醇、聚乙二醇和山 梨聚糖的脂肪酸酯，及其混合物。
除了惰性稀释剂外，口服组合物也可以包含佐剂，例如湿润剂、 乳化剂和悬浮剂、甜味利、矫味剂、着色剂、芳香剂和防腐剂。
除了抗感染药，混悬剂可以包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八 醇、聚氧乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、 膨润土、琼脂-琼脂和黄蓍胶，及其混合物。
本发明组合物的无菌注射形式可以是水性或油性的混悬剂。这些 混悬剂可以根据本领域中的已知技术使用合适的分散或湿润剂和悬 浮剂配制。湿润剂、乳化剂和滑润剂，例如硫酸月桂酯钠和硬脂酸镁， 以及着色剂、隔离剂、包衣剂、甜味剂、矫味剂和芳香剂、防腐剂和 抗氧化剂也可以存在于所述组合物中。
无菌的可注射制剂也可以是在无毒的肠道外可接受的稀释剂或 溶剂中的无菌可注射溶液或混悬液，例如为1，3-丁二醇中的溶液。可 以使用的可接受载体和溶剂中包括水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶 液。此外，通常使用无菌的不挥发性油作为溶剂或悬浮介质。为此目 的，可以使用任何温和的不挥发性油，包括合成的单-或二-甘油酯。 在可注射制剂中可以使用脂肪酸，例如油酸及其甘油酯衍生物，如天 然的药学上可以接受的油，例如橄榄油或蓖麻油，尤其其聚氧乙基化 的形式。这些油性溶液或混悬液也可以包含长链的醇稀释剂或分散 剂，例如Ph.Helv或类似的醇。
抗感染药或其药学上可以接受的盐在形成组合产品的材料中占 到其它剂型的总剂量的一定百分比，包括液态的溶液剂或混悬剂、栓 剂、灌洗液、灌肠剂、凝胶剂、乳膏、乳剂、洗剂、膏剂、皂剂、洗 发剂、去污剂、散剂、喷雾剂、唇膏、泡沫剂、糊剂、牙膏、软膏剂、 油膏剂、香膏、冲洗液、滴剂、含片、锭剂、漱口剂、冲洗剂及其它。 例如乳膏和凝胶剂通常受到递送介质的物理化学性质的限制而浓度 低于20％(例如，200mg/gm)。对于特殊的使用，可以制备非常小浓 度的制剂(例如，用于儿科应用的低百分比制剂)。例如，本发明的药 物组合物可以包含总制剂重量0.001-99％、典型地0.01-75％、更典型 地0.1-20％、特别是1-10％的量的蔗糖八硫酸酯。尤其是，制剂中其 优选的浓度为0.5-50％，特别是0.5-25％，例如1-10％。根据需要治疗 或预防的状态的类型和严重性，每天可以适当地使用1-10次。
抗感染药或其药学上可接受的盐作为抗溃疡药在数十年临床使 用中显示了低的毒性(W.R.Garnett，Clin.Pharm.1：307-314(1982)； R.N.Brogden等，Drugs 27：194-209(1984)；D.M.McCarthy，New Eng J Med.，325：1017-1025(1991))，治疗有效剂量的上限不是关键的问题。
对于预防性的应用，本发明的药物组合物可以在潜在的感染之前 使用。潜在感染之前的使用时间可以优化以使所述化合物的预防效果 最大化。应用的时间将根据给药的模式、所应用的上皮表面、表面积、 剂量、上皮表面的pH条件下的组合物的稳定性和效率、使用的频率 (例如单次使用或多次使用)变化。本领域技术人员将能够确定使化合 物的预防效果最大化所需要的最适合的时间间隔。
除非另有说明，本发明的实施使用细胞生物学、细胞培养、分子 生物学、遗传学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，其在 本领域的技术之内。这些技术在文献中已被详细说明。参见，例如， Genetics；Molecular Cloning A Laboratory Manual，第二版，Sambrook， J.等编辑(Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))；Short Protocols in Molecular Biology，第三版，Ausubel，F.等编辑(Wiley，NY(1995))； DNA Cloning，Volumes I和II(D.N.Glover编辑，1985)； Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，(1984))；Mullis等，美国专 利No：4,683,195；Nucleic Acid Hybridization(B.D.Hames & S.J. Higgins编辑，(1984))；论文Methods In Enzymology(Academic Press， Inc.，N.Y)；Immunochemical Methods In Cell and Molecular Biology (Mayer和Walker编辑，Academic Press，London(1987))；Handbook Of Experimental Immunology，Volumes I-IV(D.M.Weir和C.C.Blackwell 编辑，(1986))；和Miller，J.Experiments in Molecular Genetics(Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1972))。
IX.转录激活因子多肽在生物膜中的作用
在一个实施方式中，本发明涉及一种通过给与有效量的转录因子 调节化合物(例如HTH蛋白调节化合物、AraC家族多肽调节化合物、 MarA家族多肽调节化合物或MarA抑制化合物)分散或防止生物膜在 表面上或区域中形成的方法。
人们已发现，MarA及其同源物的缺失对于大肠杆菌中的生物膜 形成有负面作用。为了从遗传学上证实此发现，将编码marA的质粒 转化到删除了marA、soxS和rob(三重敲除)的大肠杆菌菌株中。在 该三重敲除中MarA的表达将宿主中生物膜的形成恢复到与野生型宿 主相当的水平。
术语“生物膜”包括在水性和其他环境中在界面上生成和保持的 生物薄膜。生物膜由嵌入到有机的凝胶结构中的微生物组成，该有机 凝胶结构由寄居微生物分泌的一种或多种基质聚合物组成。术语“生 物膜”还包括以足够检测的数量粘附到表面上的细菌或粘附到表面上 的微生物群落(Costerton，J.W.等，(1987)Ann.Rev.Microbiol. 41：435-464；Shapiro，J.A.(1988)Sci Am.256：82-89；O′Toole，G.等， (2000)Annu Rev Microbiol.54：49-79)。
在另一实施方式中，本发明涉及治疗对象的与生物膜有关的状态 的方法，其通过对所述对象施用有效量的转录因子调节化合物(例如 MarA家族抑制化合物)治疗所述与生物膜有关的状态。
术语“与生物膜有关的状态”包括以细菌生物膜的存在或潜在存 在为特征的病症。许多医学上重要的病原体形成生物膜，且生物膜的 形成常常是传染过程的一个组成部分(Costerton，J.W.等，(1999) Science 284：1318-1322)。与生物膜有关的状态的实例包括，但不限于 中耳炎、囊性纤维化、骨髓炎、痤疮、牙龋洞和前列腺炎。与生物膜 有关的状态还包括对象被一种或多种如绿脓杆菌的细菌感染。生物膜 形成的一种后果就是生物膜内的细菌相对于其浮游的相应部分对一 定范围的不同抗生素具有较低的敏感性。
此外，本发明也涉及一种抑制生物膜在表面上或区域中形成的方 法，包括将该区域与有效量的转录因子调节化合物(例如MarA家族抑 制化合物等)接触。
工业设施使用多种防止工业水系统的生物结垢的方法。许多微生 物有机体涉及工业水中生物膜的形成。在工业水系统中产粘液的细菌 的生长导致包括热传递降低、线路和阀门的积垢和阻塞、以及表面腐 蚀或降解的问题。过去采用杀菌剂控制细菌生长。许多杀菌剂和杀菌 制剂在本领域是已知的。然而，它们中的许多含有可能对环境有害或 有毒的成分，而且常常是不易分解的。
本发明的转录因子抑制化合物(例如，但不限于AraC家族抑制化 合物和MarA家族抑制化合物)可用于包括工业、临床、家庭和个人护 理的多种环境中。本发明的组合物可包含一种或多种本发明的化合物 作为单独地、累加地或协同地起到对抗目标生物体的作用的活性成 分。
本发明的MarA家族抑制化合物和调节化合物可配制成适于在包 括工业、制药、家庭和个人护理的环境中使用的组合物。在一个实施 方式中，本发明的化合物可溶解于水中。所述调节化合物可以通过可 接受的载体系统应用或递送。所述组合物可以通过可接受的载体系统 应用或递送，由此活性成分(如本发明的转录因子调节化合物，例如 MarA家族调节化合物，如MarA家族多肽抑制化合物)可以稳定的 方式分散或溶解，以便活性成分(在直接或间接施用时)以其中它可 以以有利方式提供的形式存在。
另外，本发明组合物的分离的组分可预先混合或者各个组分按照 预定的剂量分别加入到同一个环境中以达到所期望的治疗组分浓度 水平，只要组分最终彼此很好地混合。此外，本发明可连续地或间断 地给药或递送。
本发明的转录因子调节化合物(例如MarA家族调节化合物)当存 在于组合物中时，通常以约0.000001％～约100％，更优选约0.001％～ 约50％，且最优选约0.01％～约25％的量存在。
对于包含载体的本发明的组合物，所述组合物包含例如约1％～ 约99％，优选约50％～约99％，且更优选约75％～约99％(重量)的 至少一种载体。
本发明的转录因子调节化合物(例如MarA家族多肽抑制化合物) 可使用任何适合的载体配制并制备成以例如溶液剂、微乳剂、混悬剂 或气雾剂的形式递送。本发明的气雾剂或任何其他递送装置的产生可 按照本领域已知的任何方法实现。例如，就气雾剂递送而言，化合物 利用喷射剂与任何合适的载体一起以细微分离的形式提供。液化的喷 射剂通常在环境条件下是气体且在压力下被冷凝。喷射剂可以是本领 域可接受的和已知的类型，包括丙烷和丁烷或其他低级烷烃，如最多 5个碳的低级烷烃。所述组合物容纳在具有适当喷射剂和阀门的容器 中，并保持在高压下直至通过阀门的活动而释放。
本发明的组合物可以通过按照本领域的已知技术与所述化合物 一起纳入稳定剂、渗透剂和载体或稀释剂而制备成适合于(但不限于) 局部或区域涂覆的常规形式，如软膏剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂和液 体。这些制剂可以制备成适合肠内、非肠道、局部或吸入应用的常规 形式。
本发明可用于适合家庭使用的组合物。例如本发明的化合物也可 以在家庭用品(例如清洁剂、去污剂、消毒剂、洗碗液、肥皂和去垢 剂)中用作活性抗菌成分。在一个实施方式中，本发明的转录因子调 节化合物以有效抑制、移除或终止微生物的量和形式递送。
用于家庭使用的本发明的组合物包含，例如至少一种本发明的转 录因子调节化合物和至少一种适合的载体。例如，所述组合物可以包 含基于总组合物重量百分比的约0.00001％～约50％，优选约0.0001％～ 约25％，最优选约0.0005％～约10％(重量)的调节化合物。
本发明的转录因子调节化合物也可用于个人护理的卫生组合物。 例如，本发明的化合物可以用作个人护理产品(例如脸部清洁剂、收 敛剂、身体洗液、洗发剂、护发剂、化妆品和其它卫生产品)中的活 性成分。只要本发明化合物的效果不受影响，所述卫生组合物可以包 含本领域已知的任何载体或溶剂以获得希望的形式(例如固体、液体、 半固体或气溶胶)。制备卫生组合物的方法在此不作详细描述，但是 它们是本领域已知的。对于这些方法的讨论，The CTFA Cosmetic Ingredient Handbook，第二版，1992和A Formulary of Cosmetic Preparations(Vol.2，7-16章)的5-484页以参阅的方式引入此处。
用于个人护理的卫生组合物通常包含至少一种本申请的调节化 合物和至少一种适合的载体。例如，所述组合物可以包含基于组合物 总的重量百分比的约0.00001％～约50％，优选约0.0001％～约25％， 更优选约0.0005％～约10％(重量)的本发明的转录因子调节化合物。
本发明的转录因子调节化合物可用于工业中。在工业环境中，微 生物的存在可能是有问题的，如微生物经常引起工业污染和生物结 垢。用于工业应用的本发明的组合物可以在工业使用的组合物中包含 有效量的本发明化合物和本领域已知的可以用于这类系统的处理的 至少一种可接受的载体或溶剂。这类载体或溶剂可以包括稀释剂、抗 絮凝剂、渗透剂、涂铺剂、表面活性剂、悬浮剂、湿润剂、稳定剂、 相容剂、粘着剂、蜡、油、共溶剂、偶联剂、泡沫、消泡剂、天然或 合成聚合物、弹性体和增效剂。这些组合物的制备方法、递送系统和 载体在此不作详细描述，但是它们是本领域已知的。对于这些方法的 讨论，美国专利No.5,939,086在这里以参阅的方式引入。此外，根据 活性成分和组合物应用的情境，所述组合物的优选使用量可以发生变 化。
本发明的转录因子调节化合物(例如MarA家族多肽抑制化合物) 和组合物可以用于非水性环境。这类非水性环境包括，但不限于陆地 环境、干燥表面或半干燥的表面，其中所述化合物或组合物以适合该 情境的方式和量应用。
本发明的转录因子调节化合物，如MarA家族多肽调节化合物， 如MarA抑制化合物，可用于在各种基质(包括个人护理产品(例如牙 刷、隐形眼镜盒和牙科装置)、保健产品、家用产品、食物制品表面 和包装、以及实验室和科学装置)上形成接触杀灭的涂层或层。此外， 其它的基质包括医疗器械，例如导管、泌尿外科器械、血液采集和转 移装置、气管切开术装置、眼内透镜、创伤敷料、缝线、外科肘钉、 膜、分流通管、手套、组织贴片、假体装置(例如，心脏瓣膜)和创伤 引流管。再进一步地，其它的基质包括纺织产品(例如毯和织物)、油 漆和接缝胶泥。进一步的用作抗微生物的土壤烟熏剂。
本发明的转录因子调节化合物也可以结合到聚合物中，例如多糖 (纤维素、纤维素衍生物、淀粉、果胶、藻酸盐、壳多糖、瓜尔胶、 角叉菜胶)、乙二醇聚合物、聚酯、聚氨酯、聚丙烯酸脂、聚丙烯腈、 聚酰胺(例如，尼龙)、聚烯烃、聚苯乙烯、乙烯基聚合物、聚丙烯、 丝或生物聚合物。所述调节化合物可以与任何聚合材料偶联，例如具 有下述的特定官能团的那些聚合材料：1)羧基，2)氨基，3)羟基和/或 4)卤代烷基。
用于处理非水性环境的组合物可以包含至少一种本申请的转录 因子调节化合物和至少一种合适的载体。在一个实施方式中，所述组 合物包含基于总的组合物重量百分比的约0.001％～约75％，有利地约 0.01％～约50％，且优选约0.1％～约25％(重量)的本发明的转录因子 调节化合物。
本发明的转录因子调节化合物和组合物也可以用在水性环境中。 “水性环境”包括任何类型的含水系统，包括但不限于天然的水体(例如 湖或池塘)、人造的娱乐的水体(例如游泳池和热浴盆)以及饮用蓄水库 (例如井)。本发明的组合物可以用于处理在这些水性环境中的微生物 生长且可以例如，在水的表面或附近应用。
用于处理水性环境的本发明的组合物可以包含至少一种本发明 的转录因子调节化合物和至少一种合适的载体。在一个实施方式中， 所述组合物包含基于总的组合物重量百分比的约0.001％～约50％，有 利地约0.003％～约15％，优选约0.01％～约5％(重量)的本发明的化 合物。
本发明也提供一种生产工业上使用的抗生物结垢的组合物的方 法。该方法包括：将本领域已知的任何工业上可以接受的载体中的至 少一种与本发明的转录因子调节化合物紧密接触。所述载体可以是上 述讨论的或本领域已知的任何合适的载体。
合适的抗生物结垢组合物可以是递送所述组合物到潜在具有或 具有至少一种活的微生物的位点的任何可接受的形式。所述抗生物结 垢组合物可以使用标准的制剂以前面讨论的至少一种适当地选择的 载体递送。递送的模式可以使得在潜在具有或具有至少一种活的微生 物的位点具有结合抑制有效量的抗生物结垢组合物。本发明的抗生物 结垢组合物可用于处理在这些水性环境中导致生物结垢(例如浮渣或 粘泥形成)的微生物生长。这些化合物可能有效的工业过程的实例包 括冷却水系统、反渗透膜、纸浆和纸系统、空气洗涤系统和食品加工 工业。所述抗生物结垢组合物可以有效阻止、去除或终止微生物的量 和形式递送。
本发明的抗生物结垢组合物通常包含至少一种本发明的化合物。 所述组合物可以含有基于总的组合物重量百分比约0.001％～约50％， 更优选约0.003％～约15％，最优选约0.01％～约5％(重量)的本发明 的化合物。
抗生物结垢组合物可以约1mg/l～约1000mg/l，有利地约2mg/l～ 约500mg/l，且优选约20mg/l～约140mg/l的量投送。
用于水处理的抗生物结垢组合物通常以总组合物的约0.001％～约 50％(重量)的量包含本发明的转录因子调节化合物。所述抗生物结 垢组合物中的其它成分(按0.1％～50％使用)可以包括，例如，2-溴-2- 硝基丙烷-1，3-二醇(BNPD)、β-硝基苯乙烯(BNS)、盐酸十二烷基胍、 2，2-二溴-3-氰基丙酰胺(DBNPA)、戊二醛、异噻唑啉、亚甲基二(硫氰 酸酯)、三嗪、n-烷基二甲基苯甲基氯化铵、磷酸三钠基物质、抗微生 物剂、三丁基氧化锡、噁唑烷、四(羟基乙基)磷硫酸酯(THPS)、酚类、 铬化砷酸铜、羟基吡啶硫酮锌或铜、氨基甲酸酯类、次氯酸钠或钙、 溴化钠、卤代乙内酰脲类(Br、Cl)或其混合物。
在本发明组合物中其它可能的成分包括生物分散剂(总组合物重 量的约0.1％-约15％)、水、二醇类(约20-30％)或普兰尼克(总组合物 重量的约7％)。用于连续或半连续使用的抗生物结垢组合物的浓度为 约5～约70mg/l。
基于总组合物的重量，用于工业水处理的抗生物污垢组合物可以 包含约0.001％～约50％的本发明的化合物。本发明的化合物在用于水 性水处理的抗生物结垢组合物中的量可以根据特定环境进行调整。休 克剂量范围(Shock dose range)通常为约20～约140mg/l；半连续使用 的浓度为这些浓度的约0.5倍。
本发明也涉及(至少部分涉及)一种调节生物膜发育的方法。所 述方法包括：施用含有本发明的转录因子调节化合物的组合物。所述 组合物也可以含有提高所述组合物降解生物膜的能力的其它成分。
所述组合物可以配制成清洁产品(例如，家庭或工业清洁剂)以去 除、预防、抑制或调节生物膜发育。有益地，通过施用本发明的化合 物所述生物膜受到负面影响，例如，降低了生物膜的发育。这些组合 物可以包含如消毒剂、皂类、去污剂以及其它表面活性剂的化合物。 表面活性剂的实例包括，例如十二烷基硫酸钠、季胺类化合物、烷基 吡啶碘化物、TWEEN 80、TWEEN 85、TRITON X-100、BRIJ 56、生 物表面活性剂、鼠李糖脂、表面活性素(surfactin)、粘液菌素(visconsin) 和磺酸酯。本发明的组合物可以应用于已知的需要消毒的区域和表 面，包括但不限于排水设备、淋浴门帘、灌浆料(grout)、马桶和地板。 特殊的应用为在医院表面和医疗器械上。本发明的消毒剂可用作细菌 消毒剂，例如，但不限于假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、固氮菌科 (Azatobacteraceae)、根瘤菌科(Rhizabiaceae)、甲基球菌科 (Mthylococcaceae)、盐杆菌科(Halobacteriaceae)、醋酸杆菌科 (Acetobacteraceae)、军团杆菌科(Legionellaceae)、奈瑟氏菌科 (Neisseriaceae)，以及其它种类。
本发明也涉及一种清洁和消毒隐形眼镜的方法。所述方法包括将 隐形眼镜与可接受的载体中的至少一种本发明化合物的溶液接触。本 发明也涉及包含所述化合物的溶液，包装中有使用所述溶液清洗隐形 眼镜的说明。
本发明也包括一种处理医疗内置装置的方法。所述方法包括将本 发明的至少一种化合物与医疗内置装置接触，从而预防或基本上抑制 生物膜的形成。医疗内置装置的实例包括导管、矫形外科装置和植入 体。
通过将本发明的化合物加入到洁牙剂或口腔清洗剂中，可以配制 含有本发明化合物的牙膏或漱口剂，例如，如在Remington′s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Publishing Co.，1990，109章 (其全部以参阅的方式引入)中描述的。洁牙剂可配制成凝胶剂、糊剂、 散剂或膏剂。洁牙剂可以包含粘合剂、磨料、矫味剂、起泡剂和保湿 剂。口腔清洗制剂在本领域是已知的，且本发明的化合物可以方便地 加入其中。
在一个实施方式中，本发明涉及此处表2中和通式(I)-(VII)中描 述的各种转录因子调节化合物。
在本申请全文中引用的所有参考文献、专利申请和专利的内容据 此明确地以参阅的方式引入。此处披露的各篇参考文献全文以参阅的 方式引入此处。本申请要求优先权的任何专利申请的全部内容也以参 阅的方式引入此处。
通过下面的实施例将进一步说明本发明，这些实施例不应当解释 为进一步的限制。
发明实施例
实施例1：本发明的选择化合物的合成

方案1
4-氨基苯甲基-(2，4-二硝基-苯基)-胺衍生物(3)的制备
室温下，将2，4-二硝基氟苯(1)(150mmol)滴加到含有4-氨基苯甲 基胺衍生物(2)(225mmol)和粉末状NaHCO3(1125mmol)的无水 DMF(300mL)溶液中。2小时后，用水(1000mL)缓慢稀释溶液以沉淀 产物，收集产物置于多孔漏斗(fritted funnel)中，用水冲洗直至洗脱液 无色。固体进一步在高真空中干燥，得亮橙色固体。
6-硝基-2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑衍生物(4)的制备
室温、氩气气氛下，将甲醇钠(30％w/w)(375mmol)缓慢加入到含 有N-(4-氨基苯甲基)-2，4-二硝基苯胺衍生物(3)(74.9mmol)的无水乙 醇(300mL)和无水DMF(75mL)的溶液中。加毕，将溶液升温到60℃ 维持2小时。冷却至室温后，通过用水(700mL)稀释，将溶液转移到 Erlenmyer烧瓶或高型烧杯中，然后用饱和柠檬酸酸化。在用水冲洗 的烧结漏斗上收集生成的沉淀。粗品用热乙醇重结晶纯化得到褐色固 体。
N-酰基-6-硝基-2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑衍生物(5)的制备
室温下，将酰基氯(2.50mmol)或原位形成的混和酸酐加入到含 6-硝基-2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑衍生物(4)(1.00mmol)的无水 吡啶(2.0mL)溶液中。搅拌2～3小时后，用3M NaOH(6.0mL)稀释溶 液，再搅拌1小时。通过用水(100mL)稀释，将深琥珀色溶液转移到 Erlenmyer烧瓶或烧杯中，然后用饱和柠檬酸酸化。在用水冲洗的烧 结漏斗上收集生成的沉淀物。粗品用制备HPLC进一步纯化，或通过 热乙醇或热乙醇与氯仿的混合物重结晶进行纯化。
(E)-N-[4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-(4-[1，2，4]三 唑-1-基-苯基)-丙烯酰胺(化合物BI)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.60(s，1H)，9.38(s，1H)， 8.36-8.32(d，3H)，8.28(s，1H)，8.15-8.11(d，1H)，7.99-7.93(t，4H)， 7.87-7.82(m，3H)，7.73-7.68(d，1H)，6.96-6.91(d，1H).MS(M+1)＝ 375.05
(E)-N-[4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-(4-咪唑-1- 基-苯基)-丙烯酰胺(化合物BK)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.77(s，1H)，9.77(s，1H)， 8.37-8.34(m，4H)，8.15-8.12(dd，1H)，7.98-7.92(m，7H)，7.85-7.82(d， 1H)，7.76-7.71(d，1H)，7.08-7.03(d，1H).MS(M+1)＝467.20
2-[4-(4-氟-苯甲酰氨基)-苯基]-3-羟基-3H-苯并咪唑-5-羧酸酰胺 (化合物AD)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.55(s，1H)，8.30(d，2H)， 8.18-7.96(m，6H)，7.87(d，1H)，7.70(d，1H)，7.39(t，3H)，6.78(d，2H)， 3.02(s，6H).MS(M+1)＝391.20
(E)-N-[2-氟-4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-(4-氟- 苯基)-丙烯酰胺(化合物AZ)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.23(s，1H)，8.49-8.39(t，1H)， 8.38(s，1H)，8.22-8.12(m，3H)，7.87-7.84(d，1H)，7.72-7.63(m，3H)， 7.33-7.28(t，2H)，7.14-7.09(d，1H).MS(M+1)＝375.05
4-乙酰基-N-[2-氟-4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-苯 甲酰胺(化合物BA)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.81(br s，1H)，10.57(s，1H)， 8.42(s，1H)，8.41-8.13(m，7H)，7.98(t，1H)，7.89-7.86(d，1H)，2.66(s， 3H).MS(M+1)＝435.10
(E)-3-(4-乙酰基-苯基)-N-[4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)- 苯基]-丙烯酰胺(化合物BQ)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.65(s，1H)，10.65(s，1H)， 8.33～8.36(m，3H)，8.13(dd，1H)，8.03(d，2H)，7.94(d，2H)，7.78～7.84 (m，3H)，7.7(d，1H)，7.0(d，1H)，2.6(s，3H).MS(M-1)＝441

方案2
4-苯基酰氨基苯甲胺衍生物(7)的制备
强力搅拌下，3-5分钟内，将酰基氯(225.4mmol)加入到含4-氰 基苯胺衍生物(6)(225mmol)的N-甲基吡咯烷酮(180mL)溶液中。反应 混合物搅拌约5小时(直至反应物的HPLC监测显示原料完全消耗) 后，室温下将其倒入1400mL水中，所得混悬液搅拌约1小时。过滤 沉淀，用4×500mL水冲洗，然后干燥。从滤出液和洗涤液中获得第 二批固体。在压力反应器中，4-苯基酰氨基苄腈中间体(98mmol)溶解 于无水THF(940mL)中，溶液通氩气净化2-3分钟，接着加入11mL 均匀混悬的催化剂(镍2400，水悬液)。在混悬液中加入少量甲 醇后，强力搅拌下将反应器加压至55psi的H2压。反应物的LC-MS 监测表明原料在2.5小时内完全转化成相应的胺。反应混合物通过硅 藻土床(例如，)过滤，用3×100mL无水THF冲洗。合并的滤 液蒸发至干，在高真空下进一步干燥以获得白色固体。
N-{4-[(2，4-二硝基苯基氨基)-甲基]-苯基}-苯甲酰胺衍生物(8)的 制备
室温下，将2，4-二硝基氟苯(1)(150mmol)滴加到4-苯基酰氨基苯 甲胺衍生物(7)(225mmol)和粉末状NaHCO3(1125mmol)的无水DMF (300mL)溶液中。2小时后，用水(1000mL)缓慢稀释溶液以沉淀产物， 在多孔漏斗上收集产物，用水冲洗直至洗脱液无色。固体在高真空中 进一步干燥以得到亮橙色固体。
N-[4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-苯甲酰胺衍生物 (5)的制备
室温、氩气气氛下，将甲醇钠(30％w/w)(69.1g，375mmol)缓慢 加入到含有N-{4-[(2，4-二硝基苯基氨基)-甲基]-苯基}-苯甲酰胺衍生 物(8)(74.9mmol)的无水乙醇(300mL)和无水DMF(75mL)溶液中。加 毕，将溶液升温到60℃维持2小时。冷却至室温后，通过用水(700mL) 稀释，将溶液转移到Erlenmyer烧瓶或高型烧杯中，然后用饱和柠檬 酸酸化。在用水冲洗的烧结漏斗上收集生成的沉淀。粗品用热乙醇重 结晶进行纯化。
[5-(4-氟-苯甲酰氨基)-2-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯氧 甲基]-磷酸(化合物AR)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.57(s，1H)，8.30(s，1H)， 8.29-8.06(m，3H)，7.86-7.83(d，2H)，7.67-7.44(t，2H)，7.41-7.38(t，2H)， 4.36-4.32(d，2H).MS(M-1)＝501

方案3
N-[4-(1-烷氧基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-苯甲酰胺衍生 物(9)的制备
含有N-[4-(1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-苯甲酰胺衍 生物(5)(0.19mmol)和无水碳酸钠(0.96mmol)的3mL DMF的混悬液 用取代的卤代烷衍生物(0.25mmol)处理并在室温下搅拌。24小时后， 将反应混合物倒入20mL水中，并搅拌2小时。将形成的沉淀物过滤、 用4×10mL的水冲洗，并在真空中干燥以得到产物。
(2-{2-[4-(4-氟-苯甲酰氨基)-苯基]-6-硝基-苯并咪唑-1-基氧}-乙 基)-三甲基-铵(化合物W)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.62(s，1H)，8.72(s，1H)，8.22 (t，3H)，8.15-8.12(m，4H)，7.93(d，1H)，7.41(t，2H)，4.78(t，2H)，3.99(t， 2H)，3.21(s，9H).MS(m/z，M)＝478.39
{2-[4-(4-氟-苯甲酰氨基)-苯基]-6-硝基-苯并咪唑-1-基氧}-乙酸 (化合物V)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.55(s，1H)，8.78(d，1H)， 8.30(d，2H)，8.20-8.00(m，5H)，7.85(d，1H)，7.41(t，2H)，5.02(s，2H). MS(M+1)＝451.20
(2-{4-[(E)-3-(4-氟-苯基)-丙烯酰氨基]-苯基}-6-硝基-苯并咪唑-1- 基氧甲基)-磷酸二乙酯(化合物AS)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.62(s，1H)，8.60(d，1H)， 8.30(d，2H)，8.23(dd，1H)，7.99(d，2H)，7.91(d，1H)，7.79～7.67(m，3H)， 7.34(dd，2H)，6.86(d，1H)，4.95(d，2H)，4.19(q，4H)，1.33(t，6H).MS (M-1)＝567
(2-{4-[(E)-3-(4-氟-苯基)-丙烯酰氨基]-苯基}-6-硝基-苯并咪唑-1- 基氧甲基)-磷酸(化合物AL)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ10.55(s，1H)，8.56(d，1H)， 8.32(d，2H)，8.17(dd，1H)，7.92(d，2H)，7.86(d，1H)，7.74～7.61(m，3H)， 7.30(dd，2H)，6.80(d，1H)，4.50(d，2H).MS(M-1)＝511

方案4
(E)-N-(4-氨基甲基-苯基)-3-苯基-丙烯酰胺衍生物(11)的制备
将酰基氯衍生物(1.0mmol)加入到含有4-(叔丁氧羰基-氨基甲 基)-苯胺衍生物(0.94mmol)的7mL NMP溶液中，室温下搅拌40分钟。 然后边搅拌边倒入100mL水中。过滤沉淀物，用水(5×15mL)冲洗， 干燥得叔丁氧羰基保护的产物。叔丁氧羰基保护的产物(0.83mmol) 在10mL TFA中的溶液在室温下搅拌20分钟。然后用200mL乙醚稀 释，混悬液再搅拌10分钟。过滤沉淀，用3×20mL乙醚冲洗，真空 中干燥6小时以得到其TFA盐形式的产物(11)。
(E)-N-{4-[(5-氟-2，4-二硝基-苯基氨基)-甲基]-苯基}-3-苯基-丙烯 酰胺(13)的制备
将碳酸氢钠(10.0mmol)和化合物(11)(2.0mmol)加入到含有1，5- 二氟-2，4-二硝基苯(12)(2.0mmol)的8mL DMF溶液中，反应混合物回 流10小时。将反应物倒入冰水中以生成沉淀。过滤沉淀，用水冲洗， 并在真空中干燥得所需产物。
(E)-N-[4-(5-乙氧基-1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3- 苯基-丙烯酰胺(14)的制备
将氢化钠(2.2mmol)加入到含有(E)-N-{4-[(5-氟-2，4-二硝基-苯基 氨基)-甲基]-苯基}-3-苯基-丙烯酰胺(13)(0.44mmol)的乙醇(10mL)和 DMF(10mL)溶液中。反应混合物加热至60℃维持3小时。冷却至室 温后，将它倒入冰水中，用柠檬酸水溶液酸化。收集所得沉淀，用水 冲洗，并在真空中干燥以生成黄色固体产物。
(E)-3-(4-氟-苯基)-N-[4-(1-羟基-5-甲基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2- 基)-苯基]-丙烯酰胺(化合物BC)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.57(s，1H)，10.52(s，1H)， 8.31(d，2H)，8.16(s，1H)，7.91(d，2H)，7.74～7.62(m，4H)，7.30(dd，2H)， 6.82(d，1H)，2.63(s，3H).MS(M+1)＝433
(E)-N-[4-(5-乙氧基-1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯 基]-3-(4-氟-苯基)-丙烯酰胺(化合物BJ)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.41(s，1H)，10.51(s，1H)， 8.28(d，2H)，8.05(s，1H)，7.91(d，2H)，7.72(dd，2H)，7.64(d，1H)，7.49 (s，1H)，7.30(dd，2H)，6.82(d，1H)，4.22(q，2H)，1.36(t，3H).MS(M+1) ＝463
N-[4-(1-羟基-5-甲基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-4-噁唑-5- 基-苯甲酰胺(化合物BL)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.47(s，1H)，10.67(s，1H)， 8.50(s，1H)，8.32(d，2H)，8.18(s，1H)，8.10(d，2H)，8.01(d，2H)，7.88(d， 2H)，7.84(s，1H)，7.69(s，1H)，2.62(s，3H).MS(M+1)＝456
N-[4-(5-二甲氨基-1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-(4- 氟肉桂酰)胺(化合物BN)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.32(s，1H)，10.51(s，1H)， 8.27(d，2H)，7.97(s，1H)，7.90(d，2H)，7.71(dd，2H)，7.65(d，1H)，7.49 (s，1H)，7.30(dd，2H)，6.82(d，1H)，2.75(s，6H).MS(M+1)＝462
N-[4-(5-氟-1-羟基-6-硝基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-3-(4-氟-肉桂 酰)胺(化合物BO)
1H NMR(300MHz，DMSO-d6)：δ12.72(s，1H)，10.55(s，1H)， 8.33(d，2H)，8.28(d，1H)，7.92(d，2H)，7.81(d，1H)，7.75～7.70(m，2H)， 7.64(d，1H)，7.30(dd，2H)，6.82(d，1H).MS(M+1)＝437

方案5
6-溴-2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑(16)的制备
室温下将含有4-溴-1-氟-2-硝基苯(15)(31.4mL，250mmol)的无 水DMF(50mL)溶解通过滴液漏斗在1小时的时间内滴加到含4-氨基 苯甲胺(35.4mL，313mmol)和粉末状NaHCO3(158g，1875mmol)的无 水DMF(500mL)溶液中。另外4小时后或经HPLC测定反应完成后， 溶液用无水乙醇(1000mL)稀释，且按份加入粉末状叔丁醇钾(140g， 1250mmol)。接着将溶液加热至60℃维持6小时。冷却至室温后， 溶液倒入正在搅动的水(4L)中，然后，用1M HCl调至pH 6。在冰浴 中缓慢搅拌混悬液以促使生成固体。用精细的多孔漏斗收集悬浮的产 物，用水冲洗至洗脱液无色。橙色固体进一步在高真空中干燥。
6-吡唑-2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑的制备
在20mL Biotage微波管中装入6-溴-2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并 咪唑(16)(1.52g，5.00mmol)、N，N’-二甲基乙二胺(1.10mL，10.0 mmol)、CuI(0.952g，5.00mmol)、吡唑(1.36g，20.0mmol)和叔丁醇钾 (2.24g，20.0mmol)及无水DMSO(20mL)。封好的管置于温度设置为 195℃的Biotage微波反应器中，放置45分钟。冷却后，打开管，倒 入快速搅动的水中。所得混悬液经0.5M NaOH冲洗的Celite塞过滤。 水溶液加载到制备DVB柱上。加载后，产物用CH3CN洗脱。减压下 移除CH3CN。所得水溶液通过冰浴冷却至0℃，然后用1M HCl调至 pH 6以沉淀出产物17。收集所得固体于用冷水冲洗的多孔漏斗上， 得到浅褐色固体1.52g，产率70％。产物进一步在高真空中干燥。
(E)-3-(4-氟-苯基)-N-[4-(1-羟基-6-吡唑-1-基-1H-苯并咪唑-2- 基)-苯基]-丙烯酰胺(化合物CL)的制备
室温下，将4-氟肉桂酰氯(1.15g，6.25mmol)加入到含有6-吡唑 -2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑(0.78g，2.50mmol)和NaHCO3(0.84 g，10.0mmol)的无水CH3CN(20mL)和DMPU(5mL)的溶液中。6小 时后，用3M NaOH(25mL)稀释溶液，再搅拌2小时。通过水(100mL) 的稀释将溶液转移入另一个烧瓶中，然后用饱和柠檬酸酸化。在用水 冲洗的烧结漏斗上收集所得沉淀。粗品进一步用热乙醇或热乙醇和氯 仿混合物重结晶进行纯化。1H NMR(DMSO-d6)δ10.49(s，1H)， 8.61(s，1H)，8.33(m，2H)，7.94-7.63(m，9H)，7.32(m，2H)，6.84(m，1 H)，6.55(s，1H).LC/MS(m+1)440。
4-乙酰基-N-[4-(1-羟基-6-吡唑-1-基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-苯 甲酰胺(化合物CM)的制备
室温下，将4-乙酰基苯甲酰氯(1.14g，6.25mmol)加到含有6-吡唑 -2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑(0.78g，2.50mmol)和NaHCO3(0.84 g，10.0mmol)的无水CH3CN(20mL)和DMPU(5mL)中。6小时后， 用3M NaOH(25mL)稀释溶液，再搅拌2小时。通过水(100mL)稀释 将溶液转移入另一个烧瓶中，然后用饱和柠檬酸酸化。在用水冲洗的 烧结漏斗上收集所得沉淀。粗品进一步用热乙醇或热乙醇和氯仿混合 物重结晶进行纯化。1H N MR(DMSO-d6)δ10.61(s，1H)，8.69-7.77 (m，13H)，6.60(1，1H)，2.63(s，3H).LC/MS(m+1)438。
4-乙酰基-N-[4-(1-羟基-6-咪唑-1-基-1H-苯并咪唑-2-基)-苯基]-苯 甲酰胺(化合物CN)的制备
室温下，将4-乙酰苯甲酰氯(1.14g，6.25mmol)加到含有6-咪唑 -2-(4-氨基苯基)-1-羟基苯并咪唑(0.78g，2.50mmol)和NaHCO3(0.84g， 10.0mmol)的无水CH3CN(20mL)和DMPU(5mL)的溶液中。6小时 后，用3M NaOH(25mL)稀释溶液，再搅拌2小时。通过水(100mL) 的稀释将溶液转移入另一个烧瓶中，然后用饱和柠檬酸酸化。收集所 得沉淀于用水冲洗的烧结漏斗上。粗品进一步用热乙醇或热乙醇和氯 仿混合物重结晶进行纯化。1H NMR(DMSO-d6)δ10.63(s，1H)， 8.32-7.46(m，13H)，7.13(1，1H)，2.68(s，3H).LC/MS(m+1)438。
实施例2：化合物的SoxS凝胶迁移分析
这些化合物用DMSO稀释至所需浓度并加入到适当的孔中。将 蛋白(SoxS)以确定引起DNA的50％迁移的浓度在EMSA缓冲液中加 入到孔中。然后将板加盖、混合、并在室温下振摇30分钟以使化合 物-蛋白质结合。
然后将10μl的DNA混合物(每次反应2.4μl的5×EMSA缓冲液， 0.2μl的聚(dIdC)，1μl的33P-DNA探针，7.4μl的蒸馏水)加入到各 个孔中。最终的DNA浓度大约为1nM。然后将样品于室温下混合15 分钟，这使得形成蛋白质-DNA复合物。
以约110伏开始电泳且凝胶预跑(pre-run)10-15分钟。然后将5μl 凝胶加样缓冲液加入到各个样品中并混合。然后将15μl的各样品加 样到凝胶上。凝胶在110V电压下电泳约2小时或直至溴酚蓝标记物 接近凝胶底部。然后将凝胶转移到Whatman滤纸上，加盖，于80℃ 干燥约30分钟。将放射自显影胶片在凝胶上曝光过夜并显影。
实施例3：发光分析的建立
采用基于化学发光的定量分析方法测量各种不同MarA(AraC)家 族成员的DNA结合活性。利用此技术，将生物素化的双链DNA分子 (2nM)与融合6-组氨酸(6-His)残基的MarA(AraC)蛋白(20nM)一起在 抗生物素蛋白链菌素涂布的96孔微量滴定(白色)板(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)中孵育。未结合的DNA和蛋白质通过冲 洗移除，接着加入初级单克隆抗6-组氨酸抗体。进行第二次冲洗，然 后向混合物中加入次级HRP耦联抗体。过量的抗体通过第三次冲洗 步骤移除，并向板中加入化学发光基质(Cell Signaling Technology， Beverly，MA)。立即用Victor V板读板器(PerkinElmer Life Sciences， Wellesley，MA)读取发光。抑制蛋白与DNA结合的化合物导致蛋白质 在第一次冲洗步骤时从板上流失，因而由发光信号的降低来识别。可 使用系列稀释的抑制化合物计算信号降低50％必需的化合物浓度 (EC50/IC50)。另外，已鉴别出影响不同转录因子的单转录因子调节剂。
实施例4：Mar抑制剂在肾盂肾炎感染模型中的体内活性
对雌性CD1小鼠组(n＝6)进行利尿处理并通过囊内接种用大肠杆 菌UPEC菌株C189感染小鼠。然后，在感染时和随后的4天中每天 一次通过口服给药途径对小鼠施用转录因子调节剂(25mg/kg)、对照 化合物，例如SXT(Qualitest Pharmaceuticals，Huntsville，AL)、或单独 的载体(0mg/kg)，以维持小鼠体内恒定的药物水平。5天的感染期后 且在通过CO2/O2窒息处死前，轻压腹部取尿样。窒息后，在无菌条 件下移去膀胱和肾。记录尿量和单个器官重量，将器官悬浮于含 0.025％Triton X-100的无菌PBS中，然后匀浆。尿样和匀浆的系列 10倍稀释液置于McConkey琼脂板上以测定尿的CFU/ml和器官的 CFU/克。
这些实验的有效性定义为尿CFU/ml或器官CFU/g的对数降低 ≥2。
实施例5：Mar抑制剂抗假结核耶尔森菌的LcrF(VirF)的体外 活性
MarA(AraC)家族成员LcrF(VirF)从假结核耶尔森菌克隆、表达和 纯化。纯化的蛋白用于产生无细胞系统以监测DNA-蛋白的体外相互 作用。测定Mar抑制剂抗LcrF的活性以鉴别在全细胞分析中50μg/mL 的抑制活性和细胞毒性百分数。本发明一些化合物的EC50总结于下 表3中。具有优异的抑制作用的化合物用“***”(小于10μM)标示，具 有非常好的抑制作用的化合物用“**”(在10.1～25μM之间)标示，以 及具有良好的抑制作用的化合物用“*”(大于25.1μM)标示。未测试的 化合物用“NT”表示，且没有活性的化合物用“--”表示。
实施例6：Mar抑制剂在全细胞系统中的活性
在致病性的耶尔森氏菌某些种中，III型分泌(细胞毒性蛋白(Yops) 从细菌分泌入宿主细胞中的过程)是由LcrF调节的。野生型假结核耶 尔森氏菌对J774组织培养细胞有毒性而携带yopJ(抑制真核信号通路 的Yop)或lcrF突变的细菌则没有。为了筛选具有穿透完整细菌细胞 并通过结合使LcrF失能而抑制III型分泌的能力的化合物，利用了野 生型假结核耶尔森菌的细胞毒性。
本分析使用来自Promega的CytoTox分析试剂盒。简言之， 在感染前的该天，将J774巨噬细胞以每孔2×104细胞涂布于96孔板 上。假结核耶尔森菌在26℃于2x YT培养基中生长过夜，然后在第 二天早晨按1∶25或1∶40稀释至补充有20mM MgCl2和20mM草酸钠 的2x YT中。培养物在26℃中进一步生长90分钟，然后转换到37℃ 生长90分钟。温度转换和螯合钙的草酸钠导致诱导LcrF表达。后面 的实验也包括YPIIIpIB1ΔJ(YopJ突变体)和YPIIIpIB1ΔLcrF(LcrF突变 体)。YPIIIpIB1ΔJ是YopJ缺失型突变体，以及任何与YopJ无关的(即， lps-介导的)细胞毒性由此菌株看出。测定OD600，将培养物调整到 OD600为1.0。这相当于约1.25×109细胞/mL。假定J774细胞密度为 2×104，在不同的多重感染下(MOIs)用DMEM(J774培养基)制备稀释 液。以10μl等份加入假结核耶尔森氏菌，将细胞在带有CO2生成系 统的培养室中，或之后在具有5％CO2的组织培养箱中37℃下培养2 小时。然后加入庆大霉素至终浓度为50μg/ml，培养物继续培养2-3 小时或过夜。对照包括单独的培养基、靶细胞自发溶解液、靶细胞最 大溶解液和效应细胞自发溶解液。对于最大溶解液而言，终止实验前 45分钟加入Triton X-100至终浓度为0.8％。收集含有释放的LDH的 上清液，接着以1,000rpm离心5分钟。上清液可冷冻过夜或立即进 行分析。50μl上清液与50μl新鲜分析缓冲液混合，并在黑暗中培养 30分钟，然后在每孔中加入50μl终止液，并在490nm读板。下面的 表3中给出了用本发明的化合物处理的细菌与未经处理的细菌对比的 细胞毒性百分数。在50μg/mL显示大于75％的细胞毒性的化合物用 “*”标示，在50μg/mL具有小于75％的细胞毒性的化合物用“**”标示。
实施例7：Mar抑制剂抗绿脓杆菌的ExsA的体外活性
MarA(AraC)家族成员ExsA从绿脓杆菌中克隆、表达和纯化。纯 化的蛋白质用于产生无细胞系统以监测体外DNA-蛋白相互作用。在 剂量效应研究中测定单个Mar抑制剂抗ExsA的作用以产生各个化合 物的EC50，即体外抑制50％的ExsA DNA结合需要的浓度。下表3 总结了本发明中的一些化合物的EC50。具有优异的抑制作用的化合物 用“***”(小于10μM)标示，具有非常好的抑制作用的化合物用“**”(在 10.1～25μM之间)标示，以及具有良好的抑制作用的化合物用“*”(大 于25.1μM)标示。未测试的化合物用“NT”表示，而没有活性的化合物 用“--”表示。
实施例8：Mar抑制剂在全细胞系统中的活性
在致病性绿脓杆菌中，通过ExsA调节III型分泌。III型分泌是 其中细胞毒性蛋白(ExoU，ExoT等)从细菌分泌到宿主细胞中的过程。 野生型绿脓杆菌对J774组织培养细胞具有毒性而携带exsA突变的细 菌则没有。在本实施例中，野生型绿脓杆菌的细胞毒性用于就渗透完 整细胞和通过结合使ExsA失能而阻止III型分泌的能力对化合物进行 筛选。
Promega提供的CytoTox分析试剂盒用于该实验。简言之， 在感染前的该天将J774巨噬细胞样细胞涂布于96孔板，每孔5×104 个细胞。绿脓杆菌在37℃用Luria Broth培养基生长过夜，然后用 MinS(含钙离子螯合剂腈基醋酸三钠的最低限度盐培养基)按1∶25 稀释。实验还包括WT ExsA突变，其中删除了整个exsA编码序列。 将Mar抑制剂(浓度为50μg/mL)加入到MinS培养物中，然后在 37℃再生长3小时。转移到无钙培养基中导致诱导ExsA表达。培养 物生长至OD600为1.0，约1×109细胞/mL。以不同的多重感染(MOIs) 在DMEM(J774培养基)中制备稀释液，假定J774细胞密度为5×104。 J774细胞孔中的培养基用含有50μg/mL Mar抑制剂的DMEM替换。 将10μl等份绿脓杆菌加入到J774细胞中，在1,000rpm下将板离心5 分钟以使感染同步，然后在具有5％CO2的组织培养箱中孵育2小时。 对照组包括单独培养基、靶细胞自发溶解液、靶细胞最大溶解液、及 具有单独J774细胞的Mar抑制剂。对靶细胞最大溶解液而言，在实 验终止前30分钟，将10μl的CytoTox分析试剂盒溶胞溶液加入 到未处理的J774细胞中。收集含释放的LDH的上清液，然后以1,000 rpm离心5分钟。上清液可冷冻过夜或立即进行分析。50μl上清液与 50μl新鲜LDH基质溶液混合，并在黑暗中孵育30分钟。在每孔中加 入50μl终止溶液，并在490nm下读板。下面的表3中，在50μg/mL 具有大于75％的细胞毒性的化合物用“*”标示，在50μg/mL具有小于 75％的细胞毒性的化合物用“**”标示。
表3
  编号  LcrF EC50  (μM)  ExsA EC50  (μM)   50μg/mL时的   细胞毒性   耶尔森氏菌属   50μg/mL时的   细胞毒性   假单胞菌属   A  **  **   *   *   B  ***  ***   **   **   C  *  ***   **   **   D  ***  ***   **   *   E  **  ***   **   *   F  ***  **   *   **   G  **  ***   *   **   H  *  *   *   NT   I  *  --   *   NT   J  *  ***   **   *   K  *  **   *   *
  L   --   NT   *   NT   M   *   *   *   NT   N   *   NT   *   *   P   **   **   *   *   R   *   **   **   *   S   **   **   *   *   T   ***   ***   **   *   U   *   *   *   NT   V   *   NT   *   NT   X   **   **   *   *   Y   **   ***   *   *   Z   **   *   *   NT   AA   **   **   *   *   AB   **   **   *   *   AC   **   **   *   *   AD   --   --   *   NT   AE   ***   ***   *   *   AF   *   *   *   NT   AG   *   **   *   *   AH   **   **   *   *   AI   *   **   *   *   AJ   **   **   *   *   AK   --   --   *   NT
  AL   ***   ***   **   *   AM   **   **   *   *   AN   ***   ***   *   *   AO   **   ***   *   *   AP   ***   ***   *   *   AQ   ***   ***   *   *   AR   --   --   *   NT   AS   *   **   *   *   AT   ***   ***   *   *   AU   --   --   *   NT   AV   ***   ***   *   *   AW   ***   **   **   *   AX   --   --   *   NT   AY   --   --   *   NT   AZ   **   **   *   *   BA   **   ***   *   *   BB   **   *   *   NT   BC   ***   ***   **   **   BD   *   *   *   NT   BE   ***   ***   *   *   BF   --   ***   *   NT   BG   *   **   *   **   BH   **   **   *   *
  BI   *   ***   **   **   BJ   **   ***   **   **   BK   --   ***   **   **   BL   *   ***   **   **   BM   **   **   *   *   BN   *   **   **   **   BO   *   *   NT   **   BP   --   --   *   *   BQ   **   ***   NT   **   CE   ***   ***   NT   **   CF   ***   ***   NT   *   CG   NT   *   NT   *   CH   *   **   BT   *   CI   ***   ***   NT   **   CJ   --   --   NT   **   CK   **   **   NT   **   CL   *   *   NT   *   CM   --   --   NT   *   CN   NT   --   NT   *   CO   **   *   NT   **
等同物
本领域技术人员将认识到或能够仅使用例行实验确定此处描述 的特定多肽、核酸、方法、测试方法和试剂的等同物。这些等同物也 被认为在本发明的范围之内且被下面的权利要求覆盖。