技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物发酵领域，尤其涉及一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法。
背景技术
[0002] 微生物作为在
生物防治制剂中的一种或几种活性成分，在作物病和虫害防治中发挥着减少或取代化学
农药的重要作用。在已经商业化生产和广泛使用的生防制剂中，由于许多生防
真菌具有广谱的生防作用、产量高、
货架期长等特性，已成为当今除芽孢杆菌外，运用最为广泛的生防制剂，例如木霉菌(Trichoderma spp.)、白僵菌(Beauveria spp.)、绿僵菌(Metarhizum spp.)等。
[0003] 木霉菌是使用最广泛的一种微生物
杀菌剂，其可以通过
重寄生、营养竞争、细胞壁降解酶类的降解作用、诱导
植物抗性或者产生
次级代谢产物等多种途径防治植物的根部和叶部病害。木霉菌还能影响根系微生物菌群的变化，提高养分的吸收，稳定
土壤养分，促进根系发育，增加根毛形成。木霉菌在自然界的生长、繁殖和传播主要是通过3种菌体形态进行：菌丝，分生孢子和厚垣孢子。在木霉菌制剂的工业化生产过程中，由于菌丝在脱
水干燥时容易失活，而木霉菌的分生孢子或厚垣孢子对外界更加具有耐受性，因此被选用为木霉菌生防制剂的主要活性成分(Churchill 1982，Harman et al.,1991；Jin et al.,1991)。目前，生防真菌孢子的产业化生产主要是通过液体或固体发酵获得的(Churchill 1982)。，通过分析影响发酵和后处理工序的各种条件，最大限度的提高孢子产量，是提高木霉菌制剂产业化生产能
力的重要策略(Cascino et al.1990)。本发明拟提供一种提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法。
发明内容
[0004] 本发明为解决
现有技术中的上述问题提出一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法，可操作性强，成本低廉，便于规模化生产应用。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
[0006] 本发明的第一个方面是提供一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法，包括如下步骤：
[0007] 步骤一，将木霉菌孢子液接种于液体
种子培养基中，并给0.5-250μmol·m-2·s-1的光照对所述孢子液进行光照诱导培养15-55小时；
[0008] 步骤二，将步骤一诱导培养后得到的种子液接种于发酵产酶培养基中，并给与0.5-250μmol·m-2·s-1的光照对种子液进行光照诱导发酵培养4-7天。
[0009] 进一步地，光照的方式包括持续、光/暗交替或间隔短时光照中的一种或几种组合。
[0010] 进一步地，步骤一中的光照诱导培养时间为18-48小时。
[0011] 进一步地，步骤二中的光照诱导发酵培养的时间为5-6天。
[0012] 进一步地，光照采用的光为自然光、白光或蓝光。
[0013] 进一步地，步骤一中木霉菌包括绿色木霉菌、长枝木霉菌、拟康宁木霉菌、橘绿木霉菌中的一种或几种。
[0014] 进一步地，步骤一中液体种子培养基包括土豆粉和
葡萄糖。
[0015] 进一步地，以体积比计算，步骤二中种子液按5％-10％接种量接种于发酵产孢培养基。
[0016] 进一步地，发酵培养基包括1-2.5％氮源、1-3％
碳源和0.1-0.5％
氨基酸。
[0017] 进一步地，碳源包括葡萄糖、可溶性
淀粉、麦芽糊精、
蔗糖一种或几种。
[0018] 进一步地，氮源包括土豆粉、
酵母粉、蚕豆粉、黄豆粉一种或几种。
[0019] 进一步地，步骤二中发酵培养的
温度为25-37℃。
[0020] 本发明采用上述技术方案，与现有技术相比，具有如下技术效果：
[0021] 本发明提供的利用光照诱导提高木霉菌孢子产量的方法，以持续、光/暗交替或间隔短时光照中的一种或几种组合光照方式对木霉进行0.5-250μmol·m-2·s-1的光强进行光照诱导液体培养，进而得到大量液生分生孢子，提高了木霉菌制剂产业化生产能力，且可操作性强，成本低廉，便于规模化生产应用。
附图说明
[0022] 图1为本发明一
实施例中长枝木霉菌光照培养产孢曲线图；
[0023] 图2为本发明一实施例中深绿木霉(T.atroviride,Tr775,CGMCC7.281)培养产孢曲线；
[0024] 图3为本发明一实施例中拟康宁木霉(T.pseudokoningii,Tr25,CGMCC7.284)培养产孢曲线图；
[0025] 图4为本发明一实施例中橘绿木霉(T.citrinoviride,Tr673,CGMCC N0.8723)光照培养产孢曲线。
具体实施方式
[0026] 本发明提供了一种利用光照诱导提高液体发酵木霉菌分生孢子产量的方法，以持续、光/暗交替或间隔短时光照中的一种或几种组合光照方式对木霉进行0.5-250μmol·m-2·s-1的光强进行光照诱导液体培养，进而得到大量液生分生孢子。
[0027] 下面通过具体实施例对本发明进行详细和具体的介绍，以使更好的理解本发明，但是下述实施例并不限制本发明范围。
[0028] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化
试剂。
[0029] 实施例一
[0030] 本实施例选用长枝木霉(T.longibrachiatum，TL02，CGMCC7.280)为生产菌种，培养过程包括如下步骤：
[0031] 1.种子
发酵罐中投入750g土豆粉，500g葡萄糖后混匀，加水定容至50L，121℃灭菌20min，冷却到30℃。
[0032] 2.刮取平板上活化好的孢子置于500ml无菌含0.1％吐温溶液的补料瓶中，振荡分散成孢子悬液作为种子液。通过血球计数法计数，刮入孢子使种子液浓度达到2×107个/ml，种子悬浮液经火焰口无菌接入种子发酵罐内。
[0033] 3.种子发酵罐开启罐内蓝光
光源，给予0.5-250μmol·m-2·s-1的光照，30℃，220rpm无菌空气40L/min，220rpm培养38小时。
[0034] 4.配制500L发酵培养基，称取土豆粉7500g、葡萄糖10000g、氨基酸1000g用水调匀，加入到750L发酵罐内，定容到450L。121℃灭菌20min，冷却到30℃。
[0035] 5.通过无菌移种管道将50L种子培养液接种到750L发酵罐。
[0036] 6.发酵罐开启罐内蓝光光源，给予0.5-250μmol·m-2·s-1的光照，30℃，120rpm无菌空气300L/min，培养96小时。
[0037] 7.
收获孢子液，通过血球计数法计算孢子浓度，并测定培养基中还原糖、孢子量和生物量。
[0038] 孢子的终浓度达到1.5亿个/ml，由图1可知，培养基中的还原糖终量降低了将近50％，孢子量增加显著。
[0039] 实施例二
[0040] 本实施例选用深绿木霉(T.atroviride，Tr775，CGMCC7.281)为生产菌种，设置不同的培养条件验证持续蓝光光照对孢子产量的影响，培养过程包括如下步骤：
[0041] 1.A、B两个75L种子发酵罐中分别投入750g土豆粉，500g葡萄糖，150g氨基酸后混匀，加水定容至50L，121℃灭菌20min，冷却到30℃。
[0042] 2.刮取平板上活化好的孢子置于500ml无菌含0.1％吐温溶液的补料瓶中，振荡分散成孢子悬液作为种子液。通过血球计数法计数，刮入孢子使种子液浓度达到2×107个/ml。种子悬浮液经火焰口无菌接入A、B两个发酵罐内。
[0043] 3.A发酵罐开启罐内蓝光光源，给予0.5-250μmol·m-2·s-1的光照，30℃，220rpm无菌空气40L/min，220rpm培养96小时；
[0044] B发酵罐不开启罐内蓝光光源，同时用
锡箔纸封闭发酵罐视镜，完全避光培养：30℃，220rpm无菌空气40L/min，220rpm培养96小时。
[0045] 4.收获孢子液，通过血球计数法测定发酵液孢子浓度。
[0046] 由图2可知，A罐分生孢子产量大幅度高于B罐分生孢子产量，说明进行持续蓝光光照可以提高真菌液体发酵孢子产量。
[0047] 实施例3
[0048] 本实施例选用深拟康宁木霉(T.pseudokoningii，Tr25，CGMCC7.284)为生产菌种，设置不同的培养条件验证以光/暗交替方式进行蓝光光照对孢子产量的影响，培养过程包括如下步骤：
[0049] 1.A、B两个75L种子发酵罐中分别投入750g土豆粉，500g葡萄糖，150g氨基酸后混匀，加水定容至50L，121℃灭菌20min，冷却到30℃。
[0050] 2.刮取平板上活化好的孢子置于500ml无菌的含0.1％吐温溶液的补料瓶中，振荡分散成孢子悬液作为种子液。通过血球计数法计数，刮入孢子使种子液浓度达到2×107个/ml。种子悬浮液经火焰口无菌接入A、B两个发酵罐内。
[0051] 3.A发酵罐开启罐内蓝光光源，12小时光照-12小时黑暗-12小时光照-12小时黑暗间隔交替给予0.5-250μmol·m-2·s-1的光照，30℃，220rpm无菌空气40L/min，220rpm培养96小时；
[0052] B发酵罐不开启罐内蓝光光源，同时用锡箔纸封闭发酵罐视镜，完全避光培养：30℃，220rpm无菌空气40L/min，220rpm培养96小时。
[0053] 4.收获孢子液，通过血球计数法测定发酵液孢子浓度。
[0054] 由图3可知，A罐分生孢子产量大幅度高于B罐分生孢子产量，以光/暗交替方式进行蓝光光照可以提高真菌液体发酵孢子产量。
[0055] 实施例4
[0056] 本实施例选用橘绿木霉(T.citrinoviride，Tr673，CGMCC N0.8723)为生产菌种，观察光/暗交替光照方式对橘绿木霉分生孢子产量的影响，培养过程包括如下步骤：
[0057] 1.75L种子发酵罐中投入750g土豆粉，500g葡萄糖后混匀，加水定容至50L，121℃灭菌20min，冷却到30℃。
[0058] 2.刮取平板上活化好的孢子置于500ml无菌的含0.1％吐温溶液的补料瓶中，振荡分散成孢子悬液作为种子液。通过血球计数法计数，刮入孢子使种子液浓度达到2×107个/ml。种子悬浮液经火焰口无菌接入种子发酵罐内。
[0059] 3.种子发酵罐开启罐内蓝光光源，给予6小时光照-6小时黑暗-6小时光照-6小时-2 -1黑暗交替(光照强度0.5-250μmol·m ·s )，30℃，220rpm无菌空气40L/min，220rpm培养
38小时。
[0060] 4.配制500L发酵培养基，称取土豆粉7500g、葡萄糖10000g、氨基酸1000g用水调匀，加入到750L发酵罐内，定容到450L。121℃灭菌20min，冷却到30℃。
[0061] 5.通过无菌移种管道将50L种子培养液接种到750L发酵罐。
[0062] 6.发酵罐开启罐内蓝光光源，给予12小时0.5-250μmol·m-2·s-1的光照-12小时黑暗-12小时0.5-250μmol·m-2·s-1的光照-12小时黑暗间隔的交替，30℃，130rpm无菌空气350L/min，培养96小时。
[0063] 7.收获孢子液，通过血球计数法，平皿梯度稀释法测定发酵液孢子浓度。
[0064] 测的孢子浓度超过2.1亿个/ml，由图4可知，培养基中的还原糖终量降低了将近60％，孢子量增加显著。
[0065] 由上述实施例可知，本发明通过光照可大幅度诱导提高木霉菌孢子产量，且可操作性强，成本低廉，便于规模化生产应用。
[0066] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同
修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
