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奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位的疫苗及其制备方法和应用

阅读：296发布：2024-01-09

专利汇可以提供奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位的疫苗及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位的疫苗及其制备方法和应用。该疫苗包含PVL‑S蛋白与药学上可接受的佐剂、或PVL‑F蛋白与药学上可接受的佐剂；其制备方法包括以下步骤：(1)金黄色葡萄球菌PVL‑S蛋白或PVL‑F蛋白的克隆；(2)重组PVL‑S蛋白或PVL‑F蛋白的表达与纯化；(3)将重组PVL‑S蛋白或PVL‑F蛋白与ISA 201 VG混合乳化得到重组亚单位疫苗。该疫苗不含有核酸，不会导致同源重组和自身毒力返强等潜在危险；能诱发机体产生特异性抗体，可促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，因此该疫苗更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉，且省时省力。，下面是奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位的疫苗及其制备方法和应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位的疫苗，其特征在于：所述疫苗包括PVL-S蛋白与药学上可接受的佐剂、或PVL-F蛋白与药学上可接受的佐剂。
2.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述PVL-S蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述PVL-F蛋白的编码基因如SEQ ID NO.2所示。
4.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗中每头份含PVL-S蛋白为100μg、或所述疫苗中每头份含PVL-F蛋白为100μg。
5.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于，所述药学上可接受的佐剂为ISA 201 VG佐剂。
6.根据权利要求1～5任一所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗还含有防腐剂。
7.根据权利要求6所述的疫苗，其特征在于，所述防腐剂为硫柳汞，所述硫柳汞的浓度为2μg/ml。
8.一种制备如权利要求1～7任一所述疫苗的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)金黄色葡萄球菌PVL-S蛋白或PVL-F蛋白的克隆；
(2)重组PVL-S蛋白或PVL-F蛋白的表达与纯化；
(3)将重组PVL-S蛋白或PVL-F蛋白与佐剂ISA 201 VG混合乳化得到重组亚单位疫苗，其中，重组PVL-S蛋白或PVL-F蛋白与佐剂ISA 201 VG体积比为46:55。
9.一种根据权利要求1～7任一权利要求所述的重组PVL-S蛋白、PVL-F蛋白在制备奶牛金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。
10.一种根据权利要求1-7任一权利要求所述的亚单位疫苗在制备用于预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的药物中的应用。

说明书全文

奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位的疫苗及其制备方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗及其制备方法和应用。属于兽用疫苗技术领域。

背景技术

[0002] 奶牛乳房炎(Mastitis)是成年奶牛最普遍的感染性疾病之一，主要是奶牛乳腺组织受到微生物感染后而引起的一种炎症，多发生于产后哺乳期，该病广泛存在于世界各地，为奶牛常见病、多发病，是造成乳制品业经济损失最为严重的疾病之一。引起奶牛乳房炎的病原微生物大约有150多种，主要以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌为主，这三种细菌引起的奶牛乳房炎占总发病率的90％以上，其中尤以金黄色葡萄球菌为最。

[0003] 当前奶牛乳房炎的治疗主要是抗生素治疗。抗生素用于治疗奶牛乳房炎已有50多年的历史，其在奶牛乳房炎的防治中起了一定的作用，但由于长期单一的、大剂量、不科学使用抗生素，造成了敏感性细菌消除，耐药性细菌逐渐占了主流，尤其是金黄色葡萄球菌的耐药问题日益严重，导致了抗生素治疗收效甚微；另一方面，随着生活水平的提高，牛奶中抗生素残留是一个非常严重的健康问题。

[0004] 用疫苗防治奶牛乳房炎具有很好的前景，首先，疫苗可以预防奶牛感染病原菌而引起乳房炎；其次，疫苗有助于降低乳腺感染的严重程度，控制亚临床型乳房炎；第三，使用疫苗防治乳房炎不会存在乳汁中抗生素残留问题；最后是操作简便，费用低廉。当前，研制成功的疫苗很少，且大都数为弱毒活菌苗或灭活菌苗，在生产实践中，对乳房炎的防治有一定作用，然而随着大规模集约化养殖的发展，人工致弱菌株存在着同源重组、自身毒力返强等潜在可能，而灭活疫苗也存在使用剂量大、灭活不彻底等不足，为提高传统疫苗的安全性与免疫保护力，高效、廉价的新型疫苗研制极为重要。

[0005] 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,简称SA)，也称“金葡菌”，是一种革兰氏染色阳性的球菌，直径0.8μm，在显微镜下排列成葡萄串状，并可以产生金黄色的色素，因此而得名。金葡菌是引起慢性/隐性奶牛乳房炎的主要病原菌之一，可以极大的影响牛奶的产量和质量，给奶制品产业带来巨大的经济损失。

[0006] Panton-valentine杀白细胞素(panton-valentine leukocidin，PVL)是由金黄色葡萄球菌产生的细胞外毒素之一，也是其主要的致病因子之一。 PVL由Van deleld于1894年首先发现，并在1932年由Panton and Valentine将其从溶血素中分离出来。PVL由两种蛋白质组成，即PVL-S 蛋白和PVL-F蛋白(LukS-PVT，LukF-PV)，其分子量分别为34kDa和
33kDa，且F蛋白和S蛋白之间的氨基酸序列同源性有36％。PVL属于膜钻孔毒素家族，能诱导PMNs坏死或调亡，首先是LukS-PV与 PMNs细胞膜上的特异性高亲和力的受体结合，其次LukF-PV与之结合形成二聚体，再依次LukS-PV和LukF-PV结台，最后形成一个环状结构的杂聚体。此杂聚体内径为3nm，外径为9nm，分子量大约200 kDa，其中所含的LukS-PV和LukF-PV的分子比为1:1，此环状结构的杂聚体插入在PMNs细胞膜上，形成一个直径大约2nm的膜穿孔，其他的PVL分子通过该孔进入细胞，并在线粒体外膜上建立孔道，从而破坏线粒体的内环境，并激活caspase 9、caspase 3和释放杀白细胞素 C，诱导细胞调亡。因此，PVL是金葡菌亚单位疫苗的重要候选蛋白之一，但是当PVL-S和PVL-F都存在时，可能会造成细胞毒性，本实验室对其做了小鼠安全性实验，结果与预期相同，在免疫同时含有PVL-S 蛋白和PVL-F蛋白的疫苗时，小鼠在免疫后3-4天就死亡，但是仅免疫相同剂量的PVL-S蛋白或PVL-F蛋白，在免疫后跟踪的14天内，小鼠都正常，未出现任何异常，所以，在亚单位疫苗的选择时，仅能选择其中一种蛋白作为亚单位疫苗的候选蛋白。

发明内容

[0007] 本发明要解决的技术问题：一是提供一种新型的奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位疫苗及其制备方法；二是克服活疫苗存在的同源重组、自身毒力返强等潜在可能；三是克服灭活疫苗使用剂量大和可能存在的灭活不彻底导致的同源重组等问题。

[0008] 本发明提供了一种新型的奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位疫苗，该疫苗包括PVL-S蛋白(即金黄色葡萄球菌PVL-S蛋白)与药学上可接受的佐剂、或PVL-F蛋白(即金黄色葡萄球菌PVL-F蛋白)与药学上可接受的佐剂。

[0009] 本发明的技术方案中，优选地，所述PVL-S蛋白的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

[0010] 本发明的技术方案中，优选地，所述PVL-S蛋白为蛋白质(a1) 或蛋白质(b1)：蛋白质(a1)由SEQ ID NO.3所示的氨基酸组成的蛋白质；蛋白质(b1)在蛋白质(a1)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有PVL-S蛋白抗原性的由蛋白质 (a1)衍生的蛋白质。

[0011] 本发明的技术方案中，优选地，PVL-F蛋白编码基因如SEQ ID NO.2所示。

[0012] 本发明的技术方案中，优选地，所述PVL-F蛋白为蛋白质(a2) 或蛋白质(b2)：蛋白质(a2)由SEQ ID NO.4所示的氨基酸组成的蛋白质；蛋白质(b2)在蛋白质(a2)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个氨基酸或几个氨基酸且具有PVL-F蛋白抗原性的由蛋白质 (a2)衍生的蛋白质。

[0013] 本发明的技术方案中，优选地，所述的疫苗中每头份含PVL-S蛋白为100μg、或疫苗中每头份含PVL-F蛋白为100μg。

[0014] 本发明的技术方案中，优选地，所述药学上可接受的佐剂为ISA 201 VG佐剂。

[0015] 本发明的技术方案中，优选地，所述疫苗中还含有防腐剂，所述防腐剂为硫柳汞，所述硫柳汞的浓度为2μg/ml。

[0016] 本发明还提供了一种制备奶牛金黄色葡萄球菌亚单位疫苗的方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)金黄色葡萄球菌PVL-S蛋白或 PVL-F蛋白的克隆；(2)重组PVL-S蛋白或PVL-F蛋白的表达与纯化； (3)将重组PVL-S蛋白或PVL-F蛋白与ISA 201 VG混合乳化得到重组亚单位疫苗，其中，重组PVL-S蛋白或PVL-F蛋白与佐剂ISA 201 VG 体积比为46:55。

[0017] 本发明再提供了一种重组PVL-S蛋白、PVL-F蛋白在制备奶牛金黄色葡萄球菌重组亚单位疫苗及相关诊断试剂中的应用。本发明又提供了一种亚单位疫苗在制备用于预防或治疗奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎的药物中的应用。

[0018] 与现有技术相比，本发明提供了一种新型的奶牛金黄色葡萄球菌乳房炎亚单位疫苗及其制备方法和应用。该亚单位疫苗不含有核酸，不会导致同源重组和自身毒力返强等潜在危险；能诱发机体产生特异性抗体，可促进细胞免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，因此该疫苗更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉，且省时省力。

[0019] 与现有技术相比，本发明的小鼠免疫攻毒实验结果显示，无论是 PVL-S蛋白还是PVL-F蛋白制备的亚单位疫苗在免疫效果方面相当，且不存在安全性问题，相对于其他的毒素(如α-溶血素和β-溶血素) 在制备亚单位疫苗时，不需要预先对蛋白进行灭活处理或对编码基因进行突变处理就能直接制备亚单位疫苗，省时、省力、节约成本。附图说明

[0020] 图1表示琼脂糖凝胶电泳PCR扩增PVL-F，PVL-S结果。PVL-F 基因PCR结果，大小约为906bp；PVL-S基因基因PCR结果，大小约为849bp；M：DNA分子量标准DL2,000。

[0021] 图2表示pET28a-PVL-F，PVL-S酶切验证结果。pET28a-PVL-F：质粒pET28a-PVL-F XhoI和Nde I酶切鉴定结果，酶切片段大小为 5,369bp和904bp；pET28a-PVL-S：质粒pET28a-PVL-F XhoI和Nde I 酶切鉴定结果，酶切片段大小为5,369bp和849bp；M：DNA分子量标准DL5,000。

[0022] 图3表示PVL-F蛋白和PVL-S蛋白纯化结果。

[0023] 图4表示免疫后抗体效价检测结果。

[0024] 图5表示免疫后攻毒实验结果。

具体实施方式

[0025] 以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。

[0026] 本发明试剂及药品的来源列单如下：

[0027] 化学试剂和生物试剂全部为市售产品；

[0028] 防腐剂硫柳汞购自Life Sciences；

[0029] ISA 201 VG购自法国赛比克公司。

[0030] 实施例1：表达载体pET28a-PVL-S和pET28a-PVL-F-的构建(两种载体构建方法相同)

[0031] 以临床分离到的奶牛金黄色葡萄球菌基因组为模板，进行PCR，引物如下表所示，结果如图1所示：PVL-F基因PCR结果，大小约为906 bp；PVL-S基因基因PCR结果，大小约为849bp；都与预期大小一致。

[0032]

[0033]

[0034] 1.1加样体系为(50μl):

[0035]

[0036] 1.2PCR扩增程序:

[0037]

[0038] 1.3胶回收DNA片段:

[0039] (1)将步骤1.2的反应液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(110V 30 min)；

[0040] (2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5ml EP管中；

[0041] (3)向步骤(2)中的1.5ml EP管中加入500μl PC buffer，50℃，水浴10min；

[0042] (4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000 rpm，30s；

[0043] (5)弃废液，向吸附柱中心加入600μl PW buffer，静置3min，12,000rpm，30s；

[0044] (6)重复步骤(5)；

[0045] (7)空吸附柱离心，12,000rpm，1min；

[0046] (8)向吸附柱中心加入30μl ddH2O，静置3min，离心(12,000rpm， 2min)；

[0047] (9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。

[0048] 1.4双酶切反应(50μl体系)：

[0049]

[0050] 在1.5ml EP管中按照上述体系进行加样、混匀，而后将这两个 50μl反应液置于37℃恒温水浴锅中，水浴3h。

[0051] 1.5胶回收DNA片段：

[0052] (1)将步骤1.4的反应液进行0.8％琼脂糖凝胶电泳(110V 30 min)；

[0053] (2)在紫外灯下，切胶回收DNA片段于1.5ml EP管中；

[0054] (3)向步骤(2)中的1.5ml EP管中加入500μl PC buffer，50℃，水浴10min；

[0055] (4)将步骤(3)中溶液移至吸附柱中心，静置2min，离心，12,000 rpm，30s；

[0056] (5)弃废液，向吸附柱中心加入600μl PW buffer，静置3min，12,000rpm，30s；

[0057] (6)重复步骤(5)；

[0058] (7)空吸附柱离心，12,000rpm，1min；

[0059] (8)向吸附柱中心加入30μl ddH2O，静置3min，离心(12,000rpm， 2min)；

[0060] (9)收集步骤(8)DNA样品进行电泳。

[0061] 1.6连接反应(10μl体系)：

[0062]

[0063] 在1.5ml EP管中按照上述体系进行加样、混匀，而后将上述反应液置于16℃，水浴16h后取出，65℃，水浴15min后进行灭活，将样品4℃保存。

[0064] 1.7转化实验：

[0065] (1)取出步骤1.6的连接反应液，向其中添加100μl E.coli DH5α 感受态细胞，混匀；

[0066] (2)冰浴30min；

[0067] (3)42℃，水浴100s；

[0068] (4)冰浴2min；

[0069] (5)取出，向EP管中加入600μl液体LB培养基，37℃，水浴1 h；

[0070] (6)取出样品管，离心(8,000rpm，2min)，去掉600μl，剩余 100μl LB重悬菌体；

[0071] (7)取菌液铺板于LK平板中(Kan浓度为50μg/ml)，将LK平板置于生化恒温培养箱中，37℃培养12h。

[0072] 1.8重组质粒提取及酶切鉴定：

[0073] (1)从转化平板中挑取单克隆至3ml LK液体培养基中，37℃， 260rpm摇菌过夜；

[0074] (2)取1ml菌液至1.5ml EP管中，离心(12,000rpm，2min)，弃上清；

[0075] (3)向步骤(2)中的EP管中加入250μl P1 buffer，重悬菌体；

[0076] (4)向步骤(3)溶液中加入250μl P2 buffer，温和混匀，静置2 min；

[0077] (5)向步骤(4)溶液中加入350μl P3 buffer，温和混匀；

[0078] (6)将步骤(5)溶液，离心(12,000rpm，10min)；

[0079] (7)将步骤(6)中的上清溶液移至吸附柱中心，离心(8,000g， 30s)；

[0080] (8)弃废液，向吸附柱中心加入500μl wash buffer，离心(9,000 g，30s)；

[0081] (9)重复步骤(8)；

[0082] (10)空吸附柱离心(9,000g，1min)；

[0083] (11)向吸附柱加入30μl Elution buffer，静置2min，离心(12,000 rpm，2min)；

[0084] (12)收集步骤(11)DNA样品进行电泳；

[0085] (13)如步骤1.4所示，对提取到的质粒进行酶切鉴定，而后进行 0.8％琼脂糖凝胶电泳。

[0086] (14)重组质粒酶切鉴定结果如图2所示：：pET28a-PVL-F：质粒 pET28a-PVL-F XhoI和Nde I酶切鉴定结果，酶切片段大小为5,369bp 和904bp；pET28a-PVL-S：质粒pET28a-PVL-F XhoI和Nde I酶切鉴定结果，酶切片段大小为5,369bp和849bp。

[0087] 实施例2：转化大肠杆菌BL21

[0088] 吸取1μl质粒加入100μl BL21感受态细胞中，冰浴30min；

[0089] 42℃热激90s；

[0090] 冰浴2min；

[0091] 在超净台内加入900μl无抗性的LB培养液；

[0092] 37℃180rpm摇1h；

[0093] 吸取100μl菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养。

[0094] 实施例3：大量诱导表达

[0095] 挑菌：挑取单克隆至50ml卡那抗性LB培养液中，37℃过夜培养；

[0096] 转接：按1:100比例转接菌液至500ml卡那抗性LB培养液，共摇 3.5L，37℃220rpm培养2-2.5h至OD600值到0.6；

[0097] 诱导：菌液OD600值到0.6后，加入500μl IPTG(1M)至IPTG 终浓度为1mmol/L,37℃220rpm诱导培养4h；

[0098] 菌体收集：菌液6,000rpm离心10min，收集菌体；用40ml PBS 清洗菌体，6,000rpm离心10min，收集菌体，置于-20℃保存；

[0099] 实施例4：PVL-S蛋白或PVL-F蛋白纯化(两种蛋白纯化过程相同)

[0100] (1)菌体破碎：向实施例3中的得到的菌体中加入裂解液(8ml/g 湿重)(50mM NaH2PO4(pH 8.0)，500mM NaCl，20mM咪唑；使用0.8μm的滤膜过滤)，用50mL注射器吹打均匀至无颗粒状菌块；将菌体样品倒入到细胞均质仪样品槽中，出样口用烧杯准备收集样品；以样品的90％流出出样口为一个循环，一个循环完成后，将出样口烧杯收集的样品倒回样品槽，继续重复5个循环。

[0101] (2)将步骤(1)中破碎完全的样品分装到250mL Beckman离心管中，12,000rpm，4℃离心30min，上清样品过0.8μm膜后作为上样样品，预留80μL样品用于SDS-PAGE检测；

[0102] (3)柱平衡：用超纯水平衡2～3柱体积(CV)，排出20％的乙醇保存液；然后用裂解液平衡2～3柱体积(CV)，5mL/min。控制压力小于0.5MPa。

[0103] (4)上样：2mL/min进行上样，收集流穿液(Flowthrough)，取 80μL用于SDS-PAGE检测。

[0104] (5)冲洗1：用清洗缓冲液组分1(washing buffer 1：50mM NaH2PO4 (pH 7.4)，500mM NaCl，20mM咪唑，0.1％TritonX-114，使用0.8μm 的滤膜过滤)洗柱，5mL/min，冲洗80个柱体积。

[0105] (6)冲洗2：用10倍柱体积(CV)的洗脱缓冲液组分1(elution buffer 1：50mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，使用0.8μm的滤膜过滤)洗柱，减少Triton X-114的残留。

[0106] (7)洗脱：50％洗脱缓冲液组分2(50％Elution buffer 2：50mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，250mM咪唑，使用0.8μm的滤膜过滤)洗脱目的蛋白，至基线洗平，速度5ml/min,收集，混合后取 80μL用于SDS-PAGE分析；100％脱缓冲液2组分清洗柱子(100％ Elution buffer 2：50mM NaH2PO4(pH 7.4)，500mM NaCl，500mM咪唑，使用0.8μm的滤膜过滤)，至基线洗平，5mL/min,收集，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析。

[0107] (8)HiPrep Desalting脱盐柱柱平衡：用超纯水平衡2～3柱体积 (CV)，排出20％的乙醇保存液；然后用洗脱缓冲液组分1平衡3-4 柱体积(CV)，速度10mL/min。

[0108] (9)上样：速度10mL/min进行注入(inject)，最大注入(inject) 量为13mL。

[0109] (10)收集：停止上样后，进入load模式，10mL/min，UV上升至1mAU开始收集，即蛋白样品开始出峰，10ml/管收集，待UV降至5mAU以下，停止收集。

[0110] (11)平衡：流速10ml/min，平衡2-3CV。

[0111] (12)循环7.10～7.12，直至上样完成。

[0112] (13)除菌过滤：收集的蛋白溶液在4℃，12,000rpm离心15min，收集上清，移至生物安全柜，过0.2μm蛋白结合率低的针头滤器，过滤后置于-80℃冰箱保存。

[0113] (14)纯化结果如图3所示：纯化后的PVL-S蛋白和PVL-F蛋白的纯度均能达到90％以上；经过计算，在没有优化发酵培养的情况下， PVL-S蛋白和PVL-F蛋白的表达量均能达到500mg/L以上。

[0114] 实施例5：疫苗制备(1ml/头份)

[0115] (1)按照实验需要，计算疫苗溶液各成分的量，使疫苗中重组 PVL-S蛋白或PVL-F蛋白终浓度均为100μg/ml，使疫苗中硫柳汞的终浓度为2μg/ml，再将称量好的重组蛋白与称量好的硫柳汞混合作为水相，根据水相与佐剂ISA 201 VG体积比为46:55，量取佐剂；

[0116] (2)将量好的水相和佐剂放置在恒温水浴锅内加热至32℃±1℃，待温度稳定后将抗原加入到佐剂管中，震荡器震荡10min进行预乳化；

[0117] (3)将预乳化完的疫苗放置于盛满冰的烧杯中，固定在预先处理好的超声波细胞破碎仪上进行乳化；

[0118] (4)乳化结束后，观察乳化效果：取部分疫苗置于离心管中，3,000 rpm离心15min，疫苗不分层为合格；

[0119] (5)检测合格的疫苗分装到15ml离心管中，标记，封口膜封口，置于4℃保存。

[0120] 实施例6：小鼠免疫攻毒实验

[0121] 6.1免疫实验

[0122] (1)将疫苗拿到室温(25℃)放置2h左右，使疫苗温度恢复到常温；

[0123] (2)给小鼠称重、分组并标记，两组为免疫试验组(每组10只小鼠)，分别免疫PVL-S亚单位疫苗和PVL-F亚单位疫苗；另一组为对照组(n＝10)，免疫PBS，并记录数值；

[0124] (3)用1ml注射器吸取1ml疫苗，注意将气泡排尽；然后用75％酒精棉球给后腿肌肉消毒，在肌肉块中部进针，左右后腿各注射50μl 疫苗；

[0125] (4)在一免后14天进行二免，二免后7天进行三免，并在一免前、二免前、三免前及三免后14天采集血清，检测抗体效价。

[0126] (5)效价检测结果如图4所示：将检测后的抗体效价结果整合到一张图中，二免后2组免疫组相对抗体效价均能达到12,800以上，三免后2组免疫组相对抗体效价均能达到
80,000以上；无论是二免后还是三免后，PVL-S免疫组的抗体效价均高于PVL-F免疫组的抗体效价，这也与攻毒结果相对应。

[0127] 6.2攻毒实验(三免后14天进行攻毒)

[0128] (1)挑取SA单菌落(菌株为本实验室保存的CQ339菌株)于5 ml液体肉汤培养基中中，220rpm、37℃摇菌过夜；

[0129] (2)按百分之一的体积(1ml)将摇过夜的细菌接种于100ml新鲜液体肉汤培养基中，220rpm、37℃摇菌过夜；

[0130] (3)将100ml菌液装入到500ml离心瓶中，8,000rpm离心10min，吸去培养基，菌体用100ml PBS重悬，重复上述步骤3次，最后将所有的菌体用5ml PBS重悬混匀；

[0131] (4)将菌液做10,000倍稀释后计数。根据菌液的浓度，将原菌液稀释到1.5×108CFU/ml(2M LD50)；

[0132] (5)给2组免疫组和对照组小鼠称重，一组免疫PVL-S蛋白试验组(n＝10)，另一组免疫PVL-F蛋白试验组(n＝10)；最后一组为对照组(n＝10)记录数值；

[0133] (6)用1ml注射器吸取菌液，按照各浓度细菌对应的小鼠进行尾静脉注射，注射量为200μl/20g小鼠。

[0134] (7)连续观察小鼠的生存状况，记录每一只小鼠的死亡时间：早中晚各检查一次。

[0135] (8)攻毒后小鼠存活率结果如图5所示：在观察的308h之内，对照组死亡8只，PVL-S免疫组死亡1只，PVL-F免疫组死亡2只，因此，对照组存活率只有20％，而2组免疫组存活率均高于80％，且 PVL-S免疫组较PVL-F免疫组存活率高10％。

[0136] 实施例7：ELISA抗体效价检测

[0137] (1)包被：用包被液(50mM 碳酸盐缓冲液，pH 9.5)稀释纯化的检测用蛋白(PVL-S蛋白或PVL-F蛋白)至0.5μg/ml，在酶标板上每孔加入100μl，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；

[0138] (2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，放入洗板机中洗涤，洗涤液用 PBST；

[0139] (3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后 37℃孵育2h；

[0140] (4)样品准备：按已知的信息和需要用量，用封闭液将血清进行适度稀释；

[0141] (5)洗涤：同(2)；

[0142] (6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育 1h；

[0143] (7)洗涤：同(2)；

[0144] (8)加二抗：每孔加入适度稀释的HRP标记的二抗100μl，37℃ 孵育0.5h；

[0145] (9)洗涤：同(2)；

[0146] (10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；

[0147] (11)终止：每孔加入50μl终止液(2M的H2SO4)，终止反应；

[0148] (12)检测：于450nm 波长测定样品OD值，分析数据；

[0149] (13)结果分析：判断抗体阳性的标准：P/N≥2.1，OD450≥0.1。

[0150] 本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。

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