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复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌 发酵 饲料

阅读：766发布：2024-02-29

专利汇可以提供复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌发酵饲料专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌发酵饲料，该复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液8-10份、约氏乳杆菌菌剂8-15份、保加利亚乳杆菌菌剂25-30份、双歧杆菌菌剂15-20份、伯顿毕赤酵母菌剂5-8份；所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂分别由发酵液与相应菌制备而成；所述养料液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、收集沉淀、沉淀溶于水所得的溶液；所述发酵液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、过滤去除沉淀、收集滤液、滤液浓缩后所得的溶液；本发明中双孢蘑菇罐藏加工废水能够被充分利用，节约了双孢蘑菇罐藏加工废水的处理成本。，下面是复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌发酵饲料专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种复合益生菌菌液，其特征在于：以重量份数比计，它包括养料液8-10份、约氏乳杆菌菌剂8-15份、保加利亚乳杆菌菌剂25-30份、双歧杆菌菌剂15-20份、伯顿毕赤酵母菌剂
5-8份；所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂分别由发酵液与相应菌制备而成；
其中，所述养料液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、收集沉淀、沉淀溶于水所得的溶液；
所述发酵液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、过滤去除沉淀、收集滤液、滤液浓缩后所得的溶液；
所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的活菌数均为2～3亿个/mL。
2.根据权利要求1所述的复合益生菌菌液，其特征在于：所述发酵液中可溶性固形物浓度为0.2％-2％。
3.根据权利要求1所述的复合益生菌菌液，其特征在于：所述养料液折光率达到58～
60％。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的复合益生菌菌液的制备方法，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
(1)制备养料液与发酵液；(2)活化各菌种；(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液；(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；(5)制备菌液；
其中，步骤(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的方法为：取4个250ml的三角瓶，将步骤(1)所得的发酵液置于三角瓶中，且每个三角瓶中发酵液的体积为85-95ml；接着将步骤(3)所得的约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液分别接种于对应的三角瓶中，每个三角瓶的接种量均为3％-10％，接种之后，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在26-
38℃条件下进行厌氧静置培养24-48h，使活菌数均达2～3亿个/mL，伯顿毕赤酵母在26-38℃，转速为100-250rpm条件下，进行振荡培养24-48h，使活菌数为2～3亿个/mL，即分别得所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；
步骤(5)制备菌液的方法为：将经步骤(1)所得的养料液与步骤(4)所得的约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂进行混合，即得所述复合益生菌菌液。
5.根据权利要求4所述的复合益生菌菌液的制备方法，其特征在于：步骤(1)中养料液与发酵液的具体制备方法为：
a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；
b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；
c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到35～55％，得浓缩液；
d.对浓缩液进行梯度递增醇沉，回收每次醇沉后所得的沉淀，并收集最后一次醇沉后，过滤所得的终滤液；
e.将步骤d收集的终滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至终滤液中可溶性固形物浓度达0.2％-2％，然后将浓缩后的终滤液pH调节至6.5-6.8，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵液；
f.将步骤d回收的沉淀进行合并，之后将合并的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到58～60％，之后将溶解所得的溶液在121-122℃下，湿热灭菌10-20min后，得所述养料液。
6.根据权利要求5所述的复合益生菌菌液的制备方法，其特征在于：步骤d的具体操作方法为：
在浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到25％，在室温下静置12-15h，进行第一次醇沉；第一次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第一滤液与第一沉淀；
接着，在第一滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到35％，在室温下静置5-6h，进行第二次醇沉；第二次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第二滤液与第二沉淀；
最后，在第二滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到50％，在室温下静置2-3h，进行第三次醇沉；第三次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的终滤液与第三沉淀。
7.根据权利要求4所述的复合益生菌菌液的制备方法，其特征在于：步骤(2)活化各菌种的具体过程为：
将约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母分别对应接种于含有MRS斜面培养基、日本乳酸菌斜面培养基、双歧杆菌斜面培养基、YM斜面培养基的4个斜面上进行分开培养18～24h，培养时温度控制在24～35℃。
8.根据权利要求4所述的复合益生菌菌液的制备方法，其特征在于：步骤(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液的具体方法为：用接种环挑取1环步骤(2)已活化的约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母，分别对应接入装有100-150mL的MRS液体培养基、日本乳酸菌液体培养基、双歧杆菌液体培养基、YM液体培养基的4个三角瓶中，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在28-40℃条件下进行厌氧培养培养24-48h，伯顿毕赤酵母在25-28℃、150-200rpm条件下，进行摇床振荡培养24-48h，即分别得所述约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液。
9.一种复合益生菌发酵饲料，其特征在于：以重量份数比计，它包括权利要求1-8任意一项所述的复合益生菌菌液5-8份、鱼粉20～30份、豆粕9～11份、莲子壳15～20份、紫苏0.5～1份、桔梗5～8份、花生粕8～10份、菜粕0.5～1份、豆油5～8份、鱼油2～3份、磷酸二氢钙2～3份。
10.根据权利要求9所述的复合益生菌发酵饲料的制备方法，其特征在于：它包括以下工艺步骤：
1)将莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过
120目筛网，得初混料；
2)将步骤1)所得的初混料与鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得次混料；
3)将复合益生菌菌液与步骤2)所得的次混料搅拌混合均匀，即得所述复合益生菌发酵饲料。

说明书全文

复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌发

酵饲料

技术领域

[0001] 本发明涉及一种复合益生菌菌液及其制备方法以及由其制成的复合益生菌发酵饲料。

背景技术

[0002] 双孢蘑菇学名为Agaricus bisporus(Lange)Sing,中文别名为蘑菇、洋菇，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，约占世界食用菌总产量的25％左右。由于新鲜的双孢蘑菇储藏期较短，故其国际贸易形式主要以罐藏加工产品为主，而罐藏加工生产时必须及时对鲜菇进行预煮杀青，防止蘑菇开伞，而预煮后的熟菇重量比鲜菇下降35％～40％，损失的重量变成工业废水。在中国，每年用于罐藏加工的双孢蘑菇原料约占双孢蘑菇总产量的80％，也就是说每年约有30％的双孢蘑菇产量变成工业废水而流失，而它是高BOD和 COD含量的生产废水，其中COD的含量为540.29g/L，比国家三级排放标准高出13.07倍，直接排放会造成环境污染，而废水处理会增加企业的生产成本。这些废水中含有大量的营养成分，充分利用好蘑菇产业废水，将其被废为宝，具有极其深远的实际意义。

[0003] 发酵饲料是一类以长见的牧草、植物茎秆皮壳、农产品下脚料等为原料，利用一些益生菌发酵制成的节约型的绿色安全生物饲料，这样的发酵饲料能够变废为宝，降低饲料成本，消除环境污染，增加养殖效益，减少疾病发生，符合国家政策的有关规定，目前发酵饲料的研发已经成为了饲料行业的一个新的发展方向。然而，目前市面上现有的发酵饲料功能单一，不能集提高动物免疫机能与促进动物的生长发育为一体的发酵饲料。

发明内容

[0004] 本发明的目的之一在于提供一种成本低、能够充分利用双孢蘑菇加工废水的复合益生菌菌液及其制备方法；

[0005] 本发明的目的之二在于提供一种能够提高动物免疫力、促进动物生长发育且能够变废为宝的由所述复合益生菌菌液制成的复合益生菌发酵饲料。

[0006] 本发明的目的通过如下技术方案实现：一种复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液8-10份、约氏乳杆菌菌剂8-15份、保加利亚乳杆菌菌剂25-30 份、双歧杆菌菌剂15-20份、伯顿毕赤酵母菌剂5-8份；所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂分别由发酵液与相应菌制备而成；

[0007] 其中，所述养料液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、收集沉淀、沉淀溶于水所得的溶液；

[0008] 所述发酵液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、过滤去除沉淀、收集滤液、滤液浓缩后所得的溶液；

[0009] 所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的活菌数均为2～3亿个/mL。

[0010] 所述的复合益生菌菌液的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0011] (1)制备养料液与发酵液；(2)活化各菌种；(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液；(4) 制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；(5)制备菌液；

[0012] 其中，步骤(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的方法为：取4个250ml的三角瓶，将步骤(1)所得的发酵液置于三角瓶中，且每个三角瓶中发酵液的体积为85-95ml；接着将步骤(3) 所得的约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液分别接种于对应的三角瓶中，每个三角瓶的接种量均为 3％-10％，接种之后，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在26-38℃条件下进行厌氧静置培养24-48h，使活菌数均达2～3亿个/mL，伯顿毕赤酵母在 26-38℃，转速为100-250rpm条件下，进行振荡培养24-48h，使活菌数为2～3 亿个/mL，即分别得所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；

[0013] 步骤(5)制备菌液的方法为：将经步骤(1)所得的养料液与步骤(4)所得的约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂进行混合，即得所述复合益生菌菌液。

[0014] 一种复合益生菌发酵饲料，以重量份数比计，它包括所述的复合益生菌菌液5-8份、鱼粉20～30份、豆粕9～11份、莲子壳15～20份、紫苏0.5～1份、桔梗5～8份、花生粕8～10份、菜粕0.5～1份、豆油5～8份、鱼油2～3份、磷酸二氢钙2～3份。

[0015] 所述的复合益生菌发酵饲料的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0016] 1)将莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过120目筛网，得初混料；

[0017] 2)将步骤1)所得的初混料与鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得次混料；

[0018] 3)将复合益生菌菌液与步骤2)所得的次混料搅拌混合均匀，即得所述复合益生菌发酵饲料。

[0019] 较之现有技术而言，本发明的优点在于：

[0020] 1.本发明将双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、过滤去除沉淀、收集滤液、滤液浓缩后所得的溶液用于约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母菌剂的发酵培养制成相应的菌剂，同时本发明还将双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、收集沉淀、沉淀溶于水所得的溶液作为养料液，与所得的菌剂制成复合益生菌菌液，可见在本发明中双孢蘑菇罐藏加工废水能够被完完全全充分地利用，真正的做到了被废为宝，节约了双孢蘑菇罐藏加工废水的处理成本，因此本发明具有节能环保的优点。

[0021] 2.由本发明的复合益生菌菌液制成的复合益生菌发酵饲料，能够增强动物肠道动力，促使动物肠道对营养物质的吸收，进而促进动物生长发育；该饲料还能够显著的提高动物的免疫力，降低动物的发病率。

[0022] 3.该饲料未添加任何抗生素添加剂，不会蓄积在动物体内直接或者间接的对人体健康造成危害。

[0023] 4.该饲料还具有制备工艺简单的优点，且该饲料的原料成本低，适合工业化生产。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：

[0025] 一种复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液8-10份、约氏乳杆菌菌剂8-15份、保加利亚乳杆菌菌剂25-30份、双歧杆菌菌剂15-20份、伯顿毕赤酵母菌剂5-8份；所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂分别由发酵液与相应菌制备而成；

[0026] 其中，所述养料液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、收集沉淀、沉淀溶于水所得的溶液；

[0027] 所述发酵液为双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉、过滤去除沉淀、收集滤液、滤液浓缩后所得的溶液；

[0028] 所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的活菌数均为2～3亿个/mL。

[0029] 双孢蘑菇罐藏加工废水经浓缩、醇沉后形成的沉淀，其主要成分为一些活性多糖，这些活性多糖能够为动物机体吸收，有效地提高动物免疫力，进而降低动物发病率。而醇沉过滤后形成滤液，含有除多糖以外的一些无机盐、氨基酸、单糖等成分，特别适合菌的发酵培养，因此将醇沉过滤后形成的滤液用于菌的发酵培养。本发明将双孢蘑菇罐藏加工废水醇沉后的沉淀以及醇沉过滤后的滤液充分利用，制成能够用于饲料中的菌液，做到真正的被废为宝。

[0030] 所述发酵液中可溶性固形物浓度为0.2％-2％，优选为0.5％。

[0031] 所述养料液折光率达到58～60％，优选为60％。

[0032] 所述的复合益生菌菌液的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0033] (1)制备养料液与发酵液；(2)活化各菌种；(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液；(4) 制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；(5)制备菌液；

[0034] 其中，步骤(1)中养料液与发酵液的具体制备方法为：

[0035] a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；

[0036] b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500-12500rpm之间，离心温度为15-25℃，离心时间为10-
20min。

[0037] c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到 35～55％，得浓缩液；

[0038] d.对浓缩液进行梯度递增醇沉，回收每次醇沉后所得的沉淀，并收集最后一次醇沉后，过滤所得的终滤液；步骤d的具体操作方法为：

[0039] 在浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到25％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到25％)，在室温下静置12-15h，进行第一次醇沉；第一次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第一滤液与第一沉淀；

[0040] 接着，在第一滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到35％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到35％)，在室温下静置5-6h，进行第二次醇沉；第二次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第二滤液与第二沉淀；

[0041] 最后，在第二滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到50％(即使液体中乙醇的体积百分比浓度达到50％)，在室温下静置2-3h，进行第三次醇沉；第三次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的终滤液与第三沉淀。

[0042] 本发明采取梯度醇沉的方式，对浓缩后的双孢蘑菇罐藏加工废水进行醇沉，能够将双孢蘑菇罐藏加工废水中的多糖充分地醇沉为沉淀，本发明将这些多糖沉淀回收合并后，并不用于各菌的发酵培养，而是作为制成的饲料中的另一营养成分，该营养成分不仅可以促进各菌对饲料的发酵，而且可以为动物所吸收，增强动物免疫力。

[0043] e.将步骤d收集的终滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至终滤液中可溶性固形物浓度达0.2％-2％(优选为0.5％)，然后将浓缩后的终滤液 pH调节至6.5-6.8(优选pH为6.5)，再经121-122℃，湿热灭菌10-20min后，得所述发酵液；

[0044] f.将步骤d回收的第一沉淀、第二沉淀以及第三沉淀进行合并，之后将合并的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到58～60％(优选为60％)，之后将溶解所得的溶液在121-122℃下，湿热灭菌10-20min后，得所述养料液。

[0045] 步骤(2)活化各菌种的具体过程为：

[0046] 将约氏乳杆菌(GIM1.730)、保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)、双歧杆菌 (ATCC29521)、伯顿毕赤酵母(GIM2.179)分别对应接种于含有MRS斜面培养基、日本乳酸菌斜面培养基、双歧杆菌斜面培养基、YM斜面培养基的4个斜面上进行分开培养18～24h，培养时温度控制在24～35℃。

[0047] 其中，约氏乳杆菌(AS1.3221)、双歧杆菌(ATCC29521)、伯顿毕赤酵母 GIM2.179购自广东省微生物菌种保藏中心；保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；

[0048] 约氏乳杆菌所适用的培养基为MRS培养基；保加利亚乳杆菌所适用的培养基为日本乳酸菌培养基，双歧杆菌所适用的培养基为双歧杆菌培养基；伯顿毕赤酵母所适用培养基为YM培养基。

[0049] 所述MRS斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g以及蒸馏水1.0升混合；调节pH为6.8，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0050] 所述日本乳酸菌斜面培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g、琼脂20.0g以及蒸馏水1000ml 混合后，调节pH为6.6-7.0，在121℃高压灭菌15min，即可。

[0051] 所述双歧杆菌斜面培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml、琼脂15.0g以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，在121℃高压灭菌15min，即可；

[0052] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水 1.0L混合后、调节pH为
6.5。

[0053] 所述YM斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g、琼脂20g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为 6.2，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0054] 步骤(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液的具体方法为：用接种环挑取1环步骤(2) 已活化的约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母，分别对应接入装有100-150mL的MRS液体培养基、日本乳酸菌液体培养基、双歧杆菌液体培养基、YM液体培养基的4个三角瓶中，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在28-40℃条件下进行厌氧培养培养24-48h，伯顿毕赤酵母在25-28℃、 150-200rpm条件下，进行摇床振荡培养24-48h，即分别得所述约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液。

[0055] 其中，所述MRS液体培养基的配置方法为：1L蒸馏水中溶解下列组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g以及吐温80 1.0mL；调节pH为5.5～5.9，在101Kpa，118℃下高压灭菌15min，即可。

[0056] 所述日本乳酸菌液体培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g以及蒸馏水1000ml混合后，调节 pH为6.6-7.0，再121℃高压灭菌15min，即可。

[0057] 所述双歧杆菌液体培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，再121℃高压灭菌15min，即可；

[0058] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水1.0L 混合后，调节pH为
6.5。

[0059] 所述YM液体培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为6.2，即可。

[0060] 步骤(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的方法为：取4个250ml的三角瓶，将步骤(1)所得的发酵液置于三角瓶中，且每个三角瓶中发酵液的体积为85-95ml(优选为90mL)；接着将步骤(3)所得的约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液分别接种于对应的三角瓶中，每个三角瓶的接种量均为3％-10％(优选为4％)，接种之后，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在26-38℃(优选为35℃)条件下进行厌氧静置培养24-48h(优选为 36h)，使活菌数均达2～3亿个/mL，伯顿毕赤酵母在26-38℃(优选为35℃)，转速为100-
250rpm(优选为150rpm)条件下，进行振荡培养24-48h(优选为36h)，使活菌数为2～3亿个/mL，即分别得所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；

[0061] 步骤(5)制备菌液的方法为：将经步骤(1)所得的养料液与步骤(4)所得的约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂进行混合，即得所述复合益生菌菌液。

[0062] 一种复合益生菌发酵饲料，以重量份数比计，它包括所述的复合益生菌菌液5-8份、鱼粉20～30份、豆粕9～11份、莲子壳15～20份、紫苏0.5～1份、桔梗5～8份、花生粕8～10份、菜粕0.5～1份、豆油5～8份、鱼油2～3份、磷酸二氢钙2～3份。

[0063] 所述的复合益生菌发酵饲料的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0064] 1)将莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过120目筛网，得初混料；

[0065] 2)将步骤1)所得的初混料与鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得次混料；

[0066] 3)将复合益生菌菌液与步骤2)所得的次混料搅拌混合均匀，即得所述复合益生菌发酵饲料。

[0067] 下面结合具体实施例对本发明的内容作更细致地阐述：

[0068] 实施例一：

[0069] 一种复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液8份、约氏乳杆菌菌剂15份、保加利亚乳杆菌菌剂30份、双歧杆菌菌剂15份、伯顿毕赤酵母菌剂5份。

[0070] 所述的复合益生菌菌液的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0071] (1)制备养料液与发酵液；(2)活化各菌种；(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液；(4) 制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；(5)制备菌液；

[0072] 其中，步骤(1)中养料液与发酵液的具体制备方法为：

[0073] a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；

[0074] b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在11500rpm之间，离心温度为25℃，离心时间为10min。

[0075] c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到 35％，得浓缩液；

[0076] d.对浓缩液进行梯度递增醇沉，回收每次醇沉后所得的沉淀，并收集最后一次醇沉后，过滤所得的终滤液；步骤d的具体操作方法为：

[0077] 在浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到25％，在室温下静置12h，进行第一次醇沉；第一次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第一滤液与第一沉淀；

[0078] 接着，在第一滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到35％，在室温下静置5h，进行第二次醇沉；第二次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第二滤液与第二沉淀；

[0079] 最后，在第二滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到50％，在室温下静置2h，进行第三次醇沉；第三次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的终滤液与第三沉淀。

[0080] e.将步骤d收集的终滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至终滤液中可溶性固形物浓度达0.2％，然后将浓缩后的终滤液pH调节至6.7，再经 121℃，湿热灭菌20min后，得所述发酵液；

[0081] f.将步骤d回收的第一沉淀、第二沉淀以及第三沉淀进行合并，之后将合并的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到59％，之后将溶解所得的溶液在121℃下，湿热灭菌20min后，得所述养料液。

[0082] 步骤(2)活化各菌种的具体过程为：

[0083] 将约氏乳杆菌(GIM1.730)、保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)、双歧杆菌 (ATCC29521)、伯顿毕赤酵母(GIM2.179)分别对应接种于含有MRS斜面培养基、日本乳酸菌斜面培养基、双歧杆菌斜面培养基、YM斜面培养基的4个斜面上进行分开培养18h，培养时温度控制在35℃。

[0084] 其中，约氏乳杆菌(AS1.3221)、双歧杆菌(ATCC29521)、伯顿毕赤酵母 GIM2.179购自广东省微生物菌种保藏中心；保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；

[0085] 约氏乳杆菌所适用的培养基为MRS培养基；保加利亚乳杆菌所适用的培养基为日本乳酸菌培养基，双歧杆菌所适用的培养基为双歧杆菌培养基；伯顿毕赤酵母所适用培养基为YM培养基。

[0086] 所述MRS斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g以及蒸馏水1.0升混合；调节pH为6.8，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0087] 所述日本乳酸菌斜面培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g、琼脂20.0g以及蒸馏水1000ml 混合后，调节pH为6.6-7.0，在121℃高压灭菌15min，即可。

[0088] 所述双歧杆菌斜面培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml、琼脂15.0g以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，在121℃高压灭菌15min，即可；

[0089] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水1.0L混合后、调节pH为6.5。

[0090] 所述YM斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g、琼脂20g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为 6.2，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0091] 步骤(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液的具体方法为：用接种环挑取1环步骤(2) 已活化的约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母，分别对应接入装有120mL的MRS液体培养基、日本乳酸菌液体培养基、双歧杆菌液体培养基、YM液体培养基的4个三角瓶中，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在28℃条件下进行厌氧培养培养48h，伯顿毕赤酵母在25℃、180rpm条件下，进行摇床振荡培养48h，即分别得所述约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液。

[0092] 其中，所述MRS液体培养基的配置方法为：1L蒸馏水中溶解下列组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g以及吐温80 1.0mL；调节pH为5.5～5.9，在101Kpa，118℃下高压灭菌15min，即可。

[0093] 所述日本乳酸菌液体培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g以及蒸馏水1000ml混合后，调节pH为6.6-7.0，再121℃高压灭菌15min，即可。

[0094] 所述双歧杆菌液体培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，再121℃高压灭菌15min，即可；

[0095] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水1.0L 混合后，调节pH为
6.5。

[0096] 所述YM液体培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为6.2，即可。

[0097] 步骤(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的方法为：取4个250ml的三角瓶，将步骤(1)所得的发酵液置于三角瓶中，且每个三角瓶中发酵液的体积为85ml；接着将步骤(3)所得的约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液分别接种于对应的三角瓶中，每个三角瓶的接种量均为3％，接种之后，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在26℃条件下进行厌氧静置培养48h，使活菌数均达2～3亿个/mL，伯顿毕赤酵母在26℃，转速为100rpm 条件下，进行振荡培养48h，使活菌数为2～3亿个/mL，即分别得所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；

[0098] 步骤(5)制备菌液的方法为：将经步骤(1)所得的养料液与步骤(4)所得的约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂按规定的重量份数比进行混合，即得所述复合益生菌菌液。

[0099] 实施例二：

[0100] 一种复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液9份、约氏乳杆菌菌剂10份、保加利亚乳杆菌菌剂26份、双歧杆菌菌剂18份、伯顿毕赤酵母菌剂6份。

[0101] 所述的复合益生菌菌液的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0102] (1)制备养料液与发酵液；(2)活化各菌种；(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液；(4) 制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；(5)制备菌液；

[0103] 其中，步骤(1)中养料液与发酵液的具体制备方法为：

[0104] a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；

[0105] b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在12000rpm之间，离心温度为20℃，离心时间为15min。

[0106] c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到 45％，得浓缩液；

[0107] d.对浓缩液进行梯度递增醇沉，回收每次醇沉后所得的沉淀，并收集最后一次醇沉后，过滤所得的终滤液；步骤d的具体操作方法为：

[0108] 在浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到25％，在室温下静置14h，进行第一次醇沉；第一次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第一滤液与第一沉淀；

[0109] 接着，在第一滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到35％，在室温下静置5.5h，进行第二次醇沉；第二次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第二滤液与第二沉淀；

[0110] 最后，在第二滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到50％，在室温下静置2.5h，进行第三次醇沉；第三次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的终滤液与第三沉淀。

[0111] e.将步骤d收集的终滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至终滤液中可溶性固形物浓度达0.5％，然后将浓缩后的终滤液pH调节至6.5，再经 121℃，湿热灭菌15min后，得所述发酵液；

[0112] f.将步骤d回收的第一沉淀、第二沉淀以及第三沉淀进行合并，之后将合并的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到60％，之后将溶解所得的溶液在121℃下，湿热灭菌15min后，得所述养料液。

[0113] 步骤(2)活化各菌种的具体过程为：

[0114] 将约氏乳杆菌(GIM1.730)、保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)、双歧杆菌 (ATCC29521)、伯顿毕赤酵母(GIM2.179)分别对应接种于含有MRS斜面培养基、日本乳酸菌斜面培养基、双歧杆菌斜面培养基、YM斜面培养基的4个斜面上进行分开培养20h，培养时温度控制在30℃。

[0115] 其中，约氏乳杆菌(AS1.3221)、双歧杆菌(ATCC29521)、伯顿毕赤酵母 GIM2.179购自广东省微生物菌种保藏中心；保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；

[0116] 约氏乳杆菌所适用的培养基为MRS培养基；保加利亚乳杆菌所适用的培养基为日本乳酸菌培养基，双歧杆菌所适用的培养基为双歧杆菌培养基；伯顿毕赤酵母所适用培养基为YM培养基。

[0117] 所述MRS斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g以及蒸馏水1.0升混合；调节pH为6.8，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0118] 所述日本乳酸菌斜面培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g、琼脂20.0g以及蒸馏水1000ml 混合后，调节pH为6.6-7.0，在121℃高压灭菌15min，即可。

[0119] 所述双歧杆菌斜面培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml、琼脂15.0g以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，在121℃高压灭菌15min，即可；

[0120] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水 1.0L混合后、调节pH为
6.5。

[0121] 所述YM斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g、琼脂20g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为 6.2，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0122] 步骤(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液的具体方法为：用接种环挑取1环步骤(2) 已活化的约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母，分别对应接入装有100mL的MRS液体培养基、日本乳酸菌液体培养基、双歧杆菌液体培养基、YM液体培养基的4个三角瓶中，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在35℃条件下进行厌氧培养培养36h，伯顿毕赤酵母在28℃、150rpm条件下，进行摇床振荡培养36h，即分别得所述约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液。

[0123] 其中，所述MRS液体培养基的配置方法为：1L蒸馏水中溶解下列组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g以及吐温80 1.0mL；调节pH为5.5～5.9，在101Kpa，118℃下高压灭菌15min，即可。

[0124] 所述日本乳酸菌液体培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g以及蒸馏水1000ml混合后，调节 pH为6.6-7.0，再121℃高压灭菌15min，即可。

[0125] 所述双歧杆菌液体培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，再121℃高压灭菌15min，即可；

[0126] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水1.0L 混合后，调节pH为
6.5。

[0127] 所述YM液体培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为6.2，即可。

[0128] 步骤(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的方法为：取4个250ml的三角瓶，将步骤(1)所得的发酵液置于三角瓶中，且每个三角瓶中发酵液的体积为90ml；接着将步骤(3)所得的约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液分别接种于对应的三角瓶中，每个三角瓶的接种量均为4％，接种之后，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在35℃条件下进行厌氧静置培养36h，使活菌数均达2～3亿个/mL，伯顿毕赤酵母在35℃，转速为150rpm 条件下，进行振荡培养36h，使活菌数为2～3亿个/mL，即分别得所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；

[0129] 步骤(5)制备菌液的方法为：将经步骤(1)所得的养料液与步骤(4)所得的约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂按规定的重量份数比进行混合，即得所述复合益生菌菌液。

[0130] 实施例三：

[0131] 一种复合益生菌菌液，以重量份数比计，它包括养料液10份、约氏乳杆菌菌剂8份、保加利亚乳杆菌菌剂25份、双歧杆菌菌剂20份、伯顿毕赤酵母菌剂8份。

[0132] 所述的复合益生菌菌液的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0133] (1)制备养料液与发酵液；(2)活化各菌种；(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液；(4) 制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；(5)制备菌液；

[0134] 其中，步骤(1)中养料液与发酵液的具体制备方法为：

[0135] a.收集双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水；

[0136] b.将收集来的双孢蘑菇罐藏加工过程中所产生的工业废水进行离心，取上清液；离心时，离心机的转速控制在12500rpm之间，离心温度为15℃，离心时间为20min。

[0137] c.将所得的上清液利用降膜蒸发器，降膜蒸发浓缩，浓缩至溶液折光率达到 55％，得浓缩液；

[0138] d.对浓缩液进行梯度递增醇沉，回收每次醇沉后所得的沉淀，并收集最后一次醇沉后，过滤所得的终滤液；步骤d的具体操作方法为：

[0139] 在浓缩液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到25％，在室温下静置15h，进行第一次醇沉；第一次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第一滤液与第一沉淀；

[0140] 接着，在第一滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到35％，在室温下静置6h，进行第二次醇沉；第二次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的第二滤液与第二沉淀；

[0141] 最后，在第二滤液中边搅拌边加入无水乙醇，使含醇量达到50％，在室温下静置3h，进行第三次醇沉；第三次醇沉之后，过滤，并分别收集过滤后所得的终滤液与第三沉淀。

[0142] e.将步骤d收集的终滤液进行旋转蒸发浓缩并除去乙醇，旋转蒸发浓缩至终滤液中可溶性固形物浓度达2％，然后将浓缩后的终滤液pH调节至6.8，再经 122℃，湿热灭菌10min后，得所述发酵液；

[0143] f.将步骤d回收的第一沉淀、第二沉淀以及第三沉淀进行合并，之后将合并的沉淀溶解于水，并使溶解所得的溶液折光率达到58％，之后将溶解所得的溶液在122℃下，湿热灭菌10min后，得所述养料液。

[0144] 步骤(2)活化各菌种的具体过程为：

[0145] 将约氏乳杆菌(GIM1.730)、保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)、双歧杆菌 (ATCC29521)、伯顿毕赤酵母(GIM2.179)分别对应接种于含有MRS斜面培养基、日本乳酸菌斜面培养基、双歧杆菌斜面培养基、YM斜面培养基的4个斜面上进行分开培养24h，培养时温度控制在24℃。

[0146] 其中，约氏乳杆菌(AS1.3221)、双歧杆菌(ATCC29521)、伯顿毕赤酵母 GIM2.179购自广东省微生物菌种保藏中心；保加利亚乳杆菌(ACCC 03958)购自中国农业微生物菌种保藏管理中心；

[0147] 约氏乳杆菌所适用的培养基为MRS培养基；保加利亚乳杆菌所适用的培养基为日本乳酸菌培养基，双歧杆菌所适用的培养基为双歧杆菌培养基；伯顿毕赤酵母所适用培养基为YM培养基。

[0148] 所述MRS斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨10.0g、牛肉浸取物10.0g、酵母提取液5.0g、葡萄糖5.0g、乙酸钠5.0g、柠檬酸二胺2.0g、吐温80 1.0g、磷酸氢二钾2.0g、七水硫酸镁0.2g、七水硫酸锰0.05g、碳酸钙20.0g、琼脂20.0g以及蒸馏水1.0升混合；调节pH为6.8，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0149] 所述日本乳酸菌斜面培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g、琼脂20.0g以及蒸馏水1000ml 混合后，调节pH为6.6-7.0，在121℃高压灭菌15min，即可。

[0150] 所述双歧杆菌斜面培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml、琼脂15.0g以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，在121℃高压灭菌15min，即可；

[0151] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水 1.0L混合后、调节pH为
6.5。

[0152] 所述YM斜面培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g、琼脂20g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为 6.2，在121℃下高压灭菌15min，即可。

[0153] 步骤(3)制备约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液的具体方法为：用接种环挑取1环步骤(2) 已活化的约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌、伯顿毕赤酵母，分别对应接入装有150mL的MRS液体培养基、日本乳酸菌液体培养基、双歧杆菌液体培养基、YM液体培养基的4个三角瓶中，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在40℃条件下进行厌氧培养培养24h，伯顿毕赤酵母在26℃、200rpm条件下，进行摇床振荡培养24h，即分别得所述约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液。

[0154] 其中，所述MRS液体培养基的配置方法为：1L蒸馏水中溶解下列组分：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g以及吐温80 1.0mL；调节pH为5.5～5.9，在101Kpa，118℃下高压灭菌15min，即可。

[0155] 所述日本乳酸菌液体培养基的配置方法为：将牛肉膏5g、酵母膏5g、蛋白胨10g、葡萄糖10g、乳糖5g、氯化钠5g以及蒸馏水1000ml混合后，调节 pH为6.6-7.0，再121℃高压灭菌15min，即可。

[0156] 所述双歧杆菌液体培养基的配置方法为：将大豆蛋白胨5.0g、胰胨5.0g、酵母提取物10.0g、葡萄糖10.0g、盐溶液40.0ml、L-半胱氨酸0.5g、0.1％刃天青1.0ml以及蒸馏水1.0L混合后，调节pH为7.0，再121℃高压灭菌15min，即可；

[0157] 其中，所述盐溶液的配置方法为：将氯化钙0.2g、七水硫酸镁0.48g、磷酸氢二钾1.0g、磷酸二氢钾1.0g、碳酸氢钠10.0g、氯化钠2.0g以及蒸馏水1.0L 混合后，调节pH为
6.5。

[0158] 所述YM液体培养基的配置方法为：将蛋白胨5.00g、葡萄糖10.00g、酵母粉3.00g、麦芽提取物3.00g以及蒸馏水1000mL混合后，调节pH为6.2，即可。

[0159] 步骤(4)制备约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂的方法为：取4个250ml的三角瓶，将步骤(1)所得的发酵液置于三角瓶中，且每个三角瓶中发酵液的体积为95ml；接着将步骤(3)所得的约氏乳杆菌种子悬液、保加利亚乳杆菌种子悬液、双歧杆菌种子悬液、伯顿毕赤酵母种子悬液分别接种于对应的三角瓶中，每个三角瓶的接种量均为10％，接种之后，约氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌、双歧杆菌在38℃条件下进行厌氧静置培养24h，使活菌数均达2～3亿个/mL，伯顿毕赤酵母在38℃，转速为250rpm 条件下，进行振荡培养24h，使活菌数为2～3亿个/mL，即分别得所述约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂；

[0160] 步骤(5)制备菌液的方法为：将经步骤(1)所得的养料液与步骤(4)所得的约氏乳杆菌菌剂、保加利亚乳杆菌菌剂、双歧杆菌菌剂、伯顿毕赤酵母菌剂按规定的重量份数比进行混合，即得所述复合益生菌菌液。

[0161] 实施例四：

[0162] 一种复合益生菌发酵饲料，以重量份数比计，它包括由实施例二制得的复合益生菌菌液5份、鱼粉30份、豆粕9份、莲子壳20份、紫苏0.5份、桔梗8 份、花生粕8份、菜粕1份、豆油5份、鱼油3份、磷酸二氢钙2份。

[0163] 所述的复合益生菌发酵饲料的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0164] 1)将按重量份数比称好的莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过120目筛网，得初混料；

[0165] 2)将步骤1)所得的初混料与按重量份数比称好的鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得次混料；

[0166] 3)将按重量份数比称好的复合益生菌菌液与步骤2)所得的次混料搅拌混合均匀，即得所述复合益生菌发酵饲料。

[0167] 实施例五：

[0168] 一种复合益生菌发酵饲料，以重量份数比计，它包括由实施例二制得的复合益生菌菌液7份、鱼粉25份、豆粕10份、莲子壳18份、紫苏0.8份、桔梗6 份、花生粕9份、菜粕0.7份、豆油6份、鱼油2.5份、磷酸二氢钙2.5份。

[0169] 所述的复合益生菌发酵饲料的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0170] 1)将按重量份数比称好的莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过120目筛网，得初混料；

[0171] 2)将步骤1)所得的初混料与按重量份数比称好的鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得次混料；

[0172] 3)将按重量份数比称好的复合益生菌菌液与步骤2)所得的次混料搅拌混合均匀，即得所述复合益生菌发酵饲料。

[0173] 实施例六：

[0174] 一种复合益生菌发酵饲料，以重量份数比计，它包括由实施例二制得的复合益生菌菌液8份、鱼粉20份、豆粕11份、莲子壳15份、紫苏1份、桔梗5 份、花生粕10份、菜粕0.5份、豆油8份、鱼油2份、磷酸二氢钙3份。

[0175] 所述的复合益生菌发酵饲料的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0176] 1)将按重量份数比称好的莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过120目筛网，得初混料；

[0177] 2)将步骤1)所得的初混料与按重量份数比称好的鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得次混料；

[0178] 3)将按重量份数比称好的复合益生菌菌液与步骤2)所得的次混料搅拌混合均匀，即得所述复合益生菌发酵饲料。

[0179] 实施例七(对比饲料)：

[0180] 一种饲料，以重量份数比计，它包括鱼粉20份、豆粕11份、莲子壳15份、紫苏1份、桔梗5份、花生粕10份、菜粕0.5份、豆油8份、鱼油2份、磷酸二氢钙3份。

[0181] 所述饲料的制备方法，它包括以下工艺步骤：

[0182] 1)将按重量份数比称好的莲子壳、紫苏、桔梗混合后置于粉碎机中进行粉碎处理，并将粉碎后所得的粉末过120目筛网，得初混料；

[0183] 2)将步骤1)所得的初混料与按重量份数比称好的鱼粉、豆粕、花生粕、菜粕、豆油、鱼油、磷酸二氢钙混合后置于研磨机中研磨，之后，将研磨所得的混合物过120目筛网，得饲料；

[0184] 实施例八：

[0185] 试验选择某养殖场平均体重为(13.00±0.20)kg的健康仔猪160头，随机分为4组，每组4个重复，每个重复10头(公母各半)，其中包括一个对照组和3个试验组。对照组饲喂实施例七所制得的饲料，3个试验组分别饲喂实施例四、实施例五、实施例六所得的饲料。仔猪自由采食和饮水，按常规进行免疫及驱虫，试验期为25d，记录试验猪的日采食量，试验结束时结料并称重，计算日增重，日采食量、料重比和成活率。结果如下

[0186]

[0187] 由上述结果可知，本发明制得的复合益生菌发酵饲料可提高仔猪日采食量、日增重和成活率，降低料重比。

[0188] 需要说明的是，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干改变、改进和润饰，这些改变、改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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