技术领域
[0001] 本
发明涉及一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒及用法，属于免疫分析技术领域。
背景技术
[0002] 重症肌无
力(myasthenia gravis,MG)是一种自身免疫性
疾病，它是一种自身
抗体介导、补体参与、细胞免疫依赖的神经肌肉接点(NMJ)处神经递质的
信号传递障碍。MG人群发病率为(32～64)/10万，我国目前约有60万MG患者[1]。其主要临床表现为骨骼肌无力、易疲劳，活动后加重，休息和应用胆
碱酯酶
抑制剂后症状明显缓解、减轻。其特点是发病率高、致残率高、
预后差、易复发，已经严重威胁到人类的生活和健康，得到了医疗、科研工作者的广泛关注。MG是典型的抗体介导的
自身免疫性疾病，主要靶
抗原是NMJ突触后膜的乙酰胆碱受体(AChR)。但抗AChR抗体并非存在于所有的MG患者中，且其与病情严重程度、是否合并胸腺瘤和发病年龄无关。
[0003] 乙酰胆碱(ACh)是一种神经递质，主要在运动神经终末处合成，其作用为传导神经冲动。乙酰胆碱酯酶(AChE)广泛分布于人的神经组织，其主要功能是催化胆碱能神经末梢释放的ACh的
水解，维持正常的神经活动。任何一种因素影响到突触结构都会导致胆碱能神经元功能的不完整，如抗乙酰胆碱酯酶抗体(AChE-Ab)与突触部位的AChE结合，造成AChE失活，阻碍ACh水解，ACh持续作用于突触后膜，使突触后膜处于去极化状态不能恢复，而影响下一次的神经活动的传递[2]。Lennon等发现将AChE作为靶抗原，把抗乙酰胆碱酯酶的抗体注入大鼠体内，通过组织化学及形态学检查，发现AChE活性降低引发了临床症状的产生[3]。MG患者中有13％血清中为AChE-Ab阳性，且多为AChR-Ab阴性，临床多见眼肌型MG[4]。
[0004] 目前AChE-Ab的主要检测方法还是ELISA检测，该方法具有灵敏度低，重现性差，操作繁琐等多个缺点。建立高灵敏度、高特异性的检测AChE-Ab方法是尚待解决的问题。电化学发光免疫分析法是继酶联免疫分析、放射免疫分析、
荧光免疫分析之后的新一代标记
免疫测定技术，具有高度敏感、特异性强、测定范围宽、试剂稳定、操作简单等优点。目前尚未有文献报道电化学发光免疫分析法检测AChE-Ab的研究。
发明内容
[0005] 本发明要解决的技术问题是：为解决
现有技术中尚未有高灵敏度、高特异性的定量检测AChE-Ab的方法或试剂盒的技术问题，提供一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒及制法。
[0006] 本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0007] 一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒，包括：包被链霉亲和素的
磁珠微粒工作液，
生物素标记的AChE工作液，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液，AChE-Ab的校准品和/或质控品工作液，含三丙胺的电化学发光底物液，以及清洗液。
[0008] 优选地，所述包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液由pH为6.8～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的
磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液、MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～1wt％的BSA(
牛血清
白蛋白)和/或
酪蛋白、0.05～1wt％的Brij-35(月桂醇聚
氧乙烯醚)和/或Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)和/或Tween-20(山梨醇酐单月桂酸酯聚氧乙烯醚)、0.05～0.5wt％的proclin 300或叠氮化钠。
[0009] 优选地，所述抗人IgG抗体为单克隆抗体、多克隆抗体、单克隆抗体Fab
片段或多克隆抗体Fab片段，优选来源于鼠、兔、羊。
[0010] 优选地，所述生物素标记的AChE抗原以及三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体，工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MOPSO缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、0.5～5wt％
氯化钠、1～5wt％
蔗糖、0.05～2wt％
小牛血清、0.02～1wt％酪蛋白、0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
[0011] 优选地，所述检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒还包括AChE-Ab校准品工作液和/或质控品工作液，所述AChE-Ab校准品和/或质控品工作液由pH为6.0～7.6，浓度为0.01mol/L～0.2mol/L的磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、HEPES缓冲液或MES缓冲液中的一种配制而成，所述缓冲液中含有0.5～5wt％牛血清白蛋白、10～50wt％人血清、0.5～3wt％氯化钠、2～20wt％乙二醇、0.02～1wt％的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～
0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
[0012] 优选地，所述化学发光底物液pH为6.0～7.2，浓度为0.05～0.4mol/L的磷酸盐缓冲液或Tris缓冲液的一种配制而成，所述缓冲液含有0.05～0.4mol/L三丙胺、0.01～2wt％的Brij-35和/或Triton X-100和/或Tween-20、0.05～0.5wt％proclin 300和/或叠氮化钠。
[0013] 优选地，所述清洗液是pH≥13，浓度为0.1mol/L～0.5mol/L的氢氧化
钾溶液，所述清洗液含有0.01～2wt％的烷基聚乙二醇类
表面活性剂。
[0014] 本发明还提供一种上述检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒的制法，包括：包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备，生物素标记的AChE工作液的制备，三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液的制备，电化学发光底物液的配制，以及清洗液的配制，并将上述制备的试剂进行分装及组装。
[0015] 优选地，所述生物素标记的AChE抗原的制备方法为：将NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)活化的生物素与AChE按照1:1～20:1的摩尔比在2～8℃或室温条件下混匀反应0.5～2小时，
透析或过柱除去多余的NHS活化的生物素及副产物，得生物素标记的AChE。
[0016] 优选地，所述三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备方法为：将Ru-NHS(NHS活化的三联吡啶钌)与pH为6.5～8.0的抗人IgG抗体溶液按照1:1～20:1的摩尔比在室温或37℃条件下，避光混匀反应1～4小时，加入甘
氨酸溶液终止反应，透析除去多余的Ru-NHS及反应副产物，得三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体。
[0017] 本发明的有益效果是：
[0018] 本发明提供了一种检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒、制法，所制备试剂盒的发光体系为电化学发光，利用链霉亲和素-生物素信号放大系统，检测速度快、灵敏度高、线性范围宽、检测结果重复性好，能够实现血液中AChE-Ab的准确定量检测；尤其地，将该试剂盒应用于全自动电化学发光系统，加样、孵育、清洗和检测等步骤均可实现自动化，避免了人为操作带来的结果偏差，提高了工作效率，通过内置标准曲线到测试
软件，只需测试样本即可定量检测样本中的AChE-Ab，使检测更快速、更可靠、更稳定。
具体实施方式
[0019] 现在对本发明作进一步详细的说明。
[0020]
实施例1检测AChE-Ab的电化学发光试剂盒的制备方法
[0021] 1)包被链霉亲和素的磁珠微粒工作液的制备
[0022] 将链霉亲和素包被磁珠微粒的悬浮液，磁分离去除上清，用pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)重悬至浓度为0.75mg/mL，所述缓冲液含有0.5wt％的BSA、0.05wt％的Triton X-100、0.05wt％proclin 300和0.05wt％叠氮化钠。
[0023] 2)生物素标记的AChE抗原的制备
[0024] 准确称取1mgAChE抗原，加入适量PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)调整抗体总浓度至1mg/mL，并加入透析袋中进行透析，每隔3～4小时换一次
透析液，更换3～4次，透析后将抗体转移至离心管或冻存管内；
[0025] 准确称取1mg N-羟基琥珀酰亚胺活化的生物素(NHS-biotin)，加入适量水调整其浓度为2mg/mL，得NHS-biotin水溶液；
[0026] 将NHS-biotin水溶液加入抗体中，使NHS-biotin与抗体按照5:1的摩尔比在室温混匀反应1小时，得生物素标记的AChE抗原溶液粗产品；
[0027] 将生物素标记的AChE抗原溶液转移至透析袋，于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析，每隔3～4小时换一次透析液，更换3～4次，透析后收集生物素标记的AChE抗原至离心管或冻存管内，≤-15℃冷冻保存备用。
[0028] 3)三联吡啶钌标记抗人IgG抗体的制备
[0029] 用DMSO配制浓度为10mg/mL的Ru-NHS溶液；用PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)配制浓度为1mg/mL的抗人IgG抗体溶液；
[0030] 于1mL抗人IgG抗体溶液中加入10μL新配制的Ru-NHS溶液，37℃避光反应2小时，然后加入20μL、2M的甘氨酸终止反应，将反应液于PBS缓冲液(0.1M，pH 7.4)透析过夜，更换3～4次透析液，回收三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体溶液，≤-15℃冷冻保存备用。
[0031] 4)生物素标记的AChE抗原工作液以及三联吡啶钌标记抗人IgG抗体工作液的制备[0032] 配制pH为6.5，浓度为0.1mol/L的磷酸盐缓冲液，所述缓冲液含有2wt％BSA、0.1wt％酪蛋白、1wt％氯化钠、1wt％蔗糖、2wt％小牛血清、0.5wt％Triton X-100、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制抗体浓度为1mg/L的生物素标记的AChE抗原工作液，以及抗体浓度为8mg/L三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液。
[0033] 5)校准品和质控品工作液的配制
[0034] 配制pH＝7.4，浓度为0.1mol/L的N-(2-羟乙基)哌嗪-N′-(2-乙磺酸)(HEPES)缓冲液，所述缓冲液含有1wt％BSA、20wt％人血清、1wt％氯化钠、5wt％乙二醇、0.1wt％Tween-20、0.2wt％proclin 300；然后用该缓冲液配制AChE-Ab校准品和质控品工作液，校准品共6个点，AChE-Ab的浓度分别为0ng/mL、0.2ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、25ng/mL、100ng/mL。质控品分高、低两个浓度，AChE-Ab的浓度分别为1ng/mL、25ng/mL。
[0035] 6)清洗液的配制
[0036] 配制176mmol/L的KOH溶液，所配清洗液中含有0.15wt％Brij-35。
[0037] 7)化学发光底物液的配制
[0038] 配制pH＝6.5，0.15mol/L三丙胺、0.05wt％Brij-35、0.01wt％proclin 300。
[0039] 8)试剂分装及组装
[0040] 将链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液12mL/瓶、生物素标记的AChE抗原工作液12mL/瓶、三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液12mL/瓶、校准品/质控品工作液1.0mL/瓶分装后，组装在一起，保存于2～8℃，将化学发光底物液380mL/瓶、清洗液380mL/瓶单独
包装，保存于20～25℃。
[0041] 实施例2使用本发明的试剂盒检测AChE-Ab的方法以全自动电化学发光法免疫分析仪为检测仪器，将试剂盒装载到仪器上进行检测，步骤如下：
[0042] 将样本(或校准品或质控品)、生物素标记的AChE抗原工作液和三联吡啶钌标记的抗人IgG抗体工作液加入到反应杯中，37℃孵育10分钟，形成抗原-抗体-抗抗体复合物溶液；
[0043] 于抗原-抗体-抗抗体复合物溶液中加入链霉亲和素包被的磁珠微粒工作液，37℃孵育10分钟，形成
磁性复合物悬浮液；
[0044] 将磁性复合物悬浮液置于
磁场内，清洗液流过并洗涤所述磁性复合物；
[0045] 向洗涤后的磁性复合物中注入电化学发光底物液，使用
光电倍增管检测其发光强度。由光电倍增管所得信号值和定标曲线推算出AChE-Ab的含量。
[0046] 实施例3本发明的试剂盒的性能评估
[0047] 1)试剂灵敏度的研究
[0048] 试剂灵敏度是根据最低
检测限(Limit of Blank,LOB)来确定的，最低检测限按下述实验方法进行。检测零浓度校准品20次，得到20次测定结果的信号值(RLU)，计算其平均值M和标准差SD，得出M+2SD所对应的RLU值，根据零浓度校准品与相邻浓度校准品(0.2ng/mL)之间的浓度-RLU均值结果进行两点回归拟合得出一次方程，将M+2SD所对应的RLU值带入上述方程中，计算得出对应的浓度，即LOB。
[0049] 以下表1中的测定结果显示，按上述方法检测试剂LOB为0.010ng/mL，根据此结果确定试剂灵敏度可达到0.02ng/mL以下。
[0050] 表1本发明试剂盒的灵敏度测定结果
[0051]
[0052] 2)本发明试剂盒的重复性的研究
[0053] 检测抗AChE抗体浓度为0.294ng/mL、3.473ng/mL两个浓度的样本，每个样本检测10次，分别计算每个样本的变异系数(CV)，结果表明该试剂盒变异系数CV均小于5％。
[0054] 表2本发明试剂盒的重复测定结果
[0055]
[0056] 3)本发明试剂盒的准确度测定结果
[0057] 由于该指标目前尚未有国家或国际标准品，采用第三方外购标准品对试剂盒的准确度进行测定。检测浓度为0.5ng/mL、2ng/mL、10ng/mL三个浓度的AChE-Ab标准品，分别计算检测值与理论值的偏差，结果表明该试剂盒检测标准品偏差均小于5％。
[0058] 表3本发明试剂盒的准确度测定结果
[0059]
[0060] 应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的
权利要求。
[0061] 本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
[0062] 参考文献
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[0065] [3]S.Brimijoin,M.Balm,P.Hammond,V.A.Lennon.Selective Complexing of Acetylcholinesterase in Brain by Intravenously Administered Monoclonal Antibody[J].Journal of Neurochemistry.1990,54(1):236-241.
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