一种高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种
甜味剂的方法
技术领域
[0001] 本
发明属于酒类检测分析技术领域，涉及一种人工合成甜味剂检测的方法，具体一 种高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种甜味剂的方法。
背景技术
[0002] 甜味剂作为一种
食品添加剂，在食品中适量添加可改善食品
风味，但人体长期大量摄入 人工甜味剂可能会导致高血糖、
葡萄糖耐受不良、肥胖等代谢系统性
疾病，易怒、抑郁、记 忆衰退、阿尔兹海默症等神经系统异常，甚至被报道，糖精钠、甜味剂等人工甜味剂具有遗 传毒性和致癌性。我国《
食品安全国家标准-食品添加剂使用标准》中对
安赛蜜、糖精钠、甜 蜜素、阿斯巴甜、纽甜、三氯
蔗糖等适用范围及添加限量都有明确规定，而酒类产品中，除 配制酒可限量添加糖精钠、甜蜜素，适量使用阿斯巴甜外，其他酒种不得使用甜味剂。
[0003]
[0004] 甜味剂的检测方法有多种，最常用的主要有液相色谱-紫外检测、液相色谱-
荧光检 测、离子交换色谱法、液相色谱-质谱法等，大部分方法只能单一的检测一种或两种甜 味剂，不仅耗费时间和人
力，而且像液相色谱-紫外检测法、液相色谱-荧光检测等所检 测到的结果，其精
密度已经不足达到严管监控的目的，再者这些方法已经不能很好的满 足国家有关部
门对6种甜味剂的检测要求。公布号为CN104634895A中国发明
专利公 开了一种超高液相色谱-三重四级杆
串联质谱仪同时检测白酒中六种甜味剂的方法，该 方法流动相为0.5～2mmol乙酸铵(0.1～0.3％乙酸)+甲醇，溶液配制较复杂；灵敏度 不够高，检出限(≥
10ng/mL)、定量限(≥20ng/mL)较高，检测时间相对较长；液相 部分采用超高效液相，与高效液相相比较，检测成本大大增加。所以，在不增加检测成 本的
基础上采用液质联用技术建立一种准确可靠、快速、灵敏度和精密度高，又同时可 检测多种甜味剂的方法显得尤为重要。
发明内容
[0005] 本发明提供一种高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种甜味剂的方 法。具体地，实现本发明目的的具体技术方案概况如下：高效液相色谱-质谱联用法同 时检测凤香型白酒中六种甜味剂的方法包括以下步骤：
[0006] a.分别称取糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜标准品各0.010g， 用超纯
水定容至100mL容量瓶，配制成0.1mg/mL的混合标准储备液，与-4℃
冰箱中储 存备用。
[0007] b.取步骤a中的1mL混合标准储备液用甲醇水溶液(V/V为20:80)定容至100mL 容量瓶，配置成1.00mg/L的标准中间液，再分别取25.00、10.00、5.00、2.50、1.00、 0.50、0.25mL标准中间液，用甲醇水溶液(V/V为20:80)定容至50mL容量瓶，配置 成浓度分别为
500μg/L、200μg/L、100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、5μg/L的标准 工作液，过0.22μm滤膜，待上机。
[0008] c.仪器参数条件设定
[0009] 该方法的质谱条件：在多级反应监测(MRM)扫描模式下，选择ESI负离子模式； 加热
块温度：450℃；DL温度：250℃；雾化气流速：3.0L/min；干燥气流速：10L/min； 驻留时间：40ms。
[0010] 该方法的液相条件：色谱柱：Shin-pack XR-ODSIII C18(2.0mmI.D*150mm L.,3.0μm)；
[0011] 进样量：10μL；
[0012] 流动相：A：0.1％
甲酸水溶液B：甲醇；
[0013] 柱温：45℃；
[0014] 洗脱方式为梯度洗脱：初始至3min时流动相A体积为100～50％，流动相B的体 积为0～50％；3.00～5.00min时流动相A体积为50～10％，流动相B的体积为50～90％； 6.50～6.51min时流动相A体积为10～100％，流动相B的体积为90～0％；6.51～7.00min 时流动相A体积占100％，流动相B的体积为0％。
[0015] d.检测离子的确定
[0016] 在c步骤中质谱参数已设定的条件下，不接色谱柱进样500μg/L的标准液1μL，确 定六种甜味剂的母离子；再进行产物离子优化，得到六种甜味剂的定性离子对和定量离 子对。
[0017] e.绘制标准曲线
[0018] 在步骤b的基础上，按照步骤c所设定的仪器参数，进标准样分析。以保留时间和 质荷比对分离出的组分进行定性分析，以各甜味剂的峰面积与其相对应的
质量浓度进行 线性回归，获得6种甜味剂的线性回归方程，各线性回归方程所对应的曲线，即为相应 甜味剂的标准曲线。
[0019] f.白酒样品的测试
[0020] 吸取10.00mL样品，60℃水浴加热，待酒样剩余量小于1mL时取出，用超纯水定 容至10mL，摇匀后过0.22μm滤膜，待分析。
[0021] 与
现有技术相比，本发明方法具有如下有益效果：
[0022] (1)本发明建立了高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种甜味剂 的方法，测定时间只需7min，很大程度提高了检测效率；且
检测限和定量限都较低， 仪器及方法的精密度高；方法简单快捷、准确可靠；
[0023] (2)本发明在液相部分采用的是高效液相，与超高液相相比较，降低了检测成本；
[0024] (3)本发明样品前处理是60℃水浴加热，既避免了酒精所造成的的基质效应，又 防止了阿斯巴甜受高温不稳定。
[0025] 本发明方法能准确的分离混合甜味剂，分别定性、定量安赛蜜、糖精钠、甜蜜素、 三氯蔗糖、阿斯巴甜、纽甜六种甜味剂，而且操作简单、快速、灵敏度高，方法检出限 低。本发明通过大量试验摸索了凤香型白酒中甜味剂混合物分离及检测的方法，最终以 10％甲酸-甲醇为流动相，采用梯度洗脱的方法成功将甜味剂混合物分离并进行定性和 定量，并严格进行方法验证，保证方法的科学严谨，满足了研发和生产的需求。
附图说明：
[0026] 图1为六种甜味剂混合标准样品的MRM色谱图。
[0027] 图2为安赛蜜的MRM色谱图和定量离子质谱图。
[0028] 图3为甜蜜素的MRM色谱图和定量离子质谱图。
[0029] 图4为糖精钠的MRM色谱图和定量离子质谱图。
[0030] 图5为阿斯巴甜的MRM色谱图和定量离子质谱图。
[0031] 图6为纽甜的MRM色谱图和定量离子质谱图。
[0032] 图7为三氯蔗糖的MRM色谱图和定量离子质谱图。
[0033] 图8为安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、纽甜、三氯蔗糖的标准校准曲线。
具体实施方式
[0034] 以下通过
实施例形式，对本发明涉及的对凤香型白酒中六种甜味剂的检测方法作进 一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例，凡基于 本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0035] 实施例
[0036]
一种高效液相色谱-质谱联用法同时检测凤香型白酒中六种甜味剂的方法，所用仪 器为高效液相色谱-质谱联用仪HPLC-MS。方法按照如下步骤进行：
[0038] 样品：成品酒，取自于陕西西凤酒股份有限公司。
[0039] 试剂：甲酸、甲醇、乙酸铵(分析纯)、超纯水。
[0040] 仪器设备：高效液相色谱串联质谱仪(岛津公司HPLC-20A高效液相色谱仪串联 LCMS-8045质谱仪)，万分天平(梅特勒-托利多公司)。
[0041] 标准品：安赛蜜(纯度≥99.4％，Dr.Ehrenstorfer公司)，糖精钠(纯度≥86.2％， Dr.Ehrenstorfer公司)，甜蜜素(纯度≥99.1％，Dr.Ehrenstorfer公司)，三氯蔗糖(纯 度≥99.7％，Dr.Ehrenstorfer公司)，阿斯巴甜(纯度≥97.7％，Dr.Ehrenstorfer公司)， 纽甜(纯度≥99.8％，安普公司)。
[0042] 1.2标准溶液的配制
[0043] 1.2.1标准储备液和工作液
[0044] 分别称取糖精钠、安赛蜜、甜蜜素、三氯蔗糖、纽甜、阿斯巴甜标准品各0.010g， 用超纯水定容至100mL容量瓶，配制成0.10mg/mL标准储备液；取1mL混合标准储 备液用甲醇水溶液(V/V为20:80)定容至100mL容量瓶，配置成1.00mg/L的标准中 间液，再分别取25.00、10.00、5.00、2.50、1.00、0.50、0.25mL标准中间液，用甲醇 水溶液(V/V为20:80)定容至50mL容量瓶，配置成浓度分别为500μg/L、200μg/L、 100μg/L、50μg/L、20μg/L、10μg/L、
5μg/L的标准工作液，过0.22μm滤膜，待上机。
[0045] 1.3仪器参数条件
[0046] 液相条件：色谱柱：Shin-pack XR-ODSIII C18(2.0mmI.D*150mm L.,3.0μm)；进样 量：10μL；流动相：A：0.1％甲酸水溶液B：甲醇；柱温：45℃；洗脱方式：梯度洗脱， 见表1。
[0047] 表1梯度洗脱
[0048] 时间(min) 流动相A 流动相B0.00～3.00 100～50 0～50
3.00～5.00 50～10 50～90
6.50～6.51 10～100 90～0
6.51～7.00 100 0
[0049] 质谱条件：扫描方式为多级反应监测(MRM)；离子源：ESI，负离子模式；加热 块温度：450℃；DL温度：250℃；雾化气流速：3.0L/min；干燥气流速：10L/min；驻 留时间：40ms。
[0050] 1.4试验方法
[0051] 酒成品：吸取10.00mL样品，60℃水浴加热，待酒样剩余量小于1mL时取出，用 超纯水定容至10mL，摇匀后过0.22μm滤膜，待分析。
[0052] 检测方法的优化
[0053] 2.1色谱条件的选择
[0054] 在甜味剂检测中，常用到的流动相有甲醇-水、甲醇-乙酸铵或乙腈-水，考虑到在流 动相中加入少量的
有机酸可帮助分离多种物质，和铵盐可加强
离子化程度，故本试验选 择0.1％甲酸-甲醇和甲醇-乙酸铵作为流动相。试验对比发现，在表1的洗脱梯度下，0.1％ 甲酸-甲醇作为流动相所得到的甜蜜素、糖精钠、安赛蜜、纽甜四种甜味剂混合物分离 效果好，阿斯巴甜和三氯蔗糖几乎在同一时间出峰，且各物质的峰形瘦高。
[0055] 图1为六种甜味剂混合标准样品的MRM色谱图，安赛蜜保留时间为2.62min，甜 蜜素保留时间为3.86min，糖精钠保留时间为3.33min，阿斯巴甜保留时间为4.22min， 三氯蔗糖保留时间为4.23min，纽甜保留时间为5.65min。
[0056] 2.2质谱条件的优化
[0057] 采用ESI负离子的多级检测模式，因加热块温度、DL温度、干燥气流速、驻留时 间等因素均会影响灵敏度，所以在不同的条件下进行了多次试验，最终确定加热块温度 为450℃，DL温度为250℃，雾化气流速为3.0L/min，干燥气流速为10L/min，驻留时 间为40ms。
在以上质谱条件下，对产物离子进行了自动优化，得到了安赛蜜、甜蜜素、 糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜六种甜味剂的定性离子对和定量离子对，各甜味剂 的MRM优化参数如表
2。同时获得了各种甜味剂的MRM图和定量离子质谱图。
[0058] 表2 MRM优化参数
[0059]
[0060] “*”表示定量离子
[0061] 图2为安赛蜜的MRM图和定量离子质谱图，图中质荷比m/z＝82.05为安赛蜜的产 物离子，作为定量离子；色谱图上的定量离子对162.05＞82.05用于安赛蜜的定量。
[0062] 图3为甜蜜素的MRM图和定量离子质谱图，图中质荷比m/z＝178.15为甜蜜素的 产物离子，作为定量离子；色谱图上的定量离子对178.15＞80.00用于甜蜜素的定量。
[0063] 图4为糖精钠的MRM图和定量离子质谱图，图中质荷比m/z＝182.05为糖精钠的 产物离子，作为定量离子；色谱图上的定量离子对182.05＞105.95用于糖精钠的定量。
[0064] 图5为阿斯巴甜的MRM图和定量离子质谱图，图中质荷比m/z＝293.15为阿斯巴 甜的产物离子，作为定量离子；色谱图上的定量离子对293.15＞261.00用于阿斯巴甜的 定量。
[0065] 图6为纽甜的MRM图和定量离子质谱图，图中质荷比m/z＝377.00为纽甜的产物 离子，作为定量离子；色谱图上的定量离子对377.00＞200.10用于纽甜的定量。
[0066] 图7为三氯蔗糖的MRM图和定量离子质谱图，图中质荷比m/z＝441.00为三氯蔗 糖的产物离子，作为定量离子；色谱图上的定量离子对441.00＞395.00用于三氯蔗糖的 定量。
[0067] 2.3线性范围
[0068] 将5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L和500μg/L不同浓度的混 合标准工作液按照1.3中的分析条件进行测定，外标法定量。以浓度为横坐标，峰面积 为纵坐标，绘制校准曲线，所得六种甜味剂校准曲线线性关系均良好，r值均>0.999， 线性方程、相关系数和检出限、定量限见表3。仪器的灵敏度用仪器的检出限表示，取
信噪比≥3的甜味剂混合标准液的最小浓度为仪器检出限，方法的灵敏度用方法的定量 限表示，取信噪比≥10的甜味剂混合标准液的最小浓度为方法定量限。
[0069] 表3校准曲线参数
[0070]
[0071] 图8为安赛蜜(a)、甜蜜素(b)、糖精钠(c)、阿斯巴甜(d)、纽甜(e)和三氯蔗糖(f) 标准校准曲线，横坐标为浓度，纵坐标为峰面积。
[0072] 2.4精密度试验
[0073] 取放置一周左右的三个不同浓度混合标准工作液(50μg/L、100μg/L、200μg/L)， 分别连续测定6次，考察仪器的精密度，保留时间和峰面积的重复性结果如下表4。结 果显示，不同浓度标准品保留时间和峰面积的相对标准偏差分别在0.047～0.565％和 0.559～4.168％之间，仪器精密度良好。
[0074] 表4保留时间和峰面积重复性结果(n＝6)
[0075]
[0076] 2.5回收率试验
[0077] 在三个50mL的容量瓶中各加入一定量的甜味剂混合标准溶液，用同一个白酒样定 容，使得加标酒样浓度分别为50μg/L、120μg/L、150μg/L。按照1.4中的试验方法对 样品进行前处理，再按照1.3中的分析条件测定六种甜味剂的加标回收率，见表5。结 果显示：应用此方法检测，安赛蜜、甜蜜素、糖精钠、阿斯巴甜、三氯蔗糖、纽甜的平 均加标回收率在80.17～117.90％之间。
[0078] 表5回收率试验结果
[0079]
[0080] 2.6样品分析
[0081] 按建立的试验分析方法对凤香型白酒100个样品进行测试，结果均未检测到六种甜 味剂，符合国家标准对固态
发酵白酒人工甜味剂的要求，即不得检出。
[0082] 以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了 解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和
说明书中描述的只是说明本发明的原 理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和 改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的
权利要求书及其效 物界定。
